PT96415A - Processo para a preparacao de novas glicose isomerases possuindo uma especificidade de substrato alterada - Google Patents

Description

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Descrição referente à patente' de invenção de GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Watér-ingsweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA DELFT, Holanda e de PLANT GENETIC SYSTEMS N.V., belga, industrial e comercial, com sede em Kolonél Bourgstraat 106, bus 6, 1040 Bruxelas, Bélgica, (inventores : Anne--Marie Virginie Reneé Lambéir e1 Ignacé Lasters, residentes na Bélgica e Wilhelmus Johan-nes Quax e Jan Métske Van Der Laan residentes na Holanda), para, "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVAS GLICOSES ISO-MERASES POSSUINDO UMA ESPECIFICIDADE DE SUBSTRATO ALTE-RADA".

DESCRIÇÃO

ÂMBITO TÉCNICO A presente invenção refére-se á aplicação da tecnologia de proteínas para melhorar as propriedades das en zimas. Especificamente, a presente invenção refere-se a um processo para a selecção de aminoácidos que após substituição dão 1

origem a uma especificidade de substrato alterada. 0 processo é aplicado a glicose isomerases. Em outro aspecto a invenção proporciona glicose isomérasés com uma éspécificidade de substrato alterada. Estas novas glicoses isomerases podem ser utilizadas com vantagem em processos industriais, por exemplo na produção de xaropes de milho com alto teor de frutose (HFCS).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As glicoses isomerases catalisam a isoméri-zação reversível dé glicose para frutose’. A frutose é hoje em dia vulgarmente utilizada como substituto do açúcar devido ao seu maior poder edulcorante em relação por exemplo à sacarose e a glicose. São conhecidos muitos microorganismos que produzem a glicose' isomerase, ver por exemplo os artigos dé revisão dé Wen-Pin Chén ém Procéss Biochémistry, 15 Junho/Julho (1980) 30-41 e Agosto/Setémbro (1980) 36-41, em que é apresentado um grande número dé microorganismos, qué são susceptívéis de produzir a glicose isomerase.

Podem sér utilizados vários microrganismos para a produção industrial de glicose isomerases, e entre estes são bem conhecidos os Stréptomyces Ampullariella e Actinoplanes. A referência de Wén-Pin Chen déscréve as condições de cultura para os microrganismos é os processos de recuperação e purificação para as glicose isomérasés obtidas.

Geralmente as glicose' isomerases de ocorrên cia natural também revelam uma elevada afinidade para açucares diferentes da glicose. Néste aspecto, a D-xilose, D-ribosé, L--arabinose, D-alose é 6-desoxiglicose revelaram sér substratos desta enzima. Os valores de da D-xilosé e D-ribose, revelaram variar de microrganismo para microrganismo é são referidos como estando na gama de 0,086-0,920, 0,005-0,093 e 0,35-0,65 M, respectivaménte. 2 t

Os valores de Km para a xilosé são signifi-cativaménte' inferiores aos da glicose, o que implica que o nome correcto para a enzima é‘ de facto xilose1 isomérase'. Além disso, o valor de Vmax das glicose isomérasés vulgarménté utilizadas é superior na xilosé do qué na glicose1, o que1 também sugéré que' a xilose isomerase é um nome adequado.

Dado qué a glicose' isomérase' é activa ém diferentes substratos pode' sér vantajoso altérar a especificidade dé substrato dépéndéndo do produto da réacção préténdido, o processo específico ém qué é utilizada ou a vontade' dé évitar produtos indéséjávéis.

Para a aplicação da glicose' isomérase1 na produção de HFCS, um valor mais elevado dé Vmax é um valor inferior dé Km seriam bastante' úteis, dado qué o témpo dé reacção e o custo da énzima seriam réduzidos.

Outra aplicação da glicose' isomérase' réside na conversão dé xilosé para étanol (Jéffriés, T.W., Trénds Bio-téchnol. 3 (1985) 208). Uma maior actividade (Vmáx) na xilosé e/ou uma me'lhor actividade' para a xilosé sériam propriedades úteis para ésta aplicação. A capacidade' dé digéstão é o gosto das re'a£ çõés para animais monográsticos podém sér melhorados sé a glicose for convertida enzimaticaménte' ém frutosé. Na prática a aplicação dé glicose' isomérase' é prejudicada péla actividade' da isomérização da xilosé, o qué provoca uma formação indéséjávél de xilosé. Uma glicose' isomérase’ com ou sém éspécificidadé reduzida (Vmáx ou Km) para a xilosé séria preferida para a aplica ção no pré-trataménto dé raçõe's.

Assim, existe' claraménte’ uma nécéssidade' para altérar a éspécificidadé dé substrato dé glicose isoméra-ses o qué alargaria ao mesmo témpo o campo dé aplicação désta enzima. 3 i •t

Foi já descrita a réconcépção recente' da ac tividade' especifica das enzimas com o auxilio de1 técnicas dé engenharia de1 protéinas. Wells e1 col. (Proc. Natl. Acad. Sei1, USA 84 (1987) 5167) mostra um exemplo para a subtilisina. As protéases dé sérina do Baclllus lichéniformis e amylolique'-facléns diférém dé 31% (86 résiduos dé aminoácidos) na sequência dé protéinas é dé um factor dé 60 na éficiência catalítica ém cértos substratos. Substituindo 3 dos 86 aminoácidos diférén tés da séquência dé amyloliquéfacléns pelos résiduos dé B. lichéniformis correspondentes a ac tividade' catalítica da énzima mutante’ foi aumentada dé cerca dé 60 vézés.

Noutro documénto é descrita a forma como uma lactacto désidrogénasé foi alterada para uma malato désidro génase' por mutação de glutamina 102 ém arginina 102 (Wilks e col., Science' 242 (1988) 1541).

Em ambos os casos ém cima référidos, sérina protéasé é lactato désidrogénasé, a proposta dé modificação foi baseada na comparação da molécula a modificar com as énzimas dé ocorrência natural, que’ já apresentavam a éspécificidadé dé substrato préténdida. Da mésma forma a éspécificidadé do cito- croma p450^5 foi alterada para a éspécificidadé do citrocomo p450 substituindo Le'u209 por Phe'209 (Lindbérg e1 Négishi, Na-coh turé 339 (1989) 632).

Para a glicose' isomérase' não é conhécida nenhuma énzima dé ocorrência natural, que’ révéle1 uma mélhor és-pécifidade' para a glicose' do que’ para a xilosé. 0 procésso acima mencionado, baseado na comparação dé locais activos dé énzimas homologas possuindo uma diferente' éspécificidadé dé substrato, não podé sér assim aplicado à glicose1 isomérasé. 0 documénto ¥0 89/01520 (Cétus) reféré um cérto núméro dé mutéínas da xilosé isomérasé qué podém sér obti das dé Stréptomycés rublglnosus e' qué podém tér uma maior ésta-bilidadé. A éscolha dos locais possíveis qué podém sofrer mutação é baséada ém critérios qué diférém dos utilizados na présen - 4 -

té invenção. São referidas mais dé 300 mutantes mas não são apresentados dados qué refiram as caractéristicas é as alterações nelas introduzidas das moléculas dé énzimas mutantes.

RESUMO DA INVENÇÃO A présénté invéção référé-sé a um procésso para a selécção de' aminoácidos qué por substituição conduzem a uma espécificidadé de substrato alterada de uma dada énzima. Esté processo, qué é' dé aplicação géral, ê utilizado para alterar a espécificidadé de substrato isomérasé.

