JPH06277072A - 改変された基質特異性を有する新規グルコースイソメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 野性型グルコースイソメラーゼ酵素と少
なくとも１つのアミノ酸において異なるアミノ酸配列を
有するグルコースイソメラーゼ酵素をコードする遺伝子
の発現によって得られ、改変された基質特異性を示す突
然変異グルコースイソメラーゼ酵素 【効果】 本発明により改変された基質特異性、例えば
キシロースに比較して高められたグルコース特異性を有
する突然変異グルコースイソメラーゼが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

〔０００１〕 〔産業上の利用分野〕本発明はタンパク質工学技術の酵
素の性質の改良への応用に関する。具体的には本発明は
置き代えによって改変された基質特異性を与えるアミノ
酸を選択する方法を開示する。この方法はグルコースイ
ソメラーゼに応用される。別の面において本発明は改変
された基質特異性を有するグルコースイソメラーゼを提
供する。これらのグルコースイソメラーゼは工業的方法
に、例えば高フラクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）
の生産に有利に用いることができる。 〔０００２〕 〔従来の技術〕グルコースイソメラーゼはグルコースの
フラクトースへの可逆的異性化を触媒する。マクロース
やグルコースに比べてのより高い甘味によりフラクトー
スは現在では砂糖代替物として広く用いられている。 〔０００３〕Ｗｅｎ−Ｐｉｎ Ｃｈｅｎ，Ｐｒｏｃｅｓ
ｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５ Ｊｕｎｅ／Ｊｕ
ｌｙ（１９８０） ３０−４１及びＡｕｇｕｓｔ／Ｓｅ
ｐｔｅｍｂｅｒ（１９８０）３６−４１にみられるごと
く、グルコースイソメラーゼを生産する多くの微生物が
知られており、上記文献中には、グルコースイソメラー
ゼ生産能を有するおびただしい数の微生物が掲示されて
いる。 〔０００４〕いくつかの微生物はグルコースイソメラー
ゼの工業生産に用いることができ、これらのうちストレ
プトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アンプラ
リーラ（Ａｍｐｌｌａｒｉｅｌｌａ）及びアクチノプラ
ネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）が周知である。Ｗｅ
ｎ−Ｐｉｎ Ｃｈｅｎ文献は該微生物の培養条件及び生
産されたグルコースイソメラーゼの回収及び精製を記述
している。 〔０００５〕一般に天然性グルコースイソメラーゼはグ
ルコース以外の糖に対しても高い親和性を示す。この点
に関し、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノ
ース、Ｄ−アロース及び６−デオキシグルコースがこの
酵素の基質となることが見い出された。Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−キシロース及びＤ−リボースのＫ_ｍ値は微生物
毎に変化し、それぞれ０．０８６−０．９２０、０．０
０５−０．０９３及び０．３５−０．６５Ｍの範囲であ
ることが報告された。 〔０００６〕キシロースに対するＫ_ｍ値はグルコースに
対するよりかなり低く、このことはこの酵素に対する正
しい名称が実はキシロースイソメラーゼであることを意
味している。さらに、通常用いられるグルコースイソメ
ラーゼのＶ_ｍａｘはグルコースについてよりキシロース
についてより高く、このこともキシロースイソメラーゼ
がより良い名称であることを示している。 〔０００７〕グルコースイソメラーゼは異なる基質に対
し活性なので、目的とする反応産物、それが用いられる
具体的方法、または望ましくない副生物をさけたいとい
う願望によって、基質特異性を改変できると有利であ
る。 〔０００８〕ＨＦＣＳ生産におけるグルコースイソメラ
ーゼの適用については、反応時間及び酵素コストの低減
上、グルコースに対するより高いＶ_ｍａｘ及びより低い
Ｋ_ｍが有用な性質である。

