JPH06222061A - 免疫学的診断試験の実施方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 酵素もしくは抗体が多孔性支持材に結合され
ている免疫学的診断試験は、 ａ）溶液中で相分離を引き起こす量で、少なくとも二種
の不相容性ポリマーを含有する溶液中に不溶性充填剤を
分散させ、均一な注型溶液とすること、および ｂ）支持材にこの溶液を適用し、沈降凝固を起こさせる
こと、によって作製されるマクロポーラスポリマー膜
を、多孔性支持材として使用することにより実施出来
る。 【効果】 免疫アッセイに用いられる試薬類が簡易に、
しかも安定して固定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素または抗体が、多
孔性支持材に結合されている免疫学的診断試験の実施方
法に関する。

【０００２】本発明による方法は、そのような多孔性支
持材として、マクロポーラスポリマー膜を使用すること
を特徴とする。マクロポーラスポリマー膜は、少なくと
も２種の不相容性ポリマーを、溶液中で相分離を起こす
量において含有するその溶液に、不溶性の充填剤を分散
させることによって均質な注型溶液を作製し、この溶液
を支持体に適用し、次いで、沈降凝固させることによっ
て形成される。

【０００３】

【従来の技術】酵素または抗体のような生物学的に活性
なタンパクを結合した多孔性支持材は、種々の技術分野
および臨床学的診断において重要な役割を演じている。
この分野においては、免疫学的アッセイ法が、特に重要
である。最も広範に使用されているのは、競合結合アッ
セイ（ＲＩＡ，ＥＩＡ）およびサンドイッチアッセイ
（ＩＲＭＡ，ＥＬＩＳＡ）であり、ＥＬＩＳＡに関して
重要性が増しつつある。ＥＬＩＳＡ［エンザイム リン
クト イムノソルベント アッセイ（Enzyme Linked Im
munosorbent Assey)］においては、測定すべき抗原は、
支持材に結合した抗体（第一抗体）によって結合され、
酵素活性をもつ第二の抗体（第二抗体）によって定量的
に測定される。

【０００４】これらの検出方法の基礎原理は、種々の出
版物に記載されている(Angew. Chemie 97 (1985), 141-
163; Chimia 29, (3) (1975)、 109) 。多孔性マトリッ
クス表面への第一抗体の固定化（結合）は、原則的に二
つの異なる方法、即ち吸着または共有結合で行うことが
出来、両方法とも長所および欠点を有する。吸着の場合
には、生化学物質の変性の危険は少ないものの、一方、
アッセイの実施中に洗い落とされたり、浸出されたりす
る危険がある；全く反対のことが共有結合に対して言え
る。このことは、目的により、使用法とアッセイ法の具
体例に従う変法（吸着および共有結合の両方法）を用い
ねばならない理由である。

【０００５】ＥＬＩＳＡ法における免疫化学的アッセイ
反応の検出は、しばしば、第二抗体に標識された酵素に
より触媒される発色反応によって行われる。かくして、
例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識された第二
抗体がしばしば用いられ、Ｈ₂Ｏ₂の存在で酸化反応を起
こし、それによって色の変化が起きる。発色物質は、ア
ッセイ操作の進行中、マトリックス中にしみ込ませられ
ており、ＰＯＤ触媒反応の場合には、しばしば、周知の
水溶性トリンダーシステム(trinder system)４−アミノ
アンチピリン／２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベン
ゼンスルホン酸塩(H.V. Bergmeyer, Methods of Enzyma
tic Analysis, Vol. I, 3rd. ed., Verlag Chemie)
が、しばしば、使用される。

【０００６】その他の酵素／発色物質系は：アルカリホ
スファターゼ／ｐ−ニトロフェニルホスフェートもしく
はβ−ガラクトシダーゼ／ｏ−ニトロフェニルガラクト
シドである。免疫学的診断のための膜系を市販している
会社は、例えば、ミリポア (Millipore,製品名：Immobi
lon(商標))もしくはＰＡＬＬ(製品名：Immunodyne(商
標))であり、測定操作を記した小冊子と組み合わせにな
っている。完全なアッセイは、一般に共有結合によって
起きる第一抗体の固定化とともに、複数のインキュベー
ションと洗浄段階より成る。マイクロタイタープレート
もしくはドット−ブロット装置が、アッセイを実施する
ために使用でき、例えば、バイオ−ラッドから市販され
ている。アッセイの実施上、決定的な問題は、洗い落と
しと浸出除去であり、それによって前以て導入された物
質や試薬類が、複数の含浸および洗浄段階の間に再度洗
浄除去される可能性がある。このことは、一般に共有結
合することが出来ず、強い抽出操作を受ける場合に使用
された発色物質については、特に決定的であり、そのた
めに、それらの水への溶解性は、続く洗浄操作におい
て、しばしば大きくなる。