Assim, a invenção também proporciona glicose isomerasés com espécificidadé dé substrato alterada é' e'xpre:s sa ém térmos dé uma capacidade' dé substrato alterada e'/ou uma actividade catalitica alterada. Espécificaménté, as glicose iso merases mutantes são proporcionadas com uma altéração absoluta é relativa na capacidade’ dé ligação a substratos é uma actividade catalitica na glicose’ é na xilosé como substratos.

Além disso, são proporcionadas glicose' iso-merases mutantes que revélam qué parâmétros, por éxémplo, maior estabilidade' (éxpressa ém termos da constante' dé decaimento) é espécificidadé dé substrato altérada podem sér combinadas numa única molécula por adição das mutaçõés réspéctivas qué têm esses efeitos.

As glicose1 isomerasés mutantes são obtidas por éxpréssão dé um géné qué codifica a référida énzima dé glicose1 isomérasé com uma sequência dé aminoácidos qué diféré dé pêlos ménos um aminoácido da énzima dé glicosé isomérasé dé tipo natural.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra uma répréséntação ésqué-mática do local activo da glicosé isomérasé obtida de Actino- 5

planes missourlénsls, derivada da estrutura tridimensional do complexo dé glicose isomérasé-xilitoi. 0 inibidor é1 representado em detalhe completo no céntro da figura. Para os resíduos de' aminoácidos apenas são desenhados os átomos que' estão envolvidos na ligação de hidrogénio. Os nomes dos resíduos e!stão nas caixas desenhadas com linhas a cheio, as moléculas de solventes em caixas desenhadas a linhas a tracejado. Os locais de' ligação de metal são representadas por ovais numéradas de1 395 e1 580. As linhas a tracejado indicam intéracçõés éléctrôstáticas : as linhas a trace'jado fino representam ligações dé hidrogénio é a tracejado grosso répréséntam a ligação proposta dos metais.

Os resíduos éstritaménte conservados são marcados com um asterisco. Para os résíduos não consérvados são indicadas as substituições encontradas na natureza. A Figura 2 mostra o alinhamento das sequências dé aminoácidos de glicose' isomérasés obtidas dé diféréntés microrganismos. A sequência compléta dé Actinoplanés mlssouri1-énsls da glicose' isomérasé é também répréséntada. A séquê'ncia de aminoácidos dé glicose' isomérasés dé Ampul 1 ariél 1 a diféré das sequências publicadas (Saari, J. Bactériol., 169, (1987) 612) por um résíduo : Prolina 177 na séquencia publicada vérifi cou-sé sér Arginina. A sequência dé Stréptomycés thérmovulgaris foi apénas éstabélécida até1 ao aminoácido 346. Os résíduos não déterminados são déixados ém branco. Um ponto indica a ausência de um résíduo dé aminoácido néssa posição comparado com qualquer uma das outras sequências. As diféréntés éspéciés são indicadas pelos símbolos séguintés:

Ami. Amp. Svi. Smu. Sth. Art. : Actinoplanés missouriénsis DSM 4643 : Ampullariélla spécies ATCC 31351 : Stréptomycés vi-olacéorubér LMG 7183 ; Stréptomycés murinus : Stréptomycés thermovulgaris DSM 40444 : Arthrobactér spéciés 6

Bsu. : Bacillus subtilis Eco. : Eschérichia coli Lxy. : Lactobacillus xylosus A atribuição da estrutura secundária foi feita na estrutura de Actinoplanés missouriénsis. As espirais na caixa são envolvidas por linhas a cheio. As· caixas a sombreado indicam espirais-^ . A figura 3 mostra uma comparação da mutante' H290N (a cheio forte) com a estrutura de sorbitol-Mg de1 tipo na tural.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENgAO A presente invenção refere um processo para sélêccionar aminoácidos, numa enzima, que' após substituição dão origém a uma especificidade de! substrato alterada. Para se obter essa enzima mutante' a sequência de ADN que' codifica e‘sta én zirna é alterada dê forma a quê a enzima codificada tênha uma ou mais substituições séléccionadas de' aminoácidos. 0 ADN alterado ê expresso num sistema dê hospêdêiro/vêctor déséjado.

Para sêlêccionar as mutações (pontos) adequadas foi uma técnica racional, baseando-se na bem coordénada aplicação de' cristalografia dê proteínas, modulação molécular é métodos de computação, ênzimologia é cinética, técnicas de biologia molécular é da química das proteínas. As éstratégias para a identificação dos locais alvo dos aminoácidos são inovadores no sentido de' sér réconhécido que' as mutações pontuais raraménté causam péturb.açõés locais, mas aféctam várias proprié dades diféréntés da éstrutura das proteínas dê uma véz, causando uma alteração ém diféréntés propriédadés. Assim, émbora as estratégias descritas utilizém rélaçõés bém éstabélécidas de' eb trutura-função, elas também proporcionam uma maneira racional de' evitar ou corrigir altéraçõés não desejadas da cinética é . das propriedades estruturais. 7

Alteração da especificidade1 dé substrato por substituição dos aminoácldos adequados

Para modular a ligação de' substrato ao local activo dé uma énzima, podem sér aplicadas as séguintés regras gérais ém ordem sequencial, désdé que' existam dados dispo-nivéis reféréntés à estrutura Tri-Dimensional (3D) para os complexos dé énzima-substrato ou énzima-substrato-análogo/inibi-dor: • a) séléccionar todos os résíduos é moléculas de água cristalograficaménte' atribuidas que' tê’m pélo ménos um átomo dentro dé uma ésféra dé qué rodeia os átomos dé substrato ou dé uma ligação de análogo dé substrato/inibidor no local activo; b) séléccionar todos os résiduos qué éstão ém contacto dé tipo Van dér waals com os résiduos é moléculas dé água obtidas por aplicação do critério a); c) desprezar da lista dos résiduos e' moléculas dé água os qué éstão implicados ém catálise', ligação dé cofac-tor (como por éxémplo iõés metálicos e' nucléótidos) é intérac-çõés intérsubunidadés essenciais (no caso de1 énzimas oligomé’-ricas); d) désprézar os résiduos é moléculas dé água qué intérférém com o pape'1 estrutural dos résiduos acima référi dos. A construção do modelo é a analisé da natureza consérvada dos résiduos alvo pode' sér utilizada para identificar o pape'1 estrutural ésséncial; é) modular a afinidade' do substrato um ou mais dos résiduos acima déscritos pode' sér substituido por alteração do código genético para altérar um ou mais das seguintes intér-acçõés é propriédadés: - e'1) impédiménto éstérico através da alteração do .tamanho do résiduo; 8

- e'2) hidrofobicidadé-polaridadé da vizinhança do substrato; - e'3) solvatação da vizinhança do substrato quér proporcionando cadeias late'rais que' solvatam através da cadeia do hidrogénio os grupos dentro do substrato ou através dé substituições que! alteram a distribuição dé água dentro da vizinhança do substrato; - a4) fléxibilidade' dé resíduos individuais segmentos ou dé toda a estrutura dé protéuna por substituições que1 rompem as ligaçõés dé hidrogénio, diminuem a densidade' local dé émpacotaménto na vizinhança do substrato ou qué introduzem cavidadés. 0 conjunto dé régras acima citadas é géral é pode e'm principio sér aplicada as todas as enzimas désdé qué estejam disponíveis dados estruturais suficiéntés. Para démons-trar a viabilidade' deste conjunto dé régras sérá discutindo ém séguida um éxémplo éspécífico.