〔０００９〕グルコースイソメラーゼの別の適用はキシ
ロースのエタノールへの変換における適用である（Ｊｅ
ｆｆｒｉｅｓ，Ｔ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．３（１９８５）２０８）。この適用ではキシ
ロースに対する高活性（Ｖ_ｍａｘ）及び／またはキシロ
ースに対するより良い親和性が有用な性質である。 〔００１０〕単胃動物に対する飼料の消化性及び味覚は
グルコースをフラクトースへ酵素変換すると改善され
る。現実にはグルコースイソメラーゼの適用は望ましく
ないキシロースの飼料中への生成をもたらすキシロース
異性化活性によって妨げられている。キシロースに対し
特異性（Ｖ_ｍａｘまたはＫ_ｍ）を有さないかまたは減じ
られた特異性を有するグルコースイソメラーゼがあれば
飼料前処理における適用上好ましい。 〔００１１〕かくの如く、グルコースイソメラーゼの基
質特異性の改変に対する要望があり、これはまたこの酵
素の適用範囲を拡げるものである。 〔００１２〕近年、タンパク質工学技術の助けによって
酵素の特異性活性を再設計することが記述された。Ｗｅ
ｌｌｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８４（１９８７）５１６７）はズブチリシンの例を
示している。バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｌｉｃｋｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバチルス・ア
ミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆ
ａｃｉｅｎｓ）のセリンプロテアーゼはタンパク質配列
において３１％（８６のアミノ酸残基）異なり、いくつ
かの基質に対する触媒効率において６０の要素によって
異なる。Ｂ．アミロリクエファシエンスからの８６の異
なるアミノ酸のうち３つを対応するＢ．リケニホルミス
残基によって置き代えることにより、突然変異酵素の触
媒活性はＡを６０倍も改善された。 〔００１３〕別の報告ではグルタミン１０２をアルギニ
ン１０２に変異させることによってラクテートデヒドロ
ゲナーゼをマレナデヒドロゲナーゼに変換する方法が記
述されている（Ｗｉｌｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２
（１９８８）１５４１）。 〔００１４〕上記セリンプロテアーゼ及びラクテートデ
ヒドロゲナーゼに関する両ケースにおいて、修飾の提案
は修飾すべき分子とすでに目的とする基質特異性を示し
た天然性酵素の比較に基づいている。同様にしてチトク
ロームｐ４５０_１５αの特異性がチトクロームｐ４５０
_ｃｏｈの特異性にＬｅｕ２０９をｐｈｅ２０９で置き代
えることによって改変された（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ及びＮ
ｅｇｉｓｈｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３３９（１９８９）６３
２）。 〔００１５〕グルコースイソメラーゼについては、キシ
ロースよりグルコースに対し優れた特異性を示す天然性
酵素は知られていない。異なる基質特異性を有する相同
酵素の活性部位の比較に基づく上記方法は従って、グル
コースイソメラーゼに応用することはできない。 〔００１６〕ＷＯ ８９／０１５２０（Ｌｅｔｕｓ）は
ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）から得られ、増
加した安定性を示すキシロースイソメラーゼのいくつか
のミューテイン（ｍｕｔｅｉｎｓ）をリストしている。
突然変異され得る部位の選択は本発明で用いられるのと
は異なる基準に基づいている。３００以上の突然変異体
がリストされているが、突然変異酵素分子の性格付け及
び改変についてのデータはそこには提示されていない。 〔００１７〕 〔発明の概要〕本発明は置き代えによって与えられた酵
素の改変された基質特異性をもたらすアミノ酸を選択す
る方法を開示する。一般に適用可能なこの方法はグルコ
ースイソメラーゼの基質特異性を改変するのに用いられ
る。 〔００１８〕かくして、本発明は改変された基質特異性
を有するグルコースイソメラーゼをも提供する。この改
変された基質特異性は改変基質結合能及び／または改変
触媒活性と称せられる。具体的には、基質としてのグル
コース及びキシロースについての基質結合能及び触媒活
性において絶対的及び相対的変化を有する突然変異グル
コースイソメラーゼが提供される。 〔００１９〕さらに、増加した安定性（崩壊定数として
表される）及び改変された基質特異性等のパラメーター
を、これらの作用を有するそれぞれの変異を加えること
によって、組み合わせて１つの分子とすることができる
ことを示す突然変異グルコースイソメラーゼが提供され
る。 〔００２０〕突然変異グルコースイソメラーゼは、野性
型グルコースイソメラーゼ酵素と少なくとも１つのアミ
ノ酸において異なるアミノ酸配列を有する該グルコース
イソメラーゼをコード化する遺伝子の発現によって得ら
れる。 〔００２１〕 〔発明の詳しい記述〕本発明は置き代えによって改変さ
れた基質特異性をもたらす、酵素中の、アミノ酸を選択
する方法を開示する。かかる突然変異酵素を得るため
に、この酵素をコード化するＤＮＡ配列をコード化され
た酵素が１以上の選択されたアミノ酸置き代えを有する
ように改変する。改変されたＤＮＡは望ましい宿主／ベ
クター系で発現される。 〔００２２〕適当な（点）突然変異を選択するために、
タンパク質結晶学、分子模型化及びコンピューター使用
方法、酵素学及び動力学、分子生物学及びタンパク質化
学技術のよく調和させた適用による合理的アプローチが
行われる。標的アミノ酸部位の同定のための入念な方策
は、点突然変異が局地的動揺（ｌｏｃａｌ ｐｅｒｔｕ
ｒｂａｔｉｏｎｓ）を引き起こすことがめったになく、
タンパク質構造のいくつかの異なる性質に直ちに影響を
与え、異なる性質における変化もまた引き起こすという
意味において革新的である。従って、記述された方策は
よく確立された構造−機能相関関係を利用するけれど
も、それらはまた動力学的及び構造的性質の望ましくな
い改変を避けるかまたは訂正する合理的方法を提供す
る。 〔００２３〕適当なアミノ酸の置き代えによる基質特異
性の改変 酵素の活性部位への基質の結合を変化調節するために、
酵素−基質または酵素−基質−アナログ／阻害剤複合体
の三次元（３Ｄ）構造に関するデータが利用できるな
ら、以下の一般的ルールを逐次的順序で適用できる： ａ）活性部位中の基質のまたは基質アナログ／阻害剤結
合の原子の周囲４Åの球内に少なくとも１つの原子を有
する、すべての残基及び結晶学的に割り当てられた水分
子を選択する； ｂ）基準ａ）に従う選択によって得られる残基及び水と
ファンデルワールス接触しているすべての残基を選択す
る；ｃ）該記録された残基及び水分子リストから触媒作
用、コファクター結合（例えば金属イオン及びヌクレオ
チド）、及び（オリゴマー酵素の場合の）本質的なサブ
ユニット間相互作用に関与するものを除外する、 ｄ）上記で選択された残基の構造的役割に干渉する残基
及び水分子を除外する。標的残基の保存された性質の模
型構築及び分析を本質的な構造的役割を同定するのに用
いることができる； ｅ）基質親和性を変化調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）た
めに、上記選択された残基の１以上を遺伝子コードの改
変によって置き代えて以下の相互作用及び性質の１以上
を変化させることができる： −ｅ１）残基サイズの改変による立体障害； −ｅ２）基質周囲の疎水性／極性； −ｅ３）基質内の基への水素の結合を介して溶媒和する
側鎖を提供することによって、または基質の周囲内の水
分布を改変する置き代えによって基質周囲を溶媒和する
こと； −ｅ４）水素結合網状組織を粉砕し、基質の周囲におけ
る局地的詰込み密度を減少し、または空隙を導入する置
き代えによる、個々の残基、断片またはタンパク質全体
構造の柔軟性。 〔００２４〕上記一連のルールは十分な構造的データが
利用できるならば原則としてすべての酵素に適用できる
一般的ルールである。この一連のルールの実行可能性を
実施するために具体例を以下に論ずる。 〔００２５〕グルコースイソメラーゼの基質特異性の変
化調節における一般ルールの適用 上述の基準ａ）−ｅ）の適用による残基の選択はここで
はアクチノプラネス・ミソウリエンシスのグルコースイ
ソメラーゼの具体例を用いて実証するが、他の種から得
られるグルコースイソメラーゼにおいても強度の相同か
ら同様な置き代え部位を選択できることは明らかであ
る。上述した配列の相同性はアクチノプラネス・ミソウ
リエンシス、アンプラリーラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌ
ｌａ）・スピーシーズ、ストレプトマイセス・ビオラセ
オルーバー（ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、ストレプ
トマイセス・ムリナス（ｍｕｒｉｎｕｓ）、ストレプト
マイセス・サーモバルガリス（ｔｈｅｒｍｏｖｕｌｇａ
ｒｉｓ）、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）・スピーシーズ、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシエリキア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びラクトバチ
ルス・キサローサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘ
ｙｌｏｓｕｓ）から得られたグルコースイソメラーゼの
アライメント（一列整列）を与える図２に示される。上
述のアプローチは、他の種からのグルコースイソメラー
ゼにおける対応する位置でのアミノ酸置き代え後に、他
のグルコースイソメラーゼの改変された基質特異性をも
もたらすであろう。 〔００２６〕一般に、全体的相同性が６５％より大、好
ましくは７４％（Ａｎｉｃｒｅ及びＨｏｌｌｅｎｂｅｒ
ｇ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，７５１５
（１９８９）によると、アクチノプラネス・ミソウリエ
ンシスとストレプトマイセスのグルコースイソメラーゼ
の間の最低相同性）、及びより好ましくは８５％より大
であって、かつ３Ｄ構造が類似している場合には、アミ
ノ酸置き代えは基質特異性における同様な変化をもたら
すと考えられる。基質特異性における同様な変化によっ
て我々は動力学的パラメーターは変化するが、その大き
さは変化しない方向を意味する。具体的には、放線菌目
に属する種からのグルコースイソメラーゼが、選択され
た部位でのアミノ酸の置き代えによる基質特異性の変化
が類似するほど高い程度の類似性を有すると予想され
る。アクチノプラネス・ミソウリエンシスはグルコース
イソメラーゼを突然変異させるのに好ましいソースとな
る。 〔００２７〕本発明による基質特異性の変化はグルコー
ス及びキシロースの両方についてＶ_ｍａｘ及びＫ_ｍの増
加と減少のすべての組合せを包含する。当業者であれば
このことが他の動力学的パラメーターの変化を包含する
ことを理解するであろう。さらに、他の基質に対する特
異性も本質的に変化するであろう。基質特異性を改変す
るための上記提案ルールは上述の基質に限定されず、他
の基質にも適用できる。これらの中にはＤ−リボース、
Ｌ−アラビノース、Ｄ−アロース及び６−デオキシグル
コースがある。 〔００２８〕かくして基質特異性を改変する一般的方法
を提供することは別として、本発明はこの方法をグルコ
ースイソメラーゼに適用する。 〔００２９〕選択されたアミノ酸置き代えはグルコース
イソメラーゼをコード化するＤＮＡにおいて当業者に周
知の方法（例えば部位特異的突然変異誘導）によって巧
みに実行できる。グルコースイソメラーゼまたはその突
然変異体をコード化するＤＮＡを発現ベクター上にクロ
ーン化し、この構築物で、遺伝子が発現される宿主を形
質転換することができる。該宿主中で遺伝子が発現さ
れ、ｍＲＮＡが転写され、ついで好ましくは成熟タンパ
ク質、または前駆体、が菌体から分泌される。ついでタ
ンパク質を精製することができる。標準的手順はＭａｎ
ｉａｔｉｓら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，第１及び２版、それぞれ１９８２及び１９８９）に
見ることができる。 〔００３０〕これらの方法の適用は、野性型グルコース
イソメラーゼ酵素と少なくとも１つのアミノ酸において
異なるアミノ酸配列を有するグルコースイソメラーゼ酵
素をコード化する遺伝子の発現によって得られるグルコ
ースイソメラーゼ酵素であって、改変された基質特異性
を示すことによって特徴づけられるグルコースイソメラ
ーゼ酵素をもたらす。単一の突然変異体の代りに二重の
突然変異体も得ることができる。望ましい性質の組合せ
を目的とするこれらの二重突然変異体のいくつかは性質
が少なくとも部分的に累積的であることを示す。本適用
において、グルコースに対する高められた特異性と高め
られた安定性の両方を有する突然変異体の例を提示す
る。 〔００３１〕新規酵素の基質特異性は目的とする適用の
ために必要とされる基質についてテストすることができ
る。ここで基質としてのグルコースとキシロースに関す
る動力学的パラメーター、及びまたこれらのパラメータ
ーにおける相対的変化に特別の注意が払われる。 〔００３２〕図１はＡ．ミソウリエンシスの活性部位の
周囲の残基の図式的地図を示す。以下に野性型と比較し
てグルコースに対しより高い相対的特異性を有する突然
変異体を設計する方法を説明する。 〔００３３〕アクチノプラネス・ミソウリエンシスから
のグルコースイソメラーゼに上記ルールを適用し、つい
でソルビトール−ＧＩ−Ｃｏ^２＋の座標（ｃｏｏｒｄｉ
ｎａｔｅｓ）を用いて以下の残基リストが得られる： − 基準（ａ）によって選択された残基及び水：１６Ｔ
ｒｐ、 ２６ｐｈｅ及び任意的に４９１、４９２、６９０及び８
８７として表示される４つの水分子。 − 基準（ｂ）によって追加の残基が選択される。本ケ
ースの場合には上述の残基（基準（ａ））の周囲２Åの
球内のすべての残基が取り上げられた。これらは以下の
アミノ酸である： ２９１ｐｈｅ、２９３Ｔｙｒ及び２９５Ｐｒｏ。 − 触媒作用残基：５４Ｈｉｓ、１８３Ｌｙｓ、２２０
Ｈｉｓ；カチオン配位子：１８１Ｇｌｕ、２１７Ｇｌ
ｕ、２２１Ｇｌｕ、２４５Ａｓｐ、２５５Ａｓｐ、２９
２Ａｓｐ、水６９０；及び界面残基：２６Ｐｈｅを基準
（ｃ）の適用により除外する。 − 残基１６Ｔｒｐ、９４Ｐｈｅ及び１３７Ｔｒｐは基
質結合ポケットの全体的形を決める保存された疎水性ク
ラスターを形成するので、基準（ｄ）の適用により除外
する、さらに残基１８４Ｐｒｏも基準（ｄ）により除外
する。 〔００３４〕上述の基準の適用後に得られる置き代えす
べき好ましい残基は表１に示される。 〔００３５〕

