JPH06256388A - 合成ペプチド、これに対する抗体及びこれらの使用 - Google Patents

合成ペプチド、これに対する抗体及びこれらの使用

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JPH06256388A
JPH06256388A JP5344306A JP34430693A JPH06256388A JP H06256388 A JPH06256388 A JP H06256388A JP 5344306 A JP5344306 A JP 5344306A JP 34430693 A JP34430693 A JP 34430693A JP H06256388 A JPH06256388 A JP H06256388A
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leu
fibrinogen
lys
fibrin
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JP5344306A
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Michael Dr Kraus
ミヒャエル、クラウス
Werner Stueber
ベルナー、シュテューバー
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Behringwerke AG
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 プラスミンによるフィブリノーゲンの開裂の
結果生じるE断片のカルボキシ末端と少くとも部分的に
対応し、かつ、抗原性を有するアミノ酸配列を含んでな
る合成ペプチドおよびこのペプチドと免疫化学的に反応
する抗体。 【効果】 本発明による抗体は断片Eとのみ交差する。
従って、フィブリノーゲン又はフィブリンの含有量にか
かわらず、フィブリン分解活性を正確に定量することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】[発明の背景]本発明はペプチド、それら
によって産生された抗体並びに治療及び診断のためのこ
のようなペプチド及び抗体の使用に関する。
【0002】生物は凝固系により血液の喪失から保護さ
れている。凝固カスケードはA及びBフィブリノペプチ
ドを除くことによりフィブリノーゲンをフィブリンに変
換するプロテアーゼであるトロンビンの活性化を起こ
す。個々のフィブリン分子は互いに凝集し(いわゆる
“軟血餅”)、しかる後正常であればトランスペプチダ
ーゼ因子XIIIにより互いに架橋される(いわゆる“硬血
餅”)。この創傷閉鎖は反対方向に活性化されるフィブ
リン分解系により溶解される。フィブリン分解のキー酵
素はプロテアーゼであるプラスミンであり、これは本質
的にフィブリノーゲン及びフィブリンをD及びE断片に
開裂する。フィブリノーゲンはN末端付近でジスルフィ
ド架橋により互いに結合された2本のトリペプチドから
対称的に組立てられる。したがってフィブリン又はフィ
ブリノーゲンが開裂されると、フィブリン(フィブリノ
ーゲン)の中心的結合領域を構成する1分子の断片Eと
2分子の断片Dが分子当たりで形成される。硬血餅にお
いて、フィブリンのDドメインは架橋されており、その
結果プラスミンによる分解はDダイマーと断片Eを遊離
する。E断片自体は更に2回の分解ステップに付され
る。その第一及び第二形態(各々E1及びE2)におい
て、それはDダイマーに非共有結合し、DD/E複合体
を形成している。第二の酵素分解ステップの後になって
ようやくE3断片がDダイマー分子から解離する。
【0003】フィブリン又はフィブリノーゲンの開裂に
より生じたDダイマーのように、1つの分子又はタンパ
ク質内にいくつかの免疫化学的に同一のエピトープを有
するタンパク質は“分子内オリゴマー”とも呼ばれる。
ここでDダイマーは少くとも生理学的条件下では、各ケ
ースにおいて少くとも1つの免疫化学的に同一のエピト
ープを有するタンパク質分子のオリゴマーとして構成さ
れている。
【0004】凝固系の望ましくない活性化が多くの病的
状況下において血管系で生じることがあり、結果として
閉塞を起こす。これは重度の心臓発作と血栓塞栓症を引
き起こすことがある。これらの過剰な凝固症状のために
血栓溶解剤で治療されている患者においては、治療を管
理する目的から溶解の成功がモニターされねばならな
い。これはDダイマーを測定することによって行われ
る。しかしながら、血栓溶解剤は特異的でなく、そのた
めフィブリノーゲンもプラスミンの全身的活性化のため
にかなりの程度まで分解されてしまう。E断片を測定す
ることで適宜にこのフィブリノーゲン分解を検出するこ
とができる。フィブリノーゲンは例えば汎発性血管内凝
固(DIC)を進行させる過剰フィブリン分解条件下、
例えば補体系により敗血症で誘発される条件下、でも主
に分解される。しかしながら、フィブリノーゲンの消費
は高い出血の危険性を更に招き、このためその危険性は
断片Eを測定することで適宜に診断上認識され、それに
より治療上において抑制することができる。
【0005】例えば赤血球凝集阻止試験のような多くの
方法がフィブリン(フィブリノーゲン)の分解産物を検
出するために知られている(Mersky C.et al.,"A rapid,
simple,sensitive method for measuring fibrinolytic
split products in human serum",Proc.Soc.Exp.Biol.
Med.131:871-875(1969))。この原理は Schifreenら"Aqu
antitative automated immunoassay for fibrinogen/fi
brin degradation products",Clin.Chem.31:1468-1473
(1985)により採用されているが、但し赤血球はラテック
ス粒子で置き換えられている。
【0006】フィブリン(フィブリノーゲン)分解産物
を測定するための他の凝集アッセイではフィブリン(フ
ィブリノーゲン)分解産物に対する抗体で被覆されたラ
テックス粒子を利用している。その既知抗体は天然分解
産物で免疫することにより生産された。種々の特異性を
有する抗体が用いられた。
【0007】フィブリノーゲンとの交差反応性が存在す
ることはポリクローナル抗体又はフィブリノーゲンレセ
プターを用いるアッセイに共通して見られる特徴であ
る。そのアッセイで必要なサンプル前処理の結果とし
て、そのサンプルは異なる量のフィブリノーゲン及び人
工生産開裂産物を含有しており、そのためこれらの方法
ではせいぜい半定量的に判定できるだけである(Gaffne
y P.J.and Perry M.J.,"Unreliability of current ser
um degradation products (FDP) assays" ,Thromb.Haem
ost.53:301-302(1985);Nieuwenhuizen W.,"Plasma assa
ys of fibrinogen/fibrin degradation products and t
heir clinical relevance":Fibrinogen 2,Biochemistr
y,Physiology and Clinical Relevance.G.D.O.Lowe et
al.,Edt.,173-180(1987))。
【0008】抗体の特異性によって、モノクローナル抗
体を用いるアッセイでは無傷のフィブリノーゲン又はフ
ィブリンとの交差反応性の問題が避けられていることは
事実である。しかしながら、凝集アッセイにおける使用
では、検出されるエピトープは凝集物を形成するために
抗原上で2度抗体に対して利用できねばならない。この
理由から、例えばDモノマーに対するモノクローナル抗
体を用いる上記ラテックスアッセイ(例えば、特許出願
WO第86/01298号)では、Dモノマーではなく
架橋後にフィブリンのみから生じるDダイマーを認識す
る(Gaffney P.J.et al.,"Monoclonal antibodies agai
nst fibrinogen,fibrin and their fragments",Thromb.