Aplicação das régras gérals para modular a éspéciflcidadé do substrato da Glicose' Isomérase'

Embora a escolha dos resíduos por aplicação dos critérios a) até e') acima référidos seja aqui demonstrada utilizando o éxémplo éspécífico da glicose1 isomérase, é dé Ac- tinoplanés mlssouriénsis é évidénté qué devido à grande' homolo- gia, locais dé substituição sémélhantés podém sér escolhidos ém glicose' isomérasés obtidos dé outras éspéciés. A homologia dé séquencia mencionada é démonstrada na Figura 2 qué dá um alinha ménto dé glicose' isomérasés obtidas dé éspéciés; Ac tinoplanés mlssourlenses, Ampullariélla éspécie', Streptomycés vlolacéoru-ber, Stréptomyces murlnus, Stréptomycés thérmovulgaris, Arthro-bactér éspéciés, Bacillus subtilis, Eschérichia coll é Lactoba-cillus xylosus. A técnica acima déscrita daria origém também, após substituição dé aminoácidos nas posiçõés corréspondéntés • nas glicose’ isomérasés dé outras éspéciés, a uma éspécificamén- - 9 -

té dé substrato alterada de' outras glicose' isomérasés.

Em ge'ral, pode' assumir-sé qué quando a homo logia golbal é superior a 65%, de préférência superior a 74%, (homologla minima éntré Actinoplanés missouriénsis é Stréptomy-cés dé glicose' isomérase', dé acordo com Amo ré e1 Hollenbérg, Nucl. Aci-ds Rés. 17, 7515 (1989) ), e' mais préférivélménté superior a 85% é quando a estrutura 3D é! sémelhanté, as substitui ções dé aminoácidos conduzirão a altéraçõés sémélhantés na éspé cificidadé do substrato. Com altéraçõés sémélhantés na éspécifi cidade' do substrato préténde-sé significar a dirécção e'm qué os parâmétros cinéticos se altéram é não a sua grandeza. Espécifi-cidadé é dé éspérar qué as glicose' isomérasés das espé'cie's qué pértencém á ordem dos Actlnomycétalés ténham um élévado grau dé sémélhança tal qué a alteração da éspécificidadé do substrato devido a uma substituição do aminoácido nos locais éscolhidos séja sémelhanté. 0 Actinoplanés missouriénsis é‘ a fonte' preferida dé glicose' isomérasés para sofrér a mutação.

As altéraçõés na éspécificidadé do substrato de acordo com a presente' invénção incluém todas as combinações dé aumento e' diminuição do valores dé Vmáx e! Km para a gli cose' e para a xilosé. 0 éspécialista comprééndérá qué isto engloba. as alterações noutros parâmétros cinéticos. Alé'm disso, as éspécificidadés para outros substratos sérão também consé-quéntéméntés alteradas. As régras propostas para a altéração da éspécificidadé dé substrato não são réstringidas aos substratos mencionados, élas podém sér aplicadas a outros substratos. De: entre éstés, saliéntam-sé a D-ribose', L-arabinose', D-alosé é 6--désoxiglicose'.

Assim, para além dé proporcionar um processo géral para altérar a éspécificidadé dé substrato, a présénté invenção aplica ésté procésso à glicose' isomerasé.

As substituiçõés dé aminoácidos sélécciona-dos podém sér feitas no ADN qué codifica a glicose' isomérase' por processos bém conhécidos dos éspécialistas (por éxémplo mu- 10

tagénése1 dirigida a locais). 0 ADN que' codifica a glicose1 isomérasé ou os seus mutante:s pode ser clonado num véetor de' expressão e' e'sta construção pode' sér transformada num hospedeiro e'm que' o gene é éxprésso, o mARN pode' ser deslocado e' preferivelmente' a proteína madura, ou um pre'cursor, ségrégado da célula. A proteína pode' sér postériorménté purificada. Podém éncon-trar-sé processos convencionais ém Maniatis é col. (Cold Spring Harbor, la é 2a édiçõés 1982 e1 1989 re'spéctivaménté). A aplicação déstés processos dá origem a én zimas de1 glicose isomérasé mutantés, obtidas péla éxpréssão de' um géné qué codifica a referida énzima de' glicose isomérasé pos_ suindo uma sequência de' aminoácidos qué difére' de1 pelo ménos um aminoácido da énzima dé glicose' isomérasé do tipo natural, ém que a énzima dé glicose’ isomérasé mutanté é caractérizada por apresentar uma éspécificidadé dé substrato alterada. Em véz dos mutantés simples podém também sér obtidos mutantés duplos. Alguns déstés mutantés duplos, obtidos com o objéctivo dé combinar as propriédadés préténdidas, mostram qué as propriédadés são pelo ménos parcialménte' cumulativas. São apresentados éxemplos déstés mutantés, na présénté invénção, qué apréséntam uma maior éspécificidadé para a glicose' é uma maior estabilidade. A éspécificidadé dé substrato das novas én-zimas podé sér avaliada no substrato qué é nécéssário para a aplicação préténdida. Dévé tér-sé aqui éspécial aténção aos pa-râmétros cinéticos référéntés á glicose1 e' á xilosé como substrato é também a altéraçôés relativas néstés parâmétros. A Figura 1 mostra um mapa esquemático dé re síduos ém volta do local activo de' A. mlssouriensls. A séguir são descritos para concésér mutantés com uma maior éspécifici-d dadé relativa para a glicose’ comparada com a énzima dé tipo na·1· tural.

Aplicando as régras acima dadas para a glicose' isomérasé dé Actlnoplanes mlssouriénsis é utilizando as 11

. 2+ ι coordenadas de estrutura de sorbitol-GI-Co e obtida a seguinte lista de' resíduos: - Resíduos e! águas escolhidas pe'lo critério (a): 16Trp, 54His, 88Mét, 90Thr, 94Phé, 135Val, 137Trp, 181Glu, l83Lys, 217Glu, 220Hi's, 245Asp, 255Asp, 292Asp, 294Lys, 26Phe' é 4 moléculas dé água qué são arbitrariaménte designadas por 491, 492, 690 e' 887. - Foram séléccionados resíduos adicionais pelo critério (b). Neste' caso foram tomados todos os resíduos dentro dé uma ésféra dé 2$°ém torno dos résíduos ém cima référi dos (critério (a))). Obtiveram-se1 os séguintés aminoácidos: 15Le'u, 17Thr, 20Trp, 25Ala, 27Gly, 52Phé, 53Phé, 55Asp, 57Asp, 87Pro, 89Val, 91Thr, 92Asn, 93Le'u, 95Thr, 133Thr, 134Le'u, 136Le'u, 138Gly, 140Arg, 179Ala, I801lé, 182Pro, 184Pro, 186Glu, 215Asn, 216Pro, 218Thr, 2l9Gly, 221Glu, 243HÍS, 244Ilé, 246Le’u, 254Phé, 256Gln, 257Asp, 290HÍS, 291Phé, 293Tyr é 295Pro. - Os résíduos catalíticos: 54His, 183Lys, 220His; os ligantés dé catiõés: 181Glu, 217Glu, 221Glu, 245Asp, 255Asp, 292Asp, água 690 é o résíduo dé intérface': 26Phé; são desprezados aplicando o critério (c). - Os résíduos 16Trp, 94Phé é 137Trp foram um agregado hidrofóbico conservado qué détérmina a forma global do saco dé ligação dé substrato é são portanto désprézados por aplicação do critério (d). Alem disso o résíduo 184Pro é' despré zado por aplicação do critério (d).

