JPH06233679A - 修飾スーパーオキシドディスムターゼ - Google Patents
修飾スーパーオキシドディスムターゼInfo
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- JPH06233679A JPH06233679A JP3232472A JP23247291A JPH06233679A JP H06233679 A JPH06233679 A JP H06233679A JP 3232472 A JP3232472 A JP 3232472A JP 23247291 A JP23247291 A JP 23247291A JP H06233679 A JPH06233679 A JP H06233679A
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- copolymer
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Abstract
(57)【要約】
【構成】式（１）で示されるアルケニルエーテルと無水
マレイン酸と他の単量体とのモル比が、５〜60：20〜9
0：０〜30である共重合体で修飾されたスーパーオキシ
ドディスムターゼ。 【化１】 （Ｚは２〜８個の水酸基を持つ化合物の残基、ＡＯは炭
素数２〜18のオキシアルキレン基の１種または２種以上
の混合物で、２種以上のときはブロック状に付加してい
てもランダム状に付加していてもよく、Ｒ1 は炭素数２
〜５のアルケニル基、Ｒ2 は炭素数１〜24の炭化水素基
またはアシル基、ａとｂとｃはオキシアルキレン基の平
均付加モル数でそれぞれ０〜600 、ｍは１〜７の整数、
ｎは０〜６の整数、ｍ＋ｎ＝１〜７、ｎ／（１＋ｍ＋
ｎ）≦１／２、かつａ＋ｂｍ＋ｃｎ＝１〜1000であ
る。) 【効果】水系中でも活性を永く持続することができ、且
つ皮膚刺激性が低く適用範囲の広いスーパーオキシドデ
ィスムターゼが提供できる。
マレイン酸と他の単量体とのモル比が、５〜60：20〜9
0：０〜30である共重合体で修飾されたスーパーオキシ
ドディスムターゼ。 【化１】 （Ｚは２〜８個の水酸基を持つ化合物の残基、ＡＯは炭
素数２〜18のオキシアルキレン基の１種または２種以上
の混合物で、２種以上のときはブロック状に付加してい
てもランダム状に付加していてもよく、Ｒ1 は炭素数２
〜５のアルケニル基、Ｒ2 は炭素数１〜24の炭化水素基
またはアシル基、ａとｂとｃはオキシアルキレン基の平
均付加モル数でそれぞれ０〜600 、ｍは１〜７の整数、
ｎは０〜６の整数、ｍ＋ｎ＝１〜７、ｎ／（１＋ｍ＋
ｎ）≦１／２、かつａ＋ｂｍ＋ｃｎ＝１〜1000であ
る。) 【効果】水系中でも活性を永く持続することができ、且
つ皮膚刺激性が低く適用範囲の広いスーパーオキシドデ
ィスムターゼが提供できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高分子の共重合体で修
飾された安定なスーパーオキシドディスムターゼに関
し、更に詳しくは、水系中で長時間活性を持続すること
ができ、適用範囲の広い修飾スーパーオキシドディスム
ターゼに関する。
飾された安定なスーパーオキシドディスムターゼに関
し、更に詳しくは、水系中で長時間活性を持続すること
ができ、適用範囲の広い修飾スーパーオキシドディスム
ターゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、皮脂の過酸化脂質化の抑制、
肌や毛髪のケラチン蛋白構造の変性劣化の防止、更には
シミ、しわ等の老化現象予防の手段として、スーパーオ
キシドディスムターゼが検討されている。スーパーオキ
シドディスムターゼとは動物、植物、微生物等の生体内
に広く分布する酵素であり、下記の反応によりスーパー
オキシドアニオンの不均化を起こさせるものであること
が知られている。
肌や毛髪のケラチン蛋白構造の変性劣化の防止、更には
シミ、しわ等の老化現象予防の手段として、スーパーオ
キシドディスムターゼが検討されている。スーパーオキ
シドディスムターゼとは動物、植物、微生物等の生体内
に広く分布する酵素であり、下記の反応によりスーパー
オキシドアニオンの不均化を起こさせるものであること
が知られている。
【０００３】
【化２】
【０００４】スーパーオキシドディスムターゼは、活性
中心に銅、亜鉛、鉄、又はマンガンを含んでおり、最近
では、遺伝子工学的技術によっても多量に産生されるよ
うになった。
中心に銅、亜鉛、鉄、又はマンガンを含んでおり、最近
では、遺伝子工学的技術によっても多量に産生されるよ
うになった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、スーパ
ーオキシドディスムターゼを直接水系中に配合すると、
酵素活性が低下したり、皮膚に対して刺激やアレルギー
を与えやすい等の問題がある。スーパーオキシドディス
ムターゼの応用にあたっては、使用直前まで乾燥状態に
おき、使用時に水溶液と混合して用いる方法や、リポソ
ーム化、マイクロカプセル化、更には、高分子化合物に
よる固定化など色々な試みがなされているが、マイクロ
カプセル化による方法は、スーパーオキシドディスムタ
ーゼと水溶液等の基剤との接触を使用する直前まで断つ
ことによる安定化であり、本質的な問題の解決ではな
い。また、プロテアーゼ等の他の酵素の安定化として有
効である多価アルコールを添加する方法は、スーパーオ
キシドディスムターゼに対してはほとんど効果がなかっ
た。その他の方法でも充分満足のいく安定化の効果が得
られていない。
ーオキシドディスムターゼを直接水系中に配合すると、
酵素活性が低下したり、皮膚に対して刺激やアレルギー
を与えやすい等の問題がある。スーパーオキシドディス
ムターゼの応用にあたっては、使用直前まで乾燥状態に
おき、使用時に水溶液と混合して用いる方法や、リポソ