【表１】 〔００３６〕これらの部位の単独置き代え及び／または
異なる部位での置き代えの組合せにより、立体障害の除
去（ｒｅｌｉｅｆ）を通してまたは糖環境の極性の調節
（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）によって改善された活性がも
たらされ得る。親和性の調節及び／または種々の基質に
対する触媒効率等の異なる性質をこの方法で改変し得
る。 〔００３７〕キシロースに比較してのグルコースに対す
る特異性を増加する具体的事例においては、野性型グル
コースイソメラーゼについての基質特異性がキシロース
から６−デオキシグルコース、グルコースへ行くに従っ
て減少するということを注目することが重要である。ソ
ルビトールについての阻害定数はキシリトールについて
より大である。この観察はより大きな基質もしくは阻害
剤の結合による立体障害はより低い特異性に貢献するこ
とを示唆する。Ａ．ミソウリエンシスからの酵素−ソル
ビトール−コバルト複合体の結晶構造においてソルビト
ールのＣ６に結合したヒドロキシル基の４Å以内に以下
の残基が見い出される：１６Ｔｒｐ、８８Ｍｅｔ、１３
５Ｖａｌ、９０Ｔｈｒ及び４９１で表される水分子。疎
水性側鎖１６Ｔｒｐ、８８Ｍｅｔ及び１３５Ｖａｌはヒ
ドロキシル基を溶媒和することができない。９９Ｔｈｒ
のヒドロキシル基は回転してそっぽを向いており、その
メチル基が阻害剤の方へ向いている。水分子（４９１）
はソルビトールのＯ６及びＯ４を架橋している。基質も
しくは阻害剤の不存在下で決定された酵素−コバルト複
合体の構造において、活性部位は酵素−ソルビトール−
コバルト複合体中の阻害剤のＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４及
びＯ５の位置に略対応する位置で結合したいくつかの水
分子を含有する。しかしながら、Ｏ６に対応する環境は
水分子を収容できない。このことはＣ６のヒドロキシル
基が適当に溶媒和されない別の証拠を提供する。 〔００３８〕（基準ａ−ｅの適用による）標的残基の収
集においてなされた置き代えは基質の、特にＯ６のヒド
ロキシル基の環境の極性を増大すること、及びより大な
る基質を収容する活性部位の柔軟性を増大することを意
図したものである。 〔００３９〕他の中では、以下の単一の及び組合せの点
突然変異を行ってグルコース特異性に意図した改変を起
こさせた。 ２５Ａｌａ→Ｌｙｓ：基質のＯ１、Ｏ２及びＯ３の６−
８Åの距離に正に荷電した残基の導入。界面中の水構造
の粉砕。基質のＣ１脂肪族水素を収容する疎水性ポケッ
トを形づくる２６Ｐｈｅの変位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅ
ｎｔ）。 ２４３Ｈｉｓ→Ａｓｎ：樽状部（ｂａｒｒｅｌ）の内部
におけるタンパク質−水の水素結合網状組織の改変によ
る増加した柔軟性。 ２９０Ｈｉｓ→Ａｓｎ：樽状部の内部におけるタンパク
質−水の水素網状組織における改変による増大した柔軟
性、水の置き代え（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）。 ２５３Ｈｉｓ→Ａｒｇと組み合わせた２９０Ｈｉｓ→Ａ
ｓｎ：安定性を増加し、または不可逆的不溶性化を起こ
させるグリケーション（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）（ＥＰ−
Ａ−０３５１０２９）を防止するために２５３Ｌｙｓ→
Ａｒｇの突然変異を導入する。 ８８Ｍｅｔ→Ｓｅｒ：Ｏ６結合ポケットの極性の増大、
タンパク質のたたみ込み（ｐａｃｋｉｎｇ）を局地的に
改変することによる柔軟性の増大。 ２４３Ｈｉｓ→Ａｓｎと組み合わせた８８Ｍｅｔ→Ｓｅ
ｒ：Ｏ６結合ポケットの極性の増大、タンパク質のたた
み込みを局地的に改変することによる柔軟性の増大。 ２９０Ｈｉｓ→Ａｓｎと組み合わせた８８Ｍｅｔ→Ｓｅ
ｒ：樽状部の内部におけるタンパク質−水の水素結合網
状組織における改変による柔軟性の増大、水の置代え、
Ｏ６結合ポケットの極性の増大。 〔００４０〕９０Ｔｈｒ→Ｓｅｒ：側鎖の改変された柔
軟性、タンパク質のたたみ込みの局地的改変による柔軟
性の増大、基質結合水分子（４９２）の環境の改変。 １３５Ｖａｌ→Ｇｌｎと組み合わせ９０Ｔｈｒ→Ｓｅ
ｒ：９０位側鎖の柔軟性の改変、タンパク質のたたみ込
みの局地的改変による柔軟性の増大、基質結合水分子
（４９２）の環境の改変、極性残基による疎水性環境の
置き代え、グルタミンとＣ６ヒドロキシ基の間の直接水
素結合の可能性。 １３５Ｖａｌ→Ｇｌｎ及び２１５Ａｓｎ→Ｓｅｒと組み
合わせた９０Ｔｈｒ→Ｓｅｒ：柔軟性の改変、極性残基
による疎水性環境の置き代え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎ
ｔ）、水分子除去の可能性、９０ＳｅｒとＣ６ヒドロキ
シル基の間の直接水素結合の可能性。 １３５Ｖａｌ→Ｔｈｒ：極性残基による疎水性環境の置
き代え。 １３５Ｖａｌ→Ｇｌｎ：極性残基による疎水性環境の置
き代え、グルタミンとＣ６ヒドロキシル基の間の直接水
素結合の可能性。 〔００４１〕これらの突然変異の提案は目的とする特異
性を有する新規なグルコースイソメラーゼを創出するの
に適用できる合理的なものを例示するためのものであ
る。しかしながら、標的残基を上記したアミノ酸とは異
なるアミノ酸へ同様にして改変することによって目的と
する突然変異体を得ることができることは当業者にとっ
て明らかであろう。 〔００４２〕活性部位における結合水分子の置き代え、
除去、変位（ｓｈｉｆｔｉｎｇ） ソルビトールの構造とキシリトールの構の比較から、特
定の水分子が適当なグルコースの結合を妨害し得ると考
えられる。この水の適当なアミノ酸側鎖による置き代
え、または敵当な位置でのより短い側鎖の導入による水
の位置の移動により親和性を増加し得る。 〔００４３〕グルコースに対する高められた特異性（Ｋ
_ｍ＝２５０ｍＭ、Ｖ_ｍａｘ＝４１Ｍｍｏｌｅｓ／ｍｉｎ
／ｍｇ）を有するグルコースイソメラーゼ突然変異体Ｈ
２９０Ｎが例として役立つ。突然変異体Ｈ２９０Ｎの活
性部位における結合水の除去または変位が観察された、
グルコースに対する活性の増加に相関している。他の結
合水分子の変位によっても同様な効果を得ることができ
る。基質の原子Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５またはＯ６の周囲４Å
の球内にある水分子は隣接するアミノ酸の突然変異によ
って除去するが変位させる候補者である。 〔００４４〕以下の実施例においてアクチノプラネス・
ミソウリエンシスからクローン化した遺伝子に点変異を
導入するのに組換えＤＮＡ技術を適用する。タンパク質
はＥ．コリ中で過剰発現し（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅ
ｄ）、精製し、生体外でかつ他所で記述された適用条件
（Ｖａｎ Ｔｉｌｂｕｒｇ，１９８３，題目：“Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｓｐｅｃｔ ｏｆ ｂｉｏｃａｔ
ａｌｙｓｔｓ ｉｎｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｓｔａｒｃ
ｈ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ”（工業的デンプン変換にお
ける生物触媒の工学的側面），Ｄｅｌｆｔｓｅ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ Ｐｅｒｓ）で性格付けを行う。 〔００４５〕実験 Ｄ−グルコースイソメラーゼ遺伝子のクローニング及び
発現 Ｄ−グルコースイソメラーゼ（ＧＩ）はＤ−キシロース
をＤ−キシルロースに変換する酵素であるＤ−キシロー
スイソメラーゼ（Ｄ−キシロース）ケトール−イソメラ
ーゼ（ＥＣ ５．３．１．５）について同義的に用いら
れる。巧みに工作されたＥ．コリ菌株によって生産され
るアクチノプラネス・ミソウリエンシスからのグルコー
スイソメラーゼはＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）ＧＩと命名さ
れる。ＧＩをコード化するアクチノプラネス・ミソウリ
エンシスの遺伝子を類似のＥ．コリｘｙ１Ａ遺伝子から
区別するため、前者をＧＩと称する。 〔００４６〕ＤＮＡ分子の操作方法はＭａｎｉａｔｉｓ
ら（１９８２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
ｈａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９
８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学におけ
る最近のプロトコル），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏ
ｎｓ社、ニューヨーク）記載されている。アクチノプラ
ネス・ミソウリエンシスＤＳＭ４３０４６からのグルコ
ースイソメラーゼのクローニング及びＤＮＡ配列は他所
（ＥＰ−Ａ−０３５１０２９）に記載されている。導か
れたＧＩのアミノ配列は番号を付され、図２で他のグル
コースイソメラーゼと比較されている。以下、アミノ酸
の番号付けは図２を参照する。 〔００４７〕ＥＰ−Ａ−０３５１０２９に記述されたよ
うにして野性型及び突然変異ＧＩ酵素をＥ．コリ菌株Ｋ
５１４で生産した。ＥＰ−Ａ−０３５１０２９は本願で
適用した技術の大部分を具体的に記述しており、従って
ここに参考に加入する。 〔００４８〕発現産物の酵素活性のアッセイ グルコースイソメラーゼの酵素活性を以下に示すように
してアッセイした（酵素活性１単位は１分当り１．０Ｍ
ｍｏｌの生産物−Ｄ−キシルロースまたはＤ−フラクト
ース−を生産する；従って、比活性−ｓｐａ−はＧＩ酵
素１ｍｇあたりの単位として表される）。 〔００４９〕グルコースイソメラーゼによるキシロース
の異性化によって３５℃で生産されたキシルロースの２
７８ｎｍでの吸収の増大を測定することによってＧＩ活
性を直接アッセイした。このアッセイは１０ｍＭＭｇＳ
Ｏ_４を含有する５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、
ｐＨ７．５中で０．１Ｍキシロースの存在下に行った。
アッセイにおけるグルコースイソメラーゼの最終濃度は
±０．０１ｍｇ／ｍｌであった。この濃度は、酵素アッ
セイ混合物での希釈に先立ち、１．０ｍｇ／ｍｌの酵素
溶液について２７８ｎｍで１．０８の吸光係数を用いる
吸収分光分析法によって正確に測定した。 〔００５０〕Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼとカッ
プルさせたアッセイにおいては前述の如く（Ｋｅｒｓｔ
ｅｒｓ−Ｈｉｌｄｅｒｓｏｎら，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃ
ｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９（１９８７）１４５）、３
５℃で、５０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．５、
１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４及び０．１Ｍキシロース中±２×
１０^−８ＭのＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Ｌ−
イディトール（ｉｄｉｔｏｌ）：ＮＡＤオキシドリダク
ターゼ、ＥＬ１．１．１４）及び０．１５ｍＭＮＡＤＨ
の存在下にＤ−キシルロースの酵素測定を行った。この
アッセイにおけるグルコースイソメラーゼの最終濃度は
±２．５×１０^−３ｍｇ／ｍｌであり、この濃度は前述
の如く正確に測定した。 〔００５１〕ケト糖と酸中のカルバゾールとの反応によ
る紫色の生産物の生成に基づくシステイン−カルバゾー
ル法（ＣＣＭ）（Ｄｉｓｃｈｅ及びＢｏｒｅｎｆｒｅｕ
ｎｄ，Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９２（１９５１）５
８３）を用いて、異性化反応中に生産されたＤ−フラク
トースを測定することによって、基質としてグルコース
を用いるＧＩ活性をアッセイすることができる。別法と
して、異性化反応中に生産されたＤ−フルクトースをソ
ルビトールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＨを用いて酵素
的に測定することも可能である。 〔００５２〕特異性の目安としてＶ_ｍａｘ／Ｋ_ｍ比を時
折り用いる（Ｗｅｌｌｓら、前出）。突然変異体につい
て、キシロースについての及びグルコースについてのＶ
_ｍａｘ／Ｋ_ｍ値が型通りの操作で計算された。キシロー
スパラメーターの測定は３５℃で行い、グルコースパラ
メーターは６０℃で測定する。これらの温度は実際的理
由から選ばれる。相対的特異性についての結論が測定温
度に係りなく一般的に当てはまるかどうかをみるため
に、キシロースについてのいくつかの測定は野性型及び
突然変異酵素の両方について６０℃で行った。６０℃で
の定常状能の動力学的パラメーターについて導かれた結
論は３５℃での結論と同様であることが見い出された。 〔００５３〕 〔実施例〕実施例１：改良された触媒作用を有する突然変異体 置き代えによって改良された基質結合、触媒活性または
基質特異性を生じ得る残基を選択するべく、アクチノプ
ラネス・ミソウリエンシスのグルコースイソメラーゼの
３次元構造を研究した。基質のＯ１−Ｏ６から４Å以内
に直接的または間接的（別の残基または水分子を介し
て）に存在する残基を選択し、ｐＭａ、ｐＭｃベクター
系（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１７（１９８９）４４４１）を用いる部位特異的
突然変異誘発によって改変した。このようにして得られ
た突然変異体のいくつかの酵素パラメーターを以下の表
２に示す。 〔００５４〕