【０００７】このことは、しばしば測定結果の誤りおよ
び感度の低下をきたす。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】それ故、特にＥＬＩＳ
Ａ法に好適であり、次の特徴を示す免疫化学的検出反応
に対して有効な膜マトリックスを得ることが期待され
る： ａ）吸着および共有結合による固定化の可能性、 ｂ）単純で損失のない方法での共有結合固定化の可能
性、および ｃ）反応による発色の実質的な浸出防止のための発色物
質の固定化改善。

【０００９】

【課題を解決するための手段】今や、驚くべきことに、
ドイツ出願公開第３８ ０９ ５２３号に記載されてい
るポリマーブレンドより構成されたマクロポーラスの膜
が、免疫学的診断試験法に対して極めて好適であること
が発見された。

【００１０】酵素もしくは抗体が多孔性支持材に結合さ
れる免疫学的診断試験を実施する方法が、初めて発見さ
れ、使用される多孔性支持材が ａ）溶液中で相分離を引き起こす量で、少なくとも二種
の不相容性ポリマーを含有する溶液中に不相溶性充填剤
を分散させ、均質な注型溶液とする工程、および ｂ）支持材にこの溶液を適用し、沈降凝固を起こさせる
工程、かならる方法によって作製されるマクロポーラス
ポリマー膜であることを特徴とする。

【００１１】例えば、もし、ジメチルホルムアミド中の
ポリウレタンの２０重量％溶液（ＰＵ／ＤＭＦ溶液）と
ジメチルホルムアミド中のポリアクリロニトリル２０重
量％溶液（ＰＡＮ／ＤＭＦ溶液）が、撹拌により混合さ
れるならば、短時間放置後には相分離が起きるであろ
う。このタイプの混合液は、不安定であり、膜を作製す
るための注型溶液としては不適切である。

【００１２】反対に、もし、同じポリマー／ＤＭＦ溶液
が、充填剤、例えばタルクと組み合わされ、同時にもし
くは続けて分散させられた場合には、沈降凝固法による
膜作製に好適である安定で均質な注型溶液が得られる。
既知の膜と比較して、このタイプの注型溶液から形成さ
れるこれらの膜は、その表面上に驚くほど顕著に比較的
大きい細孔、非常に高度な全体にわたる多孔度およびク
ロマトグラフィーペーパーに匹敵する顕著に増大した吸
着性能を示す。

【００１３】これらのポリマー膜の断面の電子顕微鏡像
は、それらが、フェルト様組織をもった構造であり、一
方、膜表面上に稠密なポリマースキンをもつ非対称的構
造組織は、ほとんど完全に抑えられていることを示して
いる。前記組織をもつ膜の場合には、３０μｍまでの細
孔径が、膜表面上に認められる。

【００１４】このタイプのマクロ細孔性の膜マトリック
スの作製に要求されるポリマー注型溶液は、次の条件を
満たしていなければならない：個々のポリマー成分の溶
液が、相互に混和性であってはならないこと。相互に混
和性な系の場合には、本願で開示された注型溶液と比
べ、明瞭な非対称構造をもったマクロポーラス膜構造が
得られる；個々のポリマー成分のための溶剤は、相互に
混和性でなければならないこと；非混和性ポリマー成分
を均質な注型溶液に変えるために、適切な不溶性の、例
えば無機の充填剤をその中に分散させることが必要であ
ること。

【００１５】好適な充填剤の例は：タルク、二酸化チタ
ン、硫酸バリウム、二酸化ケイ素、微結晶セルロース、
ゼオライト、ベントナイト、炭酸カルシウム、炭酸マグ
ネシウム、酸化亜鉛、酸化鉄、好ましくは、タルク、二
酸化チタン、硫酸バリウム、高分散シリカ（例えば、De
gussa製Aerosils(商標)）、石英、微結晶セルロース、
ゼオライトおよびベントナイトである。これらのタイプ
の無機および有機充填剤は、市販品を利用できる。全て
の前記充填剤が、全てのポリマーの組み合わせに対して
同じように好適であるというわけではない。従って、例
えば、ポリウレタン／ポリアクリロニトリル混合物より
なる注型溶液は、二酸化チタンもしくは硫酸バリウムと
一緒では安定性が悪く、明らかに不均質性を示すが、一
方、同じポリマー溶液のタルクとの組み合わせでは、良
好な均質性と分散体の安定性をもつ。また、複数の前記
充填剤の混合物を使用することも可能である。使用され
る充填剤の表面は、適する場合には有機物で変性されて
もよい。例えば、疎水性の高分散シリカ（Degussa製Aer
osil R972(商標)）もしくはアミン変性型が、市販品よ
り利用できる。