ーム化、マイクロカプセル化、更には、高分子化合物に
よる固定化など色々な試みがなされているが、マイクロ
カプセル化による方法は、スーパーオキシドディスムタ
ーゼと水溶液等の基剤との接触を使用する直前まで断つ
ことによる安定化であり、本質的な問題の解決ではな
い。また、プロテアーゼ等の他の酵素の安定化として有
効である多価アルコールを添加する方法は、スーパーオ
キシドディスムターゼに対してはほとんど効果がなかっ
た。その他の方法でも充分満足のいく安定化の効果が得
られていない。
【０００６】本発明は、水系中で長時間活性を持続する
ことができ、適用範囲の広い修飾スーパーオキシドディ
スムターゼを提供することを目的とする。
ことができ、適用範囲の広い修飾スーパーオキシドディ
スムターゼを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは同一分子中
に酸無水物基とポリオキシアルキレン基を合わせもつ重
合体を化学的に結合させたスーパーオキシドディスムタ
ーゼが、水系中でも長時間活性を持続することを見出
し、本発明に到達した。すなわち、本発明は式（１）で
示されるアルケニルエーテルと無水マレイン酸と他の単
量体とのモル比が５〜60：20〜90：０〜30である共重合
体を化学結合した修飾スーパーオキシドディスムターゼ
である。
に酸無水物基とポリオキシアルキレン基を合わせもつ重
合体を化学的に結合させたスーパーオキシドディスムタ
ーゼが、水系中でも長時間活性を持続することを見出
し、本発明に到達した。すなわち、本発明は式（１）で
示されるアルケニルエーテルと無水マレイン酸と他の単
量体とのモル比が５〜60：20〜90：０〜30である共重合
体を化学結合した修飾スーパーオキシドディスムターゼ
である。
【０００８】
【化３】
【０００９】（Ｚは２〜８個の水酸基を持つ化合物の残
基、ＡＯは炭素数２〜18のオキシアルキレン基の１種ま
たは２種以上の混合物で、２種以上のときはブロック状
に付加していてもランダム状に付加していてもよく、Ｒ
1 は炭素数２〜５のアルケニル基、Ｒ2 は炭素数１〜24
の炭化水素基またはアシル基、ａとｂとｃはオキシアル
キレン基の平均付加モル数でそれぞれ０〜600 、ｍは１
〜７の整数、ｎは０〜６の整数、ｍ＋ｎ＝１〜７、ｎ／
（１＋ｍ＋ｎ）≦１／２、かつａ＋ｂｍ＋ｃｎ＝１〜10
00である。)
基、ＡＯは炭素数２〜18のオキシアルキレン基の１種ま
たは２種以上の混合物で、２種以上のときはブロック状
に付加していてもランダム状に付加していてもよく、Ｒ
1 は炭素数２〜５のアルケニル基、Ｒ2 は炭素数１〜24
の炭化水素基またはアシル基、ａとｂとｃはオキシアル
キレン基の平均付加モル数でそれぞれ０〜600 、ｍは１
〜７の整数、ｎは０〜６の整数、ｍ＋ｎ＝１〜７、ｎ／
（１＋ｍ＋ｎ）≦１／２、かつａ＋ｂｍ＋ｃｎ＝１〜10
00である。)
【００１０】式（１）において、Ｚを残基とする２〜８
個の水酸基を持つ化合物としては、エチレングリコー
ル、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキ
シレングリコール、スチレングリコール、炭素数８〜18
のアルキレングリコール、ネオペンチルグリコール等の
グリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリ
ン、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、
１，３，５−ペンタントリオール、エリスリトール、ペ
ンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、ソルビ
トール、ソルビタン、ソルバイド、ソルビトールとグリ
セリンの縮合物、アドニトール、アラビトール、キシリ
トール、マンニトール等の多価アルコール、あるいはそ
れらの部分エーテル化物またはエステル化物；キシロー
ス、アラビノース、リボース、ラムノース、グルコー
ス、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボ
ース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、ト
レハロース、シュークロース、ラフィノース、ゲンチア
ノース、メレジトース等の糖、あるいはそれらの部分エ
ーテル化物またはエステル化物；カテコール、レゾルシ
ノール、ヒドロキノン、フロログルシン等のフェノール
類が挙げられる。
個の水酸基を持つ化合物としては、エチレングリコー
ル、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキ
シレングリコール、スチレングリコール、炭素数８〜18
のアルキレングリコール、ネオペンチルグリコール等の
グリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリ
ン、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、
１，３，５−ペンタントリオール、エリスリトール、ペ
ンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、ソルビ
トール、ソルビタン、ソルバイド、ソルビトールとグリ
セリンの縮合物、アドニトール、アラビトール、キシリ
トール、マンニトール等の多価アルコール、あるいはそ
れらの部分エーテル化物またはエステル化物；キシロー
ス、アラビノース、リボース、ラムノース、グルコー
ス、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボ
ース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、ト
レハロース、シュークロース、ラフィノース、ゲンチア