【表２】 〔００５５〕精製した酵素について活性を測定した。キ
シロースについてはカップルしたソルビトールデヒドロ
ゲナーゼアッセイを用い、グルコースについてはシステ
インカルバゾール法もしくは不連続（ｄｉｓｃｏｎｔｉ
ｎｕｏｕｓ）ソルビトールデヒドロゲナーゼ法を用い
た。 〔００５６〕実施例２：改良されたグルコースに対する
親和性を有するグルコースイソメラーゼ 表３は野性型酵素と比較した、種々の突然変異体からの
測定されたＫ_ｍ値を要約する。これらの突然変異体がす
べてグルコースに対してより低いＫ_ｍを有することが分
る。このことは基質グルコースの結合が高められている
ことを意味する。さらに突然変異体のいくつかについて
はキシロースについてのＫ_ｍが改良されず悪くなってい
る（表２に例示）。かくの如く、突然変異体Ｍ８８Ｓ、
Ｔ９０Ｓ、Ｔ９０ＳＶ１３５Ｑ、Ｖ１３５Ｑ、Ｈ２９０
Ｎ、Ｋ２９４Ｑ、Ｈ２４３Ｎは野性型酵素に比べ優れた
Ｋ_ｍキシロース／Ｋ_ｍグルコース比を獲得した。 〔００５７〕