Os résiduos préféridos para serem substituídos résultantés após a aplicação dos critérios acima reféri-dos são apréséntados na Tabela í. 12 TABELA 1 15Le'u 17Thr 20Trp 25Ala 27Gly 52Thr 53Phé 55Asp 57Asp 87Pro 88Me't ’89Val· 90Thr 91Thr 92Asn 93Le'u 95Thr 133Thr 134Le'u 135Val 136Léu 138Gly 140Arg 179Ala 180Ilé 182Pro 186Glu 215Asn 216Pro 218Thr 219Gly 243His 244ILe' 246Le'u 254Phe' 256Gln 257Asp 290HÍS 291Phé 293Tyr 294Lys 295Pro

As substituições simple's néstés sítios e/ou combinações de' substituições nos diferentes sítios pode'm le!var a uma maior actividadé quér através do alívio da máscara ésté-rica quér por modulação da polariédadé no ambiente do açúcar. Podem sér alteradas desta forma diféréntés propriedades como por exemplo a modulação da afinidade é/ou eficiência catalítica.

No caso éspécífico do auménto da éspécifici dadé para a glicose ém relação à xilosé é importante' notar qué a especificidade’ dé substrato para a glicose’ isomérasé dé tipo natural diminui desde1 a xilosé ate a 6-de'soxi-glicosé até á gli cose'. A constante1 dé inibição para o sorbitol é' maior do qué para o xilitol. Esta obsérvação sugére’ qué o impédiménto ésté- rico após ligação do maior substrato ou inibidor contribui para a ménor éspécificidadé. Na estrutura cristalina do complexo dé énzima-sorbitol-cobalto dé A. missouriénsis são encontrados os séguintés résíduos déntro dé 4^ do grupo hidroxilo ligado ao C6 do sorbitol: 16Trp, 88Me't, 135Val, 90Thr é uma molécula dé água designada por 491. As cadeias latérais hidrofóbicas 16Trp, 88Me't, 135Val são incapazes de solvatar o grupo hidroxilo. 0 grupo hidroxilo da cadéia 90Thr é rodado para fora, éxpondo o séu grupo métilo ao inibidor. A molécula dé água (491) faz a ponte' dé 06 a 04 do sorbitol. Na éstrutura do complexo dé énzi- ma-cobalto determinada na ausência dé substrato ou inibidor, o • 7 13

sitio activo contém um número dé moléculas dé água ligadas nas posições aproximadaménté corréspondéntés às posições 01, 02, 03, 04 é 05 do inibidor no complexo dé énzima-sorbitol-cobalto. Contudo, o ambiente1 correspondente à posição 06 não é1 capaz dé acomodar uma molécula dé água. Isto dá uma evidencia adicional de que o grupo hidroxilo C6 não é adéquadaménte' solvatado.

As substituições qué foram féitas na recolha dos resíduos alvo (por aplicação do critério a-é) foram fel tas com o objéctivo dé aumentar a polaridade' do ambiénté do ambiente dos grupos hidroxilo dé substrato, particularménté do 06, e aumentar a flexibilidade1 do sítio activo para acomodar o substrato maior.

Foram féitas éntré outras as seguintes mutações pontuais simples é combinadas, conduzindo às altéra-çõés pretendidas na éspécificidade' da glicosé. 25Ala para Lys: introdução de: um résíduo de carga positiva a uma distância dé 01, 02, é 03 do substrato. Ro tura da estrutura dé água na interface'. Deslocação dé 26Phé, o qué conforma o saco hidrofóbico qué acomada os hidrogénios ali-fáticos Cl do substrato. 243His para Hsn: maior flexibilidade* devido a alterações na rede' dé ligação dé protéína-hidrogénio da água no interior da caixa. 290His para Asn: maior flexibilidade' devido a altéraçõés na rédé dé protéína-hidrogénio da água no interior da caixa, deslocamento da água. 290His para Asn combinada com 235Lys para Arg: A mutação dé 253Lys para Arg é' introduzida para aumentar a estabilidade' ou evitar a glicação (EP-A-0351029) que; conduz a désactivação irreversível. 88Mét para Sér: aumento da polaridade' dé sa co dé ligação 06, maior flexibilidade' por altéração local do empacotamento da proteína. 14 - 4

88Me’t para Sér combinada com 243His para Asn: aume'nto da polaridade1 do saco de ligação 06, maior flexibilidade por alteração local do empacotamento da proteína. 88Met para Ser combinada com 290His para Asn: aume'nto da flexibilidade de'vido a alterações na rede de li gações de' proteína-hidrogénio da água no interior da caixa, dés locaménto da água, aumento da polaridade do saco de! ligação 06. 90Thr para Ser: flexibilidade alterada da cadeia lateral, auménto da flexibilidade por alteração local do empacotamento da proteína, alteração do ambiente da molécula dé água ligado a substrato (492). 90Thr para Ser combinado com 135Val para Gin: flexibilidade alterada da cadéia latéral na posição 90, au mento da flexibilidade por alteração local do émpacotaménto da proteína, alteração do ambiente da molécula dé água ligada ao substrato (492), substituição do ambiente hidrofóbico por um resíduo polar, possibilidade' dé uma ligação dirécta dé hidrogénio éntre a glutamina é o grupo hidroxilo C6. 90Thr para Sér combinado com 135Val para Gin é 215Asn para Ser: flexibilidade' altérada, substituição do ambiente hidrofóbico por um résíduo polarés, possibilidade dé rémoção dé uma molécula dé água, possibilidade dé uma ligação dirécta hidrogénio entre' o 90Sér é o grupo hidroxilo C6. 135Val para Thr: substituição do ambiente hidrofóbico por um résíduo polar. 135Val para Gin: substituição do ambiénte' hidrofóbico por um résíduo polar, possibilidade' dé uma ligação de hidrogénio dirécta éntre a glutamina é o grupo hidroxilo C6.

Estas propostas dé mutação preténdem exemplificar uma via racional qué pode’ sér aplicada para criar novas glicose isomerases com éspecificidadés pretendidas. Contudo sérá óbvio para os especialistas qué podém sér obtidas as mutan tés pretendidas por alteração dos résíduos alvo ém aminoácidos 15

que diferem dos acima re'fe'ridos numa forma sémélhanté.

Substituirão, rémoção, desvio de- água ligada no sitio activo

Da comparaçãp da estrutura de sorbitol com a estrutura dé xilitol parece' que' moléculas de' água particulares podém interferir com a adequada ligação de' glicose. A substituição desta água por uma cadeia adéquada dé aminoácidos, ou o moviménto da posição da água por introdução dé uma cadeia lateral mais curta na posição adéquada podé provocar um aumento da afinidade’. A mutanté de glicose1 isomérasé H290N, qué tém uma maior éspécificidadé para a glicose1 (Km=250 mM, V g^=41 μιηοΙβ'Β/ηιϊ'η/ϊΐ^) podé servir como éxémplo. A remoção ou deslocamento dé moléculas dé água ligadas no sitio activo da mutanté H290N éstá relacionado com o aumento obsérvado na actividade da glicose’. Podém sér obtidos efeitos sémélhantes por deslocamento dé outras moléculas dé água. As moléculas dé água qué éstão numa ésféra dé 4% ém torno dos átomos 03, 04, 05 ou 06 do substrato são candidatas para sérém removidas ou déslocadas por mutação dos aminoácidos vizinhos.

Nos seguintes éxémplos são aplicadas técnicas dé ADN récombinanté para introduzir mutaçõés pontuais no géne' clonado dé Actinoplanés missouriensis. A proteína é’ sobré-éxpréssa em E. coll, purificada e' caractérizada in vitro e' nas condições de aplicação da forma descrita noutro documento (Van Tilburg, 1983, Thésis: "Enginééring aspécts of biocatalysts in industrial starch convérsion", Délftsé Univérsitairé Pérs).