ノース、メレジトース等の糖、あるいはそれらの部分エ
ーテル化物またはエステル化物；カテコール、レゾルシ
ノール、ヒドロキノン、フロログルシン等のフェノール
類が挙げられる。
【００１１】ＡＯで示されるオキシアルキレン基として
は、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブ
チレン基、オキシテトラメチレン基、オキシスチレン
基、オキシドデシレン基、オキシテトラデシレン基、オ
キシヘキサデシレン基、オキシオクタデシレン基等が挙
げられ、これらは１種だけ付加してもよく、２種以上が
同時に付加していてもよい。また、２種以上が同時に付
加しているときは、ブロック状付加でもランダム状付加
でもよい。
は、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブ
チレン基、オキシテトラメチレン基、オキシスチレン
基、オキシドデシレン基、オキシテトラデシレン基、オ
キシヘキサデシレン基、オキシオクタデシレン基等が挙
げられ、これらは１種だけ付加してもよく、２種以上が
同時に付加していてもよい。また、２種以上が同時に付
加しているときは、ブロック状付加でもランダム状付加
でもよい。
【００１２】オキシアルキレン基は共重合体とスーパー
オキシドディスムターゼとの親和性を高めるため、か
つ、スーパーオキシドディスムターゼの安定性を向上さ
せるために必要であるが、あまり多いと共重合体中の無
水マレイン酸単位の重量割合が低くなって、スーパーオ
キシドディスムターゼ中のアミノ基との反応がおこりに
くくなるので、ａ＋ｂｍ＋ｃｎは1000を超えないことが
必要である。
オキシドディスムターゼとの親和性を高めるため、か
つ、スーパーオキシドディスムターゼの安定性を向上さ
せるために必要であるが、あまり多いと共重合体中の無
水マレイン酸単位の重量割合が低くなって、スーパーオ
キシドディスムターゼ中のアミノ基との反応がおこりに
くくなるので、ａ＋ｂｍ＋ｃｎは1000を超えないことが
必要である。
【００１３】Ｒ1 で示される炭素数２〜５のアルケニル
基としてはビニル基、アリル基、メタリル基、１，１−
ジメチル−２−プロペニル基、３−メチル−３−ブテニ
ル基等がある。Ｒ2 で示される炭素数１〜24のアルキル
基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプ
ロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三ブチル基、ペ
ンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、イソヘプチル
基、２−エチルヘキシル基、オクチル基、イソノニル
基、デシル基、ドデシル基、イソトリデシル基、テトラ
デシル基、ヘキサデシル基、イソセチル基、オクタデシ
ル基、イソステアリル基、オレイル基、オクチルドデシ
ル基、ドコシル基、デシルテトラデシル基、ベンジル
基、クレジル基、ブチルフェニル基、ジブチルフェニル
基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ドデシル
フェニル基、ジオクチルフェニル基、ジノニルフェニル
基、スチレン化フェニル基等があり、アシル基として
は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、カプリル
酸、２−エチルヘキサン酸、イソノナン酸、カプリン
酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパ
ルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、アラキ
ン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノ
ール酸、リノレン酸、エルカ酸、安息香酸、ヒドロキシ
安息香酸、桂皮酸、没食子酸等に由来するアシル基があ
る。
基としてはビニル基、アリル基、メタリル基、１，１−
ジメチル−２−プロペニル基、３−メチル−３−ブテニ
ル基等がある。Ｒ2 で示される炭素数１〜24のアルキル
基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプ
ロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三ブチル基、ペ
ンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、イソヘプチル
基、２−エチルヘキシル基、オクチル基、イソノニル
基、デシル基、ドデシル基、イソトリデシル基、テトラ
デシル基、ヘキサデシル基、イソセチル基、オクタデシ
ル基、イソステアリル基、オレイル基、オクチルドデシ
ル基、ドコシル基、デシルテトラデシル基、ベンジル
基、クレジル基、ブチルフェニル基、ジブチルフェニル
基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ドデシル
フェニル基、ジオクチルフェニル基、ジノニルフェニル
基、スチレン化フェニル基等があり、アシル基として
は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、カプリル
酸、２−エチルヘキサン酸、イソノナン酸、カプリン
酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパ
ルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、アラキ
ン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノ
ール酸、リノレン酸、エルカ酸、安息香酸、ヒドロキシ
安息香酸、桂皮酸、没食子酸等に由来するアシル基があ
る。