Haemost.54:733-734(1985) 参照)。このためこれらの
試験はフィブリン(フィブリノーゲン)分解産物を調べ
る上で適さない。
【0009】これらの均質試験に加えて、ELISAは
モノクローナル抗体によってフィブリノーゲン及びフィ
ブリン開裂産物間を識別できると最近記載された(Kopp
ertP.W.ら,"A monoclonal antibody-based enzyme immu
noassay for fibrin degradation products in plasm
a",Thromb.Haemostas.59:310-315(1988))。
【0010】しかしながら、均質法と比較して、いわゆ
るELISA法は基本的な理由から手間と時間がかか
り、かつ概して自動化が困難な方法である。
【0011】トロンビンの影響下で生じるフィブリンの
α鎖のN末端からのヘキサペプチドの使用はドイツ国D
E第37 01 812号明細書で開示されている。
【0012】Hui K.Y.ら("Monoclonal antibodies to a
synthetic fibrin-like peptide bind to human fibri
n but not fibrinogen",Science 222:1129-1132(1983))
はβ鎖の対応N末端からのヘプタペプチドを用いた。こ
れらの方法から得られる抗体はフィブリンのみを認識
し、いかなるフィブリン(フィブリノーゲン)開裂産物
も認識しない。これらのアッセイと更にフィブリノーゲ
ンからフィブリンへのトロンビンによる開裂の間に放出
されるA及びBフィブリノペプチドの検出は、過剰フィ
ブリン分解ではなく過剰凝固症状を診断するために使用
できる。
【0013】断片Eとのみ反応して天然フィブリノーゲ
ン又はフィブリンを認識しない特定の抗体がヒト血液、
滑液又は尿中でフィブリン(フィブリノーゲン)開裂産
物を検出するために必要である。更に、これらの抗体は
容易に得ることができ、すべての周知の免疫化学法、即
ち不均質及び均質双方の試験法、で使用される。
【0014】[発明の概要]したがって、本発明はフィ
ブリノーゲン及びフィブリンの開裂産物に対する抗体を
形成する抗原の提供をその目的としており、その抗体は
精製が容易で特異的であり、このためフィブリノーゲン
又はフィブリンの含有量にかかわらず生物の体液中にお
けるフィブリン分解活性を正確に定量することができる
ものである。更に、これらの抗体によれば不均質アッセ
イに加えて均質イムノアッセイ技術の使用が可能とな
る。
【0015】意外にも、断片EのC末端領域由来の合成
ペプチドで動物を免疫することにより、フィブリノーゲ
ン又はフィブリンと反応せずにすべての3つのE断片と
特異的に反応する抗体が得られ、更に凝集アッセイにも
使用できることが見出だされた。
【0016】したがって、本発明は、E断片のカルボキ
シ末端と少くとも部分的に対応するアミノ酸配列を有
し、その末端がプラスミンによるフィブリノーゲンの開
裂の結果生じ、かつ、抗原性を有する合成ペプチドに関
する。
【0017】好ましくは、それらは下記アミノ酸配列の
うち少くとも1つを含んでなるもの、である。 a)Leu-Phe-Glu-Tyr-Gln-Lys-OH b)Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Lys-OH c)Val-Lys-Glu-Leu-Ile-Lys-OH及び d)His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys-OH
【0018】特に好ましくは、下記アミノ酸配列のうち
少くとも1つを含んでなるもの、である。 a)Asn-Lys-Leu-Lys-Asn-Ser-Leu-Phe-Glu-Tyr-Gln-Ly
s-OH b)Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Gln-Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Ly
s-OH c)Glu-Asn-Lys-Thr-Ser-Gln-Val-Lys-Gln-Leu-Ile-Ly
s-OH及び d)Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Ly
s-OH
【0019】更に好ましくは、下記アミノ酸配列のうち
少くとも1つを含んでなるもの、である。
【0020】
【化2】
【0021】ペプチド1〜3に対応するアミノ酸配列か
ら構成されるペプチドも好ましい。
【0022】本発明によるペプチドは、キャリア分子に
直接又はスペーサーを介して結合されていてもよい。ま
た、これらは遺伝子操作又は化学合成により調製され
る。
【0023】本発明は更に本発明によるペプチドと免疫
化学的に反応する抗体に関する。これらの抗体は本発明
によるペプチドで動物を免疫することにより得られる。
特にそれらがポリクローナルであるならば、本発明によ
る抗体は本発明によるペプチドに免疫吸着されることで
単離及び精製されることが好ましい。本発明による抗体
は好ましくは当業者に公知の方法により調整されるモノ
クローナル抗体であってもよい。
【0024】本発明は、また、特にフィブリン(フィブ
リノーゲン)E断片及びDダイマーを測定するために本
発明によるペプチド及び/又は本発明による抗体を用い
た、フィブリノーゲン及びフィブリンの開裂産物の分子
内オリゴマーを免疫化学的に測定する診断方法に関す
る。
【0025】この関係において、不均質イムノアッセイ
が好ましく、酵素イムノアッセイが特に好ましい。
【0026】また、好ましくは均質イムノアッセイ、特
に好ましくは粒子ブースト化(particle-boosted)比ろ
う法又は濁り測定法、が用いられる。
【0027】本方法においては、抗体の一部が固相に結
合され、他の部分は検出されうる機能を担持しているこ
とが有利であり、その場合に固相として微量滴定プレー
トを用い、検出しうる機能がケイ光又は発光色素又は酵
素である方法が好ましい。均質イムノアッセイにおい
て、粒状非水溶性支持体が固相として有利に用いられ、
凝集反応が比ろう法又は濁り測定法で測定される。不均
質及び均質法において、ただ1つの単一特異性種(mono
specific species)が有利に用いられるが、しかしなが
ら捕捉抗体が本発明による抗体であって、検出抗体がそ
れとは異なっている方法も有利である。
【0028】本発明は治療、特にフィブリン分解系の障
害の治療、のための本発明によるペプチドの使用にも関
する。本発明は更に治療、特にフィブリン分解系の障害
の治療、のための本発明による抗体の使用にも関する。
【0029】これに加えて、本発明は分子内オリゴマー
を調べるための免疫化学方法に関し、その方法において
は1つの単一特異性抗体種のみが用いられる。その方法
は不均質アッセイ、好ましくは酵素イムノアッセイ、又
は均質イムノアッセイ、好ましくは粒子ブースト化比ろ
う法又は濁り測定法であってもよい。不均質イムノアッ
セイにおいて、抗体の一部は固相に結合され、他の部分
は検出しうる機能を担持していることが有利である。こ
の関係において、微量滴定プレートが固相として用いら
れることが好ましく、検出しうる機能はケイ光もしくは
発光色素又は酵素である。
【0030】特定の作用メカニズムについて明確化しよ
うとするものではないが、カルボキシ末端におけるリジ
