JPH06201691A - ヒト副甲状腺ホルモン関連蛋白質に対する高親和性ポリクローナル抗体 - Google Patents
ヒト副甲状腺ホルモン関連蛋白質に対する高親和性ポリクローナル抗体Info
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- JPH06201691A JPH06201691A JP34954992A JP34954992A JPH06201691A JP H06201691 A JPH06201691 A JP H06201691A JP 34954992 A JP34954992 A JP 34954992A JP 34954992 A JP34954992 A JP 34954992A JP H06201691 A JPH06201691 A JP H06201691A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来の抗体に比べてヒトＰＴＨｒｐに対する
親和性が高く、血中ＰＴＨｒｐの測定に使用し得る抗ヒ
トＰＴＨｒｐポリクローナル抗体、及びその製造方法を
提供する。 【構成】 ヒトＰＴＨｒｐに対する親和性が１×１０7
Ｌ／mol 以上であることを特徴とする、ヒトＰＴＨｒｐ
に対するポリクローナル抗体、及びヒトＰＴＨｒｐによ
り鳥類を免疫感作し、該免疫感作された鳥類により産卵
された卵から前記抗体を採取することを特徴とする、ヒ
トＰＴＨｒｐに対するポリクローナル抗体の製造方法。
親和性が高く、血中ＰＴＨｒｐの測定に使用し得る抗ヒ
トＰＴＨｒｐポリクローナル抗体、及びその製造方法を
提供する。 【構成】 ヒトＰＴＨｒｐに対する親和性が１×１０7
Ｌ／mol 以上であることを特徴とする、ヒトＰＴＨｒｐ
に対するポリクローナル抗体、及びヒトＰＴＨｒｐによ
り鳥類を免疫感作し、該免疫感作された鳥類により産卵
された卵から前記抗体を採取することを特徴とする、ヒ
トＰＴＨｒｐに対するポリクローナル抗体の製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト副甲状腺ホルモン関
連蛋白質（ＰＴＨｒｐ）に対する高親和性ポリクローナ
ル抗体及びその製造方法に関する。このポリクローナル
抗体は体液中のＰＴＨｒｐの正確な検出・測定のために
有用であり、このため高Ｃａ血症、特に悪性腫瘍由来に
起因する高Ｃａ血症の診断のために有用である。
連蛋白質（ＰＴＨｒｐ）に対する高親和性ポリクローナ
ル抗体及びその製造方法に関する。このポリクローナル
抗体は体液中のＰＴＨｒｐの正確な検出・測定のために
有用であり、このため高Ｃａ血症、特に悪性腫瘍由来に
起因する高Ｃａ血症の診断のために有用である。
【０００２】
【従来の技術】持続的な高Ｃａ血症はその９５％まで
は、原発性副甲状腺機能亢進症か、悪性腫瘍に伴うもの
であり、特に、入院中に発見される高Ｃａ血症は後者に
よるものが最も多い。悪性腫瘍に伴う高Ｃａ血症は、局
所性因子が重視されるＬＯＨ（ｌｏｃａｌ ｏｓｔｅｏ
ｌｙｔｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ）と体液性骨
吸収因子によるＨＨＭ（ｈｕｍｏｒａｌ ｈｙｐｅｒｃ
ａｌｃｅｍｉａ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）に大別
される。固型ガン一般については、腫瘍の産生する体液
性骨吸収因子が関わっているものが６０％以上に及ぶと
言われる。
は、原発性副甲状腺機能亢進症か、悪性腫瘍に伴うもの
であり、特に、入院中に発見される高Ｃａ血症は後者に
よるものが最も多い。悪性腫瘍に伴う高Ｃａ血症は、局
所性因子が重視されるＬＯＨ（ｌｏｃａｌ ｏｓｔｅｏ
ｌｙｔｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ）と体液性骨
吸収因子によるＨＨＭ（ｈｕｍｏｒａｌ ｈｙｐｅｒｃ