【００１４】式（１）のアルケニルエーテルと無水マレ
イン酸との共重合体がスーパーオキシドディスムターゼ
と充分に結合するためには、酸無水物構造が必要であ
り、遊離の水酸基が多いアルケニルエーテルを用いると
重合の際に酸無水物単位とエステル結合をするために、
スーパーオキシドディスムターゼとの反応性が低下した
り、共重合体の溶媒への溶解性を低下したりするので、
ｎ／（１＋ｍ＋ｎ）≦１／２であることが必要である。
イン酸との共重合体がスーパーオキシドディスムターゼ
と充分に結合するためには、酸無水物構造が必要であ
り、遊離の水酸基が多いアルケニルエーテルを用いると
重合の際に酸無水物単位とエステル結合をするために、
スーパーオキシドディスムターゼとの反応性が低下した
り、共重合体の溶媒への溶解性を低下したりするので、
ｎ／（１＋ｍ＋ｎ）≦１／２であることが必要である。
【００１５】本発明で用いる共重合体は式（１）で示さ
れるアルケニルエーテルと無水マレイン酸とをラジカル
重合触媒を用いて共重合させることによって、容易に得
ることができる。その際、更に他の単量体を加えて共重
合させても良い。他の単量体としては、アクリル酸、メ
タクリル酸、イタコン酸、クロトン酸などの不飽和カル
ボン酸、スチレン、メチルスチレンなどの芳香族ビニル
化合物、塩化ビニル、塩化ビニリデンなどのハロゲン化
ビニル化合物、イソブチレン、ジイソブチレンなどのオ
レフィン、そのほか酢酸ビニル、アクリロニトリル、ア
クリルアミドなどがある。これらは共重合体に粘着性を
持たせるなどの物性改良を行う際に加えることができる
が、その割合があまり多くなると、スーパーオキシドデ
ィスムターゼの修飾に必要なオキシアルキレン基あるい
は酸無水物基の含有量が低下し修飾がうまくできなくな
るので、他の単量体の割合が全単量体中の30モル％以下
である必要がある。
れるアルケニルエーテルと無水マレイン酸とをラジカル
重合触媒を用いて共重合させることによって、容易に得
ることができる。その際、更に他の単量体を加えて共重
合させても良い。他の単量体としては、アクリル酸、メ
タクリル酸、イタコン酸、クロトン酸などの不飽和カル
ボン酸、スチレン、メチルスチレンなどの芳香族ビニル
化合物、塩化ビニル、塩化ビニリデンなどのハロゲン化
ビニル化合物、イソブチレン、ジイソブチレンなどのオ
レフィン、そのほか酢酸ビニル、アクリロニトリル、ア
クリルアミドなどがある。これらは共重合体に粘着性を
持たせるなどの物性改良を行う際に加えることができる
が、その割合があまり多くなると、スーパーオキシドデ
ィスムターゼの修飾に必要なオキシアルキレン基あるい
は酸無水物基の含有量が低下し修飾がうまくできなくな
るので、他の単量体の割合が全単量体中の30モル％以下
である必要がある。
【００１６】本発明で用いる共重合体は、重合開始剤の
種類あるいは式（１）のアルケニルエーテルの構造を変
化させることにより、種々の重合度の共重合体を得るこ
とができ、その重量平均分子量は1000〜200 万、好まし
くは3000〜10万である。またオキシアルキレン基のうち
でオキシエチレン基が多く付加したものを用いると親水
性の大きい共重合体を得ることができる。
種類あるいは式（１）のアルケニルエーテルの構造を変
化させることにより、種々の重合度の共重合体を得るこ
とができ、その重量平均分子量は1000〜200 万、好まし
くは3000〜10万である。またオキシアルキレン基のうち
でオキシエチレン基が多く付加したものを用いると親水
性の大きい共重合体を得ることができる。
【００１７】また本発明の修飾スーパーオキシドディス
ムターゼを得る方法は、スーパーオキシドディスムター
ゼ中のアミノ基を利用する方法であり、対象となるスー
パーオキシドディスムターゼとしては、牛赤血球から得
られた銅・亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ、微
生物由来のマンガン型スーパーオキシドディスムター
ゼ、ヒト赤血球由来の銅・亜鉛型スーパーオキシドディ
スムターゼ、遺伝子組換えによるヒトの銅・亜鉛型スー
パーオキシドディスムターゼなど、種々のものが使用で
き、特にこれらに限定されるものではない。
ムターゼを得る方法は、スーパーオキシドディスムター
ゼ中のアミノ基を利用する方法であり、対象となるスー
パーオキシドディスムターゼとしては、牛赤血球から得
られた銅・亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ、微
生物由来のマンガン型スーパーオキシドディスムター
ゼ、ヒト赤血球由来の銅・亜鉛型スーパーオキシドディ
スムターゼ、遺伝子組換えによるヒトの銅・亜鉛型スー
パーオキシドディスムターゼなど、種々のものが使用で
き、特にこれらに限定されるものではない。
【００１８】本発明の修飾スーパーオキシドディスムタ
ーゼは、共重合体とスーパーオキシドディスムターゼと
を反応させることにより得ることができる。共重合体と
スーパーオキシドディスムターゼとを反応させるときの
比率は、スーパーオキシドディスムターゼ中のアミノ基
あるいは共重合体中の酸無水物基の含有量により異なる
ため一概に特定することはできないが、アミノ基の量に
比べて共重合体の量が少な過ぎると修飾率が低下するた
めに目的とする経時安定性が不充分となり、共重合体の
量が多過ぎると修飾スーパーオキシドディスムターゼの
初期活性が著しく低下するため、好ましい範囲は、スー
パーオキシドディスムターゼ100 重量部に対して、共重
合体50〜400 重量部である。
ーゼは、共重合体とスーパーオキシドディスムターゼと
を反応させることにより得ることができる。共重合体と
スーパーオキシドディスムターゼとを反応させるときの
比率は、スーパーオキシドディスムターゼ中のアミノ基
あるいは共重合体中の酸無水物基の含有量により異なる
ため一概に特定することはできないが、アミノ基の量に