【表３】 〔００５８〕実施例３：グルコースに対し高められた触
媒活性を有するグルコースイソメラーゼ グルコースに対し高められた触媒活性を有するグルコー
スイソメラーゼ突然変異体はＥ１８６Ｄ、Ｌ２５８Ｋ、
Ｈ２９０Ｎ及びＨ２９０Ｎとの組合せ突然変異である。
Ｌ２５８Ｋは一般的方法において記述された基準を用い
て選択されたものではない。というのは２５８位のロイ
シンは基質または阻害剤から約１０Å離れているからで
ある。 〔００５９〕表４に野性型Ｖ_ｍａｘと比較したＶ_ｍａｘ
を示す。８，９％から４３％への増加が示されている。
これにより好ましい基質グルコースのより早い異性化が
もたらされるであろう。 〔００６０〕

【表４】 〔００６１〕突然変異体Ｈ２９０Ｎは野性型酵素よりか
なり優れた４１．８０のグルコースに対するＶ_ｍａｘを
示す。さらにＶ_ｍａｘキシロースは改善されていない。
従ってＨ２９０ＮのＶ_ｍａｘグルコース／Ｖ_ｍａｘキシ
ロース比は改善され、この変異体を「真の」グルコース
イソメラーゼに近づけている。 〔００６２〕実施例４：Ｈ２９０Ｎグルコースイソメラ
ーゼの構造 突然変異体Ｈ２９０Ｎの結晶構造において、Ａｓｎ側鎖
のアミド基をｗ．ｔ．分子（図３）のイミダゾール基の
上に重ね合わせ得ることが観察される。結果として、２
９０Ａｓｎでのアミドは２４５Ａｓｐへの水素結合を維
持する。さらに、２９０ＡｓｎのＯδ１原子は１２Ｓｅ
ｒのヒドロキシルに水素結合し得る。 〔００６３〕ｗ．ｔ．構造中の２９０Ｈｉｓのｎｅ２に
水素結合した５２Ｔｈｒのヒドロキシル基はもはや２９
０Ａｓｎに水素結合できない。この突然変異体では５２
Ｔｈｒのヒドロキシル基はそれが水分子と結合するよう
回転している（Ｘ′ねじれ（ｔｏｒｓｉｏｎ））（野性
型Ｘ′＝７１゜、変異体Ｘ′＝−１７２．５゜）。突然
変異体構造中に存在するこの水分子は野性型では８８Ｍ
ｅｔ ｓδ原子（距離＝０．４５Å）として位置してい
る。５２Ｔｈｒへの水素結合を形成する、この位置への
水分子の導入は、野性型に比し変異体中の８８Ｍｅｔの
側鎖の再配向を強いる。加えて５２Ｔｈｒ側鎖は変異体
中では５３Ｐｈｅの主鎖水素（ｄ＝２．２３Å）に水素
結合している。 〔００６４〕Ｈ２９０Ｎ中の８８Ｍｅｔ側鎖の再配向は
２４３Ｈｉｓの移動を必要とする。加えて野性型構造中
では１２Ｓｅｒを２４３Ｈｉｓに架橋している水分子
（４９０）は５２Ｔｈｒのメチル基と８８Ｍｅｔの新た
な配向に基づく立体障害により消散する。２４３Ｈｉｓ
は別のＸ′角度を採用し（野性型（ｗ．ｔ．）ではＸ′
＝−１６９゜及び変異体ではＸ′＝−７７゜）、２１５
Ａｓｎとの水素結合を廃止させる。２４３Ｈｉｓのイミ
ダゾールによって残されたスペースは水分子（６１５）
で満たされ、これは２１５Ａｓｎ（示されていない）の
アミドに水素結合する。さらに、この水分子は新たな水
分子（８７２）に水素結合し、後者は２４４Ｉｌｅの主
鎖水素原子に水素結合する。 〔００６５〕Ｃ６ヒドロキシル環境における側鎖の柔軟
性における改変の別の証拠は野性型構造に比べて２倍高
い、残基５２Ｔｈｒ、８８Ｍｅｔ及び２４３Ｈｉｓにつ
いての温度因子によって与えられる。 〔００６６〕Ｈ２９０Ｎ突然変異によって引き起こされ
た複合体の再配列の結果、３つの水分子がソルビトール
のＣ６ヒドロキシル基を溶媒和している。 〔００６７〕このことは活性部位における結合水の置き
代え、移動または変位が酵素活性における目的とする改
変をもたらすことができることを例示している。 〔００６８〕実施例５：改良された基質結合性を有する
グルコースイソメラーゼ 表５に改良されたキシロース結合性を有するいくつかの
突然変異体を示す。Ａ２５Ｋ及びＥ１８６Ｄはキシロー
スとグルコースの双方に対して減少したＫ_ｍを有する。
Ｅ１８６Ｑはフラクトースに対しても減少したＫ_ｍを有
する。高い基質親和性を有する酵素は低い基質濃度の条
件下で好ましい。 〔００６９〕