ａｌｃｅｍｉａ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）に大別
される。固型ガン一般については、腫瘍の産生する体液
性骨吸収因子が関わっているものが６０％以上に及ぶと
言われる。
【０００３】１９８７年、Ｍｏｓｌｅｙら（Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８４，５０４８−５０５
２）は、ヒト肺ガン由来細胞の産生する１８ｋＤａのＰ
ＴＨｒｐの純化とＮ末端のアミノ酸配列の決定に成功し
た。Ｎ末端１６残基のうち８残基は、ヒトＰＴＨと同一
であるという。現在、ＨＨＭの病態には腫瘍が産生し、
血中を運ばれるＰＴＨｒｐが重要な役割を果たしている
と考えられており、主にＰＴＨｒｐが破骨細胞を活性化
し、骨からＣａが流出すると思われる。
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８４，５０４８−５０５
２）は、ヒト肺ガン由来細胞の産生する１８ｋＤａのＰ
ＴＨｒｐの純化とＮ末端のアミノ酸配列の決定に成功し
た。Ｎ末端１６残基のうち８残基は、ヒトＰＴＨと同一
であるという。現在、ＨＨＭの病態には腫瘍が産生し、
血中を運ばれるＰＴＨｒｐが重要な役割を果たしている
と考えられており、主にＰＴＨｒｐが破骨細胞を活性化
し、骨からＣａが流出すると思われる。
【０００４】１９９０年、Ｗｉｌｌｉａｍら（Ｎ Ｅｎ
ｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３２２，１１０６−１１１２）は、
ＰＴＨｒｐ（１−７４）に対するＩＲＭＡ（ｉｍｍｕｎ
ｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）と、ＰＴＨｒ
ｐ（１０９−１３８）に対するＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ）を開発して、両方の測定系で、悪
性腫瘍由来の高Ｃａ血症を呈した血漿中でＰＴＨｒｐが
高値を示した。また、慢性の腎不全患者血漿中には、Ｐ
ＴＨｒｐ（１−７４）は認められなかったが、ＰＴＨｒ
ｐ（１０９−１３８）は高値を示した。
ｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３２２，１１０６−１１１２）は、
ＰＴＨｒｐ（１−７４）に対するＩＲＭＡ（ｉｍｍｕｎ
ｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）と、ＰＴＨｒ
ｐ（１０９−１３８）に対するＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ）を開発して、両方の測定系で、悪
性腫瘍由来の高Ｃａ血症を呈した血漿中でＰＴＨｒｐが
高値を示した。また、慢性の腎不全患者血漿中には、Ｐ
ＴＨｒｐ（１−７４）は認められなかったが、ＰＴＨｒ
ｐ（１０９−１３８）は高値を示した。
【０００５】１１９２年、Ｗｅｎｄｙら（ＴＨＥＬＡＮ
ＣＥＴ，３３９，１６４−１６７）は、ＰＴＨｒｐ（１
−８６）に対するＩＲＭＡを用いて１２１例の高Ｃａ血
症を呈した患者血漿中ＰＴＨｒｐ量を測定した。これに
よると、固型ガンの患者血漿４０例のうち８８％でＰＴ
Ｈｒｐが検出され、初期の上皮小体機能亢進症の患者の
９２％は検出されず、ＰＴＨとの相関もほとんどみとめ
られなかった。
ＣＥＴ，３３９，１６４−１６７）は、ＰＴＨｒｐ（１
−８６）に対するＩＲＭＡを用いて１２１例の高Ｃａ血
症を呈した患者血漿中ＰＴＨｒｐ量を測定した。これに
よると、固型ガンの患者血漿４０例のうち８８％でＰＴ
Ｈｒｐが検出され、初期の上皮小体機能亢進症の患者の
９２％は検出されず、ＰＴＨとの相関もほとんどみとめ
られなかった。
【０００６】このため、ＰＴＨｒｐは、その患者の高Ｃ
ａ血症の成因がＨＨＭであるかどうかのマーカーとなる
と思われるが、ＰＴＨｒｐの検出には、高感度を要求さ
れるため、非常に親和性の高い抗体が必要とされる。し
か、ＰＴＨｒｐに対する高親和性の抗体の取得は、従来
非常に難しく、主に、マウス、ラビット、モルモット、
羊などの哺乳類を用いて試みられていたが、高い抗体価
の上昇はあまり認められなかった。また、抗体の大量取
得という点においても十分ではなかった。この原因とし
て、ＰＴＨｒｐは、種間でのアミノ酸配列のホモロジー
が高く、哺乳類にＰＴＨｒｐを投与しても強い免疫反応
がおこらないことがかんがえられる。
ａ血症の成因がＨＨＭであるかどうかのマーカーとなる
と思われるが、ＰＴＨｒｐの検出には、高感度を要求さ
れるため、非常に親和性の高い抗体が必要とされる。し
か、ＰＴＨｒｐに対する高親和性の抗体の取得は、従来
非常に難しく、主に、マウス、ラビット、モルモット、
羊などの哺乳類を用いて試みられていたが、高い抗体価
の上昇はあまり認められなかった。また、抗体の大量取
得という点においても十分ではなかった。この原因とし
て、ＰＴＨｒｐは、種間でのアミノ酸配列のホモロジー
が高く、哺乳類にＰＴＨｒｐを投与しても強い免疫反応
がおこらないことがかんがえられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ヒト
ＰＴＨｒｐに対して高い親和性を有するポリクローナル
抗体及びその製造方法、並びに該抗体を用いるＰＴＨｒ
ｐの検出又は測定方法を提供しようとするものである。
ＰＴＨｒｐに対して高い親和性を有するポリクローナル
抗体及びその製造方法、並びに該抗体を用いるＰＴＨｒ
ｐの検出又は測定方法を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく種々検討した結果、鳥類をヒトＰＴＨｒｐ
により感作し、そして該鳥類が産卵した卵から目的とす
る抗体を採取することにより、従来マウス、ラビット、
モルモット、羊等から得られているポリクローナル抗体
に比べてヒトＰＴＨｒｐに対する親和性がはるかに高い
ポリクローナル抗体を得ることができることを見出し、
本発明を完成した。
を解決すべく種々検討した結果、鳥類をヒトＰＴＨｒｐ
により感作し、そして該鳥類が産卵した卵から目的とす
る抗体を採取することにより、従来マウス、ラビット、
モルモット、羊等から得られているポリクローナル抗体
に比べてヒトＰＴＨｒｐに対する親和性がはるかに高い
ポリクローナル抗体を得ることができることを見出し、
本発明を完成した。
【０００９】従って本発明は、ヒトＰＴＨｒｐに対する
親和性が１×１０7 Ｌ／mol 以上であることを特徴とす
るヒトＰＴＨｒｐに対するポリクローナル抗体を提供す
る。本発明はさらに、ＰＴＨｒｐにより鳥類を免疫感作
し、そして該免疫感作された鳥類により産卵された卵か
らヒトＰＴＨｒｐに対する抗体を採取することを特徴と
する前記ＰＴＨｒｐに対する高親和性抗体の製造方法を
提供する。
親和性が１×１０7 Ｌ／mol 以上であることを特徴とす
るヒトＰＴＨｒｐに対するポリクローナル抗体を提供す
る。本発明はさらに、ＰＴＨｒｐにより鳥類を免疫感作
し、そして該免疫感作された鳥類により産卵された卵か
らヒトＰＴＨｒｐに対する抗体を採取することを特徴と
する前記ＰＴＨｒｐに対する高親和性抗体の製造方法を
提供する。
【００１０】
【具体的な説明】本発明において使用する鳥類として
は、入手のしやすさ、採卵のしやすさ等の点から鶏が最
も好ましい。免疫に使用する抗原としては、例えばヒト
の培養細胞、例えばヒト肺癌由来細胞の培養物から得ら
れたＰＴＨｒｐ、遺伝子組換え法により製造されたＰＴ
Ｈｒｐ、さらには抗原決定基を含有するそれらの断片等
を用いることができる。免疫感作にあたっては、これら
のＰＴＨｒｐ又はその断片を、Ｆｒｅｕｎｄの完全ジジ
ュバント、不完全アジュバント等と混合して使用すれば
よい。
は、入手のしやすさ、採卵のしやすさ等の点から鶏が最
も好ましい。免疫に使用する抗原としては、例えばヒト
の培養細胞、例えばヒト肺癌由来細胞の培養物から得ら
れたＰＴＨｒｐ、遺伝子組換え法により製造されたＰＴ
Ｈｒｐ、さらには抗原決定基を含有するそれらの断片等
を用いることができる。免疫感作にあたっては、これら
のＰＴＨｒｐ又はその断片を、Ｆｒｅｕｎｄの完全ジジ
ュバント、不完全アジュバント等と混合して使用すれば
よい。
【００１１】免疫感作は、１〜２週間の間隔で４〜１０
回繰り返せばよい。これは、ＰＴＨｒｐの溶液とＦｒｅ
ｕｎｄのアジュバントとから成るエマルジョンを例えば
鳥の翼下に注射することにより行う。次に、常法に従っ
て、免疫された鳥を飼育し、産卵させる。本発明のポリ
クローナル抗体は、卵黄から採取するのが好ましい。ポ
リクローナル抗体の採取・精製に先立って、各卵の卵黄
の抗体価を測定し、高力価を示す卵黄を集めて、ポリク
ローナル抗体の採取・精製に供するのが好ましい。
回繰り返せばよい。これは、ＰＴＨｒｐの溶液とＦｒｅ
ｕｎｄのアジュバントとから成るエマルジョンを例えば
鳥の翼下に注射することにより行う。次に、常法に従っ
て、免疫された鳥を飼育し、産卵させる。本発明のポリ
クローナル抗体は、卵黄から採取するのが好ましい。ポ
リクローナル抗体の採取・精製に先立って、各卵の卵黄
の抗体価を測定し、高力価を示す卵黄を集めて、ポリク
ローナル抗体の採取・精製に供するのが好ましい。
【００１２】目的とするポリクローナル抗体の精製は、
例えばデキストラン硫酸ナトリウムを用いて卵黄からリ
ポ蛋白質を分離除去し、硫酸ナトリウムにより塩析を行
って、好ましくは１７重量％（２５℃）の画分を得、次
に抗体の精製に常用されているクロマトグラフィー、例
えばＱカラムを用いるカラムクロマトグラフィーにより
行うことができる。この様な方法により、例えば純度９
０％以上に精製することができる。
例えばデキストラン硫酸ナトリウムを用いて卵黄からリ
ポ蛋白質を分離除去し、硫酸ナトリウムにより塩析を行
って、好ましくは１７重量％（２５℃）の画分を得、次
に抗体の精製に常用されているクロマトグラフィー、例
えばＱカラムを用いるカラムクロマトグラフィーにより
行うことができる。この様な方法により、例えば純度９
０％以上に精製することができる。
【００１３】本発明のポリクローナル抗体は、ヒトＰＴ
Ｈｒｐに対して、従来知られているマウス、ラビット、
モルモット、羊等の哺乳類から得られたヒトＰＴＨｒｐ
に対するポリクローナル抗体に比べて、高い親和性を有
し、１×１０7 Ｌ／mol 以上、好ましくは５×１０7 Ｌ
／mol 以上、例えば５．９４×１０7 Ｌ／mol の親和性
を有する。このため、本発明の抗体は悪性腫瘍由来カル
シウム血症患者の血漿中のＰＴＨｒｐの濃度を測定する
のに非常に有用である。なぜなら、前記患者の血漿中の
ＰＴＨｒｐの濃度は１０ｐｇ／ｍｌ前後と考えられ、こ
の様な低濃度のＰＴＨｒｐは、従来哺乳類から得られて
いる抗体においては、そのＰＴＨｒｐに対する低い親和
性のため、測定できないからである。
Ｈｒｐに対して、従来知られているマウス、ラビット、
モルモット、羊等の哺乳類から得られたヒトＰＴＨｒｐ
に対するポリクローナル抗体に比べて、高い親和性を有
し、１×１０7 Ｌ／mol 以上、好ましくは５×１０7 Ｌ
／mol 以上、例えば５．９４×１０7 Ｌ／mol の親和性
を有する。このため、本発明の抗体は悪性腫瘍由来カル
シウム血症患者の血漿中のＰＴＨｒｐの濃度を測定する
のに非常に有用である。なぜなら、前記患者の血漿中の
ＰＴＨｒｐの濃度は１０ｐｇ／ｍｌ前後と考えられ、こ
の様な低濃度のＰＴＨｒｐは、従来哺乳類から得られて
いる抗体においては、そのＰＴＨｒｐに対する低い親和
性のため、測定できないからである。
【００１４】本発明の抗ヒトＰＴＨｒｐポリクローナル
抗体を用いてＰＴＨｒｐの免疫測定を行うには、常用の
方法、例えばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノ
アッセイ、蛍光イムノアッセイ等が用いられる。ラジオ
イムノアッセイに用いる標識としては、例えば 131Ｉ,
125Ｉ, 14Ｃ, 3 Ｈ等が用いられるエンザイムアッセイ
の典型的な例としてエンザイムリンクド・イムノソルベ
ントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。このための
標識酵素として、例えばペルオキシダーゼ、例えば西洋
ワサビペルオキシダーゼが用いられる。
抗体を用いてＰＴＨｒｐの免疫測定を行うには、常用の
方法、例えばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノ
アッセイ、蛍光イムノアッセイ等が用いられる。ラジオ
イムノアッセイに用いる標識としては、例えば 131Ｉ,
125Ｉ, 14Ｃ, 3 Ｈ等が用いられるエンザイムアッセイ
の典型的な例としてエンザイムリンクド・イムノソルベ
ントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。このための
標識酵素として、例えばペルオキシダーゼ、例えば西洋
ワサビペルオキシダーゼが用いられる。
【００１５】
【発明の効果】本発明によれば、鳥類をＰＴＨｒｐによ
り免疫感作してその卵から抗体を得ることにより、従来
マウス、ラビット、モルモット、羊等の哺乳類から得ら
れた抗体に比べて、ＰＴＨｒｐに対する親和性が極めて
高い抗体が得られる。また、抗体の分離源が産卵により
得られるため、血液から抗体を分離するのに比べて便利
であり多量に得られる。また、血清に比べて、卵黄中に
は目的とする抗体が高濃度で蓄積し、しかも血清中には
目的とする抗体以外の種々の抗体が含まれているのに対
して卵黄にはそれらが含まれていないため、精製が極め
て容易である。
り免疫感作してその卵から抗体を得ることにより、従来
マウス、ラビット、モルモット、羊等の哺乳類から得ら
れた抗体に比べて、ＰＴＨｒｐに対する親和性が極めて
高い抗体が得られる。また、抗体の分離源が産卵により
得られるため、血液から抗体を分離するのに比べて便利
であり多量に得られる。また、血清に比べて、卵黄中に
は目的とする抗体が高濃度で蓄積し、しかも血清中には
目的とする抗体以外の種々の抗体が含まれているのに対
して卵黄にはそれらが含まれていないため、精製が極め
て容易である。
【００１６】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例１．抗ヒトＰＴＨｒｐポリクローナル抗体の製造 ＰＴＨｒｐ １００μｇ／１００μｌとＦｒｅｕｎｄ完
全アジャバント１００μｌを混合しエマルジョンにし、
その２００μｌを鶏の翼下に投与し、２週間後に同免疫
を繰り返した。それから、２週間後に腹腔に同免疫を繰
り返し、４週間に１回の割合で３回繰り返した。その
後、卵３５個を取得し、それらの卵黄を分離し卵黄中の
抗体価を調べ、非常に高抗体価を示した１６個を分取し
た。次に、その卵黄をデキストラン硫酸ナトリウムを用
いてリポタンパク質を分離し、硫酸ナトリウム塩析沈殿
を行い、１７重量％（２５℃）画分を得、Ｑカラムを用
いてＩｇＹを純度９０％以上に精製した。
説明する。実施例１．抗ヒトＰＴＨｒｐポリクローナル抗体の製造 ＰＴＨｒｐ １００μｇ／１００μｌとＦｒｅｕｎｄ完
全アジャバント１００μｌを混合しエマルジョンにし、
その２００μｌを鶏の翼下に投与し、２週間後に同免疫
を繰り返した。それから、２週間後に腹腔に同免疫を繰
り返し、４週間に１回の割合で３回繰り返した。その
後、卵３５個を取得し、それらの卵黄を分離し卵黄中の
抗体価を調べ、非常に高抗体価を示した１６個を分取し
た。次に、その卵黄をデキストラン硫酸ナトリウムを用
いてリポタンパク質を分離し、硫酸ナトリウム塩析沈殿
を行い、１７重量％（２５℃）画分を得、Ｑカラムを用
いてＩｇＹを純度９０％以上に精製した。
【００１７】そのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、非還
元条件下で分子量約１８万、還元下では分子量約６．５
万のＨ鎖及び分子量約２．５万のＬ鎖が認められる。次
に、このＩｇＹの抗体価を、同様な免疫をし純度９０％
以上に精製して得られた兎ＩｇＧと比較した。抗体価の
測定法は、以下の通りである。ＰＢＳにＰＴＨｒｐ １
μｇ／ｍｌになるように溶解して、その５０μｌをウエ
ルに加え、４℃で一晩放置した。次に、ＰＢＳで２回ウ
エルを洗浄した後、１％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ溶液を
３５０μｌ／ウエル加え、２時間室温で放置した。ＰＢ
Ｓで２回ウエルを洗浄した後、各抗体を希釈液（１％Ｂ
ＳＡ、１％ポリビニルピロリドン、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を溶解したＰＢＳ）で、１０μｇ／ｍｌから３倍
ずつ希釈しその５０μｌを加えて、３７℃１時間インキ
ュベートした。
元条件下で分子量約１８万、還元下では分子量約６．５
万のＨ鎖及び分子量約２．５万のＬ鎖が認められる。次
に、このＩｇＹの抗体価を、同様な免疫をし純度９０％
以上に精製して得られた兎ＩｇＧと比較した。抗体価の
測定法は、以下の通りである。ＰＢＳにＰＴＨｒｐ １
μｇ／ｍｌになるように溶解して、その５０μｌをウエ
ルに加え、４℃で一晩放置した。次に、ＰＢＳで２回ウ
エルを洗浄した後、１％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ溶液を
３５０μｌ／ウエル加え、２時間室温で放置した。ＰＢ
Ｓで２回ウエルを洗浄した後、各抗体を希釈液（１％Ｂ
ＳＡ、１％ポリビニルピロリドン、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を溶解したＰＢＳ）で、１０μｇ／ｍｌから３倍
ずつ希釈しその５０μｌを加えて、３７℃１時間インキ
ュベートした。
【００１８】０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄した後、兎ＩｇＧに対して
は、ペルオキシダーゼ結合抗兎ＩｇＧ（ＤＡＫＯ社希釈
液で５０００倍に希釈したもの）を、ＩｇＹに対して
は、ペルオキシダーゼ結合抗鶏ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ
社希釈液で１００００倍に希釈したもの）を、それぞれ
５０μｌを加え３７℃３０分インキュベートをした。
（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄した後、兎ＩｇＧに対して
は、ペルオキシダーゼ結合抗兎ＩｇＧ（ＤＡＫＯ社希釈
液で５０００倍に希釈したもの）を、ＩｇＹに対して
は、ペルオキシダーゼ結合抗鶏ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ
社希釈液で１００００倍に希釈したもの）を、それぞれ
５０μｌを加え３７℃３０分インキュベートをした。
【００１９】ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、ｃｏｌｏｒ
ｒｅａｇｅｎｔＡおよびＢ（ＭＥＤＩＸ ＢＩＯＴＥ
ＣＨＩＮＣ）を等量混合したものを５０μｌずつ加えて
室温で１０分間反応させ、２０％Ｈ2 ＳＯ4 を５０μｌ
加えて反応を止めた。その結果を図１に示す。兎ＩｇＧ
よりもＩｇＹが約１０００倍ほど抗体価が高いことがわ
かる。
ｒｅａｇｅｎｔＡおよびＢ（ＭＥＤＩＸ ＢＩＯＴＥ
ＣＨＩＮＣ）を等量混合したものを５０μｌずつ加えて
室温で１０分間反応させ、２０％Ｈ2 ＳＯ4 を５０μｌ
加えて反応を止めた。その結果を図１に示す。兎ＩｇＧ
よりもＩｇＹが約１０００倍ほど抗体価が高いことがわ
かる。
【００２０】実施例２．ＰＴＨｒｐの測定 前記の抗ヒトＰＴＨｒｐ抗体ＩｇＹをＰＴＨｒｐの測定
系に利用するためにペルオキシダーゼとの結合物を作製
して、抗ＰＴＨｒｐモノクローナル抗体とのサンドイッ
チＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）
を行った。測定方法を以下に詳細に述べる。
系に利用するためにペルオキシダーゼとの結合物を作製
して、抗ＰＴＨｒｐモノクローナル抗体とのサンドイッ
チＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）
を行った。測定方法を以下に詳細に述べる。
【００２１】２種類のマウス抗ＰＴＨｒｐモノクローナ
ル抗体をそれぞれ５μｇ／ｍｌ（計１０μｇ／ｍｌ）に
なるように０．１Ｍ炭酸緩衝液pH９．６で希釈して、１
００μｌ／ウエルずつ９６ウエルマイクロタイタープレ
ートに加える。４℃で一晩放置したのち、ＰＢＳ（Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で
２回洗浄し、２％ゲラチンを含んだＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−
Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を３５０μｌ／ウエ
ル加え、室温で２時間放置した。
ル抗体をそれぞれ５μｇ／ｍｌ（計１０μｇ／ｍｌ）に
なるように０．１Ｍ炭酸緩衝液pH９．６で希釈して、１
００μｌ／ウエルずつ９６ウエルマイクロタイタープレ
ートに加える。４℃で一晩放置したのち、ＰＢＳ（Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で
２回洗浄し、２％ゲラチンを含んだＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−
Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を３５０μｌ／ウエ
ル加え、室温で２時間放置した。
【００２２】ＰＢＳで２回洗浄したのち、１％ゲラチ
ン、１％ＰＶＰ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍ
ＭＥＤＴＡを含むＴＢＳpH７．５（試料希釈剤）で種々
の濃度に希釈したＰＴＨｒｐ溶液１００μｌを加えた。
３７℃、２時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含んだＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄した後、試
料希釈剤で希釈したペルオキシダーゼ結合ＩｇＹ１００
μｇ／ｍｌを１００μｌを加えた。
ン、１％ＰＶＰ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍ
ＭＥＤＴＡを含むＴＢＳpH７．５（試料希釈剤）で種々
の濃度に希釈したＰＴＨｒｐ溶液１００μｌを加えた。
３７℃、２時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含んだＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄した後、試
料希釈剤で希釈したペルオキシダーゼ結合ＩｇＹ１００
μｇ／ｍｌを１００μｌを加えた。
【００２３】３７℃、１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ
で５回洗浄し、基質溶液（テトラメチルベンジン溶液と
過酸化水素水の混合溶液）１００μｌを加え、室温で２
０分反応させる。２０％硫酸１００μｌを加えた後、各
ウエルの４５０ｎｍの吸光度（副波長は６００ｎｍ）を
測定した。ＰＴＨｒｐ０ｐｇ／ｍｌの値を差し引いてｌ
ｏｇ／ｌｏｇグラフにプロットした結果を図２に示す。
検出感度は約１０ｐｇ／ｍｌほどであった。
で５回洗浄し、基質溶液（テトラメチルベンジン溶液と
過酸化水素水の混合溶液）１００μｌを加え、室温で２
０分反応させる。２０％硫酸１００μｌを加えた後、各
ウエルの４５０ｎｍの吸光度（副波長は６００ｎｍ）を
測定した。ＰