JPH0625007A - Ｈｂｎｆおよびｍｋタンパク質を使用するウイルスの感染を処置および阻止する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 被検体におけるウイルスの感染性を阻害する
方法及び被検体におけるウイルスの感染の防止または処
置する方法を提供する。 【構成】 ＨＢＮＦ、ＭＫまたはこれらの両者を含有す
る、ヘパリン結合性タンパク質の存在により特徴づけら
れるウイルスの感染を阻止するのに有用な薬剤組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この出願を通して、種々の参考文献をアラ
ビア数字により言及して、本発明が関係する技術水準を
より完全に記載する。各参考文献についての完全な引用
文献は、配列のリストのすぐ後に引用されている。これ
らの参考文献の開示をこの出願に引用によって加える。

【０００２】ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒ
ｉｄａｅ）は普通の感染因子である。例えば、単純ヘル
ペスウイルス（ＨＳＶ）はある数の病気を引き起こす感
染因子である。ターゲット細胞の中へのＨＳＶの侵入
は、細胞表面の硫酸ヘパリンのプロテオグリカンへのウ
イルスの結合で開始する（１、２）。証拠のいくつかの
実験系統はこの結合の存在および重要性を証明する。第
１に、ＨＥｐ−２細胞において、細胞表面の硫酸ヘパリ
ンのプロテオグリカン（ＨＳＰ）のヘパリチナーゼおよ
びヘパリナーゼによる酵素分解は、細胞のＨＳＶ−１お
よびＨＳＶ−２の結合、ならびにプラーク形成を減少す
る（１）。第２に、ヘパリン、硫酸ヘパリン、カチオン
性アミノグリコシド類、ポリ−Ｌ−リジンおよびヘパリ
ン結合性タンパク質ＰＦ４はいくつかの実験においてＨ
ＳＶの結合性および感染性を減少する（１〜８）。すべ
てのこれらの化合物は、細胞のＨＳＰへの結合による
か、あるいはＨＳＰと相互作用することができるウイル
スのタンパク質への結合により、細胞表面とのウイルス
の会合を阻止することができる。第３に、精製されたＨ
ＳＶおよびその糖タンパク質ｇＢおよびｇＣはヘパリン
−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）のビーズに結合
する（９）。ｇＢは「欠くことのできない」エンベロー
プ糖タンパク質であり、ターゲット細胞の中へのウイル
スの浸透に関係するが、ｇＣは「必ずしも必要でない」
糖タンパク質であり、ウイルスの吸収および浸透の両者
において重要な役割を演ずる（１０〜１４）。最近、Ｈ
ＳＶはヘパリン結合性成長因子ｂＦＧＦのための高い親
和性のレセプターを「細胞の侵入のための侵入門」とし
て利用することができることが示唆された。しかしなが
ら、引き続く研究が示すように、高い親和性のレセプタ
ーはＨＳＶの結合に必ずしも関係しない（１９〜２
１）。これらの相反する結果は、ｂＦＧＦと細胞表面の
ＨＳＰまたは可溶性ヘパリンとの相互作用が高い親和性
のレセプターへのｂＦＧＦの結合のプロセスにおいて必
要なステップであるという発見により、調和させること
ができる（２２〜２４）。後者の発見は、ある種の実験
条件下に、ｂＦＧＦの高い親和性のレセプターを直接関
係させないで、ウイルスの吸着および感染を阻止できる
理由を説明する。

【０００３】本発明は、本発明の感染の阻止に有用な薬
剤組成物、有効ウイルス阻害量のＨＢＮＦ、ＭＫ、また
は両者の組み合わせ、および製剤学的に許容されうる担
体からなる組成物を提供する。また、ウイルスを本発明
の薬剤組成物と接触させることによって、ウイルスの感
染を阻止する方法が提供される。ウイルスの感染を防止
する方法がさらに提供される。これらの方法は、被検体
に有効量のＨＢＮＦ、ＭＫ、または両者の組み合わせ、
および製剤学的に許容されうる担体を投与することから
なる。

【０００４】２つの新規なヘパリン結合性タンパク質
（ＨＢＮＦおよびＭＫと呼ぶ、概観については２５を参
照のこと）は、ｂＦＧＦを高い親和性のレセプターと置
換し、そして内皮細胞の増殖を阻害する（２６）。ＨＢ
ＮＦのこれらの活性は１μＭより低い濃度において観察
されそして、明らかに、細胞表面のＨＳＰにより仲介さ
れる。両者のタンパク質は、プラーク還元アッセイにお
いて測定して、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉ
ｒｉｄａｅ）のウイルス、ＨＳＶ１型および２型の感染
を阻止する。この効果は細胞表面へのウイルスの吸着の
阻止のためである。ＨＣＭＶを使用して同様な結果が得
られた。こうして、ヘパリン結合性タンパク質は感染を
ブロックし、これによりウイルスの感染の広がりおよび
病変における再感染を制限することができる抗ウイルス
薬物である。

【０００５】本発明は、有効量のＨＢＮＦまたはＭＫの
単独または組み合わせおよび製剤学的に許容されうる担
体からなる、ヘパリン結合性タンパク質の存在により特
徴づけられるウイルスの感染を阻止するために有用であ
る薬剤組成物を提供する。あるいは、これらの薬剤組成
物は、また、他の抗ウイルス化合物を含むことができ
る。このような化合物の例は、次のものを包含するが、
これらに限定されない：アシクロビル〔Ｚｏｖｉｒａｘ
^R、ブロウフス・ウェルカム・カンパニー（Ｂｒｏｒｒ
ｏｕｇｈｓ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）〕、
ガンシクロビア〔Ｃｙｔｏｖｅｎｅ^R、シンテックス・
ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｓｙｎｔｅｘ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）〕、フォスカ
ーネット〔Ｆｏｓｃａｖｉｒ^R、アストラ（Ａｓｔｒ
ａ）〕、ビダラバイン（Ｖｉｒａ−Ａ^R、パーク・デイ
ビス（Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ）〕およびトリフルリオ
ジン〔Ｖｉｒｏｐｔｉｃ^R、ブロウフス・ウェルカム・
カンパニー（Ｂｒｏｒｒｏｕｇｈｓ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ
Ｃｏｍｐａｎｙ）〕。本発明の好ましい実施態様にお
いて、ウイルスはヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖ
ｉｒｉｄａｅ）のウイルス、単純ヘルペスウイルス１型
または２型およびヒトサイトメガロウイルスである。本
発明の目的に対して、ＨＢＮＦタンパク質およびＭＫタ
ンパク質は天然源から誘導されることができる、すなわ
ち、精製されたタンパク質であるか、あるいは組み換え
的に誘導することができる。本発明の好ましい実施態様
において、ＨＢＮＦタンパク質およびＭＫタンパク質は
ヒトＨＢＮＦおよびＭＫであるが、他の動物から単離お
よび組み換え的に誘導された類似のタンパク質はまた本
発明に包含される。組み換え的に誘導されたは、適当な
宿主細胞の中に導入され、そしてタンパク質生産物に形
質転換および／または翻訳され、そして引き続いて単離
された自律的核酸から生産されたことを意味する。本発
明のＨＢＮＦタンパク質およびＭＫタンパク質は、天然
に存在するおよび組み換え的に生産されたＨＢＮＦタン
パク質およびＭＫタンパク質のすべての類似体、アレル
の変異型および誘導体を包含する。

