JPH06256388A - 合成ペプチド、これに対する抗体及びこれらの使用 - Google Patents
合成ペプチド、これに対する抗体及びこれらの使用Info
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- JPH06256388A JPH06256388A JP5344306A JP34430693A JPH06256388A JP H06256388 A JPH06256388 A JP H06256388A JP 5344306 A JP5344306 A JP 5344306A JP 34430693 A JP34430693 A JP 34430693A JP H06256388 A JPH06256388 A JP H06256388A
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- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/75—Fibrinogen
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 プラスミンによるフィブリノーゲンの開裂の
結果生じるＥ断片のカルボキシ末端と少くとも部分的に
対応し、かつ、抗原性を有するアミノ酸配列を含んでな
る合成ペプチドおよびこのペプチドと免疫化学的に反応
する抗体。 【効果】 本発明による抗体は断片Ｅとのみ交差する。
従って、フィブリノーゲン又はフィブリンの含有量にか
かわらず、フィブリン分解活性を正確に定量することが
できる。
結果生じるＥ断片のカルボキシ末端と少くとも部分的に
対応し、かつ、抗原性を有するアミノ酸配列を含んでな
る合成ペプチドおよびこのペプチドと免疫化学的に反応
する抗体。 【効果】 本発明による抗体は断片Ｅとのみ交差する。
従って、フィブリノーゲン又はフィブリンの含有量にか
かわらず、フィブリン分解活性を正確に定量することが
できる。
Description
【０００１】［発明の背景］本発明はペプチド、それら
によって産生された抗体並びに治療及び診断のためのこ
のようなペプチド及び抗体の使用に関する。
によって産生された抗体並びに治療及び診断のためのこ
のようなペプチド及び抗体の使用に関する。
【０００２】生物は凝固系により血液の喪失から保護さ
れている。凝固カスケードはＡ及びＢフィブリノペプチ
ドを除くことによりフィブリノーゲンをフィブリンに変
換するプロテアーゼであるトロンビンの活性化を起こ
す。個々のフィブリン分子は互いに凝集し（いわゆる
“軟血餅”）、しかる後正常であればトランスペプチダ
ーゼ因子XIIIにより互いに架橋される（いわゆる“硬血
餅”）。この創傷閉鎖は反対方向に活性化されるフィブ
リン分解系により溶解される。フィブリン分解のキー酵
素はプロテアーゼであるプラスミンであり、これは本質
的にフィブリノーゲン及びフィブリンをＤ及びＥ断片に
開裂する。フィブリノーゲンはＮ末端付近でジスルフィ
ド架橋により互いに結合された２本のトリペプチドから
対称的に組立てられる。したがってフィブリン又はフィ
ブリノーゲンが開裂されると、フィブリン（フィブリノ
ーゲン）の中心的結合領域を構成する１分子の断片Ｅと
２分子の断片Ｄが分子当たりで形成される。硬血餅にお
いて、フィブリンのＤドメインは架橋されており、その
結果プラスミンによる分解はＤダイマーと断片Ｅを遊離
する。Ｅ断片自体は更に２回の分解ステップに付され
る。その第一及び第二形態（各々Ｅ１及びＥ２）におい
て、それはＤダイマーに非共有結合し、ＤＤ／Ｅ複合体
を形成している。第二の酵素分解ステップの後になって
ようやくＥ３断片がＤダイマー分子から解離する。
れている。凝固カスケードはＡ及びＢフィブリノペプチ
ドを除くことによりフィブリノーゲンをフィブリンに変
換するプロテアーゼであるトロンビンの活性化を起こ
す。個々のフィブリン分子は互いに凝集し（いわゆる
“軟血餅”）、しかる後正常であればトランスペプチダ
ーゼ因子XIIIにより互いに架橋される（いわゆる“硬血
餅”）。この創傷閉鎖は反対方向に活性化されるフィブ
リン分解系により溶解される。フィブリン分解のキー酵
素はプロテアーゼであるプラスミンであり、これは本質
的にフィブリノーゲン及びフィブリンをＤ及びＥ断片に
開裂する。フィブリノーゲンはＮ末端付近でジスルフィ
ド架橋により互いに結合された２本のトリペプチドから
対称的に組立てられる。したがってフィブリン又はフィ
ブリノーゲンが開裂されると、フィブリン（フィブリノ
ーゲン）の中心的結合領域を構成する１分子の断片Ｅと
２分子の断片Ｄが分子当たりで形成される。硬血餅にお
いて、フィブリンのＤドメインは架橋されており、その
結果プラスミンによる分解はＤダイマーと断片Ｅを遊離
する。Ｅ断片自体は更に２回の分解ステップに付され
る。その第一及び第二形態（各々Ｅ１及びＥ２）におい
て、それはＤダイマーに非共有結合し、ＤＤ／Ｅ複合体
を形成している。第二の酵素分解ステップの後になって
ようやくＥ３断片がＤダイマー分子から解離する。
【０００３】フィブリン又はフィブリノーゲンの開裂に
より生じたＤダイマーのように、１つの分子又はタンパ
ク質内にいくつかの免疫化学的に同一のエピトープを有
するタンパク質は“分子内オリゴマー”とも呼ばれる。
ここでＤダイマーは少くとも生理学的条件下では、各ケ
ースにおいて少くとも１つの免疫化学的に同一のエピト
ープを有するタンパク質分子のオリゴマーとして構成さ
れている。
より生じたＤダイマーのように、１つの分子又はタンパ
ク質内にいくつかの免疫化学的に同一のエピトープを有
するタンパク質は“分子内オリゴマー”とも呼ばれる。
ここでＤダイマーは少くとも生理学的条件下では、各ケ
ースにおいて少くとも１つの免疫化学的に同一のエピト
ープを有するタンパク質分子のオリゴマーとして構成さ
れている。
【０００４】凝固系の望ましくない活性化が多くの病的
状況下において血管系で生じることがあり、結果として
閉塞を起こす。これは重度の心臓発作と血栓塞栓症を引
き起こすことがある。これらの過剰な凝固症状のために
血栓溶解剤で治療されている患者においては、治療を管
理する目的から溶解の成功がモニターされねばならな
い。これはＤダイマーを測定することによって行われ
る。しかしながら、血栓溶解剤は特異的でなく、そのた
めフィブリノーゲンもプラスミンの全身的活性化のため
にかなりの程度まで分解されてしまう。Ｅ断片を測定す
ることで適宜にこのフィブリノーゲン分解を検出するこ
とができる。フィブリノーゲンは例えば汎発性血管内凝
固（ＤＩＣ）を進行させる過剰フィブリン分解条件下、
例えば補体系により敗血症で誘発される条件下、でも主
に分解される。しかしながら、フィブリノーゲンの消費
は高い出血の危険性を更に招き、このためその危険性は
断片Ｅを測定することで適宜に診断上認識され、それに
より治療上において抑制することができる。
状況下において血管系で生じることがあり、結果として
閉塞を起こす。これは重度の心臓発作と血栓塞栓症を引
き起こすことがある。これらの過剰な凝固症状のために
血栓溶解剤で治療されている患者においては、治療を管
理する目的から溶解の成功がモニターされねばならな
い。これはＤダイマーを測定することによって行われ
る。しかしながら、血栓溶解剤は特異的でなく、そのた
めフィブリノーゲンもプラスミンの全身的活性化のため
にかなりの程度まで分解されてしまう。Ｅ断片を測定す
ることで適宜にこのフィブリノーゲン分解を検出するこ
とができる。フィブリノーゲンは例えば汎発性血管内凝
固（ＤＩＣ）を進行させる過剰フィブリン分解条件下、
例えば補体系により敗血症で誘発される条件下、でも主
に分解される。しかしながら、フィブリノーゲンの消費
は高い出血の危険性を更に招き、このためその危険性は
断片Ｅを測定することで適宜に診断上認識され、それに
より治療上において抑制することができる。
【０００５】例えば赤血球凝集阻止試験のような多くの
方法がフィブリン（フィブリノーゲン）の分解産物を検
出するために知られている(Mersky C.et al.,"A rapid,
simple,sensitive method for measuring fibrinolytic
split products in human serum",Proc.Soc.Exp.Biol.
Med.131:871-875(1969))。この原理は Schifreenら"Aqu
antitative automated immunoassay for fibrinogen/fi
brin degradation products",Clin.Chem.31:1468-1473
(1985)により採用されているが、但し赤血球はラテック
ス粒子で置き換えられている。
方法がフィブリン（フィブリノーゲン）の分解産物を検
出するために知られている(Mersky C.et al.,"A rapid,
simple,sensitive method for measuring fibrinolytic
split products in human serum",Proc.Soc.Exp.Biol.
Med.131:871-875(1969))。この原理は Schifreenら"Aqu
antitative automated immunoassay for fibrinogen/fi
brin degradation products",Clin.Chem.31:1468-1473
(1985)により採用されているが、但し赤血球はラテック
ス粒子で置き換えられている。
【０００６】フィブリン（フィブリノーゲン）分解産物
を測定するための他の凝集アッセイではフィブリン（フ
ィブリノーゲン）分解産物に対する抗体で被覆されたラ
テックス粒子を利用している。その既知抗体は天然分解
産物で免疫することにより生産された。種々の特異性を
有する抗体が用いられた。
を測定するための他の凝集アッセイではフィブリン（フ
ィブリノーゲン）分解産物に対する抗体で被覆されたラ
テックス粒子を利用している。その既知抗体は天然分解
産物で免疫することにより生産された。種々の特異性を
有する抗体が用いられた。
【０００７】フィブリノーゲンとの交差反応性が存在す
ることはポリクローナル抗体又はフィブリノーゲンレセ
プターを用いるアッセイに共通して見られる特徴であ
る。そのアッセイで必要なサンプル前処理の結果とし
て、そのサンプルは異なる量のフィブリノーゲン及び人
工生産開裂産物を含有しており、そのためこれらの方法
ではせいぜい半定量的に判定できるだけである（Gaffne
y P.J.and Perry M.J.,"Unreliability of current ser
um degradation products (FDP) assays" ,Thromb.Haem
ost.53:301-302(1985);Nieuwenhuizen W.,"Plasma assa
ys of fibrinogen/fibrin degradation products and t
heir clinical relevance":Fibrinogen 2,Biochemistr
y,Physiology and Clinical Relevance.G.D.O.Lowe et
al.,Edt.,173-180(1987))。
ることはポリクローナル抗体又はフィブリノーゲンレセ
プターを用いるアッセイに共通して見られる特徴であ
る。そのアッセイで必要なサンプル前処理の結果とし
て、そのサンプルは異なる量のフィブリノーゲン及び人
工生産開裂産物を含有しており、そのためこれらの方法
ではせいぜい半定量的に判定できるだけである（Gaffne
y P.J.and Perry M.J.,"Unreliability of current ser
um degradation products (FDP) assays" ,Thromb.Haem
ost.53:301-302(1985);Nieuwenhuizen W.,"Plasma assa
ys of fibrinogen/fibrin degradation products and t
heir clinical relevance":Fibrinogen 2,Biochemistr
y,Physiology and Clinical Relevance.G.D.O.Lowe et
al.,Edt.,173-180(1987))。
【０００８】抗体の特異性によって、モノクローナル抗
体を用いるアッセイでは無傷のフィブリノーゲン又はフ
ィブリンとの交差反応性の問題が避けられていることは
事実である。しかしながら、凝集アッセイにおける使用
では、検出されるエピトープは凝集物を形成するために
抗原上で２度抗体に対して利用できねばならない。この
理由から、例えばＤモノマーに対するモノクローナル抗
体を用いる上記ラテックスアッセイ（例えば、特許出願
ＷＯ第８６／０１２９８号）では、Ｄモノマーではなく
架橋後にフィブリンのみから生じるＤダイマーを認識す
る（Gaffney P.J.et al.,"Monoclonal antibodies agai
nst fibrinogen,fibrin and their fragments",Thromb.
Haemost.54:733-734(1985) 参照）。このためこれらの
試験はフィブリン（フィブリノーゲン）分解産物を調べ
る上で適さない。
体を用いるアッセイでは無傷のフィブリノーゲン又はフ
ィブリンとの交差反応性の問題が避けられていることは
事実である。しかしながら、凝集アッセイにおける使用
では、検出されるエピトープは凝集物を形成するために
抗原上で２度抗体に対して利用できねばならない。この
理由から、例えばＤモノマーに対するモノクローナル抗
体を用いる上記ラテックスアッセイ（例えば、特許出願
ＷＯ第８６／０１２９８号）では、Ｄモノマーではなく
架橋後にフィブリンのみから生じるＤダイマーを認識す
る（Gaffney P.J.et al.,"Monoclonal antibodies agai
nst fibrinogen,fibrin and their fragments",Thromb.