【００１６】使用される充填剤の量は、それらの比表面
積に依存するが、一般には膜における有機物質の全重量
に対して５〜５００重量％の範囲である。高分散充填
剤、例えば、Aerosil 200(商標)（２００ｍ²／ｇ）の場
合、膜の有機物質の重量に対して５〜５０重量％の範囲
の量で十分である。数ｍ²／ｇの比較的低い比表面積を
もつ充填剤の場合には、使用される充填剤の量は、膜中
の有機物質の重量に対し３５〜５００重量％の範囲が可
能である。高分散充填剤に対する好適な範囲は、１０〜
２５重量％であり、低い比表面積の充填剤に対するそれ
は、５０〜２００重量％である。

【００１７】好適なポリマーの組み合わせの例は、次の
通りである： セルロースエステル／ポリビニルエステル ポリウレタン／ポリアクリル酸誘導体もしくはアクリル
酸コポリマー ポリカーボネートコポリマー／ポリウレタン ポリビニル誘導体／ポリスルホン ポリアミドもしくはポリイミド／ポリスチレンもしくは
スチレンコポリマー ポリ−パラ−ジメチルフェニレンオキシド／フッ化ポリ
ビニリデン ポリスルホン／ポリアクリロニトリル ポリ（エーテルスルホン）／陰イオン性修飾ポリアクリ
ロニトリル。

【００１８】前記ポリマー系の他の組み合わせも、また
可能であり、さらに、三種のポリマー混合物まで拡張す
ることも出来る。

【００１９】そのようなポリマーの組み合わせの具体例
は、次の通りである：セルロースアセテート／ポリビニ
ルアセテート（例えば、Mowilith(商標))、ポリウレタ
ン(Desmoderm KBH(商標))／ポリアクリロニトリル（Dra
lon T(商標)）、デスモデルムＫＢＨ(商標)／アミン−
修飾ドラロン(Dralon A(商標))、デスモデルムＫＢＨ
(商標)／陰イオン性修飾ドラロン(Dralon U(商標))、ポ
リスルホン(Udel P 1700(商標))／フッ化ポリビニリデ
ン、ポリエーテルカーボネート／デスモデルムＫＢＨ
(商標)、ドラロンＵ(商標)／モウィリス(商標)、セルロ
ースアセテート／ドラロンＵ(商標)、セルロースアセテ
ート／ドラロンＵ(商標)／ポリスチレン、モウィリス
(商標)／デスモデルムＫＢＨ(商標)／塩化ポリビニル、
およびポリ（エーテルスルホン）(Ultrason E(商標)）
／ポリアクリロニトリル(Dralon X(商標))。

【００２０】分散される充填剤なしでの相分離に必要な
特別な組み合わせにおけるコポリマーの量比は、簡単な
予備試験によって見いだすことが出来る。

【００２１】その他の非常に重要な三種のポリマー系
は、デスモデルムＫＢＨ(商標)／モウィリス(商標)／ド
ラロンＴ(商標)であり、ドラロンＡ(商標)もしくはドラ
ロンＵ(商標)によってドラロンＴ(商標)を置き換えるこ
とも可能である。適切に使用されるポリマーの化学構造
は、模範的態様に対する追補中に記載される。

【００２２】ポリマー注型溶液の作製に好適なものは、
例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル
ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）、ジメチルアセトアミド、ジオキソラン、ジオキサ
ン、アセトン、メチルエチルケトン、セロソルブ(商標)
(Cellosolve)もしくはこれらの溶剤の混合液である。

【００２３】膜作製の全工程は、次の例によって表すこ
とが出来る：デスモデルムＫＢＨ(商標)、モウィリス
(商標)およびドラロン(商標)が各場合について約２０重
量％である、ＤＭＦポリマー溶液が、高速撹拌機（diss
olver）によってタルク中に分散されて、均質なポリマ
ー注型溶液になるまで混合される。真空中で脱気された
後、注型溶液は、支持基材に対して、例えば厚さ１５０
μｍの層に、ナイフによって塗布され、凝固浴、好まし
くは純水中に浸漬される。約２分の滞留時間後、形成さ
れるポリマー膜は、凝固浴から取り出され、温風により
乾燥される。

【００２４】微孔性膜の作製のためのその他の成分は、
注型溶液に使用される界面活性剤、例えばジオクチルス
ルホコハク酸ナトリウムもしくはドデシルベンゼンスル
ホン酸塩である。同様に、セルロースエーテル、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコールもしくはポリ
ビニルピロリドンのような水溶性ポリマーが、ポリマー
注型溶液の成分であることも可能である。さらにまた、
好適な添加剤は、例えば、陽イオン性ポリウレタン分散
剤のような所謂凝固助剤である。