【表５】 〔００７０〕Ｅ１８６Ｑ及びＡ２５Ｋのみがテストされ
た両基質に対し改良された親和性を有することが注目さ
れる。 〔００７１〕実施例６：グルコースに対し改善された特
異性を有する突然変異体 比特異性（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔ
ｙ）はグルコースに対するＶ_ｍａｘ／Ｋ_ｍ比によって除
したキシロースに対するＶ_ｍａｘ／Ｋ_ｍ比として定義さ
れる。従って、この数字が野性型に対しての値より小さ
ければグルコースに対する比特異性が増加している。 〔００７２〕グルコースに対する比特異性の増加した突
然変異グルコースイソメラーゼを表６に示す。突然変異
体Ｖ１３５Ｑ、Ｔ９０ＳＶ１３５Ｑ及びＴ９０ＳＶ１３
５Ｑ２１５Ｓはキシロースに対し大巾に減少した活性を
有している。グルコースに対する活性は絶対的意味では
減少しているが、キシロースに対するグルコースのＶ
_ｍａｘ／Ｋ_ｍの比は相当に改善されている。従って、こ
れらの変異体はそれらの特異性を変化させて実質上キシ
ロースイソメラーゼ活性を有さない本当のグルコースイ
ソメラーゼになっている。 〔００７３〕突然変異Ｔ９０Ｓ、Ｖ１３５Ｑ及びＮ２１
５Ｓの三重突然変異体への組合せはこれらの突然変異が
動力学パラメーターに関し相加的であることを示してい
る（表６）。 〔００７４〕

【表６】 〔００７５〕実施例７：Ｍ８８ＳＨ２４３Ｎ突然変異体
で生じた構造的変化 基質特異性はより大なる側鎖の柔軟性を示すアミノ酸を
与えるアミノ酸置き代えによっても改変することができ
る。 〔００７６〕突然変異体Ｍ８８ＳＨ２４３Ｎの結晶構造
において、基質のＣ６ヒドロキシ環境の側鎖における柔
軟性の増加を反映する多重コンホーメーション（ｍｕｌ
ｔｉｐｌｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を２４３Ａｓ
ｎ及び５２Ｔｈｒが採用することが観察される。 〔００７７〕残基８８Ｓｅｒ、５２Ｔｈｒ、１３５Ｖａ
ｌ及び１７７Ａｒｇを含有する、隣接β−樽状鎖（ｂｅ
ｔａ ｂａｒｒｅｌ ｓｔｒａｎｄｓ）のＣα位が０．
３−０．５Å変位して、樽状部の内部をわずかに大きく
していることも観察される。 〔００７８〕８８Ｍｅｔ→８８Ｓｅｒの突然変異によっ
て作出される空間は別の水分子で満たされる。観察され
た代わるがわるの（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）側鎖の位置選
定（ｌｏｃａｔｉｏｎ）及び樽状部のわずかな移動は別
の水分子の導入及び基質のＣ６ヒドロキシル方向にある
水分子の移動を可能にする。 〔００７９〕実施例８：Ｍｎ^２＋の存在下に改良された
性質を有する突然変異体 Ｍｇ^２＋に加え、Ｍｎ^２＋も異性化における２価カチオ
ンとして用い得る。Ｍｎ^２＋は工業的異性化方法では通
常使用しないが、生産物から金属イオンを除去し得る場
合のまたは金属イオンが生産物の品質に関与しない場合
の適用についてその使用を考えることができる。 〔００８０〕突然変異体Ｅ１８６ＱはＭｎ^２＋の存在下
でグルコースに対する改良された触媒活性を示す（表７
参照）。 〔００８１〕

【表７】 〔００８２〕用いられた方法は実施例１におけると同様
であった。Ｖ_ｍａｘグルコースにおける改良は野性型酵
素に比べ３〜４倍であった。Ｋ_ｍグルコースにおける改
良は４倍であった。１８６ＥはＵＰ金属位の付近にある
ので（図１参照）、１８６ＱはＭｇ^２＋半径（ｒａｄｉ
ｕｓ）とよりより大なるＭｎ^２＋半径とよりよい協調関
係にあると予想される。 〔００８３〕実施例９：突然変異体Ｋ２５３ＲＨ２９０
Ｎの適用テスト 突然変異体Ｈ２９０Ｎは表４において見られる如くグル
コースに対して増加した活性を示す。表６はこの変異体
においてはグルコースに対する特異性も増加しているこ
とを示す。この変異体をＥＰ−Ａ−３５１０２９（この
出願の実施例７）に記述されたようにして固定化した。
野性型の及びこの変異体のグルコースイソメラーゼの適
用テストを同じ出願（実施例８）に記述されたようにし
て行った。安定性を一次崩壊定数（Ｋ_ｄ、崩壊定数が低
いほど酵素はより安定である）によって示す。表８は野
性型の及び変異体のグルコースイソメラーゼについての
Ｋ_ｄ値を与える。 〔００８４〕