Haemost.54:733-734(1985) 参照）。このためこれらの
試験はフィブリン（フィブリノーゲン）分解産物を調べ
る上で適さない。
【０００９】これらの均質試験に加えて、ＥＬＩＳＡは
モノクローナル抗体によってフィブリノーゲン及びフィ
ブリン開裂産物間を識別できると最近記載された（Kopp
ertP.W.ら,"A monoclonal antibody-based enzyme immu
noassay for fibrin degradation products in plasm
a",Thromb.Haemostas.59:310-315(1988))。
モノクローナル抗体によってフィブリノーゲン及びフィ
ブリン開裂産物間を識別できると最近記載された（Kopp
ertP.W.ら,"A monoclonal antibody-based enzyme immu
noassay for fibrin degradation products in plasm
a",Thromb.Haemostas.59:310-315(1988))。
【００１０】しかしながら、均質法と比較して、いわゆ
るＥＬＩＳＡ法は基本的な理由から手間と時間がかか
り、かつ概して自動化が困難な方法である。
るＥＬＩＳＡ法は基本的な理由から手間と時間がかか
り、かつ概して自動化が困難な方法である。
【００１１】トロンビンの影響下で生じるフィブリンの
α鎖のＮ末端からのヘキサペプチドの使用はドイツ国Ｄ
Ｅ第３７ ０１ ８１２号明細書で開示されている。
α鎖のＮ末端からのヘキサペプチドの使用はドイツ国Ｄ
Ｅ第３７ ０１ ８１２号明細書で開示されている。
【００１２】Hui K.Y.ら("Monoclonal antibodies to a
synthetic fibrin-like peptide bind to human fibri
n but not fibrinogen",Science 222:1129-1132(1983))
はβ鎖の対応Ｎ末端からのヘプタペプチドを用いた。こ
れらの方法から得られる抗体はフィブリンのみを認識
し、いかなるフィブリン（フィブリノーゲン）開裂産物
も認識しない。これらのアッセイと更にフィブリノーゲ
ンからフィブリンへのトロンビンによる開裂の間に放出
されるＡ及びＢフィブリノペプチドの検出は、過剰フィ
ブリン分解ではなく過剰凝固症状を診断するために使用
できる。
synthetic fibrin-like peptide bind to human fibri
n but not fibrinogen",Science 222:1129-1132(1983))
はβ鎖の対応Ｎ末端からのヘプタペプチドを用いた。こ
れらの方法から得られる抗体はフィブリンのみを認識
し、いかなるフィブリン（フィブリノーゲン）開裂産物
も認識しない。これらのアッセイと更にフィブリノーゲ
ンからフィブリンへのトロンビンによる開裂の間に放出
されるＡ及びＢフィブリノペプチドの検出は、過剰フィ
ブリン分解ではなく過剰凝固症状を診断するために使用
できる。
【００１３】断片Ｅとのみ反応して天然フィブリノーゲ
ン又はフィブリンを認識しない特定の抗体がヒト血液、
滑液又は尿中でフィブリン（フィブリノーゲン）開裂産
物を検出するために必要である。更に、これらの抗体は
容易に得ることができ、すべての周知の免疫化学法、即
ち不均質及び均質双方の試験法、で使用される。
ン又はフィブリンを認識しない特定の抗体がヒト血液、
滑液又は尿中でフィブリン（フィブリノーゲン）開裂産
物を検出するために必要である。更に、これらの抗体は
容易に得ることができ、すべての周知の免疫化学法、即
ち不均質及び均質双方の試験法、で使用される。
【００１４】［発明の概要］したがって、本発明はフィ
ブリノーゲン及びフィブリンの開裂産物に対する抗体を
形成する抗原の提供をその目的としており、その抗体は
精製が容易で特異的であり、このためフィブリノーゲン
又はフィブリンの含有量にかかわらず生物の体液中にお
けるフィブリン分解活性を正確に定量することができる
ものである。更に、これらの抗体によれば不均質アッセ
イに加えて均質イムノアッセイ技術の使用が可能とな
る。
ブリノーゲン及びフィブリンの開裂産物に対する抗体を
形成する抗原の提供をその目的としており、その抗体は
精製が容易で特異的であり、このためフィブリノーゲン
又はフィブリンの含有量にかかわらず生物の体液中にお
けるフィブリン分解活性を正確に定量することができる
ものである。更に、これらの抗体によれば不均質アッセ
イに加えて均質イムノアッセイ技術の使用が可能とな
る。
【００１５】意外にも、断片ＥのＣ末端領域由来の合成
ペプチドで動物を免疫することにより、フィブリノーゲ
ン又はフィブリンと反応せずにすべての３つのＥ断片と
特異的に反応する抗体が得られ、更に凝集アッセイにも
使用できることが見出だされた。
ペプチドで動物を免疫することにより、フィブリノーゲ
ン又はフィブリンと反応せずにすべての３つのＥ断片と
特異的に反応する抗体が得られ、更に凝集アッセイにも
使用できることが見出だされた。
【００１６】したがって、本発明は、Ｅ断片のカルボキ
シ末端と少くとも部分的に対応するアミノ酸配列を有
し、その末端がプラスミンによるフィブリノーゲンの開
裂の結果生じ、かつ、抗原性を有する合成ペプチドに関
する。
シ末端と少くとも部分的に対応するアミノ酸配列を有
し、その末端がプラスミンによるフィブリノーゲンの開
裂の結果生じ、かつ、抗原性を有する合成ペプチドに関
する。
【００１７】好ましくは、それらは下記アミノ酸配列の
うち少くとも１つを含んでなるもの、である。 ａ）Leu-Phe-Glu-Tyr-Gln-Lys-OH ｂ）Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Lys-OH ｃ）Val-Lys-Glu-Leu-Ile-Lys-OH及び ｄ）His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys-OH
うち少くとも１つを含んでなるもの、である。 ａ）Leu-Phe-Glu-Tyr-Gln-Lys-OH ｂ）Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Lys-OH ｃ）Val-Lys-Glu-Leu-Ile-Lys-OH及び ｄ）His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys-OH
【００１８】特に好ましくは、下記アミノ酸配列のうち
少くとも１つを含んでなるもの、である。 ａ）Asn-Lys-Leu-Lys-Asn-Ser-Leu-Phe-Glu-Tyr-Gln-Ly
s-OH ｂ）Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Gln-Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Ly
s-OH ｃ）Glu-Asn-Lys-Thr-Ser-Gln-Val-Lys-Gln-Leu-Ile-Ly
s-OH及び ｄ）Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Ly
s-OH
少くとも１つを含んでなるもの、である。 ａ）Asn-Lys-Leu-Lys-Asn-Ser-Leu-Phe-Glu-Tyr-Gln-Ly
s-OH ｂ）Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Gln-Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Ly
s-OH ｃ）Glu-Asn-Lys-Thr-Ser-Gln-Val-Lys-Gln-Leu-Ile-Ly
s-OH及び ｄ）Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Ly
s-OH
【００１９】更に好ましくは、下記アミノ酸配列のうち
少くとも１つを含んでなるもの、である。
少くとも１つを含んでなるもの、である。
【００２０】
【化２】
【００２１】ペプチド１〜３に対応するアミノ酸配列か
ら構成されるペプチドも好ましい。
ら構成されるペプチドも好ましい。
【００２２】本発明によるペプチドは、キャリア分子に
直接又はスペーサーを介して結合されていてもよい。ま
た、これらは遺伝子操作又は化学合成により調製され
る。
直接又はスペーサーを介して結合されていてもよい。ま
た、これらは遺伝子操作又は化学合成により調製され
る。
【００２３】本発明は更に本発明によるペプチドと免疫
化学的に反応する抗体に関する。これらの抗体は本発明
によるペプチドで動物を免疫することにより得られる。
特にそれらがポリクローナルであるならば、本発明によ
る抗体は本発明によるペプチドに免疫吸着されることで
単離及び精製されることが好ましい。本発明による抗体
は好ましくは当業者に公知の方法により調整されるモノ
クローナル抗体であってもよい。
化学的に反応する抗体に関する。これらの抗体は本発明
によるペプチドで動物を免疫することにより得られる。
特にそれらがポリクローナルであるならば、本発明によ
る抗体は本発明によるペプチドに免疫吸着されることで
単離及び精製されることが好ましい。本発明による抗体
は好ましくは当業者に公知の方法により調整されるモノ
クローナル抗体であってもよい。
【００２４】本発明は、また、特にフィブリン（フィブ
リノーゲン）Ｅ断片及びＤダイマーを測定するために本
発明によるペプチド及び／又は本発明による抗体を用い
た、フィブリノーゲン及びフィブリンの開裂産物の分子
内オリゴマーを免疫化学的に測定する診断方法に関す
る。
リノーゲン）Ｅ断片及びＤダイマーを測定するために本
発明によるペプチド及び／又は本発明による抗体を用い
た、フィブリノーゲン及びフィブリンの開裂産物の分子
内オリゴマーを免疫化学的に測定する診断方法に関す
る。
【００２５】この関係において、不均質イムノアッセイ
が好ましく、酵素イムノアッセイが特に好ましい。
が好ましく、酵素イムノアッセイが特に好ましい。
【００２６】また、好ましくは均質イムノアッセイ、特
に好ましくは粒子ブースト化（particle-boosted）比ろ
う法又は濁り測定法、が用いられる。
に好ましくは粒子ブースト化（particle-boosted）比ろ
う法又は濁り測定法、が用いられる。
【００２７】本方法においては、抗体の一部が固相に結
合され、他の部分は検出されうる機能を担持しているこ
とが有利であり、その場合に固相として微量滴定プレー
トを用い、検出しうる機能がケイ光又は発光色素又は酵
素である方法が好ましい。均質イムノアッセイにおい
て、粒状非水溶性支持体が固相として有利に用いられ、
凝集反応が比ろう法又は濁り測定法で測定される。不均
質及び均質法において、ただ１つの単一特異性種（mono
specific species）が有利に用いられるが、しかしなが
ら捕捉抗体が本発明による抗体であって、検出抗体がそ
れとは異なっている方法も有利である。
合され、他の部分は検出されうる機能を担持しているこ
とが有利であり、その場合に固相として微量滴定プレー
トを用い、検出しうる機能がケイ光又は発光色素又は酵
素である方法が好ましい。均質イムノアッセイにおい
て、粒状非水溶性支持体が固相として有利に用いられ、
凝集反応が比ろう法又は濁り測定法で測定される。不均
質及び均質法において、ただ１つの単一特異性種（mono
specific species）が有利に用いられるが、しかしなが
ら捕捉抗体が本発明による抗体であって、検出抗体がそ
れとは異なっている方法も有利である。
【００２８】本発明は治療、特にフィブリン分解系の障
害の治療、のための本発明によるペプチドの使用にも関
する。本発明は更に治療、特にフィブリン分解系の障害
の治療、のための本発明による抗体の使用にも関する。
害の治療、のための本発明によるペプチドの使用にも関
する。本発明は更に治療、特にフィブリン分解系の障害
の治療、のための本発明による抗体の使用にも関する。
【００２９】これに加えて、本発明は分子内オリゴマー
を調べるための免疫化学方法に関し、その方法において
は１つの単一特異性抗体種のみが用いられる。その方法
は不均質アッセイ、好ましくは酵素イムノアッセイ、又
は均質イムノアッセイ、好ましくは粒子ブースト化比ろ
う法又は濁り測定法であってもよい。不均質イムノアッ
セイにおいて、抗体の一部は固相に結合され、他の部分
は検出しうる機能を担持していることが有利である。こ
の関係において、微量滴定プレートが固相として用いら
れることが好ましく、検出しうる機能はケイ光もしくは
発光色素又は酵素である。
を調べるための免疫化学方法に関し、その方法において
は１つの単一特異性抗体種のみが用いられる。その方法
は不均質アッセイ、好ましくは酵素イムノアッセイ、又
は均質イムノアッセイ、好ましくは粒子ブースト化比ろ
う法又は濁り測定法であってもよい。不均質イムノアッ
セイにおいて、抗体の一部は固相に結合され、他の部分
は検出しうる機能を担持していることが有利である。こ
の関係において、微量滴定プレートが固相として用いら
れることが好ましく、検出しうる機能はケイ光もしくは
発光色素又は酵素である。
【００３０】特定の作用メカニズムについて明確化しよ
うとするものではないが、カルボキシ末端におけるリジ
ンが本発明によるペプチドにとり重要であるという仮説
が正当と思われる。
うとするものではないが、カルボキシ末端におけるリジ
ンが本発明によるペプチドにとり重要であるという仮説
が正当と思われる。
【００３１】本発明によるペプチドは当業者にそれ自体
公知である方法により製造される。例えば保護アミノ酸
誘導体又はペプチドセグメントがこの場合液中又は固相
で互いにカップリングされ、本発明によるペプチドが保