ンが本発明によるペプチドにとり重要であるという仮説
が正当と思われる。
【0031】本発明によるペプチドは当業者にそれ自体
公知である方法により製造される。例えば保護アミノ酸
誘導体又はペプチドセグメントがこの場合液中又は固相
で互いにカップリングされ、本発明によるペプチドが保
護基の除去により、固相の場合にはキャリア樹脂からの
開裂により得られる(実施例1)。この関係において、
Fmoc基が一時的な保護基として用いられることが好
ましく、側鎖の場合にはt‐ブチル/Bocベース基、
Argの場合にはPmc又はMtr基、Cysの場合に
はtert‐ブチルメルカプト又はトリチル基が永続的保護
基として用いられることが好ましい。C末端アミノ酸は
ペプチド合成に慣習上適した高分子支持体、好ましくは
架橋ポリスチレンに結合されたp‐アルコキシベンジル
エステル基により固定される。ペプチド合成は好ましく
はDMF(ジメチルホルムアミド)中20%(v/v) ピペ
リジンを用いてFmocを反復脱離し、好ましくはHO
Btの存在下でカルボジイミドを用いて次の保護アミノ
酸をカップリングすることにより行う。この目的のた
め、アミノ酸誘導体はDMF中過剰量、好ましくは3倍
量で1〜1.5時間かけてカップリングされる。各操作
段階、すなわちFmoc脱離又は縮合段階後に、樹脂は
各場合毎に少量(15ml/g)のDMF又はイソプロパノ
ールで3回洗浄される。本発明によるペプチドは酸加水
分解により開裂され、側鎖基が同時に遊離される。適切
であれば、保護される予定でないスルフヒドリル基は、
例えばトリフルオロエタノールのようなアルコール中ト
リ‐n‐ブチルホスフィンで又は水中DTTで“脱保
護”される。Cys(TrT)脱保護の場合において、
捕捉剤としてエタンジチオールを用いる別の操作段階は
不要である。ペプチドは例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、逆相クロマトグラフィー及びゲル浸透クロマト
グラフィーにより精製できる。ペプチドの正確な組成と
ペプチド含有率はアミノ酸分析により調べられる。
【0032】アミノ酸1〜62のフィブリノーゲンのγ
鎖の領域に対応するペプチド又はポリペプチドに対する
抗体は、異なる形のE断片と特異的に反応する(例7参
照)。上記領域からの完全なポリペプチドとこれらペプ
チドの成分配列は双方とも免疫に適する。特に好ましい
態様では例えば、E断片のγ鎖のC末端由来の配列Val-
Asp-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gl
n-Val-Glu-Asn-Lys を有するオクタデカペプチドを用い
る。
【0033】上記の場合、分子のカルボキシ末端配列は
露出されて免疫を行えるということが重要である。
【0034】ペプチドに関して考えられる用法からみ
て、反応性側鎖保有アミノ酸をそれらがハプテンの構造
に影響を与えないようにペプチド中に導入することが好
ましい。この理由から、その遊離SH基が多くのキャリ
アにチオエーテルを介してカップリングさせる上で適し
ているシステインは、適切であればN末端に便宜上加え
られる。例えば、上記ペプチドで表される抗原はノナデ
カペプチドCys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-
Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys の形で利用され
ることが好ましい。
【0035】免疫に用いられるペプチドは、遺伝子操作
で調製されたポリペプチドを精製するかあるいはプロテ
アーゼの作用で及び/又は化学的に例えばペプチド鎖を
開裂する臭化シアンのような試薬の作用で断片Eから生
化学的に得られるペプチドを精製することによるだけで
はなく当業者にそれ自体周知の方法で化学合成によって
も調製できる。
【0036】免疫に用いられる又は免疫吸着剤として用
いられるペプチドは実用上キャリア分子にカップリング
される。カップリング方法は当業者にそれ自体周知であ
り、文献に記載されている(Nakane,P.K.ら,"Peroxidase
-Labeled Antibody-A New Method of Conjugation",J.H
istochem.Cytochem,22:1084-1091(1974),Freifelder,D.
M.,"Physical Biochemistry",W.H.Freeman 及びCo.197
6)。本発明においてキャリア分子は免疫反応性複合体を
産生するために当業者によって用いられるような天然又
は合成高分子、例えばアルブミン、オボアルブミン、カ
サガイ(keyhole limpet)ヘモシアニン又は多糖類であ
る。好ましい態様において、ペプチド又はポリペプチド
はカサガイヘモシアニンに結合される。
【0037】免疫吸着剤として本発明による合成ペプチ
ドを用いる場合には、固体マトリックスを製造するため
に適した物質にそれらをカップリングさせること好まし
い。この場合にはキャリア分子は、例えばポリスチレ
ン、ナイロン、アガロース又は磁化性粒子のようなタン
パク質及びペプチドを固定する上で当業者により用いら
れるような不溶性ポリマーである。この関係において、
固相は例えば小さなチューブ、不織布、球、繊維又は微
粒子として何らかの望ましい形で存在させることができ
る。
【0038】好ましい態様ではペプチド、例えば上記ノ
ナデカペプチド、を臭化シアン活性化セファロースにカ
ップリングさせる。
【0039】キャリア結合ペプチドによる適切な動物の
免疫によって再現的に抗体を形成することができる。こ
の関係において、免疫および抗体の単離にとって好まし
い動物種はウサギである。これに加えて、マウスを免疫
に用いてもよい。
【0040】特異性試験に関連した免疫グロブリン分画
は、本発明に従い合成ペプチドを用いて動物で産生され
たこのような抗血清から慣習的免疫吸着法により濃縮で
きる。しかしながら、この場合において、免疫吸着に用
いられるこのようなマトリックス向けの物質として、キ
ャリアにカップリングされて免疫に用いられるペプチド
と同様の抗原決定基を有するペプチドを用いることも同
様に好ましい。免疫吸着精製に用いられるペプチドは端
部切取りアミノ酸配列を有していてもよい。望ましい抗
体の免疫吸着精製でその使用上唯一の前提条件は、この
短縮ポリペプチドにより形成される抗原決定基が望まし
い抗体により認識されて効率的に結合されることであ
る。
【0041】抗体の免疫吸着単離に用いられるペプチド
は例えばノナデカペプチドであり、ペプチドCys-Val-As
p-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gln-
Val-Glu-Asn-Lys が好ましい。本発明によれば、抗体は
合成ペプチドで免疫することにより動物系で誘導され、
しかる後適宜に免疫吸着により精製される。これらの抗
体は免疫及び精製に用いられるペプチドと特異的に反応
する。
【0042】免疫吸着剤として適切なペプチドを選択す
ることにより、この分子のプラスミンによる開裂部位に
相当する断片Eの抗原決定基と好ましく特異的に反応す
る抗体が選択できる。プラスミン認識配列のC末端領域
由来の配列を有するペプチドが免疫と免疫吸着精製の双
方に用いられる好ましいケースにおいては、これらの配
列に対する抗体が濃縮される。
【0043】本発明による性質を有するモノクローナル
抗体も当業者にそれ自体公知である方法、により有利に
調製される。
【0044】本発明により単離された抗体は当業者にそ
れ自体公知である例えば酵素イムノアッセイ又は遊離も
しくは粒子ブースト化凝集反応のような均質及び不均質
イムノアッセイ、で用いることができる。好ましくは、
それらはこの目的のために固体担体にカップリングされ
る。当業者にそれ自体公知である天然及び合成の有機及
び無機ポリマーが適切な固体非水溶性担体である。例え
ば、ポリスチレン、ポリデキストラン、ポリプロピレ
ン、ポリビニルクロリド、ポリビニリデンフルオリド、
ポリアクリルアミド、アガロース、ラテックス、マグネ
タイト、多孔質ガラス粉、赤血球、白血球、血小板又は
スチレン‐ブタジエン、スチレン‐メタクリル酸もしく
はメタクリレート‐メタクリル酸からなるコポリマーが
挙げられる。チューブ、球又は微量滴定プレートが適切
な幾何学的態様である。好ましい方法において、断片E
の含有率は粒状担体に固定された抗体と共にサンプルを
インキュベートすることにより本発明に従い決定され、
固定化抗体により結合された断片Eの濃度はこれらの環
境下で生じる濁りによって濁り測定法又は比ろう法分析
で決定される。
【0045】本発明によれば、Dダイマー/E複合体の
濃度もこうして固定化された抗体を用いて決定できる。
同一又は異なるいずれかの粒子に固定された第二抗体と
してDダイマーに対する特異的抗体の使用が必要条件で
ある。2種のうち一方の抗体は立体配置:粒子‐抗体1
/抗原/遊離抗体2/抗原/粒子‐抗体1の免疫複合体
が形成されて、比ろう法又は濁り測定法で定量されるよ
うに液中で遊離して存在してもよい。
【0046】加えて、本発明による抗体がELISA法
において固相上に固定されている不均質検出法が好まし
い。断片E又はDダイマー/E複合体は第一インキュベ
ート段階で固定化抗体に結合される。結合抗原は同一又
は異なる抗体を用いて第二インキュベート段階で検出さ
れる。この第二抗体は測定しうる性質、例えば発色原基
質を変換又は結合しうる能力、を有さねばならない。
【0047】第二抗体は、例えば酵素、フルオレセイン
イソチオシアネートのようなケイ光分子、放射性標識又
は化学発光しうる分子を付加してもよい。好ましくは、
この第二抗体はマーカー酵素と結合され、ペルオキシダ
ーゼが特に好ましい。
【0048】断片E又はDダイマー/E複合体は好まし
くは血漿のサンプルと標識抗体を固定された抗体と一緒
に同時にインキュベートすることによっても測定するこ
とができる。これに加えて、標識及び未標識断片E又は
Dダイマー/E複合体が固定化された抗体の結合部位に
対して競合する競合測定法が可能である。こうして測定
された断片E又はDダイマー/E複合体の含有率からフ
ィブリン分解系の活性化の程度について結論を引き出す
ことができる。
【0049】
【実施例】実施例に記載された態様は特に好ましいもの
である。以下の実施例によって本発明を説明するが、こ
れらは本発明を制限するものではない。
【0050】下記の略記が用いられる: ELISA 酵素イムノアッセイ(enzym linked immun
osorbent assay) KLH カサガイヘモシアニン PBS リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液(生理リ
ン酸緩衝液) トリス トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン OD 吸光度(光学密度) Cys システイン アミノ酸はD又はL配置で存在できるが他で指摘されな
いかぎりそれらはL形で存在する。 Val バリン Asp アスパラギン酸 Lys リジン Cys システイン Leu ロイシン Gln グルタミン Ser セリン Glu グルタミン酸 Ile イソロイシン His ヒスチジン Asn アスパラギン Boc t‐ブトキシカルボニル Fmoc 9‐フルオレニルメトキシカルボニル Mtr 4‐メトキシ‐2,3,6‐トリメチルフ
ェニルスルホニル DMF ジメチルホルムアミド HOBt ヒドロキシベンゾトリアゾール DTT ジチオスレイトール Trt トリチル なお上記略号は実施例においてのみならず明細書を通じ
て用いられている。
【0051】例1 免疫用抗原の調製 a)Cys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu-Asp-Il
e-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys の合成 Fmoc-Lys(Boc)-p‐アルコキシベンジルエステル樹脂1
gをDMF15mlで2回1分間かけて洗浄し、Fmoc
基を20%ピペリジン/DMF(v/v)(1×3min,1×1
0min)で脱離させた。次いで樹脂をDMF又はイソプロ
パノールで3回(各場合15ml)及びDMF15mlで2
回洗浄した。DMF15mlに溶解されたFmocアミノ
酸1.5mmol及びHOBt2.25mmolを樹脂に加え、
ジクロロメタン中1Mジイソプロピルカルボジイミド溶
液1.65mlを添加した後に混合液を室温で1.5時間
振盪した。反応はニンヒドリン試験を用いて終了につい
て調べた。次いで樹脂をDMF又はイソプロパノールで
3回(各場合15ml)洗浄し、新たなサイクルを始め
た。Boc-Cys(Trt)を最後のアミノ酸として用いた。樹脂
を各場合に15mlのイソプロパノール及びジエチルエー
テルで3回洗浄し、高真空下で乾燥させた。樹脂1.9
gをチオアニソール1ml、エタンジチオール1ml及びト
リフルオロ酢酸18mlと一緒に室温で2時間攪拌した。
次いで混合液を濾過し、樹脂をトリフルオロ酢酸/ジク
ロロメタン(1:1)で3回洗浄し、濾液をエーテル中
で結晶化させた。粗製ペプチドをジエチルエーテルで洗
浄し、乾燥させた。ペプチドを0.5%酢酸中セファデ
ックス(商標)G25でクロマトグラフィーに付した。
収量:480mg。更に精製のため、この生成物(=免疫
ペプチド)100mgを逆相物質(0.1%アセトニトリ
ル、勾配操作)によるプレパラティブHPLC系でクロ
マトグラフィーに付した。ペプチドプールを凍結乾燥さ
せた。収量:38mg。
【0052】同様のプロセスに従い、免疫ペプチドの下
記成分配列を特異的抗体を単離するために調製した。 精製ペプチド1:Cys-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys 精製ペプチド2:Cys-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val 精製ペプチド3:Cys-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu 精製ペプチド4:Cys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu 精製ペプチド5:Cys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln
【0053】b)複合体の調製 KLH20mgをpH8.0の0.05Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液に溶解し、しかる後その混合液をγ‐マレイミ
ド酪酸ヒドロキシスクシンイミドエステル2mgと一緒に
1時間攪拌した。タンパク質をセファデックス(商標)
G50(2×30cm)(0.1Mリン酸ナトリウム、
0.5mMEDTA、pH6.0)でクロマトグラフィー
に付した。溶出液を5mlまで濃縮し、免疫ペプチド20
mgと一緒に1時間インキュベートした。透析及び凍結乾
燥後に、免疫ペプチド複合体32mgを得た。
【0054】実施例2 ウサギの免疫 ウサギ5匹を各場合において動物当たり2.6mgの抗原
で8週間かけて免疫した。ペプチド‐KLH複合体をリ
ンパ節の近くで皮下投与した。3回の血液サンプリング
後に動物を放血させ、粗製抗血清を保存剤で安定化させ
た。収量:抗血清約200ml/動物。
【0055】実施例3 免疫吸着剤の調製 アフィニティクロマトグラフィーによる粗製抗血清の精
製のため、実施例1aのように調製され、免疫ペプチド
の一部を包含する精製ペプチド1〜5各25mgを固相に
共有結合で固定させた。カップリング反応は記載された
方法に従い各場合で5gの臭化シアン活性化セファロー
スを用いて起こした(Axen,R.ら,Nature,214:1302(196
7))。次いで免疫吸着剤を各ケースにおいてリン酸緩衝
化塩化ナトリウム溶液(PBS;0.15mol/l,pH
7.2)及び酢酸(0.5mol/l,pH2.5)で洗浄し
た。使用前に吸着剤をゲル容量の3倍に相当する容量の
PBSで平衡化させた。収量:各場合において約20ml
のペプチド‐セファロース。
【0056】実施例4 特異的抗体の単離 各場合において実施例2に従い免疫ペプチドで免疫され
たウサギからの粗製抗血清50mlを実施例3由来のペプ
チド‐セファロースのPBS平衡化20ml容量に付し
(径1.6cm;高さ9cm)、しかる後カラムを280nm
の吸光度が≦0.01になるまでPBSで洗浄した。次
いで塩化ナトリウム溶液(1mol/L,pH7.0)及び脱
イオン水(pH7.0)を用いる洗浄を行い、各場合に
おいて3倍ゲル容量を用いた。抗体をグリシン溶液
(0.2mol/l,pH2.5)で免疫吸着剤から溶出さ
せ、抗体溶液を飽和トリス溶液でpH7.0に調整し、
しかる後PBSに対して透析した。抗体を次の使用まで
−70℃で貯蔵した。収量は用いられた精製ペプチド
(PP)に依存していた(表1)。
【0057】表1:免疫ペプチド(PP1〜PP5)の
成分配列への免疫吸着による、実施例1の免疫ペプチド
と関係した抗血清50mlからの抗体の収量 表1PP 配列 収量(mg) 1 Cys-His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys 6.5 2 Cys-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val 7.1 3 Cys-Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu 2.3 4 Cys-Asp-Leu-Gln-Ser-Leu-Glu 1.65 Cys-Val-Asp-Lys-Asp-Leu-Gln 1.2
【0058】実施例5 フィブリノーゲン及びフィブリ
ンからの断片Eの調製 a)フィブリンE:断片E1及びE2の調製 異なる分解段階のE断片(E1、E2及びE3)をOlex
a,S.& Budzynski,A.Z.,"Binding phenomena of isolate
d unique plasmic degradation products of human cro
ss-linked fibrin",J.Biol.Chem.254:4925-4932(1979)
に記載されたプロセスに従い調製した。試験フィブリノ
ーゲン〔ベーリングウェルケ社(Behringwerke AG)〕2
50mgを0.05mol/l トリス、0.1M NaCl
(pH7.8)100mlに溶解し、10mMCaCl
存在下でトロンビン250単位及びFXIII225単位を
加えることにより+37℃で血餅に誘導した。次いでフ
ィブリン血餅を0.15mol/l トリス‐HCl(pH
7.4)で洗浄し、しかる後5mMCaClの存在下で
フィブリン(フィブリノーゲン)g当たり1CTA のプラ
スミンを加えることにより+37℃で一晩かけて開裂さ
せた。反応はアプロチニン(プラスミンCTA 当たり10
0KIU)を加えることで停止させ、開裂産物をAca34
ウルトラゲル(カラム径1.7cm;高さ90cm)でゲル
クロマトグラフィーにより分離させた。ランニング緩衝
液はpH7.4の0.05mol/l トリス、0.1mol/l
NaCl、0.028mol/l クエン酸ナトリウム、25
KIU/mlアンタゴサンであった。収量:約100mgのDD
/E複合体。
【0059】次いでDD/E複合体(E1及びE2断片
と一緒にDダイマーからなる複合体)をpH5.5及び
+37℃において0.05mol/l クエン酸塩、3M尿素
中で解離させ、E1及びE2断片(E1対E2の比率約
2:1)をAca34ウルトラゲルで再びクロマトグラ
フィーに付することによりDダイマーから分離させた。
ランニング緩衝液はpH7.4の0.05mol/l トリ
ス、1.0mol/l NaCl、0.028mol/l クエン酸
ナトリウムであった。収量:約25mgのE1/E2混合
物。
【0060】b)フィブリノーゲンE:断片E3の調製 試験フィブリノーゲン(ベーリングウェルケ社)250
mgを0.05mol/l トリス、0.1M NaCl(pH
7.8)100mlに溶解し、プラスミン4.7CTA を加
えた後、5mMCaClの存在下で30分間かけて+3
7℃で開裂させた。反応はアプロチニン(20000KI
U)を加えることで停止させた。開裂産物をAca34ウ
ルトラゲル(カラム径4cm;高さ90cm)でゲルクロマ
トグラフィーにより分離させた。ランニング緩衝液はp
H5.7の0.05mol/l トリス、1.0mol/l NaC
l、0.028mol/l クエン酸ナトリウムを用いた。収
量:約32mgの断片E3。
【0061】実施例6 ヒト血漿中における可溶性フィブリンの産生 トロンビン0.6IUをヒト血漿プール20mlに加え、混
合液を+37℃で90分間インキュベートした。反応は
ヒルジン〔ヘキスト社(Hoechst AG)〕6ATU を加えるこ
とで停止させた。フィブリンモノマーはtPA刺激試験
〔カビ社(Kabi):スウェーデン〕を用いて調べた。比較
的高濃度のフィブリンモノマーは凝集を起こし、この理
由から高い値は血漿で期待できない。収量:65μgの
フィブリンモノマー/血漿ml。
【0062】実施例7 ELISAにおける本発明による抗体の使用 a)抗体被覆微量滴定プレートの調製 実施例4で単離された抗体をリン酸ナトリウム溶液
(0.01mol/L,pH5.5)で5μg/mlの濃度まで希
釈し、微量滴定プレート〔タイプB,ナンク社(Nunc)
製:デンマーク〕に吸着により固定させた。ウェル当た
り100μlの抗体溶液を20℃で20時間インキュベ
ートし、しかる後液体を吸引し、プレートをリン酸ナト
リウム緩衝液で3回洗浄した。次いで牛血清アルブミン
溶液(0.01mol/l リン酸ナトリウム中0.1g/リッ
トル ,pH5.5)100μlを各ウェルに加え、プレ
ートを20℃で1時間インキュベートした。リン酸ナト
リウム溶液で3回洗浄した後、微量滴定プレートを気密
に密封して+4℃で貯蔵した。
【0063】b)酵素イムノアッセイの実施 試験されるサンプルをインキュベート緩衝液(PBS,
0.05%ツイーン20(Tween 20:商標),pH7.