PARTE EXPERIMENTAL

Clonação e’ expressão do géne dé D-glicose isomérasé A D-glicosé isomérasé (GI) é‘ sinonimaménté utilizada para a D-xilose' isomérasé (D-xilosé) cétol-isomérasé 16

(EC 5.3.1.5), que é uma enzima que' converte’ a.D-xilose em D-xi-lulose. A D-glicosé isomérasé de Actinoplanes missouriensis pro duzida pelas estripes de’ E, coli! dé engénharia genética designa das como EcoAmi (DSM) GI. Para distinguir o gene’ de Actinopla-nés missouriensis q-ue' codifica para GI do gene' análogo de' E. coli xyla, o priméiro se!rá désignado como GI.

Os proce’ssos para a manipulação das moléculas dé ADN são descritas ém Maniatis e1 col.(1982, Cold Sprong Harbor Laboratory) é Ausube'1 é col. (1987, Currént Protocol é in Molecular Bioligy, Jonh Wiléy & Sons Inc. Nova Iorque). A clonação é a sequência dé ADN do géné dé glicosé isomérasé dé Actinoplanés missouriensis DSM 43046 ê descrita noutro documén-to (EP-0351029). A séquéncia dé aminoácidos dérivada dé GI é numerada é comparada com outras glicosé isomérasés na Figura 2. A seguir, a numéração dos aminoácidos référé-sé à Figura 2.

As énzimas dé GI do tipo natural é mutantés foram produzidas em E. coli éstripé K514 conforme1 descrito ém EP-0351029. 0 documento EP-0351029 descreve éspécifica-ménté a maior parté das técnicas aplicadas nésté pédido é é por tanto aqui incorporado como referência.

Ensaio da actividade' énzimática do produto dé expréssão. A actividade' énzimatica da glicosé isomérasé foi avaliada da forma a seguir descrita (1 unidade* dé activi dadé énzimatica produz 1,0 micromolés do produto D-xilulose' ou D-frutosé por minuto; portanto a actividade' éspécifica-spa-é expréssa ém unidades por mg dé énzimas GI). A actividade' GI foi avaliada diréctamenté por medida do auménto da absorvância a 278 nM dé xilulosé produ zida a 359C por um isomérisação dé xilose’ péla glicosé isomé-rase. Esté ensaio foi éféctuado em tampão dé triétanol amina 50 mM, pH 7,5, contendo 10 mM dé MgSO^, na présénça dé xilose' , 0,1 Μ. A concentração final da glicose isomérasé no énsaio éra 17

de +0,01 mg/ml, tendo si:do esta conce'ntração precisamente detér minada, antes da diluição na mistura de ensaio enzimática, por éspréctroscopia de' absorção utilizando um coeficiente de1 extinção de' 1,08 a 278 nM para uma solução de1 e:nzima de' 1,0 mg/ml.

No Ensaio Acoplado de' Dexidrogenase D-Sor-bltol, a determinação enzimática de D-xilulose foi e'féctuada a 352C da forma anteriormente de'scrita (Kersters-Hilderson e col., Enzyme Microb. Technol. _9 (1987) 145) e'm 50 mM de trie'-tanolamina, pH 7,5, 10 mM de1 MgS04, e' 0,1 mM de xilose na pre-sénça de +2x 10 M de1 D-sorbitol de'sidroge'nase' (L-iditol: NAD oxidoreductase', EC 1.1.14), e' 0,15 mM de1 NADH. A conce'ntração final de glicose isomérase ne'ste ensaio era de’ +2,5x 10 mg/ml e esta concentração foi determinada com precisão da forma ante-riormente' descrita.

Com a glicose' como substrato da actividade GI pode’ ser avaliada por meio da medida de' D-frutose produzida durante a reacção de i'some'rização utilizando p método de' cistei na-carbazole (CCM) que' e baseada na reacção dos cetoaçucares com o carbazole ém ácidos para se obter um produto de cor púrpura (Dische é Borenfreund, J. Biol. Chem. 192 (1951) 583). Alternativamente', a D-frutose produzida durante' a reacção de iso-merização pode ser determinada e'nzimaticamente utilizando a sor bitol desidrogenase e NADH.

Como medida da especificidade ê utilizado por veze's o quociente V -^/K (Wells e col., ibid). Para os mu-tantes os valores de V - /K para a xilose e para a glicose fo-ram calculados da forma habitual. As medidas para os parâmetros da xilose' são efectuadas a 359C, enquanto que os parâmetros de glicose são de'te'rminados a 60aC. Estas temperaturas são escolhi das por razões práticas. Para saber se as conclusões áce'rca da especificidade1 relativa são geralménte aplicáveis independentemente’ da temperatura de medida, foram efectuadas algumas medidas na xilose a 602C para as enzimas de'· tipo natural e! mutan-tes. Foi verificado que1 as conclusões que podiam se'r tiradas no 18

que se référé aos parâmétros ciné!ticos do estado estável a 602C e com semelhantes aos de 352C.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Mutantes com propriédadés catalíticas supérlorés A estrutura tridimensional de Aotinoplanes missouriensis glicose' isomérasé foi estudada para escolher os re'síduos que após alteração podem originar uma ligação de substrato, actividadé catalítica ou especificidade' de substrato superioras. Os resíduos diréctamente ou indirectamente (através de outro resíduo ou molécula dé água) numa esfera de 4% dé 01--06 do substrato foram escolhidos é alterados por mutagénésé dirigida aos sítios com o auxílio do sistema véctor pMa, (Stans sens e col., Nucl. Acids Res. _17 (1989) 4441).

Na Tabéla 2 a séguir apreséntada são referi dos os parâmétros énzimáticos dé vários mutantes escolhidos: 19 TABELA 2

Mutanté V

V

K

K

K max max max m m m max m max *y gl gi/xy· gl xy/gl xy gl (txmol/min/mg) (irM) (nM) xlO •2 Tipo Natural 24.20 34.80 1.43 4.80 290 1.7 5.04 0.12 A25K 7.66 22.61 2.95 2.73 207 1.3 2.81 0.11 M88S 19.37 29.44 1.51 7.60 263 2.9 2.55 0.11 M88SH243N 13.90 24.98 1.79 11.92 387 3.1 1.17 0.06 M88SH290N 16.07 49.77 3.09 14.82 406 3.6 1.08 0.12 T90S 37.07 32.77 0.88 16.76 180 9 2.21 0.18 T90SV135Q 0.54 19.30 36 182 2822 6.4 0.00 0.01 V135Q 0.67 5.57 8.3 56.00 1120 5 0.01 0.00 V135T 10.90 33.11 3.04 19.95 678 3 0.55 0.05 E186D 8.51 37.90 4.45 7.00 736 0.9 1.22 0.05 E186Q 0.77 2.06 2.68 1.80 57 3 0.43 0.04 H243N 18.90 22.00 1.16 5.80 180 3.2 3.26 0.12 K253RH29CN 26.70 49.13 1.84 12.80 331 3.9 2.09 0.15 L258K 24.23 44.17 1.82 4.44 327 1.4 5.46 0.14 H29CN 24.00 41.80 1.74 9.70 250 4 2.47 0.17 K294Q 5.70 9.70 1.70 32.00 309 10 0.18 0.03 K294R 13.80 27.52 4.82 4.50 308 1.5 3.07 0.09 T90SV135Q-1 N215S * 0.93 39.6 42.60 360 1000 36 0.0025 0.04

As condições para determinar os parâmetros énzimáticos foram os seguintes: V , xilose : 352C, lOmM Mg2 max p Vmax’ SUc0se: 0 01 o «D lOmM Mg p K , xilose : • m 352C, lOmM Mg Km? glicose : 609C, lOmM Mg2 +, pH 7.5;

As actividades foram medidas e'm enzimas purificadas. 0 ensaio dé sorbitol désidrogénasé acoplada foi utilizado para a xilose, e o método dé cistéína-carbazolé ou dé 20

desidrogénase dé sorbitol descontinua foi utilizada para a glicose .