護基の除去により、固相の場合にはキャリア樹脂からの
開裂により得られる（実施例１）。この関係において、
Ｆｍｏｃ基が一時的な保護基として用いられることが好
ましく、側鎖の場合にはｔ‐ブチル／Ｂｏｃベース基、
Ａｒｇの場合にはＰｍｃ又はＭｔｒ基、Ｃｙｓの場合に
はtert‐ブチルメルカプト又はトリチル基が永続的保護
基として用いられることが好ましい。Ｃ末端アミノ酸は
ペプチド合成に慣習上適した高分子支持体、好ましくは
架橋ポリスチレンに結合されたｐ‐アルコキシベンジル
エステル基により固定される。ペプチド合成は好ましく
はＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中２０％(v/v) ピペ
リジンを用いてＦｍｏｃを反復脱離し、好ましくはＨＯ
Ｂｔの存在下でカルボジイミドを用いて次の保護アミノ
酸をカップリングすることにより行う。この目的のた
め、アミノ酸誘導体はＤＭＦ中過剰量、好ましくは３倍
量で１〜１．５時間かけてカップリングされる。各操作
段階、すなわちＦｍｏｃ脱離又は縮合段階後に、樹脂は
各場合毎に少量（１５ml/g）のＤＭＦ又はイソプロパノ
ールで３回洗浄される。本発明によるペプチドは酸加水
分解により開裂され、側鎖基が同時に遊離される。適切
であれば、保護される予定でないスルフヒドリル基は、
例えばトリフルオロエタノールのようなアルコール中ト
リ‐ｎ‐ブチルホスフィンで又は水中ＤＴＴで“脱保
護”される。Ｃｙｓ（ＴｒＴ）脱保護の場合において、
捕捉剤としてエタンジチオールを用いる別の操作段階は
不要である。ペプチドは例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、逆相クロマトグラフィー及びゲル浸透クロマト
グラフィーにより精製できる。ペプチドの正確な組成と
ペプチド含有率はアミノ酸分析により調べられる。
公知である方法により製造される。例えば保護アミノ酸
誘導体又はペプチドセグメントがこの場合液中又は固相
で互いにカップリングされ、本発明によるペプチドが保
護基の除去により、固相の場合にはキャリア樹脂からの
開裂により得られる（実施例１）。この関係において、
Ｆｍｏｃ基が一時的な保護基として用いられることが好
ましく、側鎖の場合にはｔ‐ブチル／Ｂｏｃベース基、
Ａｒｇの場合にはＰｍｃ又はＭｔｒ基、Ｃｙｓの場合に
はtert‐ブチルメルカプト又はトリチル基が永続的保護
基として用いられることが好ましい。Ｃ末端アミノ酸は
ペプチド合成に慣習上適した高分子支持体、好ましくは
架橋ポリスチレンに結合されたｐ‐アルコキシベンジル
エステル基により固定される。ペプチド合成は好ましく
はＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中２０％(v/v) ピペ
リジンを用いてＦｍｏｃを反復脱離し、好ましくはＨＯ
Ｂｔの存在下でカルボジイミドを用いて次の保護アミノ
酸をカップリングすることにより行う。この目的のた
め、アミノ酸誘導体はＤＭＦ中過剰量、好ましくは３倍
量で１〜１．５時間かけてカップリングされる。各操作
段階、すなわちＦｍｏｃ脱離又は縮合段階後に、樹脂は
各場合毎に少量（１５ml/g）のＤＭＦ又はイソプロパノ
ールで３回洗浄される。本発明によるペプチドは酸加水
分解により開裂され、側鎖基が同時に遊離される。適切
であれば、保護される予定でないスルフヒドリル基は、
例えばトリフルオロエタノールのようなアルコール中ト
リ‐ｎ‐ブチルホスフィンで又は水中ＤＴＴで“脱保
護”される。Ｃｙｓ（ＴｒＴ）脱保護の場合において、
捕捉剤としてエタンジチオールを用いる別の操作段階は
不要である。ペプチドは例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、逆相クロマトグラフィー及びゲル浸透クロマト
グラフィーにより精製できる。ペプチドの正確な組成と
ペプチド含有率はアミノ酸分析により調べられる。
【００３２】アミノ酸１〜６２のフィブリノーゲンのγ
鎖の領域に対応するペプチド又はポリペプチドに対する
抗体は、異なる形のＥ断片と特異的に反応する（例７参
照）。上記領域からの完全なポリペプチドとこれらペプ
チドの成分配列は双方とも免疫に適する。特に好ましい
態様では例えば、Ｅ断片のγ鎖のＣ末端由来の配列Val-
Asp-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gl
n-Val-Glu-Asn-Lys を有するオクタデカペプチドを用い
る。
鎖の領域に対応するペプチド又はポリペプチドに対する
抗体は、異なる形のＥ断片と特異的に反応する（例７参
照）。上記領域からの完全なポリペプチドとこれらペプ
チドの成分配列は双方とも免疫に適する。特に好ましい
態様では例えば、Ｅ断片のγ鎖のＣ末端由来の配列Val-
Asp-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gl
n-Val-Glu-Asn-Lys を有するオクタデカペプチドを用い
る。
【００３３】上記の場合、分子のカルボキシ末端配列は
露出されて免疫を行えるということが重要である。
露出されて免疫を行えるということが重要である。
【００３４】ペプチドに関して考えられる用法からみ
て、反応性側鎖保有アミノ酸をそれらがハプテンの構造
に影響を与えないようにペプチド中に導入することが好
ましい。この理由から、その遊離ＳＨ基が多くのキャリ
アにチオエーテルを介してカップリングさせる上で適し
ているシステインは、適切であればＮ末端に便宜上加え
られる。例えば、上記ペプチドで表される抗原はノナデ
カペプチドCys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-
Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys の形で利用され
ることが好ましい。
て、反応性側鎖保有アミノ酸をそれらがハプテンの構造
に影響を与えないようにペプチド中に導入することが好
ましい。この理由から、その遊離ＳＨ基が多くのキャリ
アにチオエーテルを介してカップリングさせる上で適し
ているシステインは、適切であればＮ末端に便宜上加え
られる。例えば、上記ペプチドで表される抗原はノナデ
カペプチドCys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-
Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys の形で利用され
ることが好ましい。
【００３５】免疫に用いられるペプチドは、遺伝子操作
で調製されたポリペプチドを精製するかあるいはプロテ
アーゼの作用で及び／又は化学的に例えばペプチド鎖を
開裂する臭化シアンのような試薬の作用で断片Ｅから生
化学的に得られるペプチドを精製することによるだけで
はなく当業者にそれ自体周知の方法で化学合成によって
も調製できる。
で調製されたポリペプチドを精製するかあるいはプロテ
アーゼの作用で及び／又は化学的に例えばペプチド鎖を
開裂する臭化シアンのような試薬の作用で断片Ｅから生
化学的に得られるペプチドを精製することによるだけで
はなく当業者にそれ自体周知の方法で化学合成によって
も調製できる。
【００３６】免疫に用いられる又は免疫吸着剤として用
いられるペプチドは実用上キャリア分子にカップリング
される。カップリング方法は当業者にそれ自体周知であ
り、文献に記載されている(Nakane,P.K.ら,"Peroxidase
-Labeled Antibody-A New Method of Conjugation",J.H
istochem.Cytochem,22:1084-1091(1974),Freifelder,D.
M.,"Physical Biochemistry",W.H.Freeman 及びCo.197
6)。本発明においてキャリア分子は免疫反応性複合体を
産生するために当業者によって用いられるような天然又
は合成高分子、例えばアルブミン、オボアルブミン、カ
サガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン又は多糖類であ
る。好ましい態様において、ペプチド又はポリペプチド
はカサガイヘモシアニンに結合される。
いられるペプチドは実用上キャリア分子にカップリング
される。カップリング方法は当業者にそれ自体周知であ
り、文献に記載されている(Nakane,P.K.ら,"Peroxidase
-Labeled Antibody-A New Method of Conjugation",J.H
istochem.Cytochem,22:1084-1091(1974),Freifelder,D.
M.,"Physical Biochemistry",W.H.Freeman 及びCo.197
6)。本発明においてキャリア分子は免疫反応性複合体を
産生するために当業者によって用いられるような天然又
は合成高分子、例えばアルブミン、オボアルブミン、カ
サガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン又は多糖類であ
る。好ましい態様において、ペプチド又はポリペプチド
はカサガイヘモシアニンに結合される。
【００３７】免疫吸着剤として本発明による合成ペプチ
ドを用いる場合には、固体マトリックスを製造するため
に適した物質にそれらをカップリングさせること好まし
い。この場合にはキャリア分子は、例えばポリスチレ
ン、ナイロン、アガロース又は磁化性粒子のようなタン
パク質及びペプチドを固定する上で当業者により用いら
れるような不溶性ポリマーである。この関係において、
固相は例えば小さなチューブ、不織布、球、繊維又は微
粒子として何らかの望ましい形で存在させることができ
る。
ドを用いる場合には、固体マトリックスを製造するため
に適した物質にそれらをカップリングさせること好まし
い。この場合にはキャリア分子は、例えばポリスチレ
ン、ナイロン、アガロース又は磁化性粒子のようなタン
パク質及びペプチドを固定する上で当業者により用いら
れるような不溶性ポリマーである。この関係において、
固相は例えば小さなチューブ、不織布、球、繊維又は微
粒子として何らかの望ましい形で存在させることができ
る。
【００３８】好ましい態様ではペプチド、例えば上記ノ
ナデカペプチド、を臭化シアン活性化セファロースにカ
ップリングさせる。
ナデカペプチド、を臭化シアン活性化セファロースにカ
ップリングさせる。
【００３９】キャリア結合ペプチドによる適切な動物の
免疫によって再現的に抗体を形成することができる。こ
の関係において、免疫および抗体の単離にとって好まし
い動物種はウサギである。これに加えて、マウスを免疫
に用いてもよい。
免疫によって再現的に抗体を形成することができる。こ
の関係において、免疫および抗体の単離にとって好まし
い動物種はウサギである。これに加えて、マウスを免疫
に用いてもよい。
【００４０】特異性試験に関連した免疫グロブリン分画
は、本発明に従い合成ペプチドを用いて動物で産生され
たこのような抗血清から慣習的免疫吸着法により濃縮で
きる。しかしながら、この場合において、免疫吸着に用
いられるこのようなマトリックス向けの物質として、キ
ャリアにカップリングされて免疫に用いられるペプチド
と同様の抗原決定基を有するペプチドを用いることも同
様に好ましい。免疫吸着精製に用いられるペプチドは端
部切取りアミノ酸配列を有していてもよい。望ましい抗
体の免疫吸着精製でその使用上唯一の前提条件は、この
短縮ポリペプチドにより形成される抗原決定基が望まし
い抗体により認識されて効率的に結合されることであ
る。
は、本発明に従い合成ペプチドを用いて動物で産生され
たこのような抗血清から慣習的免疫吸着法により濃縮で
きる。しかしながら、この場合において、免疫吸着に用
いられるこのようなマトリックス向けの物質として、キ
ャリアにカップリングされて免疫に用いられるペプチド
と同様の抗原決定基を有するペプチドを用いることも同
様に好ましい。免疫吸着精製に用いられるペプチドは端
部切取りアミノ酸配列を有していてもよい。望ましい抗
体の免疫吸着精製でその使用上唯一の前提条件は、この
短縮ポリペプチドにより形成される抗原決定基が望まし
い抗体により認識されて効率的に結合されることであ
る。
【００４１】抗体の免疫吸着単離に用いられるペプチド
は例えばノナデカペプチドであり、ペプチドCys-Val-As
p-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gln-
Val-Glu-Asn-Lys が好ましい。本発明によれば、抗体は
合成ペプチドで免疫することにより動物系で誘導され、
しかる後適宜に免疫吸着により精製される。これらの抗
体は免疫及び精製に用いられるペプチドと特異的に反応
する。
は例えばノナデカペプチドであり、ペプチドCys-Val-As
p-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gln-
Val-Glu-Asn-Lys が好ましい。本発明によれば、抗体は
合成ペプチドで免疫することにより動物系で誘導され、
しかる後適宜に免疫吸着により精製される。これらの抗
体は免疫及び精製に用いられるペプチドと特異的に反応
する。
【００４２】免疫吸着剤として適切なペプチドを選択す
ることにより、この分子のプラスミンによる開裂部位に
相当する断片Ｅの抗原決定基と好ましく特異的に反応す
る抗体が選択できる。プラスミン認識配列のＣ末端領域
由来の配列を有するペプチドが免疫と免疫吸着精製の双
方に用いられる好ましいケースにおいては、これらの配
列に対する抗体が濃縮される。
ることにより、この分子のプラスミンによる開裂部位に