【０００６】本発明の目的に対して、用語「製剤学的に
許容されうる担体」は、標準の製剤学的または眼科学的
担体、例えば、リン酸塩緩衝液、水、メチルセルロー
ス、ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯおよびリポソー
ムのいずれをも包含する。用語「ヘパリン結合性タンパ
ク質の存在により特徴づけられるウイルス」は、細胞表
面上に存在する細胞表面の硫酸ヘパリンのプロテオグリ
カン類に結合するウイルスのタンパク質を包含する。例
えば、単純ヘルペスウイルスのプロテオグリカン類（Ｈ
ＳＰ）のｇＢおよびｇＣは細胞表面の硫酸ヘパリンのプ
ロテオグリカン類に結合する。

【０００７】活性成分、ＨＢＮＦ、ＭＫまたは両者の組
み合わせおよび他の抗ウイルス剤の有効量は、細胞のＨ
ＳＰへの結合によるか、あるいはＨＳＰと相互作用する
ことができるウイルスのタンパク質に結合することによ
って、細胞のウイルスの感染を阻止する量である。これ
らの量は意図する用途、処置または防止するウイルスの
感染、投与のモードならびに処置する被検体の他の特性
に依存して変化するであろう。このような量を当業者は
容易に決定するであろう。

【０００８】本発明は、ヘパリン結合性タンパク質の存
在により特徴づけられるウイルスの感染を阻止または防
止する方法を提供する。この方法は、ウイルスのための
細胞のレセプターまたはウイルスのレセプター結合性タ
ンパク質を有効量の前述の組成物と接触させることから
なる。用語「ヘパリン結合性タンパク質の存在により特
徴づけられる」および「有効量」は、また、前述した。
好ましい方法において、ウイルスはヘルペスウイルス科
（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスである。最
も好ましい方法において、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒ
ｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスはヒトサイトメガロ
ウイルスである。

【０００９】これらの方法は、被検体が動物、例えば、
ヒト、マウス、ラット、雌牛、ウマ、ブタまたはニワト
リであるとき、とくに有効である。しかしながら、最も
好ましい実施態様において、人間を処置する。

【００１０】例えば、本発明は後天性免疫欠損症候群
（「エイズ」）の患者における眼のサイトメガロウイル
スの感染ならびに他の患者における単純疱疹および陰部
の疱疹を処置または防止するために有用である。これら
の場合において、医薬組成物は影響を受けた領域または
影響を受けたように思われる領域に局所的に適用され
る。例えば、組成物は被検体の眼にアイドロップ（ｅｙ
ｅ ｄｒｏｐ）で投与するか、あるいは唇に軟膏を介し
て適用することができる。あるいは、組成物を全身的に
投与すべきとき、投与は経口的投与、筋肉内に、静脈内
に、ゆっくり放出されるカプセル会いの形態でおよび浸
透圧ポンプによりことができるが、これらに限定されな
い。有効量は被検体の体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１
００ｍｇである。しかしながら、本発明の好ましい実施
態様において、被検体の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ
〜約１０ｍｇの投与量を投与する。この分野において知
られているように、正確な投与量は処置または防止する
感染ならびに被検体の他の生理学的特性に依存する。

【００１１】下に記載する実験は例示のみを目的とし、
そして本発明の範囲を限定しない。材料および方法 ＭＫ遺伝子のクローニングおよび配列決定 発表されたマウスＭＫタンパク質のアミノ酸配列を使用
して、ポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして
使用する特定のオリゴヌクレオチドをつくった。マニア
チス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（３８）に記載されているよ
うに、マウスのゲノムのＤＮＡをＣ５７ブラック／６Ｊ
マウスから単離した。

【００１２】センスプライマーを次のアミノ酸配列に対
して作った：ＣＮＷＫＫＥＦＧ（図１）ＨｉｎｄＩＩＩ
制限部位を使用して出発しそしてＤＮＡ配列：５’ＧＧ
ＡＡＴＴＣＧＧＴＣＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧ
ＣＡＧＴ−３’から構成されていた。

【００１３】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を相補的
ＤＮＡ鋳型について実施し、５０℃において１分間実施
し、７２℃において２分間伸長し、そして９４℃におい
て１分間変性し、Ｔａｑポリメラーゼ（ＵＳＢコーポレ
ーション）を使用して３０サイクルを実施した。

【００１４】１５０塩基対のマウスＭＫのＰＣＲ生成物
をブルー・スクライブ（ＢｌｕｅＳｃｒｉｂｅ）（＋）
ベクター〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）〕
の中にクローニングし、そして生まれたばかりの脳幹お
よび脳幹神経節λｇ１１のｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニングにおいてプローブとして使用した（３９）。
ＭＫ配列を含有する単一の推定上のクローンを単離し、
そしてブルー・スクライブ（Ｂｌｕｅ Ｓｃｒｉｂｅ）
（＋）のＥｃｏＲＩ部位の中にサブクローニングし、そ
してジデオキシ連鎖停止法法により配列決定した（４
０）。ＭＫ遺伝子の配列、ならびに予測されたアミノ酸
配列は図１に示されている。マウスＭＫ配列との比較
は、マウス配列の中の３つのコドンの欠失を包含する、
４１ヌクレオチドの差を示す。

【００１５】組み換えヒトＭＫの発現 前述の単離されたクローン（ｐＭＫＨＣ２とよぶ）をＰ
ＣＲ増幅のために鋳型として使用し、ここでＮ−末端リ
ジンに対して直ぐ５’にメチオニンのコドンおよびＮｄ
ｅＩ制限部位を配置するように設計したプライマーを使
用する。精製したＰＣＲ生成物を発現ベクターｐＥＴ−
３ａの誘導体の中にクローニングし、ｐＥＴ−３ａは１
４００ｂｐのＳａｌＩ／ＰｖｕＩＩ断片の欠失およびｆ
１複製由来のＥｃｏＲＩ部位の中への挿入により修飾す
る。インサートを配列決定してＰＣＲ増幅の信頼性を確
証した後、このプラスミド（ｐＥＴＭＨ２と命名する；
また以前はｐＥＴＭＫＨＣ２と呼ばれた）を菌株ＢＬ２
１ｌｙｓＳの中に形質転換し、そしてＩＰＴＧを使用す
るタンパク質の生産のために誘発した。１ｍｌの培養物
からの沈澱物を１００μｌのＳＤＳ緩衝液の中に懸濁さ
せ（４１）そして２．５μｌを１５％のアクリルアミド
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に展開させる。ゲルをクーマッ
シーブルーで染色する。組み換えＭＫをバクテリアの抽
出物からヘパリンセファローズＣＬ−６Ｂ〔ファーマシ
ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）〕樹脂上で１０ｍＭのトリス
の中で精製し、そして１〜１．１３ＭのＮａＣｌにおい
て溶離する。それ以上の精製は、モノ（Ｍｏｎｏ）（フ
ァーマシア）カラム上で５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐ
Ｈ６．８の中で達成され、ここで塩濃度を０から１Ｍの
ＮａＣｌに増加する。

【００１６】ＨＢＮＦ遺伝子のクローニングおよび配列
決定 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と生まれたばかりのヒ
ト脳幹細胞から誘導されたｃＤＮＡライブラリーｎｏス
クリーンとの組み合わせを利用することによって、ＨＢ
ＮＦをエンコードするヒトＤＮＡ配列をクローニングし
た。ＰＣＲ増幅反応のためのオリゴヌクレオチドの設計
のための出発点として、ウシＨＢＮＦアミノ酸配列を使
用した。ウシＨＢＮＦの部分的１１４アミノ酸配列を図
２に示す。タンパク質の合計の長さは、ヒトタンパク質
におけるように、１３６アミノ酸である。成体のラット
の脳からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを逆転写して相補的ｃＤ
ＮＡ鎖を生成する。次いで、この鎖を配列特異的プライ
マーを使用するＰＣＲ反応のための鋳型として使用す
る。次いで、発現された２８２塩基対のＰＣＲ生成物を
単離し、そして適当なベクターの中にクローニングし
た。ＤＮＡの配列決定は、ラットＨＢＮＦペプチドをエ
ンコードするクローニングされた断片を同定する。クロ
ーニングされたインサートを単離し、標識し、そしてフ
ァージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため
のプローブとして使用した。スクリーンしたほぼ１５０
万のファージのうちで、４つの候補のクローンを単離
し、サブクローニングし、そして配列決定した。ヒトＨ
ＢＮＦのＤＮＡ配列を図３〜４に示す。