Exemplo 2; Glicose1 lsome'rase's com maior afinidade' para a glicose A Tabela 3 resume os valores de K me‘didos m de vários mutantes comparados com a enzima dé tipo natural. Pode' observar-se que' todos éstés mutantes tem um valor dé K in-ferior para a glicose’. Isto significa qué a ligação da glicose de substrato é reforçada. Além disso, para alguns dos mutantes o valor de K para a xilosé não auméntou mas tornou-se menor, como ê exemplificado na Tabela 2. Assim, os mutantes M88S, T90S, T90SV135Q, V135Q, H290N, K294Q, H243N adquiriram uma melhor proporção de Kmxilose/Kmglicose' quando comparados com a énzima de tipo natural. TABELA 3

Mutante K(gl) K(gl)/WT E186Q 57.000 0.197 H243N 180.000 0.621 T90S 180.000 0^621 A25K 207.000 0.714 H290N 250.000 0.862 M88S 203.000 0.907 Tipo Natural 290.000 1.000 0 valor dé K m para a glicose' é expresso ém mM.

Exefriplo 3: glicose1 isomerasés com maior actividade catalíitica na glicose

Os mutantes dé glicose isomérasé com maior actividade catalitica na glicose' são E186, L258K, H290N e' as mu tações combinadas com H290N. 0 L258K não foi escolhida utilizan • do os critérios descritos nos métodos gérais como léucina na \ posição 258 está cerca de 14A°afastada do substrato ou inibidor. - 21 -

Na Tabela 4 e representado o valor de' V - max em relação a V . de tipo natural. Verificou-se! um aumento de v max 8,9% para 43%. Isto dá origem a uma isomérização mais rápida da glicose de substrato pre'fe'rida. TABELA 4

Mutante' -V(gl) V(gl)/PM M88SH290N 49.770 1.430 K253RH290N 49.130 1.412 L258K 44.170 1.269 H290N 41.800 1.201 T90SV135QN215S 39.600 1.138 E186D 37.900 1.089 Tipo Natural 34.800 1.000 0 VM^ para glicose é expressa em micromolés/min/mg.

MciX 0 mutante H290N révéla um valor de' V - max para a glicose de 41,80 que é significativamente maior do que a e'nzima do tipo natural. Além disso, o valor dé V - dé xilosé max não aumentou. A proporção de! V é de glicose;/V , dé xilose' de ΓΠ9.Χ ΓΠΘ.Χ H290N foi assim auméntado, tornando ésté mutante' mais numa "vér dadéira" glicose isomerasé.

Exemplo 4: Estrutura dé glicose' isomérasé H290N '

Na estrutura cristalina do mutante H290N, é’ observado qué o grupo amida da cadéia lateral Asn é sobrépo-nivel ao grupo dé imidazolé com o peso molécular (Fig.3). Como consequência a amida e'm 290Asn mantém a ligação dé hidrogénio a 245Asp. Além disso, o átomo 0 1 dé 290Asn pode' ligar-se por hidrogénio ao grupo hi-droxilo dé 12Se’r. 0 grupo dé hidroxilo de 52Thr, ligado por hidrogénio a ne’2 dé 290His nas estruturas dé péso molécular, não podem ligar-se por hidrogénio a 290Asn. NO mutante' o grupo - 22 -

hidroxilo de' 52Thr é rodado (torsão X ) de forma que ele sé liga através dé hidrogénio a uma molécula dé água (tipo natural 11 X = 712, mutante X =-172,52). Esta molécula de água présenté na éstrutura da mutante está posicionada como átomo 88Mét s <f (distância = 0,45$) no tipo natural. A introdução dé uma molécula de água nésta posição, qué forma uma ligação dé hidrogénio a 52Thr, força uma cadeia réoriéntação da cadéia natural dé 88Mét na estrutura mutante' quando comparada com o tipo natural. Além disso a cadéia latéral 52Thr liga-se por hidrogénio ao mu-tanté da cadéia principal dé hidrogénio a 53Phé (d=2,23$). A réoriéntação da cadéia latéral de 88Met em H290N nécéssita do movimento dé 243His. Além disso a molécula dé água (490), qué liga l2Sér a 243His na éstrutura dé tipo natural, desaparécé dévido a máscara histérica com o grupo méti lo 52Thr e' a nova orientação dé 88Me't. 243His adopta outro angu 1 1 lo X = -169a é no mutante X = -772) abolindo a ligação de hidrogénio a 215Asn. 0 éspaço deixado pélo imidazole de 243His é' préénchido com uma molécula dé água (615) qué sé liga por hidrogénio à amida dé 2l5Asn (não répréséntada). Além disso ésta molécula dé água, liga-se’ por hidrogénio a uma nova molécula dé água (872) qué se liga por hidrogénio à cadéia principal dé hidrogénio do átomo 244Ilé. Ê dada évidéncia adicional para a alteração na fléxibilidadé das cadéias laterais no ambiente' à volta do hidroxilo C6 é dado pêlos factorés dé temperatura para os résí-duos dé 52Thr, 88Me't é 243Hi's, qué é' duas vézés maior quando comparada com a éstrutura dé tipo natural.

Como resultado dos réarranjos complexos cau sados péla mutação H290N, três moléculas dé água solvatam o grupo hidroxilo C6 do sorbitol.

Isto exemplifica qué a substituição, movimento ou deslocação das ligações das moléculas dé água no sítio activo pode resultar nas alterações pretendidas na actividadé da énzima. 23

Exemplo 5: Glicose isomérase' com um maior ligação dé substrato

Na Tabela 5 são apresentados vários mutan- tes como maior ligação de xilose1. A25K e' E186D têm um valor dé

Km diminuido para a xilose é para a glicose. E186Q també'm tem um valor de K diminuido para a frutosé. As enzimas com éléva-m da afinidade dé substrato. TABELA 5

Mutanté K(xy) K(gl) K(xy)/Kgl) K(xy)/WT K(gl)/WT E186Q 1.800 57.000 0.032 0.375 0.197 A25K 2.730 207.000 0.013 0.569 0.714 L258K 4.440 327.000 0.014 0.925 1.128 K294R 4.500 308.000 0.015 0.938 1.062 Wild-type 4.800 290.000 0.017 1.000 1.000

Os valores de km são expressos ém mM. Dévé-se notar-se' que apénas E186Q e A25K têm uma maior afinidade para ambos os substratos énsaiados.

Exemplo 6: Mutanté com uma maior especificidade para a glicose A especificidade rélativa é definida como o quociente dé, V para a xilose' dividido pélo quociente' de v , /K para a glicose'. Assim, sé o núméro for inferior ao tipo natural a espécificidadé rélativa para a glicose’ é aumentada.