相当する断片Ｅの抗原決定基と好ましく特異的に反応す
る抗体が選択できる。プラスミン認識配列のＣ末端領域
由来の配列を有するペプチドが免疫と免疫吸着精製の双
方に用いられる好ましいケースにおいては、これらの配
列に対する抗体が濃縮される。
【００４３】本発明による性質を有するモノクローナル
抗体も当業者にそれ自体公知である方法、により有利に
調製される。
抗体も当業者にそれ自体公知である方法、により有利に
調製される。
【００４４】本発明により単離された抗体は当業者にそ
れ自体公知である例えば酵素イムノアッセイ又は遊離も
しくは粒子ブースト化凝集反応のような均質及び不均質
イムノアッセイ、で用いることができる。好ましくは、
それらはこの目的のために固体担体にカップリングされ
る。当業者にそれ自体公知である天然及び合成の有機及
び無機ポリマーが適切な固体非水溶性担体である。例え
ば、ポリスチレン、ポリデキストラン、ポリプロピレ
ン、ポリビニルクロリド、ポリビニリデンフルオリド、
ポリアクリルアミド、アガロース、ラテックス、マグネ
タイト、多孔質ガラス粉、赤血球、白血球、血小板又は
スチレン‐ブタジエン、スチレン‐メタクリル酸もしく
はメタクリレート‐メタクリル酸からなるコポリマーが
挙げられる。チューブ、球又は微量滴定プレートが適切
な幾何学的態様である。好ましい方法において、断片Ｅ
の含有率は粒状担体に固定された抗体と共にサンプルを
インキュベートすることにより本発明に従い決定され、
固定化抗体により結合された断片Ｅの濃度はこれらの環
境下で生じる濁りによって濁り測定法又は比ろう法分析
で決定される。
れ自体公知である例えば酵素イムノアッセイ又は遊離も
しくは粒子ブースト化凝集反応のような均質及び不均質
イムノアッセイ、で用いることができる。好ましくは、
それらはこの目的のために固体担体にカップリングされ
る。当業者にそれ自体公知である天然及び合成の有機及
び無機ポリマーが適切な固体非水溶性担体である。例え
ば、ポリスチレン、ポリデキストラン、ポリプロピレ
ン、ポリビニルクロリド、ポリビニリデンフルオリド、
ポリアクリルアミド、アガロース、ラテックス、マグネ
タイト、多孔質ガラス粉、赤血球、白血球、血小板又は
スチレン‐ブタジエン、スチレン‐メタクリル酸もしく
はメタクリレート‐メタクリル酸からなるコポリマーが
挙げられる。チューブ、球又は微量滴定プレートが適切
な幾何学的態様である。好ましい方法において、断片Ｅ
の含有率は粒状担体に固定された抗体と共にサンプルを
インキュベートすることにより本発明に従い決定され、
固定化抗体により結合された断片Ｅの濃度はこれらの環
境下で生じる濁りによって濁り測定法又は比ろう法分析
で決定される。
【００４５】本発明によれば、Ｄダイマー／Ｅ複合体の
濃度もこうして固定化された抗体を用いて決定できる。
同一又は異なるいずれかの粒子に固定された第二抗体と
してＤダイマーに対する特異的抗体の使用が必要条件で
ある。２種のうち一方の抗体は立体配置：粒子‐抗体１
／抗原／遊離抗体２／抗原／粒子‐抗体１の免疫複合体
が形成されて、比ろう法又は濁り測定法で定量されるよ
うに液中で遊離して存在してもよい。
濃度もこうして固定化された抗体を用いて決定できる。
同一又は異なるいずれかの粒子に固定された第二抗体と
してＤダイマーに対する特異的抗体の使用が必要条件で
ある。２種のうち一方の抗体は立体配置：粒子‐抗体１
／抗原／遊離抗体２／抗原／粒子‐抗体１の免疫複合体
が形成されて、比ろう法又は濁り測定法で定量されるよ
うに液中で遊離して存在してもよい。
【００４６】加えて、本発明による抗体がＥＬＩＳＡ法
において固相上に固定されている不均質検出法が好まし
い。断片Ｅ又はＤダイマー／Ｅ複合体は第一インキュベ
ート段階で固定化抗体に結合される。結合抗原は同一又
は異なる抗体を用いて第二インキュベート段階で検出さ
れる。この第二抗体は測定しうる性質、例えば発色原基
質を変換又は結合しうる能力、を有さねばならない。
において固相上に固定されている不均質検出法が好まし
い。断片Ｅ又はＤダイマー／Ｅ複合体は第一インキュベ
ート段階で固定化抗体に結合される。結合抗原は同一又
は異なる抗体を用いて第二インキュベート段階で検出さ
れる。この第二抗体は測定しうる性質、例えば発色原基
質を変換又は結合しうる能力、を有さねばならない。
【００４７】第二抗体は、例えば酵素、フルオレセイン
イソチオシアネートのようなケイ光分子、放射性標識又
は化学発光しうる分子を付加してもよい。好ましくは、
この第二抗体はマーカー酵素と結合され、ペルオキシダ
ーゼが特に好ましい。
イソチオシアネートのようなケイ光分子、放射性標識又
は化学発光しうる分子を付加してもよい。好ましくは、
この第二抗体はマーカー酵素と結合され、ペルオキシダ
ーゼが特に好ましい。
【００４８】断片Ｅ又はＤダイマー／Ｅ複合体は好まし
くは血漿のサンプルと標識抗体を固定された抗体と一緒
に同時にインキュベートすることによっても測定するこ
とができる。これに加えて、標識及び未標識断片Ｅ又は
Ｄダイマー／Ｅ複合体が固定化された抗体の結合部位に
対して競合する競合測定法が可能である。こうして測定
された断片Ｅ又はＤダイマー／Ｅ複合体の含有率からフ
ィブリン分解系の活性化の程度について結論を引き出す
ことができる。
くは血漿のサンプルと標識抗体を固定された抗体と一緒
に同時にインキュベートすることによっても測定するこ
とができる。これに加えて、標識及び未標識断片Ｅ又は
Ｄダイマー／Ｅ複合体が固定化された抗体の結合部位に
対して競合する競合測定法が可能である。こうして測定
された断片Ｅ又はＤダイマー／Ｅ複合体の含有率からフ
ィブリン分解系の活性化の程度について結論を引き出す
ことができる。
【００４９】
【実施例】実施例に記載された態様は特に好ましいもの
である。以下の実施例によって本発明を説明するが、こ
れらは本発明を制限するものではない。
である。以下の実施例によって本発明を説明するが、こ
れらは本発明を制限するものではない。
【００５０】下記の略記が用いられる： ＥＬＩＳＡ 酵素イムノアッセイ（enzym linked immun
osorbent assay） ＫＬＨ カサガイヘモシアニン ＰＢＳ リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液（生理リ
ン酸緩衝液） トリス トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ＯＤ 吸光度（光学密度） Ｃｙｓ システイン アミノ酸はＤ又はＬ配置で存在できるが他で指摘されな
いかぎりそれらはＬ形で存在する。 Ｖａｌ バリン Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｌｙｓ リジン Ｃｙｓ システイン Ｌｅｕ ロイシン Ｇｌｎ グルタミン Ｓｅｒ セリン Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｉｌｅ イソロイシン Ｈｉｓ ヒスチジン Ａｓｎ アスパラギン Ｂｏｃ ｔ‐ブトキシカルボニル Ｆｍｏｃ ９‐フルオレニルメトキシカルボニル Ｍｔｒ ４‐メトキシ‐２，３，６‐トリメチルフ
ェニルスルホニル ＤＭＦ ジメチルホルムアミド ＨＯＢｔ ヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＴＴ ジチオスレイトール Ｔｒｔ トリチル なお上記略号は実施例においてのみならず明細書を通じ
て用いられている。
osorbent assay） ＫＬＨ カサガイヘモシアニン ＰＢＳ リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液（生理リ
ン酸緩衝液） トリス トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ＯＤ 吸光度（光学密度） Ｃｙｓ システイン アミノ酸はＤ又はＬ配置で存在できるが他で指摘されな
いかぎりそれらはＬ形で存在する。 Ｖａｌ バリン Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｌｙｓ リジン Ｃｙｓ システイン Ｌｅｕ ロイシン Ｇｌｎ グルタミン Ｓｅｒ セリン Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｉｌｅ イソロイシン Ｈｉｓ ヒスチジン Ａｓｎ アスパラギン Ｂｏｃ ｔ‐ブトキシカルボニル Ｆｍｏｃ ９‐フルオレニルメトキシカルボニル Ｍｔｒ ４‐メトキシ‐２，３，６‐トリメチルフ
ェニルスルホニル ＤＭＦ ジメチルホルムアミド ＨＯＢｔ ヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＴＴ ジチオスレイトール Ｔｒｔ トリチル なお上記略号は実施例においてのみならず明細書を通じ
て用いられている。
【００５１】例１ 免疫用抗原の調製 ａ）Cys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-Asp-Il
e-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys の合成 Fmoc-Lys(Boc)-ｐ‐アルコキシベンジルエステル樹脂１
ｇをＤＭＦ１５mlで２回１分間かけて洗浄し、Ｆｍｏｃ
基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ(v/v)(１×３min,１×１
０min)で脱離させた。次いで樹脂をＤＭＦ又はイソプロ
パノールで３回（各場合１５ml）及びＤＭＦ１５mlで２
回洗浄した。ＤＭＦ１５mlに溶解されたＦｍｏｃアミノ
酸１．５mmol及びＨＯＢｔ２．２５mmolを樹脂に加え、
ジクロロメタン中１Ｍジイソプロピルカルボジイミド溶
液１．６５mlを添加した後に混合液を室温で１．５時間
振盪した。反応はニンヒドリン試験を用いて終了につい
て調べた。次いで樹脂をＤＭＦ又はイソプロパノールで
３回（各場合１５ml）洗浄し、新たなサイクルを始め
た。Boc-Cys(Trt)を最後のアミノ酸として用いた。樹脂
を各場合に１５mlのイソプロパノール及びジエチルエー
テルで３回洗浄し、高真空下で乾燥させた。樹脂１．９
ｇをチオアニソール１ml、エタンジチオール１ml及びト
リフルオロ酢酸１８mlと一緒に室温で２時間攪拌した。
次いで混合液を濾過し、樹脂をトリフルオロ酢酸／ジク
ロロメタン（１：１）で３回洗浄し、濾液をエーテル中
で結晶化させた。粗製ペプチドをジエチルエーテルで洗
浄し、乾燥させた。ペプチドを０．５％酢酸中セファデ
ックス（商標）Ｇ２５でクロマトグラフィーに付した。
収量：４８０mg。更に精製のため、この生成物（＝免疫
ペプチド）１００mgを逆相物質（０．１％アセトニトリ
ル、勾配操作）によるプレパラティブＨＰＬＣ系でクロ
マトグラフィーに付した。ペプチドプールを凍結乾燥さ
せた。収量：３８mg。
e-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys の合成 Fmoc-Lys(Boc)-ｐ‐アルコキシベンジルエステル樹脂１
ｇをＤＭＦ１５mlで２回１分間かけて洗浄し、Ｆｍｏｃ
基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ(v/v)(１×３min,１×１
０min)で脱離させた。次いで樹脂をＤＭＦ又はイソプロ
パノールで３回（各場合１５ml）及びＤＭＦ１５mlで２
回洗浄した。ＤＭＦ１５mlに溶解されたＦｍｏｃアミノ
酸１．５mmol及びＨＯＢｔ２．２５mmolを樹脂に加え、
ジクロロメタン中１Ｍジイソプロピルカルボジイミド溶
液１．６５mlを添加した後に混合液を室温で１．５時間
振盪した。反応はニンヒドリン試験を用いて終了につい
て調べた。次いで樹脂をＤＭＦ又はイソプロパノールで
３回（各場合１５ml）洗浄し、新たなサイクルを始め
た。Boc-Cys(Trt)を最後のアミノ酸として用いた。樹脂
を各場合に１５mlのイソプロパノール及びジエチルエー
テルで３回洗浄し、高真空下で乾燥させた。樹脂１．９
ｇをチオアニソール１ml、エタンジチオール１ml及びト
リフルオロ酢酸１８mlと一緒に室温で２時間攪拌した。
次いで混合液を濾過し、樹脂をトリフルオロ酢酸／ジク
ロロメタン（１：１）で３回洗浄し、濾液をエーテル中
で結晶化させた。粗製ペプチドをジエチルエーテルで洗
浄し、乾燥させた。ペプチドを０．５％酢酸中セファデ
ックス（商標）Ｇ２５でクロマトグラフィーに付した。
収量：４８０mg。更に精製のため、この生成物（＝免疫
ペプチド）１００mgを逆相物質（０．１％アセトニトリ
ル、勾配操作）によるプレパラティブＨＰＬＣ系でクロ
マトグラフィーに付した。ペプチドプールを凍結乾燥さ
せた。収量：３８mg。
【００５２】同様のプロセスに従い、免疫ペプチドの下
記成分配列を特異的抗体を単離するために調製した。 精製ペプチド１：Cys-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys 精製ペプチド２：Cys-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val 精製ペプチド３：Cys-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu 精製ペプチド４：Cys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu 精製ペプチド５：Cys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln
記成分配列を特異的抗体を単離するために調製した。 精製ペプチド１：Cys-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys 精製ペプチド２：Cys-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val 精製ペプチド３：Cys-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu 精製ペプチド４：Cys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu 精製ペプチド５：Cys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln
【００５３】ｂ）複合体の調製 ＫＬＨ２０mgをｐＨ８．０の０．０５Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液に溶解し、しかる後その混合液をγ‐マレイミ
ド酪酸ヒドロキシスクシンイミドエステル２mgと一緒に
１時間攪拌した。タンパク質をセファデックス（商標）
Ｇ５０（２×３０cm）（０．１Ｍリン酸ナトリウム、
０．５mMＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）でクロマトグラフィー
に付した。溶出液を５mlまで濃縮し、免疫ペプチド２０
mgと一緒に１時間インキュベートした。透析及び凍結乾
燥後に、免疫ペプチド複合体３２mgを得た。
ム緩衝液に溶解し、しかる後その混合液をγ‐マレイミ
ド酪酸ヒドロキシスクシンイミドエステル２mgと一緒に
１時間攪拌した。タンパク質をセファデックス（商標）
Ｇ５０（２×３０cm）（０．１Ｍリン酸ナトリウム、
０．５mMＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）でクロマトグラフィー
に付した。溶出液を５mlまで濃縮し、免疫ペプチド２０
mgと一緒に１時間インキュベートした。透析及び凍結乾
燥後に、免疫ペプチド複合体３２mgを得た。
【００５４】実施例２ ウサギの免疫 ウサギ５匹を各場合において動物当たり２．６mgの抗原
で８週間かけて免疫した。ペプチド‐ＫＬＨ複合体をリ
ンパ節の近くで皮下投与した。３回の血液サンプリング
後に動物を放血させ、粗製抗血清を保存剤で安定化させ
た。収量：抗血清約２００ml／動物。
で８週間かけて免疫した。ペプチド‐ＫＬＨ複合体をリ
ンパ節の近くで皮下投与した。３回の血液サンプリング
後に動物を放血させ、粗製抗血清を保存剤で安定化させ
た。収量：抗血清約２００ml／動物。
【００５５】実施例３ 免疫吸着剤の調製 アフィニティクロマトグラフィーによる粗製抗血清の精
製のため、実施例１ａのように調製され、免疫ペプチド
の一部を包含する精製ペプチド１〜５各２５mgを固相に
共有結合で固定させた。カップリング反応は記載された
方法に従い各場合で５ｇの臭化シアン活性化セファロー
スを用いて起こした(Axen,R.ら,Nature,214:1302(196
7)）。次いで免疫吸着剤を各ケースにおいてリン酸緩衝
化塩化ナトリウム溶液（ＰＢＳ；０．１５mol/l,ｐＨ
７．２）及び酢酸（０．５mol/l,ｐＨ２．５）で洗浄し
た。使用前に吸着剤をゲル容量の３倍に相当する容量の
ＰＢＳで平衡化させた。収量：各場合において約２０ml
のペプチド‐セファロース。
製のため、実施例１ａのように調製され、免疫ペプチド
の一部を包含する精製ペプチド１〜５各２５mgを固相に
共有結合で固定させた。カップリング反応は記載された
方法に従い各場合で５ｇの臭化シアン活性化セファロー
スを用いて起こした(Axen,R.ら,Nature,214:1302(196
7)）。次いで免疫吸着剤を各ケースにおいてリン酸緩衝
化塩化ナトリウム溶液（ＰＢＳ；０．１５mol/l,ｐＨ
７．２）及び酢酸（０．５mol/l,ｐＨ２．５）で洗浄し
た。使用前に吸着剤をゲル容量の３倍に相当する容量の
ＰＢＳで平衡化させた。収量：各場合において約２０ml
のペプチド‐セファロース。
【００５６】実施例４ 特異的抗体の単離 各場合において実施例２に従い免疫ペプチドで免疫され
たウサギからの粗製抗血清５０mlを実施例３由来のペプ
チド‐セファロースのＰＢＳ平衡化２０ml容量に付し
（径１．６cm；高さ９cm）、しかる後カラムを２８０nm
の吸光度が≦０．０１になるまでＰＢＳで洗浄した。次
いで塩化ナトリウム溶液（１mol/L,ｐＨ７．０）及び脱
イオン水（ｐＨ７．０）を用いる洗浄を行い、各場合に
おいて３倍ゲル容量を用いた。抗体をグリシン溶液
（０．２mol/l,ｐＨ２．５）で免疫吸着剤から溶出さ
せ、抗体溶液を飽和トリス溶液でｐＨ７．０に調整し、
しかる後ＰＢＳに対して透析した。抗体を次の使用まで
−７０℃で貯蔵した。収量は用いられた精製ペプチド
（ＰＰ）に依存していた（表１）。
たウサギからの粗製抗血清５０mlを実施例３由来のペプ
チド‐セファロースのＰＢＳ平衡化２０ml容量に付し
（径１．６cm；高さ９cm）、しかる後カラムを２８０nm
の吸光度が≦０．０１になるまでＰＢＳで洗浄した。次
いで塩化ナトリウム溶液（１mol/L,ｐＨ７．０）及び脱
イオン水（ｐＨ７．０）を用いる洗浄を行い、各場合に
おいて３倍ゲル容量を用いた。抗体をグリシン溶液
（０．２mol/l,ｐＨ２．５）で免疫吸着剤から溶出さ
せ、抗体溶液を飽和トリス溶液でｐＨ７．０に調整し、
しかる後ＰＢＳに対して透析した。抗体を次の使用まで
−７０℃で貯蔵した。収量は用いられた精製ペプチド
（ＰＰ）に依存していた（表１）。
【００５７】表１：免疫ペプチド（ＰＰ１〜ＰＰ５）の
成分配列への免疫吸着による、実施例１の免疫ペプチド
と関係した抗血清５０mlからの抗体の収量 表１ＰＰ 配列 収量(mg) １ Cys-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys 6.5 ２ Cys-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val 7.1 ３ Cys-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu 2.3 ４ Cys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu 1.6５ Cys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln 1.2
成分配列への免疫吸着による、実施例１の免疫ペプチド
と関係した抗血清５０mlからの抗体の収量 表１ＰＰ 配列 収量(mg) １ Cys-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys 6.5 ２ Cys-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val 7.1 ３ Cys-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu 2.3 ４ Cys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu 1.6５ Cys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln 1.2
【００５８】実施例５ フィブリノーゲン及びフィブリ
ンからの断片Ｅの調製 ａ）フィブリンＥ：断片Ｅ１及びＥ２の調製 異なる分解段階のＥ断片（Ｅ１、Ｅ２及びＥ３）をOlex
a,S.& Budzynski,A.Z.,"Binding phenomena of isolate
d unique plasmic degradation products of human cro
ss-linked fibrin",J.Biol.Chem.254:4925-4932(1979)
に記載されたプロセスに従い調製した。試験フィブリノ
ーゲン〔ベーリングウェルケ社（Behringwerke AG)〕２
５０mgを０．０５mol/l トリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ
（ｐＨ７．８）１００mlに溶解し、１０mMＣａＣｌ２の
存在下でトロンビン２５０単位及びＦXIII２２５単位を
加えることにより＋３７℃で血餅に誘導した。次いでフ
ィブリン血餅を０．１５mol/l トリス‐ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）で洗浄し、しかる後５mMＣａＣｌ２の存在下で
フィブリン（フィブリノーゲン）ｇ当たり１CTA のプラ
スミンを加えることにより＋３７℃で一晩かけて開裂さ
せた。反応はアプロチニン（プラスミンCTA 当たり１０
０KIU)を加えることで停止させ、開裂産物をＡｃａ３４
ウルトラゲル（カラム径１．７cm；高さ９０cm）でゲル
クロマトグラフィーにより分離させた。ランニング緩衝
液はｐＨ７．４の０．０５mol/l トリス、０．１mol/l
ＮａＣｌ、０．０２８mol/l クエン酸ナトリウム、２５
KIU/mlアンタゴサンであった。収量：約１００mgのＤＤ
／Ｅ複合体。
ンからの断片Ｅの調製 ａ）フィブリンＥ：断片Ｅ１及びＥ２の調製 異なる分解段階のＥ断片（Ｅ１、Ｅ２及びＥ３）をOlex
a,S.& Budzynski,A.Z.,"Binding phenomena of isolate
d unique plasmic degradation products of human cro
ss-linked fibrin",J.Biol.Chem.254:4925-4932(1979)
に記載されたプロセスに従い調製した。試験フィブリノ
ーゲン〔ベーリングウェルケ社（Behringwerke AG)〕２
５０mgを０．０５mol/l トリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ
（ｐＨ７．８）１００mlに溶解し、１０mMＣａＣｌ２の
存在下でトロンビン２５０単位及びＦXIII２２５単位を
加えることにより＋３７℃で血餅に誘導した。次いでフ
ィブリン血餅を０．１５mol/l トリス‐ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）で洗浄し、しかる後５mMＣａＣｌ２の存在下で
フィブリン（フィブリノーゲン）ｇ当たり１CTA のプラ
スミンを加えることにより＋３７℃で一晩かけて開裂さ
せた。反応はアプロチニン（プラスミンCTA 当たり１０
０KIU)を加えることで停止させ、開裂産物をＡｃａ３４
ウルトラゲル（カラム径１．７cm；高さ９０cm）でゲル
クロマトグラフィーにより分離させた。ランニング緩衝
液はｐＨ７．４の０．０５mol/l トリス、０．１mol/l
ＮａＣｌ、０．０２８mol/l クエン酸ナトリウム、２５
KIU/mlアンタゴサンであった。収量：約１００mgのＤＤ
／Ｅ複合体。
【００５９】次いでＤＤ／Ｅ複合体（Ｅ１及びＥ２断片
と一緒にＤダイマーからなる複合体）をｐＨ５．５及び
＋３７℃において０．０５mol/l クエン酸塩、３Ｍ尿素
中で解離させ、Ｅ１及びＥ２断片（Ｅ１対Ｅ２の比率約
２：１）をＡｃａ３４ウルトラゲルで再びクロマトグラ
フィーに付することによりＤダイマーから分離させた。
ランニング緩衝液はｐＨ７．４の０．０５mol/l トリ
ス、１．０mol/l ＮａＣｌ、０．０２８mol/l クエン酸
ナトリウムであった。収量：約２５mgのＥ１／Ｅ２混合
物。
と一緒にＤダイマーからなる複合体）をｐＨ５．５及び
＋３７℃において０．０５mol/l クエン酸塩、３Ｍ尿素
中で解離させ、Ｅ１及びＥ２断片（Ｅ１対Ｅ２の比率約
２：１）をＡｃａ３４ウルトラゲルで再びクロマトグラ
フィーに付することによりＤダイマーから分離させた。
ランニング緩衝液はｐＨ７．４の０．０５mol/l トリ
ス、１．０mol/l ＮａＣｌ、０．０２８mol/l クエン酸
ナトリウムであった。収量：約２５mgのＥ１／Ｅ２混合
物。
【００６０】ｂ）フィブリノーゲンＥ：断片Ｅ３の調製 試験フィブリノーゲン（ベーリングウェルケ社）２５０
mgを０．０５mol/l トリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ
７．８）１００mlに溶解し、プラスミン４．７CTA を加
えた後、５mMＣａＣｌ２の存在下で３０分間かけて＋３
７℃で開裂させた。反応はアプロチニン（２００００KI
U)を加えることで停止させた。開裂産物をＡｃａ３４ウ
ルトラゲル（カラム径４cm；高さ９０cm）でゲルクロマ
トグラフィーにより分離させた。ランニング緩衝液はｐ
Ｈ５．７の０．０５mol/l トリス、１．０mol/l ＮａＣ
ｌ、０．０２８mol/l クエン酸ナトリウムを用いた。収
量：約３２mgの断片Ｅ３。
mgを０．０５mol/l トリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ
７．８）１００mlに溶解し、プラスミン４．７CTA を加
えた後、５mMＣａＣｌ２の存在下で３０分間かけて＋３
７℃で開裂させた。反応はアプロチニン（２００００KI
U)を加えることで停止させた。開裂産物をＡｃａ３４ウ
ルトラゲル（カラム径４cm；高さ９０cm）でゲルクロマ
トグラフィーにより分離させた。ランニング緩衝液はｐ
Ｈ５．７の０．０５mol/l トリス、１．０mol/l ＮａＣ
ｌ、０．０２８mol/l クエン酸ナトリウムを用いた。収
量：約３２mgの断片Ｅ３。
【００６１】実施例６ ヒト血漿中における可溶性フィブリンの産生 トロンビン０．６IUをヒト血漿プール２０mlに加え、混
合液を＋３７℃で９０分間インキュベートした。反応は
ヒルジン〔ヘキスト社(Hoechst AG)〕６ATU を加えるこ
とで停止させた。フィブリンモノマーはｔＰＡ刺激試験