2)で1:2希釈し、各ケースにおいて被覆微量滴定プ
レート(実施例5(a)による)のウェル当たり100
μlを+37℃で60分間インキュベートした。次いで
インキュベート溶液を除去し、ウェルを各場合において
洗浄溶液(0.02mol/l リン酸ナトリウム,0.05
%ツイーン20,pH7.6)約300μlで3回洗浄
した。次いでペルオキシダーゼ複合化抗断片E抗体(ベ
ーリングウェルケ社,マールブルク,FRG)100μ
lを加え、微量滴定プレートを+37℃で60分間イン
キュベートした。複合体溶液を除去して2回洗浄した
後、基質‐発色原溶液(過酸化水素、o‐フェニレンジ
アミン)100μlを加え、微量滴定プレートを室温で
インキュベートした。30分間インキュベート後にペル
オキシダーゼを硫酸で不活性化し、反応溶液の吸光度を
490nmで測定した。
【0064】実施例8 免疫吸着により精製された抗体の検査 a)フィブリノーゲン、フィブリン及び断片E3との反
応 精製ペプチド1〜5(PP1〜PP5)を用いて実施例
4に従い単離された抗体の特異性について検査するため
に、比較検査はフィブリノーゲン、フィブリン(トロン
ビンの作用によるフィブリノーゲンの分解産物)とのそ
れらの反応性及び断片E3(プラスミンの作用によるフ
ィブリノーゲンの分解産物)とのそれらの反応性につい
て実施例7に従いELISAにより行った。フィブリン
源として実施例6に従い血漿中で産生された34μg/ml
の濃度を有するフィブリンモノマーを、断片E3として
実施例5(b)に従い産生された200μg/mlの濃度を
有するE3を及び6400μg/mlの濃度を有する試験フ
ィブリノーゲン(ベーリングウェルケ社)を、それぞれ
用いた。サンプルをインキュベート緩衝液(実施例7)
で連続的に1:2希釈した。
【0065】本発明に従い調製された抗体がプラスミン
の作用に起因するフィブリノーゲン開裂産物と非常に強
く反応することはこれらの結果(表2及び図1〜5参
照)から明らかである。PP1又はPP5を用いて免疫
吸着により精製された抗体は、フィブリンモノマー又は
フィブリノーゲンとの交差反応を全く示さない。PP
2、PP3及びPP4を用いた抗体の精製でもフィブリ
ンモノマーと反応しないか又は無視しうる程度に反応す
るだけである抗体を生じる。PP3を用いて単離された
抗体の場合、フィブリノーゲンとそれらの反応も同様に
無視してよい。結果的に、このプロセスは更に“最終精
製”を要しない特異的抗体を得る上で適している。
【0066】表2:ELISAにおける緩衝液中で免疫
ペプチドの成分配列に対して本発明に従い単離された抗
体と、フィブリノーゲン及びトロンビン切断(フィブリ
ンモノマー)又はプラスミン切断(断片E3)に起因す
る開裂産物との反応。ELISAの測定値(OD)が示
されている(抗原濃度μg/ml)。
【0067】
【表1】
【0068】
【表2】
【0069】図1〜5:ELISAにおけるペプチド3
に対するウサギ抗体とフィブリノーゲン、フィブリン及
び断片E3との反応 抗体は断片Eのγ鎖のカルボキシ末端領域からのペプチ
ド(ペプチド3)でウサギを免疫することにより得られ
た。抗体は配列が免疫ペプチド(精製ペプチドPP1〜
PP5)の場合と一部対応する固相固定化ヘキサペプチ
ドへの免疫吸着により精製した。これらの抗体を微量滴
定プレートのコーティングに用いて、フィブリノーゲ
ン、フィブリン及びプラスミン分解フィブリノーゲンか
らの断片E3とそれらの反応をサンドイッチELISA
で試験した。断片Eに対する非特異的抗体と西洋ワサビ
ペルオキシダーゼからなる複合体を結合抗原を検出する
ために用いた。示されたシグナルはサンプル緩衝液中で
フィブリノーゲン及び断片E3を用いるか又はフィブリ
ン含有血漿を用いた場合にELISAで測定されたシグ
ナルである。図1〜5はPP1に対して精製された抗
体、PP2に対して精製された抗体、PP3に対して精
製された抗体、PP4に対して精製された抗体、PP5
に対して精製された抗体を用いた測定の結果をそれぞれ
表したものである。
【0070】b)異なるE断片との反応実施例8a)と
同様に、比較検査は、異なる成分配列の免疫ペプチドを
用いて 免疫吸着精製された抗体と架橋フィブリン(断片混合物
E1/E2;実施例5aに従い調製)及びフィブリノー
ゲン(断片E3;実施例5bに従い調製)由来の断片E
との反応性について行った。ストック溶液の濃度は2μ
g/mlであった。本発明に従い調製されたすべての抗体が
断片E3及びE1/E2断片混合物の双方と等しくよく
反応することは表3(図6〜10参照)から明らかであ
る。他方、PP4及びPP5を用いて精製された抗体は
フィブリノーゲン由来の断片Eと架橋フィブリン由来の
Eを識別する。この例において、検出限界は1ng/ml 程
度であった。このため本発明による抗体は一次及び二次
双方のフィブリン分解についての感度のよい診断に適し
ている。
【0071】表3:ELISAにおける緩衝液中での、
免疫ペプチドの成分配列に対する本発明に従い単離され
た抗体とフィブリノーゲン(一次フィブリン分解)由来
の断片E(E3)及び架橋フィブリン(二次フィブリン
分解)由来の断片E(E1/E2)との反応。ELIS
Aの測定値が示されている(抗原濃度ng/ml )。
【0072】
【表3】
【0073】
【表4】
【0074】図6〜10:ELISAにおけるペプチド
3に対するウサギ抗体とフィブリノーゲン(E3)及び
フィブリン(E1/E2)由来の断片Eとの反応 架橋フィブリンでプラスミンの作用後にDダイマー/E
複合体から単離された断片E1及びE2とフィブリノー
ゲンでプラスミンの作用後に精製された断片E3との混
合物をELISAにおいて抗原として用いた。抗体は図
1〜5の説明で記載された場合と同様の抗体を用いた。
示されたシグナルは、断片E1/E2及び断片E3を用
いた場合にELISAで測定されたシグナル並びにサン
プルとしてサンプル緩衝液を用いた場合に得られたバッ
クグラウンドシグナルである。図6〜10はPP1に対
して精製された抗体、PP2に対して精製された抗体、
PP3に対して精製された抗体、PP4に対して精製さ
れた抗体、PP5に対して精製された抗体を用いた測定
の結果をそれぞれ表したものである。
【0075】 c)緩衝液及び血漿中における断片Eとの反応 本発明に従い精製された抗体(実施例4参照)が血漿中
でフィブリン(フィブリノーゲン)分解産物を検出する
ためにも適するかどうかを調べるために、比較検査を緩
衝系中で精製断片E3含有ヒト血漿プールの添加後に、
精製抗体とフィブリノーゲン由来の断片E(断片E3;
実施例5bに従い調製)との反応性について実施例8
a)と同様に行った。ストック溶液の濃度は200μg/
mlであった。フィブリン(フィブリノーゲン)分解産物
も血漿中天然フィブリノーゲンの存在下で検出できるこ
とは表4(図11〜13参照)から明らかである。異な
るマトリックスのために、血漿中における測定シグナル
はわずかだが低い。
【0076】表4:ELISAにおける緩衝液及び血漿
中での、免疫ペプチド(PP1〜PP3)の成分配列に
対する本発明に従い単離された抗体と断片E(E3)と
の反応。ELISAの測定値が示されている(抗原濃度
μg/ml)。
【0077】
【表5】
【0078】図11〜13:ELISAにおけるサンプ
ル緩衝液及びヒト血漿中でのペプチド3に対するウサギ
抗体とフィブリノーゲンからの断片E(E3)との反応 フィブリノーゲンでプラスミンの作用により調製された
断片E(=断片E3)を緩衝液又はヒト血漿で様々な濃
度に希釈し、図1〜5の説明で記載された抗体とその反
応をELISAで追跡した。示されたシグナルは抗原を
用いてELISAで測定されたシグナルと抗原を含まな