【００１７】ｃＤＮＡ配列は、ヒトＨＢＮＦタンパク質
が１３６アミノ酸の長さであることを示す。残基９８に
おいてウシ配列と単一のアミノ酸の差が存在する（ウシ
においてＡｓｐ、ヒトにおいてＧｌｕ）。Ｎ−末端のタ
ンパク質およびｃＤＮＡの完全な配列の情報に基づい
て、このタンパク質の期待されるマイクロタイターウェ
ルは１５ｋＤのであり、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用
して前に観察された１８ｋＤのより小さい（４２、４
３）。したがって、観察された大きさの差はタンパク質
の塩基性がそののゲル上の移動に影響を与えるためであ
る。

【００１８】また、ヒトタンパク質の２つのより小さい
形態は以前に同定された（欧州特許（ＥＰ）第３２６，
０７５号）；これらは酵素阻害因子が存在しないとき抽
出／単離の間の変化により発生した全長のタンパク質の
Ｃ−末端の切頭された形態を表す。推定上のメチオニン
の翻訳開始コドンは、成熟タンパク質のＮ−末端のグリ
シンより３２アミノ酸だけ前に位置する；このプレ配列
は以前に同定されたシグナル配列に類似しない（４
４）。しかしながら、タンパク質の翻訳がこのメチオニ
ンにおいて開始される場合、プレ配列はそうでなければ
高度に親水性のタンパク質の中の疎水性領域のみを表す
であろう。成熟ＨＢＮＦタンパク質の前のタンパク質プ
ロセシング部位は、成熟タンパク質からのシグナル配列
の切断のための構造の決定基と一致する（５１）。

【００１９】汚染する真核生物のタンパク質を含まない
成熟ヒトＨＢＮＦタンパク質源を提供するために、クロ
ーンの１つのＨＨＣ８を、Ｎ−末端のグリシンに対して
直ぐ５’にメチオニンのコドンを配置するように設計さ
れたプライマーを使用するＰＣＲ増幅のための鋳型とし
て使用した（図４）。増幅した生成物を発現ベクターｐ
ＥＴ−３ａの修飾された形態の中にクローニングし、そ
して生ずるプラスミドｐＥＴＨＨ８を菌株ＢＬ２１ Ｌ
ｙｓＳ（同上）の中に形質転換した。ｐＥＴＨＨ８を含
有するＩＰＴＧ誘発培養物のタンパク質抽出物（図５ａ
レーン３）は、誘発しない培養物（レーン２）について
対応する位置における淡いタンパク質バンドと比較し
て、成熟ウシＨＢＮＦとほぼ同一大きさの強いタンパク
質バンドを示す。バクテリア的に生産したＨＢＮＦがＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ上でウシおよびラット誘導ＨＢＮＦと同
一の位置に移動しそして生物学的に活性であるという事
実は、存在する場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で発
現されるＨＢＮＦに比較して、自然ＨＢＮＦタンパク質
の翻訳後の最小の修飾が存在することを示唆する。ＨＢ
ＮＦ配列の中の認識可能なグリコシル化シグナルの欠如
は、さらに、この仮説を支持する。

【００２０】ヒトＨＢＮＦタンパク質は、そのヘパリン
に対する親和性を利用することによって、ＩＰＴＧ誘発
バクテリア培養物から精製する。そのＮ−末端のアミノ
酸配列はタンパク質の配列決定により確証され、そして
このタンパク質をニューライトの発芽後成長のアッセイ
において神経親和活性についてアッセイする。このバク
テリア的に誘導されたヒトＨＢＮＦは、ウシおよびラッ
トのＨＢＮＦのそれに匹敵する活性を示した（図５
ｂ）。こうして、前述の観察と一致して、成熟ＨＢＮＦ
は神経親和活性を有することが発見された。

【００２１】以下の実施例は、ＨＢＮＦ遺伝子のクロー
ニングおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼの発現系における
発現を例示する。しかしながら、このＴ７の発現系は非
常に効率よいことが証明されたが、これはヒトＨＢＮＦ
を組み換え的に生成できる手段のみではないことを理解
すべきである。ＨＢＮＦの生成は、ＨＢＮＦ遺伝子を任
意の適当な発現ベクターの中に組み込み、そして引き続
いて適当な宿主細胞をベクターで形質転換することによ
って達成することができる；あるいは、宿主細胞の形質
転換は直接裸のＤＮＡによりベクターを使用しないで達
成することができる。真核生物の細胞または原核生物の
細胞によるＨＢＮＦの生成は本発明により考えられる。
適当な真核生物の細胞の例は、哺乳動物の細胞、植物の
細胞、酵母菌の細胞および昆虫の細胞を包含する。同様
に、適当な原核生物の宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
に加えて、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）を包含する。

【００２２】他の適当な発現ベクターは、また、使用す
ることができ、そして宿主細胞の選択に基づいて選択さ
れる。例えば、バクテリアの細胞を形質転換するとき使
用するために適当な多数のベクターはよく知られてい
る。例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ、例
えば、λファージは、バクテリアの宿主、とくに大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）のために最も普通に使用されているベ
クターである。哺乳動物および昆虫の両者の細胞におい
て、ウイルスのベクターは外因性ＤＮＡの発現を得るた
めに頻繁に使用される。とくに、哺乳動物の細胞は普通
にＳＶ４０またはポリオーマウイルスで形質転換され
る；そして培養物の中の昆虫の細胞はバキュロウイルス
の発現ベクターで形質転換することができる。酵母菌の
ベクター系は。酵母菌の動原体のプラスミド、エピソー
ムのプラスミドおよび酵母菌の組み込みプラスミドを包
含する。

【００２３】また、理解されるように、本発明の実施
は、それぞれ、図１、図３および図４に規定されるよう
な、ヒトのＭＫまたはＨＢＮＦの遺伝子の正確な配列の
使用に限定されない。生ずるタンパク質分子においてサ
イレントな変化を生成する配列の中の欠失、挿入または
置換のような配列の修飾が、また、考えられる。例え
ば、遺伝暗号の縮重を反映するか、あるいは所定の部位
において連続的アミノの変化を生ずる遺伝子の配列の中
の変更が考えられる。同様に、１つの負に帯電した残基
と他の残基との置換を生ずる変化は、また、生物学的に
同等の生成物を生成することが期待される。さらに、種
の間で保存されるのは主としてタンパク質の中央の部分
であるので、タンパク質分子のＮ−末端およびＣ−末端
の変更を生ずるヌクレオチドの変化はタンパク質の活性
を変更することは期待されないであろう。

【００２４】事実、欧州特許（ＥＰ）第３２６，０７５
号「ＨＢＮＦ」はＨＢＮＦタンパク質のＣ−末端の切頭
を包含する。また、タンパク質の活性を変更する１つの
方法として、配列の中に存在するシステインの１または
２以上を排除ことが望ましいことがある。提案された修
飾の各々、ならびにエンコードされた生成物の生物学的
活性の保持の決定は当業者によく知られている。したが
って、句「ＤＮＡ配列」または「遺伝子」を使用すると
き、生物学的に同等なタンパク質を生成する、すべての
このような修飾および変化を包含することが理解される
であろう。とくに、図１、図３および図４の配列と有意
な重複性を有し、こうして標準の高いストリンジェンー
のサザンハイブリダイゼーション条件下に、例えば、マ
ニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（３８）に記載されて
いる条件下に、前記配列とのハイブリダイゼーションを
可能とするＤＮＡ配列を本発明は意図する。