〔カビ社(Kabi)：スウェーデン〕を用いて調べた。比較
的高濃度のフィブリンモノマーは凝集を起こし、この理
由から高い値は血漿で期待できない。収量：６５μｇの
フィブリンモノマー／血漿ml。
合液を＋３７℃で９０分間インキュベートした。反応は
ヒルジン〔ヘキスト社(Hoechst AG)〕６ATU を加えるこ
とで停止させた。フィブリンモノマーはｔＰＡ刺激試験
〔カビ社(Kabi)：スウェーデン〕を用いて調べた。比較
的高濃度のフィブリンモノマーは凝集を起こし、この理
由から高い値は血漿で期待できない。収量：６５μｇの
フィブリンモノマー／血漿ml。
【００６２】実施例７ ＥＬＩＳＡにおける本発明による抗体の使用 ａ）抗体被覆微量滴定プレートの調製 実施例４で単離された抗体をリン酸ナトリウム溶液
（０．０１mol/L,ｐＨ５．５）で５μg/mlの濃度まで希
釈し、微量滴定プレート〔タイプＢ，ナンク社(Nunc)
製：デンマーク〕に吸着により固定させた。ウェル当た
り１００μｌの抗体溶液を２０℃で２０時間インキュベ
ートし、しかる後液体を吸引し、プレートをリン酸ナト
リウム緩衝液で３回洗浄した。次いで牛血清アルブミン
溶液（０．０１mol/l リン酸ナトリウム中０．１g/リッ
トル ,ｐＨ５．５）１００μｌを各ウェルに加え、プレ
ートを２０℃で１時間インキュベートした。リン酸ナト
リウム溶液で３回洗浄した後、微量滴定プレートを気密
に密封して＋４℃で貯蔵した。
（０．０１mol/L,ｐＨ５．５）で５μg/mlの濃度まで希
釈し、微量滴定プレート〔タイプＢ，ナンク社(Nunc)
製：デンマーク〕に吸着により固定させた。ウェル当た
り１００μｌの抗体溶液を２０℃で２０時間インキュベ
ートし、しかる後液体を吸引し、プレートをリン酸ナト
リウム緩衝液で３回洗浄した。次いで牛血清アルブミン
溶液（０．０１mol/l リン酸ナトリウム中０．１g/リッ
トル ,ｐＨ５．５）１００μｌを各ウェルに加え、プレ
ートを２０℃で１時間インキュベートした。リン酸ナト
リウム溶液で３回洗浄した後、微量滴定プレートを気密
に密封して＋４℃で貯蔵した。
【００６３】ｂ）酵素イムノアッセイの実施 試験されるサンプルをインキュベート緩衝液（ＰＢＳ，
０．０５％ツイーン２０（Tween 20：商標），ｐＨ７．
２）で１：２希釈し、各ケースにおいて被覆微量滴定プ
レート（実施例５（ａ）による）のウェル当たり１００
μｌを＋３７℃で６０分間インキュベートした。次いで
インキュベート溶液を除去し、ウェルを各場合において
洗浄溶液（０．０２mol/l リン酸ナトリウム，０．０５
％ツイーン２０，ｐＨ７．６）約３００μｌで３回洗浄
した。次いでペルオキシダーゼ複合化抗断片Ｅ抗体（ベ
ーリングウェルケ社，マールブルク，ＦＲＧ）１００μ
ｌを加え、微量滴定プレートを＋３７℃で６０分間イン
キュベートした。複合体溶液を除去して２回洗浄した
後、基質‐発色原溶液（過酸化水素、ｏ‐フェニレンジ
アミン）１００μｌを加え、微量滴定プレートを室温で
インキュベートした。３０分間インキュベート後にペル
オキシダーゼを硫酸で不活性化し、反応溶液の吸光度を
４９０nmで測定した。
０．０５％ツイーン２０（Tween 20：商標），ｐＨ７．
２）で１：２希釈し、各ケースにおいて被覆微量滴定プ
レート（実施例５（ａ）による）のウェル当たり１００
μｌを＋３７℃で６０分間インキュベートした。次いで
インキュベート溶液を除去し、ウェルを各場合において
洗浄溶液（０．０２mol/l リン酸ナトリウム，０．０５
％ツイーン２０，ｐＨ７．６）約３００μｌで３回洗浄
した。次いでペルオキシダーゼ複合化抗断片Ｅ抗体（ベ
ーリングウェルケ社，マールブルク，ＦＲＧ）１００μ
ｌを加え、微量滴定プレートを＋３７℃で６０分間イン
キュベートした。複合体溶液を除去して２回洗浄した
後、基質‐発色原溶液（過酸化水素、ｏ‐フェニレンジ
アミン）１００μｌを加え、微量滴定プレートを室温で
インキュベートした。３０分間インキュベート後にペル
オキシダーゼを硫酸で不活性化し、反応溶液の吸光度を
４９０nmで測定した。
【００６４】実施例８ 免疫吸着により精製された抗体の検査 ａ）フィブリノーゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反
応 精製ペプチド１〜５（ＰＰ１〜ＰＰ５）を用いて実施例
４に従い単離された抗体の特異性について検査するため
に、比較検査はフィブリノーゲン、フィブリン（トロン
ビンの作用によるフィブリノーゲンの分解産物）とのそ
れらの反応性及び断片Ｅ３（プラスミンの作用によるフ
ィブリノーゲンの分解産物）とのそれらの反応性につい
て実施例７に従いＥＬＩＳＡにより行った。フィブリン
源として実施例６に従い血漿中で産生された３４μg/ml
の濃度を有するフィブリンモノマーを、断片Ｅ３として
実施例５（ｂ）に従い産生された２００μg/mlの濃度を
有するＥ３を及び６４００μg/mlの濃度を有する試験フ
ィブリノーゲン（ベーリングウェルケ社）を、それぞれ
用いた。サンプルをインキュベート緩衝液（実施例７）
で連続的に１：２希釈した。
応 精製ペプチド１〜５（ＰＰ１〜ＰＰ５）を用いて実施例
４に従い単離された抗体の特異性について検査するため
に、比較検査はフィブリノーゲン、フィブリン（トロン
ビンの作用によるフィブリノーゲンの分解産物）とのそ
れらの反応性及び断片Ｅ３（プラスミンの作用によるフ
ィブリノーゲンの分解産物）とのそれらの反応性につい
て実施例７に従いＥＬＩＳＡにより行った。フィブリン
源として実施例６に従い血漿中で産生された３４μg/ml
の濃度を有するフィブリンモノマーを、断片Ｅ３として
実施例５（ｂ）に従い産生された２００μg/mlの濃度を
有するＥ３を及び６４００μg/mlの濃度を有する試験フ
ィブリノーゲン（ベーリングウェルケ社）を、それぞれ
用いた。サンプルをインキュベート緩衝液（実施例７）
で連続的に１：２希釈した。
【００６５】本発明に従い調製された抗体がプラスミン
の作用に起因するフィブリノーゲン開裂産物と非常に強
く反応することはこれらの結果（表２及び図１〜５参
照）から明らかである。ＰＰ１又はＰＰ５を用いて免疫
吸着により精製された抗体は、フィブリンモノマー又は
フィブリノーゲンとの交差反応を全く示さない。ＰＰ
２、ＰＰ３及びＰＰ４を用いた抗体の精製でもフィブリ
ンモノマーと反応しないか又は無視しうる程度に反応す
るだけである抗体を生じる。ＰＰ３を用いて単離された
抗体の場合、フィブリノーゲンとそれらの反応も同様に
無視してよい。結果的に、このプロセスは更に“最終精
製”を要しない特異的抗体を得る上で適している。
の作用に起因するフィブリノーゲン開裂産物と非常に強
く反応することはこれらの結果（表２及び図１〜５参
照）から明らかである。ＰＰ１又はＰＰ５を用いて免疫
吸着により精製された抗体は、フィブリンモノマー又は
フィブリノーゲンとの交差反応を全く示さない。ＰＰ
２、ＰＰ３及びＰＰ４を用いた抗体の精製でもフィブリ
ンモノマーと反応しないか又は無視しうる程度に反応す
るだけである抗体を生じる。ＰＰ３を用いて単離された
抗体の場合、フィブリノーゲンとそれらの反応も同様に
無視してよい。結果的に、このプロセスは更に“最終精
製”を要しない特異的抗体を得る上で適している。
【００６６】表２：ＥＬＩＳＡにおける緩衝液中で免疫
ペプチドの成分配列に対して本発明に従い単離された抗
体と、フィブリノーゲン及びトロンビン切断（フィブリ
ンモノマー）又はプラスミン切断（断片Ｅ３）に起因す
る開裂産物との反応。ＥＬＩＳＡの測定値（ＯＤ）が示
されている（抗原濃度μg/ml）。
ペプチドの成分配列に対して本発明に従い単離された抗
体と、フィブリノーゲン及びトロンビン切断（フィブリ
ンモノマー）又はプラスミン切断（断片Ｅ３）に起因す
る開裂産物との反応。ＥＬＩＳＡの測定値（ＯＤ）が示
されている（抗原濃度μg/ml）。
【００６７】
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】図１〜５：ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３
に対するウサギ抗体とフィブリノーゲン、フィブリン及
び断片Ｅ３との反応 抗体は断片Ｅのγ鎖のカルボキシ末端領域からのペプチ
ド（ペプチド３）でウサギを免疫することにより得られ
た。抗体は配列が免疫ペプチド（精製ペプチドＰＰ１〜
ＰＰ５）の場合と一部対応する固相固定化ヘキサペプチ
ドへの免疫吸着により精製した。これらの抗体を微量滴
定プレートのコーティングに用いて、フィブリノーゲ
ン、フィブリン及びプラスミン分解フィブリノーゲンか
らの断片Ｅ３とそれらの反応をサンドイッチＥＬＩＳＡ
で試験した。断片Ｅに対する非特異的抗体と西洋ワサビ
ペルオキシダーゼからなる複合体を結合抗原を検出する
ために用いた。示されたシグナルはサンプル緩衝液中で
フィブリノーゲン及び断片Ｅ３を用いるか又はフィブリ
ン含有血漿を用いた場合にＥＬＩＳＡで測定されたシグ
ナルである。図１〜５はＰＰ１に対して精製された抗
体、ＰＰ２に対して精製された抗体、ＰＰ３に対して精
製された抗体、ＰＰ４に対して精製された抗体、ＰＰ５
に対して精製された抗体を用いた測定の結果をそれぞれ
表したものである。
に対するウサギ抗体とフィブリノーゲン、フィブリン及
び断片Ｅ３との反応 抗体は断片Ｅのγ鎖のカルボキシ末端領域からのペプチ
ド（ペプチド３）でウサギを免疫することにより得られ
た。抗体は配列が免疫ペプチド（精製ペプチドＰＰ１〜
ＰＰ５）の場合と一部対応する固相固定化ヘキサペプチ
ドへの免疫吸着により精製した。これらの抗体を微量滴
定プレートのコーティングに用いて、フィブリノーゲ
ン、フィブリン及びプラスミン分解フィブリノーゲンか
らの断片Ｅ３とそれらの反応をサンドイッチＥＬＩＳＡ
で試験した。断片Ｅに対する非特異的抗体と西洋ワサビ
ペルオキシダーゼからなる複合体を結合抗原を検出する
ために用いた。示されたシグナルはサンプル緩衝液中で
フィブリノーゲン及び断片Ｅ３を用いるか又はフィブリ
ン含有血漿を用いた場合にＥＬＩＳＡで測定されたシグ
ナルである。図１〜５はＰＰ１に対して精製された抗
体、ＰＰ２に対して精製された抗体、ＰＰ３に対して精
製された抗体、ＰＰ４に対して精製された抗体、ＰＰ５
に対して精製された抗体を用いた測定の結果をそれぞれ
表したものである。
【００７０】ｂ）異なるＥ断片との反応実施例８ａ）と
同様に、比較検査は、異なる成分配列の免疫ペプチドを
用いて 免疫吸着精製された抗体と架橋フィブリン（断片混合物
Ｅ１／Ｅ２；実施例５ａに従い調製）及びフィブリノー
ゲン（断片Ｅ３；実施例５ｂに従い調製）由来の断片Ｅ
との反応性について行った。ストック溶液の濃度は２μ
g/mlであった。本発明に従い調製されたすべての抗体が
断片Ｅ３及びＥ１／Ｅ２断片混合物の双方と等しくよく
反応することは表３（図６〜１０参照）から明らかであ
る。他方、ＰＰ４及びＰＰ５を用いて精製された抗体は
フィブリノーゲン由来の断片Ｅと架橋フィブリン由来の
Ｅを識別する。この例において、検出限界は１ng/ml 程
度であった。このため本発明による抗体は一次及び二次
双方のフィブリン分解についての感度のよい診断に適し
ている。
同様に、比較検査は、異なる成分配列の免疫ペプチドを
用いて 免疫吸着精製された抗体と架橋フィブリン（断片混合物
Ｅ１／Ｅ２；実施例５ａに従い調製）及びフィブリノー
ゲン（断片Ｅ３；実施例５ｂに従い調製）由来の断片Ｅ
との反応性について行った。ストック溶液の濃度は２μ
g/mlであった。本発明に従い調製されたすべての抗体が
断片Ｅ３及びＥ１／Ｅ２断片混合物の双方と等しくよく
反応することは表３（図６〜１０参照）から明らかであ
る。他方、ＰＰ４及びＰＰ５を用いて精製された抗体は
フィブリノーゲン由来の断片Ｅと架橋フィブリン由来の
Ｅを識別する。この例において、検出限界は１ng/ml 程
度であった。このため本発明による抗体は一次及び二次
双方のフィブリン分解についての感度のよい診断に適し
ている。
【００７１】表３：ＥＬＩＳＡにおける緩衝液中での、
免疫ペプチドの成分配列に対する本発明に従い単離され
た抗体とフィブリノーゲン（一次フィブリン分解）由来
の断片Ｅ（Ｅ３）及び架橋フィブリン（二次フィブリン
分解）由来の断片Ｅ（Ｅ１／Ｅ２）との反応。ＥＬＩＳ
Ａの測定値が示されている（抗原濃度ng/ml ）。
免疫ペプチドの成分配列に対する本発明に従い単離され
た抗体とフィブリノーゲン（一次フィブリン分解）由来
の断片Ｅ（Ｅ３）及び架橋フィブリン（二次フィブリン
分解）由来の断片Ｅ（Ｅ１／Ｅ２）との反応。ＥＬＩＳ
Ａの測定値が示されている（抗原濃度ng/ml ）。
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】図６〜１０：ＥＬＩＳＡにおけるペプチド
３に対するウサギ抗体とフィブリノーゲン（Ｅ３）及び
フィブリン（Ｅ１／Ｅ２）由来の断片Ｅとの反応 架橋フィブリンでプラスミンの作用後にＤダイマー／Ｅ
複合体から単離された断片Ｅ１及びＥ２とフィブリノー
ゲンでプラスミンの作用後に精製された断片Ｅ３との混
合物をＥＬＩＳＡにおいて抗原として用いた。抗体は図
１〜５の説明で記載された場合と同様の抗体を用いた。
示されたシグナルは、断片Ｅ１／Ｅ２及び断片Ｅ３を用
いた場合にＥＬＩＳＡで測定されたシグナル並びにサン
プルとしてサンプル緩衝液を用いた場合に得られたバッ
クグラウンドシグナルである。図６〜１０はＰＰ１に対
して精製された抗体、ＰＰ２に対して精製された抗体、
ＰＰ３に対して精製された抗体、ＰＰ４に対して精製さ
れた抗体、ＰＰ５に対して精製された抗体を用いた測定
の結果をそれぞれ表したものである。
３に対するウサギ抗体とフィブリノーゲン（Ｅ３）及び
フィブリン（Ｅ１／Ｅ２）由来の断片Ｅとの反応 架橋フィブリンでプラスミンの作用後にＤダイマー／Ｅ