い緩衝液又は血漿を用いた場合に得られたバックグラウ
ンドシグナルである。図11〜13はPP1に対して精
製された抗体、PP2に対して精製された抗体、PP3
に対して精製された抗体を用いた測定の結果をそれぞれ
表したものである。
【0079】d)インビトロで産生されたフィブリン分
解産物との反応 ヒルジン(ヘキスト社)30ATU を各ケースにおいてヒ
ト血漿プール3ml及びα2‐抗プラスミン欠乏血漿3ml
に加え、しかる後サンプルをプラスミン(最終濃度1CT
A/ml)と一緒に+37℃でインキュベートした。0、
1、2、5、10、30及び60分間後、アンタゴサン
溶液(ベーリングウェルケ社;100APE/ml)60μl
を各ケースにおいて血漿600μlに加え、フィブリノ
ーゲン分解産物の出現を実施例4からの異なる精製抗体
を用いてELISAで実施例7に従い明らかにした。
【0080】表5(図14〜16参照)に記載されたE
LISAの測定値は、α2‐抗プラスミン欠乏血漿にプ
ラスミンを加えることによりインビトロで産生されたフ
ィブリノーゲン分解産物が精製ペプチドPP1〜PP3
に対して単離された抗体を用いて固相で検出できること
を示している。他方、加えられたプラスミンは正常血液
ドナーからの血漿プール中でα2‐抗プラスミンにより
阻害され、フィブリノーゲン開裂産物は生じない。それ
に対応して測定シグナルもELISAで認められず、こ
れは時間0の場合よりも高い。 表5:正常血漿(SHP)及びα2‐抗プラスミン欠乏
血漿(α2‐DP)のプラスミンによる処理中における
フィブリノーゲン分解産物の出現に関する時間経緯。示
された値は免疫ペプチドの成分配列PP1、PP2又は
PP3に対して精製された抗体を固相上で用いて実施例
7に従いELISAでフィブリノーゲン分解産物につい
て調べたときに得られた測定値である。
【0081】
【表6】
【0082】図14〜16:フィブリノーゲン開裂産物
のインビトロ形成の動態 等量のプラスミンを正常ヒトドナーからのヒト血漿(S
HP)及びα2‐抗プラスミンを欠乏した血漿(α2A
D‐DP)に加え、フィブリノーゲン開裂産物の出現を
ELISAで追跡した。図1〜5の説明で記載された抗
体をELISAの固相上で用いた。示されたシグナルは
異なる時間にわたりプラスミンと共にインキュベートさ
れた血漿サンプルに関してELISAで測定されたシグ
ナルである。図14〜16はPP1に対して精製された
抗体、PP2に対して精製された抗体、PP3に対して
精製された抗体を用いた測定の結果をそれぞれ表したも
のである。
【0083】実施例9 凝集試験における本発明による抗体の使用 a)フィブリン(フィブリノーゲン)分解産物測定用ラ
テックス試薬の調製 ラテックス試薬を Kapmeyer W.H.ら,"Automated nephel
ometric immunoassayswith novel shell/core particle
s",J.Clin.Lab.Anal.2:76-83(1988) の方法により調製
した。グラフトポリマー1ml(4%強度溶液;ベーリン
グウェルケ社)を抗体溶液0.1ml(実施例4に従い精
製;濃度0.4mg/ml;1:100のカップリング比に相
当する)及びツイーン20の20%強度水溶液0.05
mlと混合した。ラテックスを活性化するために、1N
HCl溶液約0.01mlを用いてその溶液をpH2に調
製した。室温で30分間インキュベート後、飽和リン酸
水素ナトリウム溶液(pH6.5)0.25ml及び水素
化シアノホウ素ナトリウム水溶液0.25ml(25mg/m
l)を加え、試薬を十分に混合した。活性化アルデヒド基
への抗体のカップリングを室温で1時間かけて行った。
次いでラテックス‐抗体複合体を遠心し〔ベックマン(B
eckman) 遠心機、40000×g、30分間〕、しかる
後ペレットを0.1Mグリシン緩衝液(pH8.2;
0.17M NaCl及び0.5%ツイーン20含有)
1.5mlに再懸濁した。次いでその溶液を約5秒間超音
波処理した〔ブロンソン・ソニフィア(Bronson Sonifie
r)B15〕。このストック溶液を+4℃で貯蔵した。
【0084】b)比ろう法による測定の実施 抗フィブリン(フィブリノーゲン)分解産物ラテックス
(抗FDPラテックス)とフィブリン(フィブリノーゲ
ン)分解産物との反応をベーリングウェルケ社(マール
ブルク)のBNA比ろう計で追跡した。実施例9b)で
記載されたように調製されたストック溶液を生理塩化ナ
トリウム溶液で0.03%の濃度に希釈した。この懸濁
液50μlを補足試薬としてDダイマー(ベーリングウ
ェルケ社)20μl及びN希釈液(ベーリングウェルケ
社)80μlと混合した。サンプル50μl及びN希釈
液70μlを添加した後、濁度の増加が12分間のイン
キュベート後に測定された。
【0085】c)抗体被覆ラテックス粒子とフィブリン
(フィブリノーゲン)分解産物との反応 実施例4に従い精製ペプチドPP1に対して単離された
抗体を実施例9a)で記載されたプロセスで230nmの
径を有するラテックス粒子に結合させた。抗FDPラテ
ックスとフィブリノーゲン分解産物E3及びフィブリン
分解産物E1/E2との反応を実施例9b)に従い追跡
した。抗原は生理塩化ナトリウム溶液中に存在していた
が、これを測定前に2.5倍濃縮ストック溶液から装備
により適切に希釈した。
【0086】表6に記載された測定シグナルは濁度の増
加を示すが、これはフィブリン(フィブリノーゲン)分
解産物の濃度に依存している。その結果、この凝集反応
は、異なるE断片中における“内部ダイマー”の推測に
従いフィブリン(フィブリノーゲン)分解産物を検出す
る上で本発明による抗体の適合性を証明している。表
6:抗FDPラテックスとフィブリン及びフィブリノー
ゲンの分解産物との反応中における濁度の増加。抗FD
Pラテックス懸濁物とフィブリン(E1/E2)または
フィブリノーゲン(E3)いずれかの分解産物との12
分間インキュベート後に比ろう計(CBNA;ベーリン
グウェルケ社)で得られた濁度(ビット)の測定差が記
載されている。抗原の濃度はmg/lで示されている。 表6 断片 E1/E2 E3濃度 吸光度 吸光度 1.3 602 414 2.5 876 459 5.0 1001 558 10.0 1288 69920.0 1473 886
【図面の簡単な説明】
【図1】ELISAにおけるペプチド3に対するウサギ
抗体(PP1に対して精製された抗体)とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片E3との反応について示した
図である。
【図2】ELISAにおけるペプチド3に対するウサギ
抗体(PP2に対して精製された抗体)とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片E3との反応について示した
図である。
【図3】ELISAにおけるペプチド3に対するウサギ
抗体(PP3に対して精製された抗体)とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片E3との反応について示した
図である。
【図4】ELISAにおけるペプチド3に対するウサギ
抗体(PP4に対して精製された抗体)とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片E3との反応について示した
図である。
【図5】ELISAにおけるペプチド3に対するウサギ
抗体(PP5に対して精製された抗体)とフィブリノー
ゲン、フィブリン及び断片E3との反応について示した
図である。
【図6】ELISAにおけるペプチド3に対するウサギ