【表８】 〔００８５〕表８に示される如く、Ｈ２９ＣＮは野性型
グルコースイソメラーゼに比し不安定になっている。Ｋ
２５３Ｒは３より大なる比率ほど野性型グルコースイソ
メラーゼを安定化することが見い出された。Ｈ２９０Ｎ
と安定化変異Ｋ２５３Ｒの組合せはこれらの性質が相加
的であることを示している。さらに、Ｋ２５３ＲＨ２９
０Ｎのグルコースに対する活性が安定化変異によって負
に影響されないどころか、この二重変異体がこの基質に
対して変異体Ｈ２９０Ｎよりむしろ高い活性を示すこと
が表４より分る。特異性が関与する限りにおいては、表
６からＫ２５３Ｒ突然変異がＨ２９０Ｎ突然変異の特異
性に実質上影響を与えないことが分る。 〔００８６〕かくして活性突然変異体は野性型酵素を安
定化することが示された突然変異を導入することによっ
て安定化できると結論し得る。 〔００８７〕上述の実施例は本発明の概念を実証するこ
とを意図するものであり、その範囲を限定することを意
図するものでないことが理解されるべきである。この観
点において、改変された特性、例えば熱安定性、変位し
た最適ｐＨもしくは金属結合性をもたらす他の突然変異
と組み合わされた上述の突然変異の組合せは本発明の範
囲内であることが明らかである。 〔００８８〕 〔発明の効果〕本発明によって、置き代えによって与え
たれた酵素の改変された基質特異性をもたらすアミノ酸
を選択する方法が提供される。また本発明によって改変
された基質特異性を有するグルコースイソメラーゼが提
供される。

【図面の簡単な説明】

〔図１〕図１はグルコースイソメラーゼ−キシリトール
複合体の三次元構造から導かれた、アクチノプラネス・
ミソウリエンシスからのグルコースイソメラーゼの活性
部位の図式的表示を表す。阻害剤が図面の中央に十分に
詳しく示されている。アミノ酸残基については水素結合
に関与する原子のみが描かれている。残基名は実線で描
かれた箱に記載され、溶媒分子は点線で描かれた箱に記
載されている。金属結合部位は３９５及び５８０と番号
付けされた卵形のものによって表される。点線は静電的
相互作用を示す：細い点線は水素結合を表し、太い点線
は金属の提案された連結を表す。厳格に保存されている
（Ｌｏｎｓｏｒｎｅｄ）残基は星印（ａｓｔｏｒｉｘ）
で印されている。保存されていない残基については天然
で見い出される置き代えが示されている。 〔図２〕図２Ａ及び図２Ｂは異なる微生物から得られた
グルコースイソメラーゼのアミノ酸配列のアラインメン
ト（一列整列）を示す。アクチノプラネス・ミソウリエ
ンシスのグルコースイソメラーゼの完全配列が与えられ
ている。アンプラリーラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌ
ａ）のグルコースイソメラーゼのアミノ配列は発表され
た配列（ｓａａｒｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６
９（１９８７）６１２）と１つの残基が異なっている：
発表された配列のプロリン１７７はアルギニンであるこ
とが判明した。ストレプトマイセス・サーモバルガリス
配列はアミノ酸３４６までしか確立されていない。未決
定の残基はブラシのままあけてある。点は他の配列のい
ずれかと比較してこの位置のアミノ酸の欠如を示す。異
なる種は以下の記号で示される。 二次構造の割当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）はアクチノ
プラネス・ミソウリエンシスの構造において行った。樽
壮部におけるヘリックスは実線で囲まれている。陰を付
した箱はβ−鎖を示す。 〔図３〕図３はＨ２９０Ｎ突然変異体（肉太）と野性型
−ソルビトール−Ｍｇ構造の比較を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年２月２２日

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はグルコースイソメラーゼ・キシリトール
複合体の三次元構造から導かれた、アクチノプラネス・
ミソウリエンシスからのグルコースイソメラーゼの活性
部位の図式的表示を表す。阻害剤が図面の中央に十分に
詳しく示されている。アミノ酸残基については水素結合
に関与する原子のみが描かれている。残基名は実線で描
かれた箱に記載され、溶媒分子は点線で描かれた箱に記
載されている。金属結合部位は３９５及び５８０と番号
付けされた卵形のものによって表される。点線は静電的
相互作用を示す：細い点線は水素結合を表し、太い点線
は金属の提案された連結を表す。厳格に保存されている
（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）残基は星印（ａｓｔｅｒｉｘ）
で印されている。保存されていない残基については天然
で見い出される置き代えが示されている。

【図２】図２は異なる微生物から得られたグルコースイ
ソメラーゼのアミノ酸配列のアラインメント（一列整
列）を示す。アクチノプラネス・ミソウリエンシスのグ
ルコースイソメラーゼの完全配列が与えられている。ア
ンプラリーラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ）のグルコ
ースイソメラーゼのアミノ配列は発表された配列（Ｓａ
ａｒｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（１９８
７）６１２）と１つの残基が異なっている：発表された
配列のプロリン１７７はアルギニンであることが判明し
た。ストレプトマイセス・サーモバルガリス配列はアミ
ノ酸３４６までしか確立されていない。未決定の残基は
ブランクのままあけてある。点は他の配列のいずれかと
比較してこの位置のアミノ酸の欠如を示す。異なる種は
以下の記号で示される： Ａｍｉ． ：Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕ
ｒｉｅｎｓｉｓ ＤＳＭ４６４３ Ａｍｐ． ：Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ ｓｐｅｃｉ
ｅｓ ＡＴＣＣ ３１３５１ Ｓｖｉ． ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃ
ｅｏｒｕｂｅｒ ＬＭＧ７１８３ Ｓｍｕ． ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎ
ｕｓ Ｓｔｈ． ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍ
ｏｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＳＭ ４０４４４ Ａｒｔ． ： Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉ
ｅｓ Ｂｓｕ． ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｅｃｏ． ： Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｌｘｙ． ： Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌ
ｏｓｕｓ 二次構造の割当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）はアクチノ
プラネス・ミソウリエンシスの構造において行った。樽
状部におけるヘリックスは実線で囲まれている。陰を付
した箱はβ−鎖を示す。

【図３】図３は異なる微生物から得られたグルコースイ
ソメラーゼのアミノ酸配列のアラインメント（一列整
列）を示す。アクチノプラネス・ミソウリエンシスのグ
ルコースイソメラーゼの完全配列が与えられている。ア
ンプラリーラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ）のグルコ
ースイソメラーゼのアミノ配列は発表された配列（Ｓａ
ａｒｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（１９８
７）６１２）と１つの残基が異なっている：発表された
配列のプロリン１７７はアルギニンであることが判明し
た。ストレプトマイセス・サーモバルガリス配列はアミ
ノ酸３４６までしか確立されていない。未決定の残基は
ブランクのままあけてある。点は他の配列のいずれかと
比較してこの位置のアミノ酸の欠如を示す。異なる種は
以下の記号で示される： Ａｍｉ． ：Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕ
ｒｉｅｎｓｉｓ ＤＳＭ４６４３ Ａｍｐ． ：Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ ｓｐｅｃｉ
ｅｓ ＡＴＣＣ ３１３５１ Ｓｖｉ． ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃ
ｅｏｒｕｂｅｒ ＬＭＧ７１８３ Ｓｍｕ． ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕ
ｓ Ｓｔｈ． ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏ
ｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＳＭ ４０４４４ Ａｒｔ． ：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅ
ｓ Ｂｓｕ． ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｅｃｏ． ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｌｘｙ． ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌｏｓ
ｕｓ 二次構造の割当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）はアクチノ
プラネス・ミソウリエンシスの構造において行った。樽
状部におけるヘリックスは実線で囲まれている。陰を付
した箱はβ−鎖を示す。