【００２５】注型溶液は、沈降凝固が実施出来、注型溶
液とマクロポーラスポリマーを操作出来るように、支持
材に適用される。そのような支持材は、例えば、ガラス
もしくは広範な種々の起源のシリコン処理された支持材
料である。その他の支持材は、マクロポーラスポリマー
がその上によく付着する液浸透性のポリマー織布もしく
はポリマー不織布である。

【００２６】本発明により使用されるマクロポーラスポ
リマー膜は、平均孔径１０〜５０μｍ、好ましくは、１
０〜３０μｍを有する。

【００２７】免疫学的診断試験の実施に対して特に有利
な膜は、発色物質が、膜の作製中に既に組み込まれてい
るものである。その重要な例は、既知の酸化反応指示薬
である３，３ ’，５，５’−テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ）である。既知の従来の系と比較して、二つの
重要な長所がある： １．試験操作の全般にわたり、指示薬の含浸段階が短縮
され、単純化される。この特色は、有機溶剤が、例え
ば、ＴＭＢを包含する多くの指示薬に対する溶剤として
使用され、そらが、ポリマー膜もしくは生化学的試薬系
の何れかを損傷する故に重要なことである。

【００２８】２．膜の中に組み入れられた指示薬のなお
一層重要な長所は、反応中に生成される指示薬の発色の
浸出が、従来の系に比べて、事実上完全に抑えられるこ
とである。

【００２９】前記のマクロポーラスポリマー膜を用いる
本発明による方法は、驚くべきことに、生化学的試薬
（酵素、抗体）の吸着および共有結合の改善が出来たこ
とである： ａ）吸着固定 驚くべきことに、前記マクロポーラスポリマー膜の吸着
的結合能は、遊離アミノ基による膜表面の変性によっ
て、著しく増大させ得ることが分かる。アミン変性膜
は、膜完成後の処理によっても、または好ましくは、水
中の沈降凝固法による膜の作製に使用されるポリマー注
型溶液に加えられる添加剤によっても作られる。好適で
あることが分かっている添加剤は、例えば、ポリエチレ
ンイミンのようなアミノ基を有するポリマーである。そ
の他の好適な添加剤は、ポリアミド−アミンもしくはそ
の他の、例えば、製紙工程での保持剤として使用される
ような水溶性のアミン含有ポリマーである（Das Papier
33, No. 10A)。そのような保持剤は、例えば、Retamin
ol(商標)(Bayer AG)もしくはParaestol(商標)(Stockhau
sen)の名で市販されているものを入手出来る。

【００３０】そのような添加剤は、水溶性化合物ではあ
るけれども、驚くべきことに、水中での凝固による膜の
作製過程でも抽出されない。この事実は、ニンヒドリン
反応によって示される。

【００３１】さらにまた、アミノ変性膜は、ポリマー注
型溶液にアミン変性充填剤を添加することによる単純な
方法でも作製することが出来る。その好適な例は：表面
がアミノシランで処理されるケイ酸塩充填剤である。こ
のタイプの製品は、例えば、Silbond 600 AST(Quartz-W
erke)のような市販品である。このことに関して、吸着
固定の点で特に良好な結果は、添加剤ポリエチレンイミ
ンとアミノシランで処理されたケイ酸塩との組み合わせ
によって得られることが分かった。

【００３２】ｂ）共有結合固定 さらに、前記アミン変性マクロポーラスポリマー膜は、
また生化学試薬の共有結合固定のために著しく好適であ
ることが分かった。これに関しては、驚くべきことに、
グルタルアルデヒド、カルボジイミドもしくはビスヒド
ロキシスクシンイミドのような既知のカップリング試薬
の他に、共有固着基として最も好適なものは、多官能性
イソシアネートの水溶性重亜硫酸付加物であることが分
かった。このタイプの重亜硫酸付加物およびその調製は
既知である（Houben-Weyl, Method der organischen Ch
emie(有機化学の方法)、 Vol, 14/2, p.63-64)。それら
は、イソシアネートと重亜硫酸ナトリウムとを反応させ
ることによって得られる。好適なイソシアネートは、好
ましくは、多官能性であり、脂肪族、脂環式もしくは芳
香族であり得る。好適なポリイソシアネートの例は：ヘ
キサメチレンジイソシアネート、１，４−ジイソシアネ
ートシクロヘキサン、２，４−および２，６−トルイレ
ンジイソシアネートおよびそれらの混合物、１−イソシ
アネートメチル−５−イソシアネート−１，３，３−ト
リメチルシクロヘキサン、２，２，４−および２，４，
４−トリメチルヘキサメチレン１，６−ジイソシアネー
ト、１，５−ジイソシアネートナフタレン、１，３−シ
クロペンチレンジイソシアネート、ｍ−およびｐ−フェ
ニレンジイソシアネート、２，４，６−トリイソシアネ
ートトルエン、トリス（４−イソシアネートフェニル）
メタン、１，３−および１，４−キシリレンジイソシア
ネート、３，３’−ジメチル４，４’−ジフェニレンジ
イソシアネート、ジイソシアネートジュレン、１−フェ
ノキシ−２，４’−フェニレンジイソシアネート、１−
ｔｅｒｔ．−ブチル−２，４−フェニレンジイソシアネ
ート、メチレンビス４，４’−シクロヘキシルジイソシ
アネート、１−クロロ−２，４−フェニレンジイソシア
ネートならびにビス（４−イソシアネートフェニル）エ
ーテル；ここで言及されないその他のポリイソシアネー
トは、当業者にとっては原則的に既知である。