【００２５】ＨＢＮＦタンパク質の精製およびアミノ酸
配列の分析 ＨＢＮＦタンパク質をウシの脳から欧州特許（ＥＰ）第
３２６，０７５号（その開示の全体をここに引用によっ
て加える）に記載されているプロトコルにより単離す
る。簡単に述べると、逆相ＨＰＬＣ精製したＨＢＮＦ
を、従来記載されたプロトコル（４６）に従い、メルカ
プトエタノール中で還元しそしてシステイン残基をヨー
ド−（２−１４Ｃ）−アミノ酸でアルキル化することに
よって、化学的に修飾する。逆相ＨＰＬＣによりブロウ
ンリー・アクアポア（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏ
ｒｅ）Ｃ８カラム〔２５×０．４６ｃｍ、７μｍの粒子
サイズ、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、移動相としてア
セトニトリルの勾配の０．１％のトリフルオロ酢酸を使
用して、カルボキシメチル化タンパク質を精製する。３
ｎＭのカルボキシメチル化ＨＢＮＦに相当するアリコー
トを酵素消化緩衝液で希釈して、試料のアセトニトリル
濃度を１０％に減少し、そして次のプロテアーゼで消化
する：黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８（グルタミン酸残基後の切断）、
Ａｒｇ−ｃ（アルギニン後の切断）、Ａｓｐ−Ｎ（アス
パラギン酸前の切断）およびキモトリプシン（芳香族残
基後の優先的切断）。酵素はベーリンガー・マンヘイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手
し、そして切断は本質的に製造業者が示唆するように実
施する。消化後、Ｃ８カラムの逆相ＨＰＬＣによりペプ
チドの溶離のために０．１％のトリフルオロ酢酸中のア
セトニトリルの９０分の直線の勾配（開始時のアセトニ
トリル含量：１２〜１６％、終わりにおいて：３０〜４
４％、消化物のタイプに依存する）を使用してペプチド
を分割する。精製したペプチドの均質性を確認するため
に、ペプチド物質を含有する分画を第２の逆相ＨＰＬＣ
段階にかける（Ｃ８カラム、適当な浅いアセトニトリル
の勾配の０．１％のヘプタフルオロ酪酸）。単離したペ
プチドの５〜５００ｐｍｏｌのアリコートをアプライド
・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）４７７Ａ気／液相ミクロシークエネイターで配
列決定する。フェニルヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸
誘導体を１２０Ａ型オンラインＰＴＨアミノ酸分析器
（アプライド・バイオシステムス）で同定する。両者の
手順のための実験のプロトコルは計器の製造業者により
供給されるものである。最初の１１４アミノ酸（期待さ
れた１３６のうちの）の配列を図６に示す。

【００２６】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） ウシＨＢＮＦアミノ酸配列を使用して、ＰＣＲ増幅反応
からの縮重オリゴヌクレオチドを設計する。完全に縮重
のセンスプライマーを次のアミノ酸配列について作る：
ＤＣＧＥＷＯＷ（図４）ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で出発
しそしてＤＮＡ配列：５’−ＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＰｙ
ＴＧＰｌＧＧＮＧＡＰｕＴＧＧＣＡＰｕＴＧＧ−３’か
ら構成されている。完全に縮重のセンスプライマーを次
のアミノ酸配列について作る：ＮＡＤＣＱＫＴ（図４）
ＥｃｏＲＩ制限部位で出発しそしてＤＮＡ配列：５’−
ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＰｙＴＴＰｙＴＧＰｕＣＡＰｕＴ
ＣＮＧＣＰｕＴＴ−３’から構成されている。

【００２７】全体のラットの脳のＲＮＡをスプレイク−
ダウレイ（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの脳
からグアニジニウムイソチオシアネート−塩化セシウム
により単離し、そしてポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）−セルロースへの結合の２サイクルにより選抜する
（４７）。脳のポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）お
よびＡＭＶ−逆転写酵素で逆転写する（３８）。ＰＣＲ
反応を相補的ＤＮＡ鋳型上で実施し、次の３０サイクル
を使用する：５０℃において１分のアニーリング、７２
℃において２分の伸長および９４℃において１分の変
性、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）を使用す
る。

【００２８】ヒトＨＢＮＦのクローニングおよび配列決
定 ２８２塩基対のラットＨＢＮＦのＰＣＲ生成物をブルー
・スクライブ（Ｂｌｕｅ Ｓｃｒｉｂｅ）（＋）ベクタ
ー〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）〕の中に
クローニングし、そして新生児の脳幹および脳幹神経節
のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに
おいてプローブとして使用する（４８）。３０ＨＨＣク
ローンが最初に同定され、そして予備的制限分析後、４
つのクローンが単離され、ブルー・スクライブ（Ｂｌｕ
ｅ Ｓｃｒｉｂｅ）（＋）のＥｃｏＲＩ部位においてサ
ブクローニングし、そしてジデオキシ連鎖停止法により
配列決定する（４９）。

【００２９】クローンのうちの３つは解読配列において
同一の配列を有し、そして第４のクローンは３ヌクレオ
チドのインフレームの欠失を有して位置１１９における
アラニンを除去する。これらの配列を図４に示す。

【００３０】組み換えＨＢＮＦの発現 メチオニンのコドンおよびＮｄｅＩ制限部位をＮ−末端
のグリシンに対して直ぐ５’に配置するように設計した
プライマーを使用するＰＣＲ増幅のための鋳型として使
用するために、クローンＨＨＣ８（図３）を選択する。
精製したＰＣＲ生成物を発現ベクターの誘導体の中にク
ローニングし、これを１４００ｂｐのＳａｌＩ／Ｐｖｕ
ＩＩ断片の欠失およびＥｃｏＲＩ部位の中へのｆ１複製
由来の挿入により修飾する。インサートを配列決定して
ＰＣＲ増幅の信頼性を確証した後、このプラスミド（ｐ
ＥＴＭＨ８と命名する）を菌株ＢＬ２１ｌｙｓＳの中に
形質転換しそして記載されているように（４５）ＩＰＴ
Ｇを使用するタンパク質の生産のために誘発した。１ｍ
ｌの培養物からの沈澱物を１００μｌのＳＤＳ緩衝液の
中に懸濁させ（５０）そして２．５μｌを１５％のアク
リルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に展開させる。ゲル
をクーマッシーブルーで染色する。自然ＨＢＮＦをラッ
トの脳から、そして組み換えＨＢＮＦをバクテリアの抽
出物から、ヘパリンセファローズＣＬ−６Ｂ〔ファーマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）〕樹脂上で１０ｍＭのトリ
スの中で精製し、そして０〜２ＭのＮａＣｌの中で１〜
１．１３ＭのＮａＣｌにおいて溶離する。それ以上の精
製は、モノ（Ｍｏｎｏ）（ファーマシア）カラム上で５
０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．８の中で達成され、
ここで塩濃度を０から１ＭのＮａＣｌに増加する。