【図４】図４はＨ２９０Ｎ突然変異体（肉太）と野性型
−ソルビトール−Ｍｇ構造の比較を示す。

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【図１】

【図２】

【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/92 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 アン マリー ヴィルジニーエ ルネ ラ ンベール ベルギー国 3030 エーヴェルレエ ビュ ス 43 スパーランドレーフ 30 (72)発明者 イニャース ラステル ベルギー国 3081 ペルク リュートガル ディス ストラート 24 (72)発明者 ウィルヘルムス ヨハネス クワックス オランダ国 2253ヴェーベー フォールシ ョッテン ヤン ファン ガレンラーン ８ (72)発明者 ヤン メツク ファン デル ラーン オランダ国 9718ペーエー グローニンイ ェンコルテ ストラート 13

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 野性型グルコースイソメラーゼ酵素と少
   なくとも１つのアミ酸において異なるアミノ酸配列を有
   するグルコースイソメラーゼ酵素をコードする遺伝子の
   発現によって得られ、改変された基質特異性を示す突然
   変異グルコースイソメラーゼ酵素。
2. 【請求項２】 グルコースに対するＶ_ｍａｘを天然性グ
   ルコースイソメラーゼより高い２０℃及び８５℃の間の
   温度で有する請求項１の突然変異グルコースイソメラー
   ゼ酵素。
3. 【請求項３】 グルコースに対するＫ_ｍを天然性グルコ
   ースイソメラーゼより低い２０℃及び８５℃の間の温度
   で有することにおいて、同じ本質的生物活性を有する天
   然性グルコースイソメラーゼから区別される請求項１の
   突然変異グルコースイソメラーゼ酵素。
4. 【請求項４】 キシロースに対するＶ_ｍａｘを天然性グ
   ルコースイソメラーゼより高い２０℃及び８５℃の間の
   温度で有することにおいて、同じ本質的生物活性を有す
   る天然性グルコースイソメラーゼから区別される請求項
   １の突然変異グルコースイソメラーゼ酵素。
5. 【請求項５】 キシロースに対するＫ_ｍを天然性グルコ
   ースイソメラーゼより低い２０℃及び８５℃の間の温度
   で有することにおいて、同じ本質的生物活性を有する天
   然性グルコースイソメラーゼから区別される請求項１の
   突然変異グルコースイソメラーゼ酵素。
6. 【請求項６】 天然性グルコースイソメラーゼより優れ
   たＶ_ｍａｘグルコース／Ｖ_ｍａｘキシロース比を有する
   ことにおいて、同じ本質的生物活性を有する天然性グル
   コースイソメラーゼから区別される請求項１の突然変異
   グルコースイソメラーゼ酵素。
7. 【請求項７】 天然性グルコースイソメラーゼより高い
   Ｋ_ｍキシロース／Ｋ_ｍグルコース比を有することにおい
   て、同じ本質的生物活性を有する天然性グルコースイソ
   メラーゼから区別される請求項１の突然変異グルコース
   イソメラーゼ酵素。
8. 【請求項８】 放線菌目の微生物から得られる請求項１
   −７のいずれか１つのグルコースイソメラーゼ酵素。
9. 【請求項９】 アクチノプナネス・ミソウリエンシスか
   ら導かれる請求項１−８のいずれか１つの突然変異グル
   コースイソメラーゼ。
10. 【請求項１０】 該グルコースイソメラーゼのアミノ酸
    配列が野性型アクチノプラネス・ミソウリエンシス株か
    ら導かれるグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列と少
    なくとも６５％の相同を示す請求項１−７のいずれか１
    つの突然変異グルコースイソメラーゼ酵素。
11. 【請求項１１】 糖基質の酸素原子の周囲４オングスト
    ロームの球内に残基の置換を有する請求項１−７のいず
    れかの突然変異グルコースイソメラーゼ。
12. 【請求項１２】 以下のアミノ酸の少なくとも１つが置
    換され、かつ改変された基質特異性を有する請求項１−
    ７のいずれかの突然変異グルコースイソメラーゼ：
13. 【請求項１３】 以下のアミノ酸置換の少なくとも１つ
    を含有する請求項１２の突然変異体：Ａ２５Ｋ，Ｍ８８
    Ｓ，Ｔ９０Ｓ，Ｖ１３５Ｑ，Ｖ１３５Ｔ，Ｅ１８６Ｄ，
    Ｅ１８６Ｑ，Ｎ２１５Ｓ，Ｈ２４３Ｎ，Ｋ２５３Ｒ，Ｌ
    ２５８Ｋ，Ｈ２９０Ｎ，Ｋ２９４Ｑ，Ｋ２９４Ｒ。
14. 【請求項１４】 糖基質の酸素原子の周囲４オングスト
    ロームの球内に水分子を移動させることによって得られ
    る請求項１−７のいずれかの突然変異体。
15. 【請求項１５】 以下の基準よりなる方法に従って選択
    されるアミノ酸を取り替えることによって改変された基
    質特異性を有する酵素を得る方法： ａ）活性部位中の基質のまたは基質アナログ／阻害剤結
    合の原子の周囲４Åの球内に少なくとも１つの原子を有
    する、すべての残基及び結晶学的に割り当てられた水分
    子を選択すること； ｂ）基準ａ）に従う選択によって得られる残基及び水と
    ファンデルワールス接触しているすべての残基を選択す
    ること； ｃ）該記録された残基及び水分子リストから触媒作用、
    コファクター結合（例えば金属イオン及びヌクレオチ
    ド）、及びオリゴマー酵素の場合の本質的なサブユニッ
    ト間相互作用に関与するものを除外すること； ｄ）これらの残基の構造的役割に干渉する残基及び水分
    子を除外すること、であって、標的残基の保存された性
    質の模型構築及び分析を本質的な構造的役割を同定する
    のに用いることができる方法。
16. 【請求項１６】 以下の相互作用及び性質の１以上が改
    変された請求項１５の改変された基質特異性を有する酵
    素を得る方法： −ｅ１）残基サイズの改変による立体障害； −ｅ２）基質周囲の疎水性／極性； −ｅ３）基質内の基への水素の結合を介して溶媒和する
    側鎖を提供することによって、または基質の周囲内の水
    分布を改変する置き代えによって基質周囲を溶媒和する
    こと； −ｅ４）水素結合網状組織を粉砕し、基質の周囲におけ
    る局地的詰込み密度を減少し、または空隙を導入する置
    き代えによる、個々の残基、断片またはタンパク質全体
    構造の柔軟性。
17. 【請求項１７】 請求項１−１３のいずれか１つの突然
    変異グルコースイソメラーゼを得る方法であって、 ａ）グルコースイソメラーゼをコード化するＤＮＡ配列
    を得、 ｂ）この配列を選択したヌクレオチド位置で突然変異さ
    せ、 ｃ）突然変異した配列を発現ベクター中にＤＮＡ配列が
    発現される方法でクローン化し、 ｄ）該ベクターで宿主生物または菌体を形質転換し、 ｅ）該宿主生物を培養し、 ｆ）グルコースイソメラーゼを単離すること よりなる方法。
18. 【請求項１８】 先行する請求項のいずれか１つの突然
    変異グルコースイソメラーゼの糖分子の変換における使
    用。