【００３３】さらに、比較的高分子量を用いることも、
また場合によっては、比較的低分子量のベース成分から
ウレトジオンもしくはイソシアヌレート誘導体を生成す
る重合反応によって作製される、より高次の官能性ポリ
イソシアネートを用いることも可能である。言及される
例は、２モルの２，４−トルイレンジイソシアネートお
よび、ジイソシアヌレート環を有し、２，４−および
２，６−トルイレンジイソシアネートもしくはヘキサメ
チレンジイソシアネートから得られる重合生成物からの
ウレトジオン、分子中に平均２個のイソシアヌレート環
を有し、５モルのトルイレンジイソシアネートから作製
される系、あるいは平均２モルのトルイレンジイソシア
ネートと３モルのヘキサメチレンジイソシアネートより
成る対応する誘導体である。その他の作製方法に従い、
ジ−もしくはポリイソシアネートから、カルバミン酸お
よびアミンをより高次にビウレット結合した系、例え
ば、ヘキサメチレンジイソシアネート３モルに水１モル
を添加し、二酸化炭素１モルを除去することにより得ら
れるビウレット結合化合物、を経る部分加水分解によっ
て調製することも可能である。同様に好適なポリイソシ
アネートは、イソシアネートに対してヒドロキシ化合物
のモル比が、遊離のＮＣＯ官能基が不規則に形成される
反応産物中に常に残存するように選択される場合に、ジ
−もしくはポリオールと多官能イソシアネートとの反応
において得られ、分子量２０００〜３０００を越えるこ
とはない。同じく好適なポリイソシアネートは、ヒドロ
キシル基を有するポリエステルより、過剰のジ−もしく
は多官能イソシアネートとの反応によって得られる。上
記の全てのジ−およびポリイソシアネートは、前記条件
下でこの方法において、モノおよびポリエチレングリコ
ール、プロパンジオール、ブタンジオール、ネオペンチ
ルグリコールおよびその他のペンタンジオール、アジポ
ール、ヘキサンジオール、シクロヘキサンジオール、
１，４−ジヒドロキシメチルシクロヘキサン、ペルヒド
ロビスフェノールＡ、グリセロール、トリメチロールエ
タン、トリメチロールプロパン、その他のヘキサントリ
オールおよびペンタエリスリトールのようなジ−および
ポリオールと反応することが出来る。

【００３４】ジイソシアネート、特にヘキサメチレンジ
イソシアネート、イソホロンジイソシアネート、トルイ
レンジイソシアネートおよびジフェニルメタンジイソシ
アネートは、より適切に使用される。

【００３５】膜表面への免疫的活性物質（酵素、抗体）
のこの共有結合の方法は、格別単純であるばかりでな
く、それは、化学構造および既知のカップリング剤に対
して知られていなかった多孔性ポリマー膜と活性物質と
の間のリンカーの鎖長の点において、種々の改変を提供
する。多数の方法が、活性物質の結合を行うために活用
される。

【００３６】かくして、第一の方法においては、前記ア
ミン変性膜は、約０．１〜１％濃度のイソシアネート−
重亜硫酸付加物水溶液によって先ず含浸される。この含
浸は、例えば、この種の溶液に膜を浸漬することによっ
て非常に容易に実施出来る。次いで、膜は、適切な条件
下で、例えば、３０〜８０℃の乾燥機中で５〜１２０分
乾燥される。免疫的活性物質の固定化は、今、膜表面に
これらの活性物質の溶液を接触させることによって簡単
に実施出来る。接触は、例えば、浸漬によっても、ある
いはミクロタイタ-プレ-トもしくはバイオドット装置で
作業する場合は、活性化合物溶液を吸引通過させること
によっても簡単に行える。

【００３７】第二の方法は、イソシアネート−重亜硫酸
付加物および固定化される生化学的活性物質の通常の水
溶液が調製され、アミン修飾膜と接触される。この場合
は、活性物質のモル数に対して要求量以上の過剰の重亜
硫酸付加物が、効果的であることが証明されている。