【００３１】抗ウイルス活性 細胞およびウイルス。Ｖｅｒｏ細胞をＡＴＣＣから入手
し、そして１０％の仔ウシ血清〔セル・カルチャー・ラ
ボラトリーズ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）〕、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−エタンスルホン
酸）および抗生物質：ペニシリンＧ５０単位／ｍｌおよ
びストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍｌ〔ギブコ（Ｇｉｂ
ｃｏ）〕を含有するダルベッコ変性イーグル培地〔メデ
ィアテク（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）〕の中で維持した。ヒ
ト包皮線維芽（ＨＦＦ）をこの実験室において単離し、
そして１０％の胎児ウシ血清〔セル・カルチャー・ラボ
ラトリーズ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）〕を含有する高いグルコース（４．５ｍ
ｇ／ｍｌ）ダルベッコ変性イーグル培地〔メディアテク
（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）〕の中で維持した；他の修飾は
前述した通りであった。ウイルスの成長培地は本質的に
記載した通りであるが、ただし２％の胎児ウシ血清をＨ
ＳＶおよびＨＣＭＶの両者の感染のために使用した。Ｈ
ＳＶ−１菌株ＣＪ３６０およびＨＳＶ−２菌株３３３
（２７）をＣ．ブラント（Ｂｒａｎｄｔ）：ウィスコン
シン大学）から入手した。ＨＣＭＶ菌株ＴｏｗｎｅはＡ
ＴＣＣから入手した。

【００３２】２２５ｃｍ²のフラスコ内の２％の胎児ウ
シ血清を含有するリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の中でＶｅ
ｒｏ細胞の単層を０．０１ＰＦＵ／細胞の多重度に感染
させることによって、ＨＳＶのストックを調製した。ウ
イルスを３７℃において１時間吸着させた後、ウイルス
の接種物を取り出しそして前述したようにウイルスの成
長培地と置換した。顕微鏡検査により判定して細胞の１
００％が感染するまで、感染を進行させた。細胞を上澄
み液の中に書き落とすことによってウイルスを収獲し、
そして凍結−融解のサイクルにかけた。細胞の破片を４
℃において１，０００ｒｐｍで１０分間遠心することに
よってウイルス懸濁液から除去した。ＨＣＭＶストック
を本質的にＨＳＶについて前述したようにＨＦＦ細胞の
中で調製したが、ただし単層の感染が完結するまで、ウ
イルスの成長培地を３日毎に置換した。２％の胎児ウシ
血清を含有するＰＢＳの中でストックのウイルスを希釈
し、そして１ｍｌのウイルスの接種物をＶｅｒｏ細胞
（ＨＳＶ）またはＨＦＦ（ＨＣＭＶ）単層に適用するこ
とによって、ウイルスのプラークアッセイのための細胞
を感染させた。ウイルスを細胞に３７℃において１時間
吸収させ、次いでウイルスの接種物を取り出し、そして
細胞をＰＢＳですすぎ、次いで２％の胎児ウシ血清およ
び１．０％のアガロースを含有する変更した必須培地ギ
ブコ（Ｇｉｂｃｏ）をオーバーレイした。単層を固定
し、そしてアガロースのプラグ上に２０％のトリクロロ
酢酸（ＴＣＡ）の添加により染色した；１０分後、ＴＣ
Ａを吸引し、そしてアガロースをウェルから除去し、次
いで固定した単層を２０％のメタノールおよび２％のホ
ルムアルデヒドを含有する０．１％のクリスタルバイオ
レット溶液で染色した。

【００３３】記載する方法により感染した未処理の対照
に関して、変化する濃度のタンパク質因子の存在下のウ
イルスのプラーク形成の効率を計算することによって、
５０％の阻止濃度を決定した。チョウ（Ｃｈｏｕ）（２
８）に記載されているように、メジアン投与量有効プロ
ットプログラム（Ｍｅｄｉａｎ Ｄｏｓｅ Ｅｆｆｅｃ
ｔ Ｐｌｏｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）〔エルセビーア・バイ
オソフト（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ）〕を使
用して、メジアン有効投与量を計算した。

【００３４】タンパク質。ヒトの血小板誘導ＰＦ４をシ
グマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス）から入手し、そし
て前述したように（２９）精製した。カルボキシメチル
化ＨＢＮＦを次のようにして調製した：凍結乾燥した組
み換えＨＢＮＦを２ｍＭのＥＤＴＡおよび４．５Ｍのグ
アニジニウムＨＣｌを含有する０．１ＭのトリスＨＣ
ｌ、ｐＨ８．６中に溶解して０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を
得た。タンパク質をジチオスレイトール（５ｍＭ）で還
元し、そしてこの溶液をアルゴン雰囲気下に３７℃にお
いて１時間インキュベーションした。還元したタンパク
質溶液を室温に冷却し、そして暗所でヨード酢酸（１５
ｍＭ）を使用して１時間アルキル化した。カルボキシメ
チル化タンパク質を２００ｍＭのＮａＣｌを含有する１
０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃におい
て一夜透析（３５００分子量のカットオフ）した。ＨＣ
ｌ気相の加水分解（５．７ＭのＨＣｌ／０．１％のフェ
ノール；１１０℃で２４時間）後、オンラインの１３０
Ａ型分離系を装備した４２０Ａ型のＰＩＴＣデリバタイ
ザー〔アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カリフォルニア州〕を使用す
るアミノ酸分析により、カルボキシメチルシステインお
よびタンパク質の濃度を決定した。カルボキシメチル化
ＨＢＮＦをヘパリン−セファローズから０．６ＭのＮａ
Ｃｌで溶離した。

【００３５】抗ウイルスの結果 バクテリアのβ−ガラクトシダーゼを発現するように遺
伝子操作した組み換えウイルスの酵素活性を測定するこ
とによって、ＨＢＮＦおよびＭＫをＨＳＶ−１およびＨ
ＣＭＶに対する抗ウイルス活性について測定した（別々
に記載するように）。ＨＢＮＦおよびＭＫは、それぞ
れ、４μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌの５０％の阻害濃
度でＨＳＶおよびＨＣＭＶを阻害することが発見され
た。インフルエンザＡ型に対するＨＢＮＦのウイルス阻
害活性はＥＬＩＳＡアッセイを使用して証明することが
できず、ヘルペスウイルスに対して観察された効果は特
異的であり、そして一般にエンベロープドウイルスに対
して向けられなかったことを示唆した。

【００３６】Ｖｅｒｏ細胞の野生型ＨＳＶおよびＨＣＭ
Ｖの感染へのＨＢＮＦおよびＭＫの効果をプラークアッ
セイによりさらにアッセイし、そして両者のタンパク質
はこれらのウイルスの感染性を阻害することが発見され
た（表１）。両者のタンパク質についてのＩＣ_５０はモ
ル以下の範囲であり、そしてＨＳＶ−２はＨＳＶ−１ま
たはＨＣＭＶより感受性が低いように思われた（表
１）。ＨＳＶの感染性はまた血小板因子ＰＦ４、他のヘ
パリン結合性タンパク質、により阻害され、ＩＣ_５０は
ＨＢＮＦおよびＭＫのそれに類似した（表１）。ＨＢＮ
Ｆの阻害活性はタンパク質の１０のシステイン残基のカ
ルボキシメチル化により破壊された。この処理は、多
分、ＨＢＮＦの適切なフォルディングを防止し、そして
ＨＢＮＦの２つの他の活性を排除する：高い親和性のレ
セプターへのｂＦＧＦの結合を手順する能力および内皮
細胞に対して向けられた抗増殖活性（２６）。

【００３７】引き続いて、ＨＢＮＦの抗ウイルス作用を
決定した。Ｖｅｒｏ細胞をＨＢＮＦの存在下または不存
在下にＨＳＶ−１で感染させた。次いで最初ウイルスの
吸着の間、ＨＢＮＦを両者の系においてオーバーレイで
添加した。この実験の結果が明瞭に示すように、ウイル
スの吸着の間にＨＢＮＦが存在したときにのみ、ＨＢＮ
Ｆの抗ウイルス活性は有意であった（図６）。