比べて共重合体の量が少な過ぎると修飾率が低下するた
めに目的とする経時安定性が不充分となり、共重合体の
量が多過ぎると修飾スーパーオキシドディスムターゼの
初期活性が著しく低下するため、好ましい範囲は、スー
パーオキシドディスムターゼ100 重量部に対して、共重
合体50〜400 重量部である。
【００１９】両者の反応は、共重合体が水溶性の場合
は、スーパーオキシドディスムターゼの水溶液に共重合
体を直接添加する方法がよく、共重合体が水に溶解しに
くい場合、あるいは水に不溶の場合は、共重合体を予め
水と相溶性のあるアセトン等の溶剤に溶解したのち、ス
ーパーオキシドディスムターゼ水溶液に添加する方法が
容易であり、かつ好ましい方法である。
は、スーパーオキシドディスムターゼの水溶液に共重合
体を直接添加する方法がよく、共重合体が水に溶解しに
くい場合、あるいは水に不溶の場合は、共重合体を予め
水と相溶性のあるアセトン等の溶剤に溶解したのち、ス
ーパーオキシドディスムターゼ水溶液に添加する方法が
容易であり、かつ好ましい方法である。
【００２０】また、反応の際のpHは６〜10、好ましくは
８〜９である。これは、pHが酸性側であるとスーパーオ
キシドディスムターゼ中の遊離アミノ基の量が少なくな
るので修飾率が低下するためである。また反応温度は、
高過ぎると修飾工程でのスーパーオキシドディスムター
ゼの活性低下がおこり、また、酸無水物基の加水分解反
応がスーパーオキシドディスムターゼのアミノ基と酸無
水物基との反応より起こりやすくなって修飾率が低下す
るため、０〜10℃が好ましい範囲である。
８〜９である。これは、pHが酸性側であるとスーパーオ
キシドディスムターゼ中の遊離アミノ基の量が少なくな
るので修飾率が低下するためである。また反応温度は、
高過ぎると修飾工程でのスーパーオキシドディスムター
ゼの活性低下がおこり、また、酸無水物基の加水分解反
応がスーパーオキシドディスムターゼのアミノ基と酸無
水物基との反応より起こりやすくなって修飾率が低下す
るため、０〜10℃が好ましい範囲である。
【００２１】
【発明の効果】本発明はポリオキシアルキレン基をもつ
アルケニルエーテルと無水マレイン酸との共重合体とス
ーパーオキシドディスムターゼとの反応生成物である新
規な修飾スーパーオキシドディスムターゼであり、水系
中でも活性を永く持続することができ、且つ皮膚刺激性
が低く適用範囲の広いスーパーオキシドディスムターゼ
が提供できる。
アルケニルエーテルと無水マレイン酸との共重合体とス
ーパーオキシドディスムターゼとの反応生成物である新
規な修飾スーパーオキシドディスムターゼであり、水系
中でも活性を永く持続することができ、且つ皮膚刺激性
が低く適用範囲の広いスーパーオキシドディスムターゼ
が提供できる。
【００２２】
【実施例】本発明を製造例および実施例により説明す
る。 製造例１ 下記の化合物を１リットルのトルエンに溶解し、窒素雰
囲気下に80±２℃で７時間の重合反応を行った。
る。 製造例１ 下記の化合物を１リットルのトルエンに溶解し、窒素雰
囲気下に80±２℃で７時間の重合反応を行った。
【００２３】 CH2=CHCH20(C2H4O)33CH3 1524g (１モル） 無水マレイン酸 103g (1.05モル) 過酸化ベンゾイル 4.8g (0.02モル) 次いでトルエンおよび未反応の無水マレイン酸を10〜30
mmHgの減圧下に100 ±10℃で留去し、1450g の共重合体
No.1を得た。得られた共重合体No.1は淡黄色のワックス
状の固体で、融点は45℃、ケン化価は68.5であった。 製造例２ 過酸化ラウロイル19.9g(0.05モル) を１リットルのベン
ゼンに溶解し、窒素雰囲気下に攪拌しながら70℃に昇温
したのち、下記組成の混合液を滴下して70±２℃で重合
反応を行った。
mmHgの減圧下に100 ±10℃で留去し、1450g の共重合体
No.1を得た。得られた共重合体No.1は淡黄色のワックス
状の固体で、融点は45℃、ケン化価は68.5であった。 製造例２ 過酸化ラウロイル19.9g(0.05モル) を１リットルのベン
ゼンに溶解し、窒素雰囲気下に攪拌しながら70℃に昇温
したのち、下記組成の混合液を滴下して70±２℃で重合
反応を行った。
【００２４】 CH2=CHCH20(C2H4O)20C4H9 497g (0.5 モル）
【００２５】
【化４】
【００２６】 無水マレイン酸 103g（1.05モル） ベンゼン 3 リットル 全量滴下後、同じ温度で３時間保持したのち、ベンゼン
および未反応の無水マレイン酸を10〜30mmHgの減圧下に
120 ±10℃で留去し、1293g の共重合体No.2を得た。共
重合体No.2は粘稠な液体であり、ケン化価81.5であっ
た。
および未反応の無水マレイン酸を10〜30mmHgの減圧下に
120 ±10℃で留去し、1293g の共重合体No.2を得た。共
重合体No.2は粘稠な液体であり、ケン化価81.5であっ
た。
【００２７】以下同様の方法により共重合体No.3〜No.8
を表１〜２に示す反応のモル比及び反応条件で調製し
た。分析値および溶解性を表３に示した。
を表１〜２に示す反応のモル比及び反応条件で調製し
た。分析値および溶解性を表３に示した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】実施例 スーパーオキシドディスムターゼとして牛赤血球から得
られた銅・亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ（シ
グマ社製、3600 units/mg)を用い、表１の共重合体によ
る修飾を試みた。修飾スーパーオキシドディスムターゼ
の活性はシトクロムＣ法により測定した。
られた銅・亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ（シ
グマ社製、3600 units/mg)を用い、表１の共重合体によ