抗体(PP1に対して精製された抗体)とフィブリノー
ゲン(E3)及びフィブリン(E1/E2)からの断片
Eとの反応について示した図である。
【図7】ELISAにおけるペプチド3に対するウサギ
抗体(PP2に対して精製された抗体)とフィブリノー
ゲン(E3)及びフィブリン(E1/E2)からの断片
Eとの反応について示した図である。
【図8】ELISAにおけるペプチド3に対するウサギ
抗体(PP3に対して精製された抗体)とフィブリノー
ゲン(E3)及びフィブリン(E1/E2)からの断片
Eとの反応について示した図である。
【図9】ELISAにおけるペプチド3に対するウサギ
抗体(PP4に対して精製された抗体)とフィブリノー
ゲン(E3)及びフィブリン(E1/E2)からの断片
Eとの反応について示した図である。
【図10】ELISAにおけるペプチド3に対するウサ
ギ抗体(PP5に対して精製された抗体)とフィブリノ
ーゲン(E3)及びフィブリン(E1/E2)からの断
片Eとの反応について示した図である。
【図11】ELISAにおけるサンプル緩衝液及びヒト
血漿中でペプチド3に対するウサギ抗体(PP1に対し
て精製された抗体)とフィブリノーゲンからの断片E
(E3)との反応について示した図である。
【図12】ELISAにおけるサンプル緩衝液及びヒト
血漿中でペプチド3に対するウサギ抗体(PP2に対し
て精製された抗体)とフィブリノーゲンからの断片E
(E3)との反応について示した図である。
【図13】ELISAにおけるサンプル緩衝液及びヒト
血漿中でペプチド3に対するウサギ抗体(PP3に対し
て精製された抗体)とフィブリノーゲンからの断片E
(E3)との反応について示した図である。
【図14】フィブリノーゲン開裂産物のインビトロ形成
の動態について示した図である(PP1に対して精製さ
れた抗体)。
【図15】フィブリノーゲン開裂産物のインビトロ形成
の動態について示した図である(PP2に対して精製さ
れた抗体)。
【図16】フィブリノーゲン開裂産物のインビトロ形成
の動態について示した図である(PP3に対して精製さ
れた抗体)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 L 8310−2J // C07K 99:00

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】プラスミンによるフィブリノーゲンの開裂
    の結果生じるE断片のカルボキシ末端と少くとも部分的
    に対応し、かつ、抗原性を有するアミノ酸配列を含んで
    なる合成ペプチド。
  2. 【請求項2】下記アミノ酸配列: a)Leu-Phe-Glu-Tyr-Gln-Lys-OH b)Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Lys-OH c)Val-Lys-Glu-Leu-Ile-Lys-OH及び d)His-Gln-Val-Glu-Asn-Lys-OH のうち少くとも1つを含んでなる、請求項1に記載の合
    成ペプチド。
  3. 【請求項3】下記アミノ酸配列: a)Asn-Lys-Leu-Lys-Asn-Ser-Leu-Phe-Gly-Tyr-Gln-Ly
    s-OH b)Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Gln-Tyr-Met-Tyr-Leu-Leu-Ly
    s-OH c)Glu-Asn-Lys-Thr-Ser-Gln-Val-Lys-Gln-Leu-Ile-Ly
    s-OH及び d)Ser-Leu-Glu-Asp-Ile-Leu-His-Gln-Val-Glu-Asn-Ly
    s-OH のうち少くとも1つを含んでなる、請求項1に記載の合
    成ペプチド。
  4. 【請求項4】下記アミノ酸配列: 【化1】 のうち少くとも1つを含んでなる、請求項1に記載の合
    成ペプチド。
  5. 【請求項5】キャリア分子に直接又はスペーサーを介し
    て結合されてなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載
    のペプチド。
  6. 【請求項6】遺伝子操作又は化学合成により調製され
    る、請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチド。
  7. 【請求項7】請求項1に記載されたペプチドと免疫化学
    的に反応する、抗体。
  8. 【請求項8】請求項1〜6のいずれか一項に記載された
    ペプチドで動物を免疫することにより得られる、請求項
    7に記載の抗体。
  9. 【請求項9】請求項1〜6のいずれか一項に記載された
    ペプチドへの免疫吸着により単離及び精製される、請求
    項8に記載の抗体。
  10. 【請求項10】モノクローナル抗体である、請求項8に
    記載の抗体。
  11. 【請求項11】請求項1に記載されたペプチド及び/又
    は請求項7で記載された抗体を用いた、フィブリノーゲ
    ン及びフィブリンの開裂産物の分子内オリゴマーを免疫
    化学的に測定する診断方法。
  12. 【請求項12】不均質イムノアッセイ、好ましくは酵素
    イムノアッセイ、を測定に用いた、請求項11に記載の
    方法。
  13. 【請求項13】均質イムノアッセイ、好ましくは粒子ブ
    ースト化比ろう法又は濁り測定法、を測定に用いた、請
    求項11に記載の方法。
  14. 【請求項14】抗体の一部が固相に結合され、他の部分
    が検出されうる機能を担持してなる、請求項12に記載
    の方法。
  15. 【請求項15】微量滴定プレートを固相として用い、検
    出されうる機能がケイ光もしくは発光色素又は酵素であ
    る、請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項16】粒状非水溶性担体を固相として用い、フ
    ィブリン及び/又はフィブリノーゲンの開裂産物との凝
    集反応を比ろう法又は濁り測定法で測定する、請求項1
    3に記載の方法。
  17. 【請求項17】ただ1つの単一特異性種をその方法で用
    いる、請求項11に記載の方法。
  18. 【請求項18】捕捉抗体が請求項7に記載の抗体であ
    り、検出抗体がそれとは異なっていてもよい、請求項1
    1に記載の方法。
  19. 【請求項19】治療、特にフィブリン分解系の障害の治
    療、のための請求項1〜6のいずれか一項に記載された
    ペプチドの使用。
  20. 【請求項20】治療、特にフィブリン分解系の障害の治
    療、のための請求項7〜10のいずれか一項に記載され
    た抗体の使用。
  21. 【請求項21】ただ一つの単一特異性抗体種を用いた、
    分子内オリゴマーを測定するための免疫化学的方法。
  22. 【請求項22】不均質イムノアッセイ、好ましくは酵素
    イムノアッセイ、である、請求項21に記載の方法。
  23. 【請求項23】均質イムノアッセイ、好ましくは粒子ブ
    ースト化比ろう法又は濁り測定法、である、請求項21
    に記載の方法。
  24. 【請求項24】抗体の一部が固相に結合され、他の部分
    が検出されうる機能を担持してなる、請求項22に記載
    の方法。
  25. 【請求項25】微量滴定プレートを固相として用い、検
    出されうる機能がケイ光もしくは発光色素又は酵素であ
    る、請求項24に記載の方法。
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