複合体から単離された断片Ｅ１及びＥ２とフィブリノー
ゲンでプラスミンの作用後に精製された断片Ｅ３との混
合物をＥＬＩＳＡにおいて抗原として用いた。抗体は図
１〜５の説明で記載された場合と同様の抗体を用いた。
示されたシグナルは、断片Ｅ１／Ｅ２及び断片Ｅ３を用
いた場合にＥＬＩＳＡで測定されたシグナル並びにサン
プルとしてサンプル緩衝液を用いた場合に得られたバッ
クグラウンドシグナルである。図６〜１０はＰＰ１に対
して精製された抗体、ＰＰ２に対して精製された抗体、
ＰＰ３に対して精製された抗体、ＰＰ４に対して精製さ
れた抗体、ＰＰ５に対して精製された抗体を用いた測定
の結果をそれぞれ表したものである。
【００７５】 ｃ）緩衝液及び血漿中における断片Ｅとの反応 本発明に従い精製された抗体（実施例４参照）が血漿中
でフィブリン（フィブリノーゲン）分解産物を検出する
ためにも適するかどうかを調べるために、比較検査を緩
衝系中で精製断片Ｅ３含有ヒト血漿プールの添加後に、
精製抗体とフィブリノーゲン由来の断片Ｅ（断片Ｅ３；
実施例５ｂに従い調製）との反応性について実施例８
ａ）と同様に行った。ストック溶液の濃度は２００μg/
mlであった。フィブリン（フィブリノーゲン）分解産物
も血漿中天然フィブリノーゲンの存在下で検出できるこ
とは表４（図１１〜１３参照）から明らかである。異な
るマトリックスのために、血漿中における測定シグナル
はわずかだが低い。
でフィブリン（フィブリノーゲン）分解産物を検出する
ためにも適するかどうかを調べるために、比較検査を緩
衝系中で精製断片Ｅ３含有ヒト血漿プールの添加後に、
精製抗体とフィブリノーゲン由来の断片Ｅ（断片Ｅ３；
実施例５ｂに従い調製）との反応性について実施例８
ａ）と同様に行った。ストック溶液の濃度は２００μg/
mlであった。フィブリン（フィブリノーゲン）分解産物
も血漿中天然フィブリノーゲンの存在下で検出できるこ
とは表４（図１１〜１３参照）から明らかである。異な
るマトリックスのために、血漿中における測定シグナル
はわずかだが低い。
【００７６】表４：ＥＬＩＳＡにおける緩衝液及び血漿
中での、免疫ペプチド（ＰＰ１〜ＰＰ３）の成分配列に
対する本発明に従い単離された抗体と断片Ｅ（Ｅ３）と
の反応。ＥＬＩＳＡの測定値が示されている（抗原濃度
μg/ml）。
中での、免疫ペプチド（ＰＰ１〜ＰＰ３）の成分配列に
対する本発明に従い単離された抗体と断片Ｅ（Ｅ３）と
の反応。ＥＬＩＳＡの測定値が示されている（抗原濃度
μg/ml）。
【００７７】
【表５】
【００７８】図１１〜１３：ＥＬＩＳＡにおけるサンプ
ル緩衝液及びヒト血漿中でのペプチド３に対するウサギ
抗体とフィブリノーゲンからの断片Ｅ（Ｅ３）との反応 フィブリノーゲンでプラスミンの作用により調製された
断片Ｅ（＝断片Ｅ３）を緩衝液又はヒト血漿で様々な濃
度に希釈し、図１〜５の説明で記載された抗体とその反
応をＥＬＩＳＡで追跡した。示されたシグナルは抗原を
用いてＥＬＩＳＡで測定されたシグナルと抗原を含まな
い緩衝液又は血漿を用いた場合に得られたバックグラウ
ンドシグナルである。図１１〜１３はＰＰ１に対して精
製された抗体、ＰＰ２に対して精製された抗体、ＰＰ３
に対して精製された抗体を用いた測定の結果をそれぞれ
表したものである。
ル緩衝液及びヒト血漿中でのペプチド３に対するウサギ
抗体とフィブリノーゲンからの断片Ｅ（Ｅ３）との反応 フィブリノーゲンでプラスミンの作用により調製された
断片Ｅ（＝断片Ｅ３）を緩衝液又はヒト血漿で様々な濃
度に希釈し、図１〜５の説明で記載された抗体とその反
応をＥＬＩＳＡで追跡した。示されたシグナルは抗原を
用いてＥＬＩＳＡで測定されたシグナルと抗原を含まな
い緩衝液又は血漿を用いた場合に得られたバックグラウ
ンドシグナルである。図１１〜１３はＰＰ１に対して精
製された抗体、ＰＰ２に対して精製された抗体、ＰＰ３
に対して精製された抗体を用いた測定の結果をそれぞれ
表したものである。
【００７９】ｄ）インビトロで産生されたフィブリン分
解産物との反応 ヒルジン（ヘキスト社）３０ATU を各ケースにおいてヒ
ト血漿プール３ml及びα２‐抗プラスミン欠乏血漿３ml
に加え、しかる後サンプルをプラスミン（最終濃度１CT
A/ml）と一緒に＋３７℃でインキュベートした。０、
１、２、５、１０、３０及び６０分間後、アンタゴサン
溶液（ベーリングウェルケ社；１００APE/ml）６０μｌ
を各ケースにおいて血漿６００μｌに加え、フィブリノ
ーゲン分解産物の出現を実施例４からの異なる精製抗体
を用いてＥＬＩＳＡで実施例７に従い明らかにした。
解産物との反応 ヒルジン（ヘキスト社）３０ATU を各ケースにおいてヒ
ト血漿プール３ml及びα２‐抗プラスミン欠乏血漿３ml
に加え、しかる後サンプルをプラスミン（最終濃度１CT
A/ml）と一緒に＋３７℃でインキュベートした。０、
１、２、５、１０、３０及び６０分間後、アンタゴサン
溶液（ベーリングウェルケ社；１００APE/ml）６０μｌ
を各ケースにおいて血漿６００μｌに加え、フィブリノ
ーゲン分解産物の出現を実施例４からの異なる精製抗体
を用いてＥＬＩＳＡで実施例７に従い明らかにした。
【００８０】表５（図１４〜１６参照）に記載されたＥ
ＬＩＳＡの測定値は、α２‐抗プラスミン欠乏血漿にプ
ラスミンを加えることによりインビトロで産生されたフ
ィブリノーゲン分解産物が精製ペプチドＰＰ１〜ＰＰ３
に対して単離された抗体を用いて固相で検出できること
を示している。他方、加えられたプラスミンは正常血液
ドナーからの血漿プール中でα２‐抗プラスミンにより
阻害され、フィブリノーゲン開裂産物は生じない。それ
に対応して測定シグナルもＥＬＩＳＡで認められず、こ
れは時間０の場合よりも高い。 表５：正常血漿（ＳＨＰ）及びα２‐抗プラスミン欠乏
血漿（α２‐ＤＰ）のプラスミンによる処理中における
フィブリノーゲン分解産物の出現に関する時間経緯。示
された値は免疫ペプチドの成分配列ＰＰ１、ＰＰ２又は
ＰＰ３に対して精製された抗体を固相上で用いて実施例
７に従いＥＬＩＳＡでフィブリノーゲン分解産物につい
て調べたときに得られた測定値である。
ＬＩＳＡの測定値は、α２‐抗プラスミン欠乏血漿にプ
ラスミンを加えることによりインビトロで産生されたフ
ィブリノーゲン分解産物が精製ペプチドＰＰ１〜ＰＰ３
に対して単離された抗体を用いて固相で検出できること
を示している。他方、加えられたプラスミンは正常血液
ドナーからの血漿プール中でα２‐抗プラスミンにより
阻害され、フィブリノーゲン開裂産物は生じない。それ
に対応して測定シグナルもＥＬＩＳＡで認められず、こ
れは時間０の場合よりも高い。 表５：正常血漿（ＳＨＰ）及びα２‐抗プラスミン欠乏
血漿（α２‐ＤＰ）のプラスミンによる処理中における
フィブリノーゲン分解産物の出現に関する時間経緯。示
された値は免疫ペプチドの成分配列ＰＰ１、ＰＰ２又は
ＰＰ３に対して精製された抗体を固相上で用いて実施例
７に従いＥＬＩＳＡでフィブリノーゲン分解産物につい
て調べたときに得られた測定値である。
【００８１】
【表６】
【００８２】図１４〜１６：フィブリノーゲン開裂産物
のインビトロ形成の動態 等量のプラスミンを正常ヒトドナーからのヒト血漿（Ｓ
ＨＰ）及びα２‐抗プラスミンを欠乏した血漿（α２Ａ
Ｄ‐ＤＰ）に加え、フィブリノーゲン開裂産物の出現を
ＥＬＩＳＡで追跡した。図１〜５の説明で記載された抗
体をＥＬＩＳＡの固相上で用いた。示されたシグナルは
異なる時間にわたりプラスミンと共にインキュベートさ
れた血漿サンプルに関してＥＬＩＳＡで測定されたシグ
ナルである。図１４〜１６はＰＰ１に対して精製された
抗体、ＰＰ２に対して精製された抗体、ＰＰ３に対して
精製された抗体を用いた測定の結果をそれぞれ表したも
のである。
のインビトロ形成の動態 等量のプラスミンを正常ヒトドナーからのヒト血漿（Ｓ
ＨＰ）及びα２‐抗プラスミンを欠乏した血漿（α２Ａ
Ｄ‐ＤＰ）に加え、フィブリノーゲン開裂産物の出現を
ＥＬＩＳＡで追跡した。図１〜５の説明で記載された抗
体をＥＬＩＳＡの固相上で用いた。示されたシグナルは
異なる時間にわたりプラスミンと共にインキュベートさ
れた血漿サンプルに関してＥＬＩＳＡで測定されたシグ
ナルである。図１４〜１６はＰＰ１に対して精製された
抗体、ＰＰ２に対して精製された抗体、ＰＰ３に対して
精製された抗体を用いた測定の結果をそれぞれ表したも
のである。
【００８３】実施例９ 凝集試験における本発明による抗体の使用 ａ）フィブリン（フィブリノーゲン）分解産物測定用ラ
テックス試薬の調製 ラテックス試薬を Kapmeyer W.H.ら,"Automated nephel
ometric immunoassayswith novel shell/core particle
s",J.Clin.Lab.Anal.2:76-83(1988) の方法により調製
した。グラフトポリマー１ml（４％強度溶液；ベーリン
グウェルケ社）を抗体溶液０．１ml（実施例４に従い精
製；濃度０．４mg/ml;１：１００のカップリング比に相
当する）及びツイーン２０の２０％強度水溶液０．０５
mlと混合した。ラテックスを活性化するために、１Ｎ
ＨＣｌ溶液約０．０１mlを用いてその溶液をｐＨ２に調
製した。室温で３０分間インキュベート後、飽和リン酸
水素ナトリウム溶液（ｐＨ６．５）０．２５ml及び水素
化シアノホウ素ナトリウム水溶液０．２５ml（２５mg/m
l)を加え、試薬を十分に混合した。活性化アルデヒド基
への抗体のカップリングを室温で１時間かけて行った。
次いでラテックス‐抗体複合体を遠心し〔ベックマン(B
eckman) 遠心機、４００００×ｇ、３０分間〕、しかる
後ペレットを０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．２；
０．１７Ｍ ＮａＣｌ及び０．５％ツイーン２０含有）
１．５mlに再懸濁した。次いでその溶液を約５秒間超音
波処理した〔ブロンソン・ソニフィア(Bronson Sonifie
r)Ｂ１５〕。このストック溶液を＋４℃で貯蔵した。
テックス試薬の調製 ラテックス試薬を Kapmeyer W.H.ら,"Automated nephel
ometric immunoassayswith novel shell/core particle
s",J.Clin.Lab.Anal.2:76-83(1988) の方法により調製
した。グラフトポリマー１ml（４％強度溶液；ベーリン
グウェルケ社）を抗体溶液０．１ml（実施例４に従い精
製；濃度０．４mg/ml;１：１００のカップリング比に相
当する）及びツイーン２０の２０％強度水溶液０．０５
mlと混合した。ラテックスを活性化するために、１Ｎ
ＨＣｌ溶液約０．０１mlを用いてその溶液をｐＨ２に調
製した。室温で３０分間インキュベート後、飽和リン酸
水素ナトリウム溶液（ｐＨ６．５）０．２５ml及び水素
化シアノホウ素ナトリウム水溶液０．２５ml（２５mg/m
l)を加え、試薬を十分に混合した。活性化アルデヒド基
への抗体のカップリングを室温で１時間かけて行った。
次いでラテックス‐抗体複合体を遠心し〔ベックマン(B
eckman) 遠心機、４００００×ｇ、３０分間〕、しかる
後ペレットを０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．２；
０．１７Ｍ ＮａＣｌ及び０．５％ツイーン２０含有）
１．５mlに再懸濁した。次いでその溶液を約５秒間超音
波処理した〔ブロンソン・ソニフィア(Bronson Sonifie
r)Ｂ１５〕。このストック溶液を＋４℃で貯蔵した。
【００８４】ｂ）比ろう法による測定の実施 抗フィブリン（フィブリノーゲン）分解産物ラテックス
（抗ＦＤＰラテックス）とフィブリン（フィブリノーゲ
ン）分解産物との反応をベーリングウェルケ社（マール
ブルク）のＢＮＡ比ろう計で追跡した。実施例９ｂ）で
記載されたように調製されたストック溶液を生理塩化ナ
トリウム溶液で０．０３％の濃度に希釈した。この懸濁
液５０μｌを補足試薬としてＤダイマー（ベーリングウ
ェルケ社）２０μｌ及びＮ希釈液（ベーリングウェルケ
社）８０μｌと混合した。サンプル５０μｌ及びＮ希釈
液７０μｌを添加した後、濁度の増加が１２分間のイン
キュベート後に測定された。
（抗ＦＤＰラテックス）とフィブリン（フィブリノーゲ
ン）分解産物との反応をベーリングウェルケ社（マール
ブルク）のＢＮＡ比ろう計で追跡した。実施例９ｂ）で
記載されたように調製されたストック溶液を生理塩化ナ
トリウム溶液で０．０３％の濃度に希釈した。この懸濁
液５０μｌを補足試薬としてＤダイマー（ベーリングウ
ェルケ社）２０μｌ及びＮ希釈液（ベーリングウェルケ
社）８０μｌと混合した。サンプル５０μｌ及びＮ希釈
液７０μｌを添加した後、濁度の増加が１２分間のイン
キュベート後に測定された。
【００８５】ｃ）抗体被覆ラテックス粒子とフィブリン
（フィブリノーゲン）分解産物との反応 実施例４に従い精製ペプチドＰＰ１に対して単離された
抗体を実施例９ａ）で記載されたプロセスで２３０nmの
径を有するラテックス粒子に結合させた。抗ＦＤＰラテ
ックスとフィブリノーゲン分解産物Ｅ３及びフィブリン
分解産物Ｅ１／Ｅ２との反応を実施例９ｂ）に従い追跡
した。抗原は生理塩化ナトリウム溶液中に存在していた
が、これを測定前に２．５倍濃縮ストック溶液から装備
により適切に希釈した。
（フィブリノーゲン）分解産物との反応 実施例４に従い精製ペプチドＰＰ１に対して単離された
抗体を実施例９ａ）で記載されたプロセスで２３０nmの
径を有するラテックス粒子に結合させた。抗ＦＤＰラテ
ックスとフィブリノーゲン分解産物Ｅ３及びフィブリン
分解産物Ｅ１／Ｅ２との反応を実施例９ｂ）に従い追跡
した。抗原は生理塩化ナトリウム溶液中に存在していた
が、これを測定前に２．５倍濃縮ストック溶液から装備
により適切に希釈した。