る修飾を試みた。修飾スーパーオキシドディスムターゼ
の活性はシトクロムＣ法により測定した。
【００３２】シトクロムＣ法 試験管に300mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.8) (注１）
0.5ml 、0.3mM ヒポキサンチン0.5ml 、60μM シトクロ
ムＣ（シグマ社製、ウシ心臓タイプＶ）0.5ml、スーパ
ーオキシドディスムターゼ試料溶液0.3ml および水１ml
をとり、充分に混合した。これにキサンチン酸化酵素
(注２）0.2ml を加えて攪拌し、すばやく光学セル(1ml)
に移した。
0.5ml 、0.3mM ヒポキサンチン0.5ml 、60μM シトクロ
ムＣ（シグマ社製、ウシ心臓タイプＶ）0.5ml、スーパ
ーオキシドディスムターゼ試料溶液0.3ml および水１ml
をとり、充分に混合した。これにキサンチン酸化酵素
(注２）0.2ml を加えて攪拌し、すばやく光学セル(1ml)
に移した。
【００３３】日立分光光度計Ｕ−3210を用いてシトクロ
ムＣの還元速度を550nm の吸光度増加の速度から求め
た。この条件下でスーパーオキシドディスムターゼを添
加しない時のシトクロムＣの還元を50％阻害するスーパ
ーオキシドディスムターゼ酵素量を１酵素単位として１
mg蛋白当りの単位数を求めた。 （注１）300mM リン酸カリウム緩衝液 0.6mM のＥＤＴＡ−２Naを含むもの。 （注２）キサンチン酸化酵素 スーパーオキシドディスムターゼを添加しない時、シト
クロムＣの還元速度（550nm での１分間の変化率）が約
0.025 になるように添加濃度を決める。 実施例１ スーパーオキシドディスムターゼ (3600 units/mg)１ｇ
をpH8.6 の硼酸系緩衝液（注３）20ｇに溶解させ、系の
温度を３℃に保持した。これに共重合体No.1の１ｇを微
粉末の状態で系に加えて３±１℃で30分間攪拌したの
ち、さらに１ｇ加えて同温度で30分間攪拌を続けた。反
応終了後、0.1N−水酸化ナトリウム水溶液でpHを7.0 に
調整した後、逆浸透膜を用いて無機塩を除去し、減圧下
35℃で乾燥して修飾スーパーオキシドディスムターゼ1.
8gを得た。
ムＣの還元速度を550nm の吸光度増加の速度から求め
た。この条件下でスーパーオキシドディスムターゼを添
加しない時のシトクロムＣの還元を50％阻害するスーパ
ーオキシドディスムターゼ酵素量を１酵素単位として１
mg蛋白当りの単位数を求めた。 （注１）300mM リン酸カリウム緩衝液 0.6mM のＥＤＴＡ−２Naを含むもの。 （注２）キサンチン酸化酵素 スーパーオキシドディスムターゼを添加しない時、シト
クロムＣの還元速度（550nm での１分間の変化率）が約
0.025 になるように添加濃度を決める。 実施例１ スーパーオキシドディスムターゼ (3600 units/mg)１ｇ
をpH8.6 の硼酸系緩衝液（注３）20ｇに溶解させ、系の
温度を３℃に保持した。これに共重合体No.1の１ｇを微
粉末の状態で系に加えて３±１℃で30分間攪拌したの
ち、さらに１ｇ加えて同温度で30分間攪拌を続けた。反
応終了後、0.1N−水酸化ナトリウム水溶液でpHを7.0 に
調整した後、逆浸透膜を用いて無機塩を除去し、減圧下
35℃で乾燥して修飾スーパーオキシドディスムターゼ1.
8gを得た。
【００３４】得られた修飾スーパーオキシドディスムタ
ーゼの活性をシトクロムＣ法で測定した結果は840 unit
s/mgであり、スーパーオキシドディスムターゼの修飾に
よる活性残存率は純分換算で70％であった。 （注３）硼酸系緩衝液（pH8.6) 0.2M−水酸化ナトリウム水溶液 12.00ml 0.2M−硼酸・塩化カリウム水溶液 50.00ml 上記水溶液を混合し、精製水を加えて全量を200ml にし
たもの。
ーゼの活性をシトクロムＣ法で測定した結果は840 unit
s/mgであり、スーパーオキシドディスムターゼの修飾に
よる活性残存率は純分換算で70％であった。 （注３）硼酸系緩衝液（pH8.6) 0.2M−水酸化ナトリウム水溶液 12.00ml 0.2M−硼酸・塩化カリウム水溶液 50.00ml 上記水溶液を混合し、精製水を加えて全量を200ml にし
たもの。
【００３５】なお、0.2M−硼酸・塩化カリウム水溶液
は、溶液１リットル中に硼酸12.4g と塩化カリウム14.9
g を含む水溶液である。修飾スーパーオキシドディスム
ターゼおよび原料のスーパーオキシドディスムターゼの
赤外線吸収スペクトル図をそれぞれ図１及び図２に示
す。
は、溶液１リットル中に硼酸12.4g と塩化カリウム14.9
g を含む水溶液である。修飾スーパーオキシドディスム
ターゼおよび原料のスーパーオキシドディスムターゼの
赤外線吸収スペクトル図をそれぞれ図１及び図２に示
す。
【００３６】また、これらのゲルパーミュエーションク
ロマトグラムを、共重合体No.1とともに図３に示すが、
修飾スーパーオキシドディスムターゼの分子量が高分子
量化していることがわかる。なお、ゲルパーミュエーシ
ョンクロマトグラフィーの条件は次の通りである。 上記２本を連結したもの。
ロマトグラムを、共重合体No.1とともに図３に示すが、
修飾スーパーオキシドディスムターゼの分子量が高分子
量化していることがわかる。なお、ゲルパーミュエーシ
ョンクロマトグラフィーの条件は次の通りである。 上記２本を連結したもの。
【００３７】試料濃度 ：スーパーオキシドディスムタ
ーゼ 0.5mg/ml 修飾スーパーオキシドディスムターゼ 1.0mg/ml 試料注入量： 100μl 溶媒 ：0.1Mリン酸系緩衝液(pH7.0) 流速 ：0.5ml/分 検出器 ：昭和電工（株）ＲＩ示差屈計SE−61 実施例２ スーパーオキシドディスムターゼ (3600 units/mg)１ｇ
をpH8.0 の燐酸系緩衝液（注４）20ｇに溶解させ、温度