【００３８】論考 本発明において、２つの組み換えヒトヘパリン結合性タ
ンパク質のＨＢＮＦおよびＭＫはＨＳＶおよびＨＣＭＶ
の感染性を阻止ことが報告される。この効果は、明らか
に、ターゲット細胞へのウイルスの吸着の阻止のためで
ある。最近、同様な活性は２つのヘパリン結合性タンパ
ク質について報告された：ヒト血小板誘導ＰＦ４（１）
およびヒトｂＦＧＦ（１７、２０）。

【００３９】ＨＢＮＦおよびＭＫ、ｂＦＧＦ、およびＰ
Ｆ４は異なるタンパク質の族に属し、こうして推定上の
高い親和性のウイルスのレセプターへの結合についての
直接の競争は起こらないように思われる。しかしなが
ら、すべての４つのタンパク質は細胞表面のＨＳＰの硫
酸ヘパリン部分への結合についてウイルスと競争するこ
とができる。ｂＦＧＦのための既知の高い親和性のレセ
プターが存在する（３０〜３６）が、最近、ｂＦＧＦは
細胞表面のＨＳＰに結合して、高い親和性のレセプター
に結合することができる「誘発された適合の」コンフォ
メーションを獲得ことが発見された（２２〜２４）。こ
うして、ｂＦＧＦは、高い親和性のレセプターよりむし
ろ、細胞表面のＨＳＰを占有することによってウイルス
の吸着を阻止することができる。

【００４０】細胞のＨＳＰに対するＨＢＮＦおよびＭＫ
の親和性は知られていない。最近、ウシ内皮細胞のＨＳ
Ｐに対するヒトＰＦ４の親和性は特性決定された（Ｋ_d
＝２．８７μＭ、３７）。ＨＢＮＦ、ＭＫおよびＰＦ４
が硫酸ヘパリンに対して同様な親和性を有する場合、マ
イクロモルまたはマイクロモルより低い濃度のこれらの
タンパク質は細胞表面を飽和し、そしてＨＳＶおよびＨ
ＣＭＶの感染性を阻害することが期待されるであろう。

【００４１】現在、ＨＳＶおよびＣＭＶの感染に対して
有効な入手可能な薬物の大部分は低分子量の化合物であ
る。これらの薬物は全身的に与えられ、そしてそれらの
あるものは、とくに免疫無防備の患者において、高度の
毒性を有する。

【００４２】ヘパリン結合性タンパク質は、ヘルペスウ
イルス族のメンバーの感染性をブロックする作用をする
抗ウイルス因子である。それら自体、これらのタンパク
質はヘルペスウイルス、ことにアルファヘルペスウイル
ス、単純ヘルペスウイルス１型および２型、水痘−帯状
疱疹ウイルス、およびベータヘルペスウイルス、サイト
メガロウイルスにより引き起こされる種々の病気の状態
において有用である。ヘルペスウイルスの特定の特性
は、初期の急性の感染性の消散に引き続いて時々再活性
化されることがある、潜伏性の感染を引き起こす性質で
ある。ヘパリン結合性タンパク質はウイルスの感染性を
細胞レセプターのレベルでブロックするので、それらは
ウイルスそれ自体の再活性化を阻止することは期待され
ないであろう。むしろ、これらのタンパク質はウイルス
の複製の基部におけるウイルスの感染および広がりを防
止するであろう。これによりこのアプローチは再活性化
されたウイルスの感染、例えば、単純疱疹、再発性陰部
疱疹、とくに単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロ
ウイルスにより引き起こされる眼の感染、ならびに帯状
ヘルペスの中の帯状ヘルペス状発疹に適用することがで
きる。組み換えヘパリンの結合による処置は、また、初
期の急性感染の間のウイルスの広がりを制限すいるとき
有用であり、そしてまた、日和見性のヘルペスウイルス
の感染が重大な問題である免疫無防備の宿主における予
防的治療として考えることができる。

【００４３】

【表１】

【００４４】ウイルスのプラークの還元のアッセイを材
料および方法に記載されているように実施した。６ウェ
ルのクラスターの皿の中のＶｅｒｏ細胞を、種々の濃度
のタンパク質因子の存在下に２００ＰＦＵ／ウェルのイ
ンプットの多重度で感染させた。因子で処理した培養物
におけるプラーク形成効率を感染した未処理の対照に関
係して計算し、そしてメジアン投与量有効プロットプロ
グラムを使用して５０％の阻止濃度を決定した。

【００４５】参考文献 １、ウヅン（ＷｙＤｕｎｎ）、Ｄ．およびスピーア（Ｓ
ｐｅａｒ）、Ｐ．Ｇ．、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ）、６２：５２−５８（１９８９）。

【００４６】２、リクケ（Ｌｙｃｋｅ）、Ｅ．ら、ジャ
ーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
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１）。

【００４７】３、タケモト（Ｔａｋｅｍｏｔｏ）、Ｋ．
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リメンタル・バイオロジー（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ
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（１９６４）。

【００４８】４、バヘリ（Ｖａｈｅｒｉ）、Ａ．、Ａｃ
ｔａ Ｐａｌｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎ．
Ｓｕｐｐｌ．（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、１７１：７−
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【００４９】５、ナーミアス（Ｎａｈｍｉａｓ）、Ａ．
Ｊ．およびキブリック（Ｋｉｂｒｉｃｋ）、Ｓ．、ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）、８７：１０６０−１０６６（１９６４）。

【００５０】６、ランゲランド（Ｌａｎｇｅｌａｎｄ）
ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６１：３
３８８−３３９３（１９８７）。

【００５１】７、ランゲランド（Ｌａｎｇｅｌａｎ
ｄ）、Ｎ．ら、ジャーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジ
ー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、６９：１１３７−１
１４５（１９８８）。

【００５２】８、ランゲランド（Ｌａｎｇｅｌａｎ
ｄ）、Ｎ．ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）、６４：１２７１−１２７７（１９９０）。

【００５３】９、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）、Ｄ．Ｃ．
ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６５：１
０９０−１０９８（１９９１）。

【００５４】１０、フラー（Ｆｕｌｌｅｒ）、Ａ．Ｏ．
およびスピーア（Ｓｐｅａｒ）、Ｐ．Ｇ．、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）
ＵＳＡ、８４：５４５４−５４５８（１９８７）。

【００５５】１１、ハイランダー（Ｈｉｇｈｌａｎｄｅ
ｒ）、Ｓ．Ｌ．ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）、６１：３３５６−３３６４（１９８７）。

【００５６】１２、カイ（Ｃａｉ）、Ｗ．Ｈ．ら、ウイ
ルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６２：７１４−７
２１（１９８８）。

【００５７】１３、リガス（Ｌｉｇａｓ）、Ｍ．Ｗ．お
よびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｄ．Ｃ．、ウイル
ス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６２：１４８６−１
４９４（１９８８）。

【００５８】１４、ハイランダー（Ｈｉｇｈｌａｎｄｅ
ｒ）、Ｓ．Ｌ．ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）、６２：１８８１−１８８８（１９８８）。

【００５９】１５、クレイネイジ（Ｃｒａｎａｇｅ）、
Ｍ．Ｐ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：３０５７−３０６３
（１９８６）。

【００６０】１６、カリ（Ｋａｒｉ）、Ｂ．およびゲル
ズ（Ｇｅｈｒｚ）、Ｒ．ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ）、６６：１７６１−１７６４（１９９２）。