【００３８】本発明による方法は、あらゆる範囲の免疫
化学的試験法、例えば、植物、人間および動物の病原体
の免疫学的検出、植物、人間および動物の活性化合物の
検出、土壌および地下水における不純物（例えば、植物
保護因子）の検出、ならびにその他の試験方法を可能に
する。

【００３９】そのような免疫化学的（免疫学的診断）試
験を実施するための本発明による方法の適合性は、次の
実施例において詳細に説明される。

【００４０】実施例は、次の段階を記述する： １．アミン変性マクロポーラス性ポリマー膜の作製 ２．マウスＩｇＧの例を用いる免疫学的診断試験方法 ３．吸着および共有結合固定の比較。

【００４１】

【実施例】

（実施例１） アミン変性ポリマーブレンド膜の作製 高速撹拌機（ディゾルバー）が、次の成分からのポリマ
ー注型溶液の作製に使用された： Dralon T(商標)（ポリアクリロニトリル） ９．６ｇ Desmoderm KBH(商標)（ポリウレタン、ＮＭＰ中２０％溶液) １７０．０ｇ Mowilith 50(商標)（ポリビニルアセテート、 ＮＭＰ中２５％溶液） ２２５．８ｇ Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ） ２２０．０ｇ Silbond 600 AST（アミン変性ケイ酸塩） ２９３．４ｇ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） ３．９ｇ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン ３１．３ｇ Polymin P(商標)（ポリエチレンイミン、５０％水溶液） ２．１ｇ 使用されたポリマーの化学構造は、ドイツ出願公開第３
８０９ ５２３号に記載されている。

【００４２】注型溶液は、濾過され（金属織布、２５μ
ｍメッシュ巾）、脱気された。

【００４３】膜の作製 支持膜は、既知の水中での沈降凝固法によって作製され
た。次の条件が採られた： 支持材： Freudenberg製不織ポリエス
テル ＦＯ ２４０３ ナイフによる湿式塗布： ３００μｍ 凝固浴： 水、４０℃ 乾燥条件： ６０℃、２０分 不織ポリエステルに接着したマクロポーラスポリマーブ
レンド膜として得られたこのものは、指示薬３，３’，
５，５’−テトラメチルベンジジンを含有し、次の免疫
化学的検出反応に対する支持マトリックスとして使用さ
れた。

【００４４】（実施例２） マウスＩｇＧの検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ法 市販品より入手出来る免疫グロブリンが、固相としてポ
リマーブレンド膜を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ原理
に基づく免疫アッセイを実施するために使用された。免
疫アッセイに使用された成分、第一（捕獲,capture)抗
体、第二（標識,marker)抗体、抗原（マウスＩｇＧ）
は，シグマ社（SIGMA Chemie GmbH,Deisenhofen)から得
られた。

【００４５】次の特異的抗体が、使用された： １．第一抗体（捕捉抗体）として シグマＮｏ． 種類 起源 Ｍ３０１４ マウスＩｇＧ ヤギ 全分子 Ｍ９６３７ マウスＩｇＧ ウサギ 全分子 ２．第二抗体（標識抗体）として シグマＮｏ． 種類 起源 標識 Ａ２０２８ マウスＩｇＧ ヤギ ペルオキシダーゼ 全分子 Ａ４４１６ マウスＩｇＧ ウサギ ペルオキシダーゼ 全分子 ３．抗原（マウスＩｇＧ）として シグマＮｏ． 種類 Ｉ５３８１ マウスＩｇＧ 第一および第二抗体の多数の組み合わせが、応用のため
に使用された。

【００４６】 第一抗体 抗原 第二抗体 Ｍ３０１４ Ｉ５３８１ Ａ２０２８ Ｍ３０１４ Ｉ５３８１ Ａ４４１６ Ｍ９６３７ Ｉ５３８１ Ａ４４１６ 免疫アッセイのための操作：アッセイ膜のために使用さ
れたフレームは、バイオラッド社製ドット−ブロット装
置であった。弱い水流ポンプによる真空が濾過段階で使
われた。

【００４７】ポリマーブレンド膜は、ドット当たり水１
００μｌで加水された。次いで、第一抗体（濃度１ｍｇ
／ｍｌ）水溶液４００μｌがその膜を通して濾過され
た。続いて、抗原（マウスＩｇＧ）の血清希釈液が、種
々の濃度の希釈に対して２００μｌでその膜を吸引通過
された。洗浄段階の後、第二抗体（ＰＯＤ標識）が、膜
を通して濾過された。最後に、洗浄が、さらに一回ＰＢ
Ｓ／ツイーン（Tweeen)５００μｌにより行われ、その
膜は、標識酵素に対する基質溶液に浸漬して発色させら
れた。