を３℃に保持した。これに共重合体No.3の0.5g（20％ア
セトン溶液）を加えて３±１℃で30分間攪拌し、さらに
0.5g（20％アセトン溶液）を加えて同温度で30分間攪拌
した。
ーゼ 0.5mg/ml 修飾スーパーオキシドディスムターゼ 1.0mg/ml 試料注入量： 100μl 溶媒 ：0.1Mリン酸系緩衝液(pH7.0) 流速 ：0.5ml/分 検出器 ：昭和電工（株）ＲＩ示差屈計SE−61 実施例２ スーパーオキシドディスムターゼ (3600 units/mg)１ｇ
をpH8.0 の燐酸系緩衝液（注４）20ｇに溶解させ、温度
を３℃に保持した。これに共重合体No.3の0.5g（20％ア
セトン溶液）を加えて３±１℃で30分間攪拌し、さらに
0.5g（20％アセトン溶液）を加えて同温度で30分間攪拌
した。
【００３８】次に、減圧下に35℃で水分を留去し、修飾
スーパーオキシドディスムターゼを2.3g得た。得られた
修飾スーパーオキシドディスムターゼの活性は972 unit
s/mgであり、修飾による活性残存率は純分換算で64％で
あった。 （注４）燐酸系緩衝液（pH8.0) 0.2M−水酸化ナトリウム水溶液 46.85ml 0.2M−燐酸二水素カリウム水溶液 50.00ml 上記水溶液を混合し、精製水を加えて全量を200ml にし
たもの。 実施例３〜７および比較例１〜２ 以下、同様の方法で表４に示す修飾スーパーオキシドデ
ィスムターゼを得た。なお、実施例５は実施例１と同様
に逆浸透膜を用いて無機塩を除去した。これらの修飾ス
ーパーオキシドディスムターゼの活性および経時安定性
テストの結果を表４に示す。
スーパーオキシドディスムターゼを2.3g得た。得られた
修飾スーパーオキシドディスムターゼの活性は972 unit
s/mgであり、修飾による活性残存率は純分換算で64％で
あった。 （注４）燐酸系緩衝液（pH8.0) 0.2M−水酸化ナトリウム水溶液 46.85ml 0.2M−燐酸二水素カリウム水溶液 50.00ml 上記水溶液を混合し、精製水を加えて全量を200ml にし
たもの。 実施例３〜７および比較例１〜２ 以下、同様の方法で表４に示す修飾スーパーオキシドデ
ィスムターゼを得た。なお、実施例５は実施例１と同様
に逆浸透膜を用いて無機塩を除去した。これらの修飾ス
ーパーオキシドディスムターゼの活性および経時安定性
テストの結果を表４に示す。
【００３９】経時安定性テスト 修飾スーパーオキシドディスムターゼ0.5gをpH7.0 のリ
ン酸系緩衝液（注５）100ml(防腐剤として４−ヒドロキ
シ安息香酸メチル0.1 ％含有）に溶解し、40℃に所定時
間保持し、シトクロムＣ法により修飾スーパーオキシド
ディスムターゼの活性を測定して経時安定性を調べた。
ン酸系緩衝液（注５）100ml(防腐剤として４−ヒドロキ
シ安息香酸メチル0.1 ％含有）に溶解し、40℃に所定時
間保持し、シトクロムＣ法により修飾スーパーオキシド
ディスムターゼの活性を測定して経時安定性を調べた。
【００４０】比較液として、スーパーオキシドディスム
ターゼ0.5gをpH7.0 のリン酸系緩衝液100ml(防腐剤とし
て４−ヒドロキシ安息香酸メチル0.1 ％含有）に溶解し
たもの（比較例１）と、これに１，３−ブチレングリコ
ールを20％添加したもの（比較例２）についても経時安
定性を調べた。表４より、本発明の修飾スーパーオキシ
ドディスムターゼが水系中において優れた経時安定性を
もっていることがわかる。 （注５）リン酸系緩衝液（pH7.0) 10mM燐酸水素２ナトリウム水溶液と10mM燐酸水素１ナト
リウム水溶液を混合してpHを7.0 に調整したもの。
ターゼ0.5gをpH7.0 のリン酸系緩衝液100ml(防腐剤とし
て４−ヒドロキシ安息香酸メチル0.1 ％含有）に溶解し
たもの（比較例１）と、これに１，３−ブチレングリコ
ールを20％添加したもの（比較例２）についても経時安
定性を調べた。表４より、本発明の修飾スーパーオキシ
ドディスムターゼが水系中において優れた経時安定性を
もっていることがわかる。 （注５）リン酸系緩衝液（pH7.0) 10mM燐酸水素２ナトリウム水溶液と10mM燐酸水素１ナト
リウム水溶液を混合してpHを7.0 に調整したもの。
【００４１】
【表４】
【００４２】表中、ＳＯＤ：スーパーオキシドディスム
ターゼ 注１）単位：units/mg ２）ＳＯＤの活性（3600 units/mg)に対する修飾ＳＯＤ
活性率（％） ３）修飾ＳＯＤの初期活性に対する経時安定性テスト終
了後の活性率（％） ４）ＳＯＤをリン酸系緩衝液（４−ヒドロキシ安息香酸
メチル含有）に溶解したもの ５）ＳＯＤ水溶液に１，３−ブチレングリコールを20％
添加したもの。
ターゼ 注１）単位：units/mg ２）ＳＯＤの活性（3600 units/mg)に対する修飾ＳＯＤ
活性率（％） ３）修飾ＳＯＤの初期活性に対する経時安定性テスト終
了後の活性率（％） ４）ＳＯＤをリン酸系緩衝液（４−ヒドロキシ安息香酸
メチル含有）に溶解したもの ５）ＳＯＤ水溶液に１，３−ブチレングリコールを20％
添加したもの。
【図１】共重合体No.1で修飾されたスーパーオキシドデ
ィスムターゼの赤外線吸収スペクトル図である。
ィスムターゼの赤外線吸収スペクトル図である。
【図２】スーパーオキシドディスムターゼの赤外線吸収
スペクトル図である。
スペクトル図である。
【図３】スーパーオキシドディスムターゼ、共重合体N
o.1および修飾スーパーオキシドディスムターゼのゲル
パーミュエーションクロマトグラムである。
o.1および修飾スーパーオキシドディスムターゼのゲル
パーミュエーションクロマトグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 7/48 9051−4Ｃ // Ａ６１Ｋ 37/50 ＡＤＡ 8314−4Ｃ (72)発明者 安河内 徹 神奈川県川崎市川崎区藤崎２−３−10− 404 (72)発明者 杉中 昭典 神奈川県茅ヶ崎市室田２−４−10