Na Tabela 6, são mostradas glicose' isome-rases mutantés com uma maior especificidade rélativa para a gli cose1. Os mutantés V135Q, T90SV135Q é T90SV135QN215S tê:m uma ac-tividade muito reduzida na xilose. Mésmo em termos absolutos a actividade com a glicose é reduzida, o quociente V .· /K da gli cose em relação à xilose foi consideravelmente' aumentado. Assim estes mutantés altéram a sua éspécificidadé para sé tornarem • uma verdadeira glicose' isomérase virtualmente' sém actividade' dé . xilose isomérase'. - ?4 -

As combinações das mutações T90S, V135Q e N215S num mutante triplo mostram que estas mutaçõés são aditivas com relação aos parâmetros cinéticos (Tabela 6). TABELA 6 Mutante V/K(xy) V/K(gl) V/K(xy)/(gl) r.é spéc T90SV135Q-, 0.003 0.040 0.065 0.002 N215S* N215S 0.058 0.018 3.193 0.076 T90SV135Q 0.003 0.007 0.434 0.010 V135Q 0.012 0.005 2.402 0.057 K294Q 0.178 0.031 5.674 0.135 M88SH290N 1.084 0.123 8.846 0.211 V135T 0.547 0.049 11.209 0.267 E186Q 0.428 0.036 11.837 0.282 T90S 2.212. 0.182 12.138 0.289 K253RH290N 2.086 0.146 14.053 0.334 H290N 2.474 0.167 14.798 0.352 M88SH243N 1.166 0.065 - 18.066 0.430 M88S 2.549 0.112 22.768 0.542 E186D 1.216 0.051 23.609 0.562 A25K 2.806 0.109 25.688 0.611 H243N 3.259 0.122 26.661 0.635 K294R 3.067 0.089 34.322 0.817 L258K 5.457 0.135 40.401 0.962 Tipo Natural 5.042 0.120 42.014 1.000 Exemplo 7: Alterações estruturais que1 ocorrem no mutante

M88SH243N A especificiadé de' substrato podé também sér alterada por substituiçõés de aminoácidos que resultem em aminoácidos que mostram uma maior flexibilidade' da cadeia lateral . 25 *

Na estrutura cristalina do mutante M88SH243 N e observado que' o 243Asn e o 52Thr adoptam conformaçõés múlti pias, réflectindo o aumento da flexibilidade' à volta da hidro-xilo C6 do substrato. È também observado que as posições C das bandas dé barril béta contendo os réslduos 88Se'r, 52Thr, 135Val e 177Arg são deslocadas dé 0,3 para 0,5 Ã, tornando o interior da caixa ligéiramehté maior. 0 espaço criado péla mutação 88Met para 88Sér é' preenchido com uma molécula dé água adicional. As localizações das cadéias latérais alternadas obsérvadas é o ligéiro movimento da caixa pérmitém a introdução dé outra molécula de água é o movimento de uma molécula dé água na dirécção do hidro xilo C6 do substrato.

Exemplo 8; Mutantes com melhores proprlédadés- na presença de: Mn2+ 2+ 2+

Para além de Mg , o Mn pode ser utilizado como catião bivalénte durante a isomérização. Embora o cati-ão Mn não séja habitualménte utilizado em procéssos de isome-rização comérciais, a sua utilização podé sér encarada ém utili zações em qué os iõés métálicos podem sér removidos do produto ou em qué os iõés métálicos não são .importantes para a qualidade do produto. 0 mutante E186Q mostra uma mélhor activi- , 2+ dade' catalitica ém relação à glicose' na présénça de Mn , como se pode vér na Tabéla 7: - 26 _ - TABELA 7

E186Q V max (μΓϊίοΙβ'β/πιχη/η^) Km(mM) Condições ·* Xilose 5.4 3.15 '352C, lmM Mn, pH 7.5 Xiiosé 14.4 7.83 352C, 2mM Mn, pH 6.4 Glicose’ 22.6 387 602C, lmM Mn, pH 7.5 Mn 5.63 0.01 352C,lOOmM xilose’, pH 7.5 Mn 14.5 0.03 35-ac, 200mM xiiosé, ph 6.4 Tipo natural V (μπιο1β'8/πι1'η/π^) Km(mM) nielX Condiçõés Xilose' 8.6 13. 2 352C, lmM Mn, pH 7.5 Glicose 6.5 1537 60aC, lmM Mn, pH 7.5 Mn 10.2 0.0048 352C,100mM xiiosé,pH 7.5

Os métodos utilizados foram os do Exemplo 1. A melhoria no valor de V ✓ de glicose é dé trés a quatro nictx vezes quando comparada com a enzima dé tipo natural. 0 aumento no valor dé Km da glicose' é dé quatro vézés. Dado qué 186E éstá na vizinhança da posição do métal UP (vér Figura 1) pode' sér admitido qué o 186Q está ém mélhor rélação com o raio maior dé Mn do que com o raio dé Mg

Exémplo 9; Ensaio de aplicação do mutanté K253RH290N 0 mutante H290N revela uma actividadé aumen tada da glicose como pode’ sér observado na tabela 4. A Tabéla 6 mostra que a espécificidadé para a glicose1 é também auméntada neste' mutanté.

Este mutanté foi imobilizado péla forma de'_s critaém EP-351029 (Exémplo 7 déssé pédido). 0 ensaio dé aplicação do tipo natural e désta glicose’ isomérasé mutante foi éféc-tuado da forma descrita no mesmo pedido (Exémplo 8). A estabilidade é indicada pela constante dé decaimento dé primeira 27

ordem (K^, quanto menor for a constante de decaimento mais estável é a enzima). A Tabela 8 mostra os valores de para as glicose isome'rase's dé tipo natural é mutantés. TABELA 8

Constantés de' de'caime'nto para glicose' iso-mérasé do tipo natural e mutante', imobilizada em Lewatit

Tipo natural K, (x 106 sec d 2.5 H290N 3.1 K253R 0.7 H290NK253R 1.6

Como pode ser observado na Tabela 8, o H290N é désestabilizado quando comparado com a glicose isomé-rase dé tipo natural. Foi verificado qué o K253R estabilizava a glicose isomerasé dé tipo natural por um factor superior a três. A combinação dé H290N com a mutação de éstabilidade K253R mostra que éstas características são aditivas. Além disso, pode sér observado na Tabela 4 qué a actividadé dé K253RH290N na gli cose' não é negativaménté influenciada pela-mutação dé estabilidade, pelo contrário a mutante1 dupla revela uma actividadé ainda maior neste' substrato qo que a mutante' H290N. No qué sé ré-feré à especificidade', na Tabela 6 pode' ser observado qué a mu-tanté K253R não influencia bastante' a especificidade do mutante H290N. Pode sér assim concluido qué a actividadé dos mutantés pode sér éstabilizada por introdução dé mutações que revelaram estabilizar a énzima dé tipo natural. Dévé-sé énténdér-sé qué os exemplos acima mencionados prétendém demonstrar o conceito da invenção é que' eles não pretendem limitar o séu âmbito. Tendo isto ém atenção é óbvio qué combinações das. mutações acima mencionadas combinadas com outras mutações conduzindo a caracteristicas alteradas ' por exemplo termo estabilidade, désvio dé pH óptimo ou ligação • de metal estão incluídas no âmbito désta invenção. 28