【００４８】結合測定法の結果は、ポケット反射率計に
より測定された。

【００４９】結合実験の結果は、次のように示される
（添付図１〜３；濃度・マウスＩｇＧμｍ／ｍｌ（ｌｏ
ｇ））。

【００５０】 図１：系Ｍ３０１４／Ｉ５３８１／Ａ２０２８ 図２：系Ｍ３０１４／Ｉ５３８１／Ａ４４１６ 図３：系Ｍ９６３７／Ｉ５３８１／Ａ４４１６ 実施例は、本発明による膜マトリックスの、免疫アッセ
イに対する優れた適合性を示している。マウスＩｇＧ検
体は、ナノグラム以下の範囲で信頼性のある検出が出来
た。

【００５１】水の他に、次のバッファー系が、実施例２
において使用された： ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液） ０．１５ＭＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸塩溶液（＝
０．００８ＭＫ₂ＨＰＯ₄および０．００２ＭＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄）、ｐＨ７．４。

【００５２】 酢酸バッファー基質混合液（ＰＯＤ反応用） ０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液、ｐＨ６．０（１Ｍクエ
ン酸で調整）；Ｈ₂Ｏ₂（３．０％）が、酸化還元の相手
として１ｍｌ／ｌ添加された。

【００５３】Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート、シグマ No.P1379)の０．０１％
蒸留水溶液。

【００５４】（実施例３）（比較のために） マウスＩｇＧを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
法 実施例２が、固相として本発明によるポリマーブレンド
膜ではなくて、ミリポア製ポリビニリデンジフルオリド
膜(Immobilon P)が使用される変法を用いて繰り返され
た。

【００５５】実施例１に記載されたアッセイ操作の前
に、その膜は、エタノール１００μｌを吸引通過させる
ことによって親液性にされた。本発明によるポリマーブ
レンド膜とは反対に、その膜は発色物質を有さないの
で、免疫学的反応の後に、次のように調製された基質溶
液に浸漬された：テトラメチルベンジジンが、濃度２ｍ
ｇ／ｍｌでメタノールに溶解された（保存液）。その基
質溶液は、保存液５、０．４Ｍクエン酸バッファー（ｐ
Ｈ５．５）３．７５、水１１．３および３０％Ｈ₂Ｏ
₂０．０２５の割合で新しく調製された。

【００５６】各々の急速に現れた青色発色スポットは、
より拡大し、より判別し難くなり、ある場合には、他の
スポットと混じりあった。基質溶液中への染料の浸出
は、その溶液を濃い青色にしてしまい、その結果膜全体
が、青色になった。

【００５７】さらに、膜が乾燥された後、その色は、数
分間しか安定ではなく、そのため反射光による測定は不
可能であった。これとは反対に、本発明によるポリマー
ブレンド膜上の発色スポットは、数日間、しばしば数週
間以上も安定であり、測定可能であった。

【００５８】（実施例４）免疫学的活性物質は、本発明
によるポリマーブレンド膜の表面に十分強固に固定され
る。固定化は、さらにイソシアネート−重亜硫酸付加物
を用いる前処理によって改善することが出来る。

【００５９】この効果は、実施例４によって示される。
標識抗体（Siguma A9169,種類:ウサギＩｇＧ，起源：ヤ
ギ，標識：ペルオキシダーゼ）は、実施例１によるポリ
マーブレンド膜の表面に、実施例２に記載されたように
固定された。ある場合には、その膜は、未処理で、また
ある場合には、ヘキサメチレンジイソシアネートの重亜
硫酸付加物の０．２％水溶液を用いて前処理された。前
処理は、その膜に浸漬によって重亜硫酸付加物溶液を含
浸させる方法で実施され、膜は、続いて循環空気乾燥機
中で６０℃、１時間乾燥された。

【００６０】膜表面への吸着の後、固定化の耐久性が、
種々のバッファーおよび試薬を用いて、８回洗浄され、
各洗浄段階の後で、使用ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）お
よび酸化還元の相手としてのＴＭＢ／Ｈ₂Ｏ₂の酵素反応
を用いる検出によって検査された。次の表１は、洗浄後
に明瞭な薄い青色が認められた洗浄回数を示している。

【００６１】

【表１】 洗浄液 １ ２ ３ ４ ５ ６ 未処理膜 ４ ６ n.w. n.w. ４ ３ 前処理膜 n.w. n.w. n.w. n.w. ６ ４ n.w.＝洗浄なし 洗浄液として使用されたバッファーおよび試薬： １＝Ｈ₂Ｏ ２＝０．１％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液 ３＝ＰＢＳ ４＝０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ５＝酢酸バッファー ６＝炭酸バッファー（０．１ＭＮａＨＣＯ₃水溶液、ｐ
Ｈ９．６、水酸化ナトリウム溶液で調整）追補 ： 好適に使用されるポリマーの化学構造 ポリウレタン（Desmoderm KBH(商標),Bayer AG) アジピン酸、エチレングリコール７０ｍｏｌ％および
１，４−ブタンジオール（ＭＷ＝２０００）３０ｍｏｌ
％のポリエステル７５、アジピン酸および１，４−ブタ
ンジオール（ＭＷ＝２２５０）のポリエステル２５、
１，４−ブタンジオール２５、ならびにジフェニルメタ
ンジイソシアネート８５の割合で反応させて得られた熱
可塑性ポリ付加物。