Claims (1)
- 【請求項１】 式（１）で示されるアルケニルエーテル
と無水マレイン酸と他の単量体とのモル比が、５〜60：
20〜90：０〜30である共重合体で修飾されたスーパーオ
キシドディスムターゼ。 【化１】 （Ｚは２〜８個の水酸基を持つ化合物の残基、ＡＯは炭
素数２〜18のオキシアルキレン基の１種または２種以上
の混合物で、２種以上のときはブロック状に付加してい
てもランダム状に付加していてもよく、Ｒ1 は炭素数２
〜５のアルケニル基、Ｒ2 は炭素数１〜24の炭化水素基
またはアシル基、ａとｂとｃはオキシアルキレン基の平
均付加モル数でそれぞれ０〜600 、ｍは１〜７の整数、
ｎは０〜６の整数、ｍ＋ｎ＝１〜７、ｎ／（１＋ｍ＋
ｎ）≦１／２、かつａ＋ｂｍ＋ｃｎ＝１〜1000であ
る。)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3232472A JP3035675B2 (ja) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | 修飾スーパーオキシドディスムターゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3232472A JP3035675B2 (ja) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | 修飾スーパーオキシドディスムターゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06233679A true JPH06233679A (ja) | 1994-08-23 |
| JP3035675B2 JP3035675B2 (ja) | 2000-04-24 |
Family
ID=16939836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3232472A Expired - Lifetime JP3035675B2 (ja) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | 修飾スーパーオキシドディスムターゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3035675B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11253156A (ja) * | 1997-12-25 | 1999-09-21 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 修飾カタラ―ゼおよび修飾カタラ―ゼ組成物ならびに修飾カタラ―ゼの製造方法 |
| WO2004085500A1 (en) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Sankyo Company Limited | Polymeric modifiers and pharmaceutical compositions |
| JP2006117652A (ja) * | 2004-09-24 | 2006-05-11 | Sankyo Co Ltd | 高分子修飾剤及びタンパク質を含有する医薬組成物 |
| CN100384894C (zh) * | 2003-03-24 | 2008-04-30 | 三共株式会社 | 聚合物改性剂和药物组合物 |
| JP2013523943A (ja) * | 2010-03-30 | 2013-06-17 | スパゴ イメージング アクチエボラグ | 分枝状のコンパクトなポリエチレングリコール誘導体 |
-
1991
- 1991-08-21 JP JP3232472A patent/JP3035675B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11253156A (ja) * | 1997-12-25 | 1999-09-21 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 修飾カタラ―ゼおよび修飾カタラ―ゼ組成物ならびに修飾カタラ―ゼの製造方法 |
| WO2004085500A1 (en) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Sankyo Company Limited | Polymeric modifiers and pharmaceutical compositions |
| AU2004223964B2 (en) * | 2003-03-24 | 2007-02-22 | Sankyo Company Limited | Polymeric modifiers and pharmaceutical compositions |
| CN100384894C (zh) * | 2003-03-24 | 2008-04-30 | 三共株式会社 | 聚合物改性剂和药物组合物 |
| JP2006117652A (ja) * | 2004-09-24 | 2006-05-11 | Sankyo Co Ltd | 高分子修飾剤及びタンパク質を含有する医薬組成物 |
| JP2013523943A (ja) * | 2010-03-30 | 2013-06-17 | スパゴ イメージング アクチエボラグ | 分枝状のコンパクトなポリエチレングリコール誘導体 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3035675B2 (ja) | 2000-04-24 |
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