【００８６】表６に記載された測定シグナルは濁度の増
加を示すが、これはフィブリン（フィブリノーゲン）分
解産物の濃度に依存している。その結果、この凝集反応
は、異なるＥ断片中における“内部ダイマー”の推測に
従いフィブリン（フィブリノーゲン）分解産物を検出す
る上で本発明による抗体の適合性を証明している。表
６：抗ＦＤＰラテックスとフィブリン及びフィブリノー
ゲンの分解産物との反応中における濁度の増加。抗ＦＤ
Ｐラテックス懸濁物とフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）または
フィブリノーゲン（Ｅ３）いずれかの分解産物との１２
分間インキュベート後に比ろう計（ＣＢＮＡ；ベーリン
グウェルケ社）で得られた濁度（ビット）の測定差が記
載されている。抗原の濃度はmg/lで示されている。 表６ 断片 E1/E2 E3濃度 吸光度 吸光度 1.3 602 414 2.5 876 459 5.0 1001 558 10.0 1288 69920.0 1473 886
加を示すが、これはフィブリン（フィブリノーゲン）分
解産物の濃度に依存している。その結果、この凝集反応
は、異なるＥ断片中における“内部ダイマー”の推測に
従いフィブリン（フィブリノーゲン）分解産物を検出す
る上で本発明による抗体の適合性を証明している。表
６：抗ＦＤＰラテックスとフィブリン及びフィブリノー
ゲンの分解産物との反応中における濁度の増加。抗ＦＤ
Ｐラテックス懸濁物とフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）または
フィブリノーゲン（Ｅ３）いずれかの分解産物との１２
分間インキュベート後に比ろう計（ＣＢＮＡ；ベーリン
グウェルケ社）で得られた濁度（ビット）の測定差が記
載されている。抗原の濃度はmg/lで示されている。 表６ 断片 E1/E2 E3濃度 吸光度 吸光度 1.3 602 414 2.5 876 459 5.0 1001 558 10.0 1288 69920.0 1473 886
【図１】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサギ
抗体（ＰＰ１に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
抗体（ＰＰ１に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
【図２】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサギ
抗体（ＰＰ２に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
抗体（ＰＰ２に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
【図３】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサギ
抗体（ＰＰ３に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
抗体（ＰＰ３に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
【図４】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサギ
抗体（ＰＰ４に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
抗体（ＰＰ４に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
【図５】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサギ
抗体（ＰＰ５に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
抗体（ＰＰ５に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片Ｅ３との反応について示した
図である。
【図６】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサギ
抗体（ＰＰ１に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断片
Ｅとの反応について示した図である。
抗体（ＰＰ１に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断片
Ｅとの反応について示した図である。
【図７】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサギ
抗体（ＰＰ２に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断片
Ｅとの反応について示した図である。
抗体（ＰＰ２に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断片
Ｅとの反応について示した図である。
【図８】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサギ
抗体（ＰＰ３に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断片
Ｅとの反応について示した図である。
抗体（ＰＰ３に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断片
Ｅとの反応について示した図である。
【図９】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサギ
抗体（ＰＰ４に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断片
Ｅとの反応について示した図である。
抗体（ＰＰ４に対して精製された抗体）とフィブリノー
ゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断片
Ｅとの反応について示した図である。
【図１０】ＥＬＩＳＡにおけるペプチド３に対するウサ
ギ抗体（ＰＰ５に対して精製された抗体）とフィブリノ
ーゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断
片Ｅとの反応について示した図である。
ギ抗体（ＰＰ５に対して精製された抗体）とフィブリノ
ーゲン（Ｅ３）及びフィブリン（Ｅ１／Ｅ２）からの断
片Ｅとの反応について示した図である。
【図１１】ＥＬＩＳＡにおけるサンプル緩衝液及びヒト
血漿中でペプチド３に対するウサギ抗体（ＰＰ１に対し
て精製された抗体）とフィブリノーゲンからの断片Ｅ
（Ｅ３）との反応について示した図である。
血漿中でペプチド３に対するウサギ抗体（ＰＰ１に対し
て精製された抗体）とフィブリノーゲンからの断片Ｅ
（Ｅ３）との反応について示した図である。
【図１２】ＥＬＩＳＡにおけるサンプル緩衝液及びヒト
血漿中でペプチド３に対するウサギ抗体（ＰＰ２に対し
て精製された抗体）とフィブリノーゲンからの断片Ｅ
（Ｅ３）との反応について示した図である。
血漿中でペプチド３に対するウサギ抗体（ＰＰ２に対し
て精製された抗体）とフィブリノーゲンからの断片Ｅ
（Ｅ３）との反応について示した図である。
【図１３】ＥＬＩＳＡにおけるサンプル緩衝液及びヒト
血漿中でペプチド３に対するウサギ抗体（ＰＰ３に対し
て精製された抗体）とフィブリノーゲンからの断片Ｅ
（Ｅ３）との反応について示した図である。
血漿中でペプチド３に対するウサギ抗体（ＰＰ３に対し
て精製された抗体）とフィブリノーゲンからの断片Ｅ
（Ｅ３）との反応について示した図である。
【図１４】フィブリノーゲン開裂産物のインビトロ形成
の動態について示した図である（ＰＰ１に対して精製さ
れた抗体）。
の動態について示した図である（ＰＰ１に対して精製さ
れた抗体）。
【図１５】フィブリノーゲン開裂産物のインビトロ形成
の動態について示した図である（ＰＰ２に対して精製さ
れた抗体）。
の動態について示した図である（ＰＰ２に対して精製さ
れた抗体）。
【図１６】フィブリノーゲン開裂産物のインビトロ形成
の動態について示した図である（ＰＰ３に対して精製さ
れた抗体）。
の動態について示した図である（ＰＰ３に対して精製さ
れた抗体）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 8310−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (25)
- 【請求項１】プラスミンによるフィブリノーゲンの開裂
の結果生じるＥ断片のカルボキシ末端と少くとも部分的
に対応し、かつ、抗原性を有するアミノ酸配列を含んで
なる合成ペプチド。 - 【請求項２】下記アミノ酸配列： ａ）Leu-Phe-Glu-Tyr-Gln-Lys-OH ｂ）Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Lys-OH ｃ）Val-Lys-Glu-Leu-Ile-Lys-OH及び ｄ）His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys-OH のうち少くとも１つを含んでなる、請求項１に記載の合
成ペプチド。 - 【請求項３】下記アミノ酸配列： ａ）Asn-Lys-Leu-Lys-Asn-Ser-Leu-Phe-Gly-Tyr-Gln-Ly
s-OH ｂ）Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Gln-Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Ly
s-OH ｃ）Glu-Asn-Lys-Thr-Ser-Gln-Val-Lys-Gln-Leu-Ile-Ly
s-OH及び ｄ）Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Ly
s-OH のうち少くとも１つを含んでなる、請求項１に記載の合
成ペプチド。 - 【請求項４】下記アミノ酸配列： 【化１】 のうち少くとも１つを含んでなる、請求項１に記載の合
成ペプチド。 - 【請求項５】キャリア分子に直接又はスペーサーを介し
て結合されてなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載
のペプチド。 - 【請求項６】遺伝子操作又は化学合成により調製され
る、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。 - 【請求項７】請求項１に記載されたペプチドと免疫化学
的に反応する、抗体。 - 【請求項８】請求項１〜６のいずれか一項に記載された
ペプチドで動物を免疫することにより得られる、請求項
７に記載の抗体。 - 【請求項９】請求項１〜６のいずれか一項に記載された
ペプチドへの免疫吸着により単離及び精製される、請求
項８に記載の抗体。 - 【請求項１０】モノクローナル抗体である、請求項８に
記載の抗体。 - 【請求項１１】請求項１に記載されたペプチド及び／又
は請求項７で記載された抗体を用いた、フィブリノーゲ
ン及びフィブリンの開裂産物の分子内オリゴマーを免疫
化学的に測定する診断方法。 - 【請求項１２】不均質イムノアッセイ、好ましくは酵素
イムノアッセイ、を測定に用いた、請求項１１に記載の
方法。 - 【請求項１３】均質イムノアッセイ、好ましくは粒子ブ
ースト化比ろう法又は濁り測定法、を測定に用いた、請
求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】抗体の一部が固相に結合され、他の部分
が検出されうる機能を担持してなる、請求項１２に記載
の方法。 - 【請求項１５】微量滴定プレートを固相として用い、検
出されうる機能がケイ光もしくは発光色素又は酵素であ
る、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】粒状非水溶性担体を固相として用い、フ
ィブリン及び／又はフィブリノーゲンの開裂産物との凝
集反応を比ろう法又は濁り測定法で測定する、請求項１
３に記載の方法。 - 【請求項１７】ただ１つの単一特異性種をその方法で用
いる、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１８】捕捉抗体が請求項７に記載の抗体であ
り、検出抗体がそれとは異なっていてもよい、請求項１
１に記載の方法。 - 【請求項１９】治療、特にフィブリン分解系の障害の治
療、のための請求項１〜６のいずれか一項に記載された
ペプチドの使用。 - 【請求項２０】治療、特にフィブリン分解系の障害の治
療、のための請求項７〜１０のいずれか一項に記載され
た抗体の使用。 - 【請求項２１】ただ一つの単一特異性抗体種を用いた、
分子内オリゴマーを測定するための免疫化学的方法。 - 【請求項２２】不均質イムノアッセイ、好ましくは酵素
イムノアッセイ、である、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】均質イムノアッセイ、好ましくは粒子ブ
ースト化比ろう法又は濁り測定法、である、請求項２１
に記載の方法。 - 【請求項２４】抗体の一部が固相に結合され、他の部分
が検出されうる機能を担持してなる、請求項２２に記載
の方法。 - 【請求項２５】微量滴定プレートを固相として用い、検
出されうる機能がケイ光もしくは発光色素又は酵素であ
る、請求項２４に記載の方法。
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