【００６１】１７、カネル（Ｋａｎｅｒ）、Ｒ．Ｊ．
ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４８：１４１０
−１４１３（１９９０）。

【００６２】１８、バイルド（Ｂａｉｒｄ）、Ａ．ら、
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（Ｌｏｎｄｏｎ）、３４
８：３４４−３４６（１９９０）。

【００６３】１９、シエ（Ｓｈｉｅｈ）、Ｍ．−Ｔ．お
よびスピーア（Ｓｐｅａｒ）、Ｐ．Ｇ．、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５３：２０８−２０９（１９９
１）。 ２０、ムッゲリッジ（Ｍｕｇｇｅｒｉｄｇｅ）、Ｍ．
Ｉ．ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６
６：８２４−８３０（１９９２）。

【００６４】２１、ミルダ（Ｍｉｒｄａ）、Ｄ．Ｐ．
ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６６：４
４８−４５７（１９９２）。

【００６５】２２、ヤヨ（Ｙａｙｏｎ）、Ａ．ら、細胞
（Ｃｅｌｌ）、６４：８４１−８４８（１９９１）。

【００６６】２３、ラプレガー（Ｒａｐｒａｅｇｅ
ｒ）、Ａ．Ｃ．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ワ
シントンＤＣ）、２５２：１７０５−１７０８（１９９
１）。

【００６７】２４、オルニツ（Ｏｒｎｉｔｚ）、Ｄ．
Ｍ．ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
ー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、１２：２４０−
２４７（１９９２）。

【００６８】２５、ボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）、Ｐ．お
よびコベスジ（Ｋｏｖｅｓｄｉ）、Ｉ．、成長因子の研
究における進歩（Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａ
ｃｔｏｒｓ Ｒｅｓ．）、３：１４３−１５７（１９９
１）。

【００６９】２６、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）、Ｊ．お
よびボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）、Ｐ．（１９９１）、特
許出願３１，６８５−０００および３１，６８６−００
０。 ２７、グラウ（Ｇｒａｕ）、Ｄ．Ｒ．ら、Ｏｐｈｔａｌ
ｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３０：２４７４−２４８０
（１９８９）。

【００７０】２８、チョウ（Ｃｈｏｕ）、Ｔ．Ｃ．およ
びタラレイ（Ｔａｌａｌａｙ）、Ｐ．、アドバンシズ・
イン・エンザイム・レギュレイション（Ａｄｖ．Ｅｎ
ｚ．Ｒｅｇｕｌ．）、２２：２７−５５（１９８４）。

【００７１】２９、クレトシュマー（Ｋｒｅｔｓｃｈｍ
ｅｒ）、Ｐ．Ｊ．ら、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃ
ｔｏｒｓ）、５：９９−１１４（１９９１）。

【００７２】３０、モスカテッリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉ）、Ｄ．、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロ
ジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｙｓｉｏｌ．）、１３１：１２
３−１３０（１９８７）。

【００７３】３１、ルタ（Ｒｕｔａ）、Ｍ．ら、オンコ
ジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、３：９−１５（１９８
８）。

【００７４】３２、コウグリン（Ｃｏｕｇｈｌｉｎ）、
Ｓ．Ｒ．ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６３：９２
８−９３３（１９８８）。

【００７５】３３、コーンブルス（Ｋｏｒｎｂｌｕｔ
ｈ）、Ｓ．ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、８：５５
４１−５５４４（１９８８）。

【００７６】３４、リー（Ｌｅｅ）、Ｐ．Ｌ．ら、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４５：５７−６０（１９
８９）。

【００７７】３５、パスクアレ（Ｐａｓｑｕａｌｅ）、
Ｅ．Ｂ．およびシンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）、Ｓ．Ｊ．、
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８６：５４４９−５４５３（１９８
９）。

【００７８】３６、サフラ（Ｓａｆｒａｎ）、Ａ．ら、
オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、５：６３５−６４
３（１９９０）。

【００７９】３７、リバク（Ｒｙｂａｋ）、Ｍ．Ｅ．
ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、７３：１５３４−１５３
９（１９８９）。

【００８０】３８、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２。

【００８１】３９、カムホルズ（Ｋａｍｈｏｌｚ）、
Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ８３：５４９６２−５４９６
６（１９８６）。

【００８２】４０、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐ．
Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（１９
８８）。

【００８３】４１、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７：６８０−６８５（１
９７０）。

【００８４】４２、ラウバラ（Ｒａｕｖａｌａ）、ＥＭ
ＢＯ Ｊ．８：２９３３−２９４１（１９８９）。

【００８５】４３、ミルナー（Ｍｉｌｎｅｒ）ら、バイ
オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）、１５４：１０９６−１１０３
（１９８９）。

【００８６】４４、ボ・ヘイジン（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎ
ｅ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１８４：９９−１０５
（１９８５）。

【００８７】４５、スツジール（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら、
メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．）、１８５：６０−６９（１９９０）。

【００８８】４６、ガウツシ−ソバ（Ｇａｕｔｓｃｈｉ
−Ｓｏｖａ）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）、１４０：
１８７４−１８８０（１９８６）。

【００８９】４７、アビブ（Ａｖｉｖ）およびレダー
（Ｌｅｄｅｒ）、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ６９：１４
０８−１４１２（１９７２）。

【００９０】４８、カムホルズ（Ｋａｍｈｏｌｚ）、
Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ８３：４９６２−４９６６
（１９８６）。

【００９１】４７、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐ．
Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（１９
８８）。

【００９２】５０、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７：６８０−６８５（１
９７０）。

【００９３】５１、ボ・ヘイジン（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎ
ｅ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．）、１４：４６８３−４６８９（１９８６）る本発
明の主な特徴および態様は、次の通りである。

【００９４】１、有効量のＨＢＮＦおよび製剤学的に許
容されうる担体からなる、ヘパリン結合性タンパク質の
存在により特徴づけられるウイルスの感染を阻止するの
に有用な薬剤組成物。

【００９５】２、有効量のＭＫおよび製剤学的に許容さ
れうる担体からなる、ヘパリン結合性タンパク質の存在
により特徴づけられるウイルスの感染を阻止するのに有
用な薬剤組成物。

【００９６】３、有効量のＨＢＮＦおよびＭＫ、および
製剤学的に許容されうる担体からなる、ヘパリン結合性
タンパク質の存在により特徴づけられるウイルスの感染
を阻止するのに有用な薬剤組成物。

【００９７】４、ウイルスがヘルペスウイルス科（Ｈｅ
ｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスである上記第１〜
３項のいずれかに記載の医薬組成物。

【００９８】５、ウイルスのための細胞のレセプターま
たはウイルスのレセプター結合性タンパク質を有効量の
上記第１〜３項のいずれかに記載の薬剤組成物と接触さ
せることからなる、ヘパリン結合性タンパク質の存在に
より特徴づけられるウイルスの感染を阻止する方法。

【００９９】６、被検体におけるウイルスの感染を防止
するために有効な、有効量の上記第１〜３項のいずれか
に記載の薬剤組成物を被検体に投与することからなる、
被検体におけるヘパリン結合性タンパク質の存在により
特徴づけられるウイルスの感染を阻止する方法。

【０１００】７、ウイルスの感染がヘルペスウイルス科
（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの感染であ
る上記第５または６項記載の方法。

【０１０１】８、被検体におけるウイルスの感染を処置
するために有効な、有効量の上記第１〜３項のいずれか
に記載の薬剤組成物を被検体に投与することからなる、
被検体におけるヘパリン結合性タンパク質の存在により
特徴づけられるウイルスの感染を処置する方法。