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES _ lã _ » Processo para a preparação de uma énzima possuindo uma especificidade' de1 substrato alterada caractériza-do por se alterar um amino ácido escolhido utilizando os seguin tés critérios: a) éscolhéram-sé todos os resíduos é todas as moléculas dé água cris talo graficamente' atribuídas qué tem pelo ménos um o átomo dentro dé uma ésféra 4A rodeando os átomos do substra to ou dé uma ligação dé análogo dé substrato/inibidor no sí tio activo, b) escolherem-se todos os résíduos qué éstão ém contacto do ti po de Van dér Waals com os resíduos é com as moléculas de água obtidas pela selécção feita dé acordo com o critério a), c) desprezarem-sé da lista registada dos résíduos é das molécu las dé água as qué éstão énvolvidas na catálise, ligação de co-factor (como por éxémplo i'õés metálicos é nucleótidos) é intéracções dé intérsubunidadés essenciais no caso dé enzimas oligoméricas, d) desprézarem-se os résíduos é as moléculas dé água qué intér ferém com o pape'1 éstrutural désses resíduos podendo utili- zar-sé a construção é análise dé modélo da naturéza conservada dos resíduos alvo para identificar um papél éstrutural essencial. _ 2ã - Processo dé acordo com a reivindicação 1, caractérizado por se altérarém ainda uma ou mais de entre' as seguintes intéracções é propriedades: - e'1) impedimento éstérico por alteração da diménsão do resíduo, 29 - e2) hidrofobicidadé/polaridade' dos limites do substrato, - e‘3) solvatação dos limites do substrato quer proporcionando cadeias laterais que se solvatam por meio de ligações de hidrogénio a grupos dentro do substrato ou através dé substituições qué alteram a distribuição dé água dentro dos limites do substrato, - e4) flexibilidade1 de résiduos individuais, ségméntos ou a es trutura global de proteína por substituições qué rompém as rédés dé ligação dé hidrogénio, diminuem a densidade local de énpacotaménto nos limités do substrato ou introduzem cavidadés. _ 3§ _ Processo para a preparação dé uma molécula dé glicose' isomérase' mutanté obtida por éxpréssão dé um géne qué codifica a référida enzima dé glicose isomérase’ possuindo uma sequência dé amino ácidos que difere' ém pélo ménos um amino ácido da enzima dé glicosé isomérase’ natural, ém qué a enzima dé glicosé isomérase mutanté éxibé uma éspécificidadé dé substrato alterada caracterizado por compreender a) obtér-sé uma sequência dé ADN qué codifica uma glicosé iso-mérasé, b) eféctuar-sé a mutação désta séquência ém posições escolhidas dé nucléótidos, c) éfectuar-sé a clonação da séquência que sofreu a mutação para um véctor dé éxpréssão dé modo a qué a séquência dé ADN possa sér expressada, d) transformar-se' um organismo ou célula hospédéiro com o refé rido vector, é) efectuar-se a cultura do référido organismo hospédéiro, f) isolar-se a glicose isomérase'.

   - 4* - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se obter uma enzima de glicose isomérase' mu-tante que tem um valor V para a glicose, a temperaturas compreendidas entre 20-C é 852C, superior ao da glicose isomérase' de ocorrência natural. _ 5ã _ Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se' obter uma enzima de' glicose isomérase’ mu-tanté qué se distingue de uma glicose isomerase' de ocorrência natural que tem a mesma actividadê biológica essencial por ter um valor dê para a glicose, a temperatura comprééndidas entre 2Ò2C e 852C, inferior ao da glicose isomerase' dê ocorrência natural. - 6» - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se obter uma enzima dê glicose isomerase mu-tante que se distingue' dê uma glicose isomerase dê ocorrência natural que têm a mesma actividadê biológica essencial por têr um valor dê V - para a xilose, a temperaturas compreendidas entre 202C e 852C, superior ao da glicose isomérase de ocorrência natural. _ 7ã _ Processo de1 acordo com a reivindicação 3, caracterizado por sê obter uma enzima de glicose1 isomerase mu-tante que’ se' distingue1 dê uma glicose' isomérase dê ocorrência natural qué tém a mésma actividadê biológica ésséncial por tér um valor dê Km para a xilose1, a temperaturas compreendidas entre 202C é 852C, inferior ao da glicose' isomérase' dê ocorrência natural. 31

   - 8» - Procêsso de1 acordo com a reivindicação 3, caracte'rizado por se1 obter uma e'nzima de' glicose1 isomêrase1 mu- tantê que se’ distingue de uma glicose' isomêrase' de' ocorrência natural que1 te!m a mesma actividade' biológica e'sse'ncial por ter uma proporção de' V , para a glicosê/V r para a xilosê supe'- msx max rior ao da glicose' isomerase' de1 ocorrência natural. - 9» - Processo de' acordo com a rêivindicação 3, caractêrizado por sê obter uma enzima de glicose1 isomerase' mu-tantê que' se1 distingue’ de uma glicose1 isomerase de' ocorrência natural que' têm a mêsma actividade' biológica êssêncial por têr uma proporção de' Km para a xilosê/K^ para a glicose' supêrior ao da glicose' isomêrase' de' ocorrência natural. - 10» - Procêsso dê acordo com as reivindicações 3, a 9, caractêrizado por se obtêr uma ênzima dê glicose isomêrase' mutante que' sê pode' obter a partir dê um microorganismo da ordem dos Actinomycêtalês. - 11» - Procêsso dê acordo com qualquer das rêivindicaçõês 3 a 10, caractêrizado por sê obtêr uma ênzima dê glicose isomêrase' mutante' que’ sê pode' obtêr a partir dê um micro-organismo dê Actlnoplanês mlssourlensis. - 12» - Processo dê acordo com qualquer das reivindicações 3 a 9, caractêrizado por sê obtêr uma ênzima de' glicose isomêrase' mutante' êm quê a sêquência dê amino ácidos da re fêrida glicose isomêrase' aprêsênta uma homologia de' pêlo mênos • 65% com a sequência dê amino ácidos da glicose' isomêrase dêri- 32 - ssítí*·.

   vada da estripe natural de Actlnoplanés missouriénsis. - 13^ - Proce!sso de' acordo com qualquér das réivin-dicaçõés 3 a 9, caractérizado por se obte'r uma e'nzima de' glicose isome'rase' mutante que1 tem uma substituição de re'sí!duos den tro dé uma ésféra de1 4 Angstroms ém volta dos átomos de oxigénio dé um substrato dé açúcar. - 14- - Processo dé acordo com as réivindicações 3 a 9, caractérizado por sé obter uma énzima dé glicose1 isomerase' mutante' ém que' foi substituído pélo ménos um dos seguintes ami-no ácidos: 15Le'u, 17Thr, 20Trp, 25Ala, 27Gly, 52Thr, 53Phé} 55Asp, 57Asp, 87Pro, 88Me't, 89Val, 90Thr, 91Thr, 92Asn, 93Léu, 95Thr, 133Thr, 134Le'u, 135Val, 136Le’u, 138Gly, 140Arg, 179Ala, 180Ilé, 182Pro, 186Glu, 215Asn, 216Pro, 218Thr, 219Gly, 243HÍS, 244Ile', 246Le'u, 254Phe, 256G1, 257Asp, 258Le'u, 290His, 291Phé, 293Tyr, 294Lys, 295Pro. - 15^ - Procésso dé acordo com a reivindicação 14, caractérizado por sé obter um mutanté qué contém pélo ménos uma das seguintes substituições dé amino ácidos: A25K, M88S, T90S, V135Q, V135T, E186D, E186Q, N215S, H243N, K253R, L258K, H290N, K294Q, K294R. - 16^ - Procésso de1 acordo com as reivindicações 3 a 9, caractérizado por sé obtér um mutanté por deslocação das moléculas dé água numa ésféra dé 4 Angstroms ém volta dé átomos dé oxigénio de um substrato dé açúcar. 33 17» Procésso para a conversão dé moléculas de’ açúcar, caracterizado por se1 utilizar uma glicose isomérasé mu-tanté quando preparada dé acordo com qualquér das reivindicações antériorés. As réquérénte's reivindicam a prioridade do pedido da paténté éuropéia apresentado ém 4 dé janeiro de1 1990, sob o n2. 90200029.8. Lisboa, 3 dé Janeiro dé 1991. ο A6BITE OFICIAL BA PffiOPBlffiBABK INBUBfffilAI.

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