【００６２】

【化１】

【００６３】

【化２】

【００６４】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。

【００６５】１． 酵素もしくは抗体が多孔性支持材に
結合され、そして使用される多孔性支持材が ａ）溶液中で相分離を引き起こす量で、少なくとも二種
の不相容性ポリマーを含有する溶液中に不相溶性充填剤
を分散させ、均質な注型溶液とする工程、および ｂ）支持材にこの溶液を適用し、沈降凝固を起こさせる
工程、かならる方法によって作製されるマクロポーラス
ポリマー膜であることを特徴とする免疫学的診断試験を
実施する方法。

【００６６】２． 各々有機的に修飾出来る、タルク、
二酸化チタン、硫酸バリウム、二酸化ケイ素、微結晶セ
ルロース、ゼオライトおよびベントナイト、高分散シリ
カおよび石英の部類から選ばれる一ないし複数の充填剤
が使用されることを特徴とする上記第１項記載の方法。

【００６７】３． 充填剤が、膜における有機物質の全
量に対して５〜５００重量％の量において、特異表面域
に依存して使用され、高分散充填剤の場合には、好まし
くは５〜５０重量％、比較的低い特異表面域をもつ充填
剤の場合には、好ましくは、３５〜５００重量％で使用
されることを特徴とする上記第１項記載の方法。

【００６８】４． 少なくとも二種の不相容性ポリマー
が、次の組み合わせ ａ）セルロースエステル／ポリビニルエステル、 ｂ）ポリウレタン／ポリアクリレ−トもしくはアクリル
酸コポリマー、 ｃ）ポリカーボネートコポリマー／ポリウレタン、 ｄ）ポリビニル誘導体／ポリスルホン、 ｅ）ポリアミドもしくはポリイミド／ポリスチレンもし
くはスチレンコポリマー ｆ）ポリ−パラ−ジメチルフェニレンオキシド／フッ化
ポリビニリデン、 ｇ）ポリスルホン／ポリアクリロニトリル、 ｈ）ポリ（エーテルスルホン）／陰イオン性修飾ポリア
クリロニトリル、 から、その可能な組み合わせの中の他の組み合わせとと
もに選ばれ、さらにまた前記ポリマーの三種のポリマー
混合物も使用することが出来ることを特徴とする上記第
１項記載の方法。

【００６９】５． マクロポーラスポリマー膜が、組み
込まれた発色物質、好ましくは３，３’，５，５’−テ
トラメチルベンジジンを含有することを特徴とする上記
第１項記載の方法。

【００７０】６． マクロポーラスポリマー膜が、遊離
アミノ基によって修飾された表面を有することを特徴と
する上記第１項記載の方法。

【００７１】７． イソシアネートの重亜硫酸付加物
が、遊離アミノ基によって修飾された表面を有するマク
ロポーラス膜に、酵素もしくは抗体を共有結合させるた
めに使用されることを特徴とする上記第６項記載の方
法。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定系で第一抗体としてＭ３０１４
を、そして第二抗体としてＡ２０２８を用い、抗原１５
３８１との結合実験の結果を示すグラフである。

【図２】本発明の測定系で第一抗体としてＭ３０１４
を、そして第二抗体としてＡ４４１６を用い、抗原１５
３８１との結合実験の結果を示すグラフである。

【図３】本発明の測定系で第一抗体としてＭ９６３７
を、そして第二抗体としてＡ４４１６を用い、抗原１５
３８１との結合実験の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カールハインツ・ヒルデンブラント ドイツ連邦共和国デー47802クレーフエル ト・ガツツエンシユトラーセ147 (72)発明者 ローラント・シユテツカー ドイツ連邦共和国デー40725ヒルデン・ノ ルデベーク16

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素もしくは抗体が多孔性支持材に結合
   され、そして使用される多孔性支持材が、 ａ）溶液中で相分離を引き起こす量において、少なくと
   も二種の不相容性ポリマーを含有する溶液中に不相溶性
   充填剤を分散させ、均質な注型溶液とする工程、 ｂ）支持材にこの溶液を適用し、沈降凝固を起こさせる
   工程、かならる方法によって作製される、マクロポーラ
   スポリマー膜であることを特徴とする免疫学的診断試験
   を実施する方法。