【０１０２】９、ウイルスの感染がヘルペスウイルス科
（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの感染であ
る上記第８項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＭＫ遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸
配列（配列のリスト１をまた参照のこと）。ボールドフ
ェースのアミノ酸は予測されたタンパク質のプレ配列を
表し、矢印は成熟タンパク質の予測されたＮ末端を表
し、そしてマウスのゲノムのＤＮＡプローブを増幅する
ために使用したプライマー１および２に相当する２つの
ペプチドの配列を表す。遺伝子の３’末端付近の２つの
ポリアデニル化配列に下線が引かれている。

【図２】ウシＨＢＮＦの部分的な１１４アミノ酸配列を
示す。

【図３】ヒトＨＢＮＦの相補的ＤＮＡクローニング、ヌ
クレオチドおよび推定されたアミノ酸配列（配列のリス
ト２をまた参照のこと）。ＨＢＮＦをエンコードする４
つのオーバーラッピングする部分的ｃＤＮＡのダイアグ
ラム。上部の線はｍＲＮＡを示しそして黒色のハッチン
グを施したボックスは、それぞれ、ＨＢＮＦ解読領域お
よび仮定した３’ポリ（Ａ）区域を表す。制限部位：Ｈ
＝ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｋ＝ＫｐｎＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、ｎｔ
＝クローンのヌクレオチド長さ。

【図４】ヒトＨＢＮＦの相補的ＤＮＡクローニング、ヌ
クレオチドおよび推定されたアミノ酸配列（配列のリス
ト２をまた参照のこと）。推定されたアミノ酸配列をも
つクローンＨＨＣ７、８、１０および１２の組み合わせ
たヌクレオチド配列。通常のタイプで示すアミノ酸は、
潜在的１６８アミノ酸前駆体タンパク質を表す追加の３
２のボールドフェースのアミノ酸が先行する、成熟ヒト
ＨＢＮＦの１３６アミノ酸を示す。

【図５】ヒトＨＢＮＦタンパク質の発現および機能的特
性決定を示す。（ａ）ＨＢＮＦタンパク質の試料のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲル電気泳動。タンパク質の標準はＢＲＬ
からのタンパク質であった。レーンＮ、精製したウシＨ
ＢＮＦタンパク質（１００ｎｇ）、レーン＋および−イ
ソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ）は、バクテリアの発現構成体ｐＥＴＨＨＳを含有
する培養物を誘発しおよび誘発しなかった。（ｂ）ラッ
ト脳ＨＢＮＦ（３２０ｎｇ／ｍｌ）の不存在（Ａ）およ
び存在（Ｂ）における脳のニューロンの中のニューライ
トの発芽後成長のアッセイ。（ｃ）バクテリアが生産し
たヒトＨＢＮＦの精製物（１６０ｎｇ／ｍｌ）。（ｄ）
バクテリアが生産したヒトＨＢＮＦの精製物（３２０ｎ
ｇ／ｍｌ）。

【図６】ＨＳＶ−１プラーク形成へのＨＢＮＦ添加の時
間の効果を示すグラフ。６ウェルの皿の中のＶｅｒｏ細
胞のコンフルエント単層を、記載したように２００ＰＦ
Ｕ／ウェルのＨＳＶ−１菌株で感染させた。対照試料を
ウイルスの吸着期間の間にあるいはオーバーレイの中で
ヒトＨＢＮＦの不存在下に感染した。感染後−吸着の間
にＨＢＮＦの不存在下に感染させたが、ＨＢＮＦをオー
バーレイにに４．２５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し
た。感染−試料を４．２５μｇ／ｍｌのＨＢＮＦの存在
下にウイルスで感染させ、そしてＨＢＮＦをオーバーレ
イに同一濃度で添加した。

【配列表】

配列のリスト （１）一般の情報： （ｉ）出願人：ジョセフ・ベッカーおよびミカエル・オ
ストランダー （ｉｉ）発明の名称：ＨＢＮＦおよびＭＫタンパク質を
使用してウイルスの感染を処置および防止する方法 （ｉｉｉ）配列の数：３ （ｉｖ）通信のアドレス： （Ａ）アドレス：アントイネッテ Ｆ．コンスキ アメリカ・サイナミッド・カンパニー （Ｂ）ストリート：ウェストメインストリート郵便私書
箱６０ （Ｃ）シティ：スタンフォード （Ｄ）州：コネチカット （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：０６９０４−００６０ （ｖ）コンピューター読み取り可能なフォーム： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ ＡＴ （Ｃ）操作のシステム：ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＩＢＭディスプレイライト４から
のＡＳＣＩＩ （ｖｉ）現在のアプリケーションのデータ： （Ａ）アプリケーション番号： （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）以前のアプリケーションのデータ： （Ａ）アプリケーション番号： （Ｂ）提出日： （ｖｉｉｉ）代理人の情報： （Ａ）名前：コンスキ、アントイネッテ Ｆ． （Ｂ）登録番号：３４，２０２ （Ｃ）参照／処理番号：３１８５０−００ （ｉｘ）遠距離通信の情報： （Ａ）ＴＥＬ：２０３ ３２１ ２４５５ （Ｂ）ＴＥＬＥＦＡＸ：２０３ ３２１ ２９７１ （Ｃ）ＴＥＬＥＸ：７１０ ４７４ ４０５９ （２）配列識別番号：１ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：７９９塩基対 １４３アミノ酸 （Ｂ）タイプ：核酸およびアミノ酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：ＤＮＡおよびタンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１：

【表２】

【表３】

【表４】 （２）配列識別番号：２ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１３８３塩基対；１６８アミノ酸 （Ｂ）タイプ：核酸およびアミノ酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：ＤＮＡおよびタンパク質 （ｉｉｉ）もとの生物：ヒト （ｘｉ）特徴： （Ａ）アミノ酸残基３３からアミノ酸残基１６８まで−
成熟タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２：

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】 （２）配列識別番号：３ （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１１４アミノ酸 （Ｂ）タイプ：タンパク質 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：３：

【表９】

【表１０】

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 有効量のＨＢＮＦおよび製剤学的に許容
   されうる担体からなる、ヘパリン結合性タンパク質の存
   在により特徴づけられるウイルスの感染を阻止するのに
   有用な薬剤組成物。
2. 【請求項２】 有効量のＭＫおよび製剤学的に許容され
   うる担体からなる、ヘパリン結合性タンパク質の存在に
   より特徴づけられるウイルスの感染を阻止するのに有用
   な薬剤組成物。
3. 【請求項３】 有効量のＨＢＮＦおよびＭＫ、および製
   剤学的に許容されうる担体からなる、ヘパリン結合性タ
   ンパク質の存在により特徴づけられるウイルスの感染を
   阻止するために有用な薬剤組成物。
4. 【請求項４】 ウイルスのための細胞のレセプターまた
   はウイルスのレセプター結合性タンパク質を有効量の請
   求項１〜３のいずれかに記載の薬剤組成物と接触させる
   ことからなる、ヘパリン結合性タンパク質の存在により
   特徴づけられるウイルスの感染を阻止する方法。
5. 【請求項５】 被検体におけるウイルスの感染を防止す
   るために有効な、有効量の請求項１〜３のいずれかに記
   載の薬剤組成物を被検体に投与することからなる、被検
   体におけるヘパリン結合性タンパク質の存在により特徴
   づけられるウイルスの感染を阻止する方法。
6. 【請求項６】 被検体におけるウイルスの感染を処置す
   るために有効な、有効量の請求項１〜３のいずれかに記
   載の薬剤組成物を被検体に投与することからなる、被検
   体におけるヘパリン結合性タンパク質の存在により特徴
   づけられるウイルスの感染を処置する方法。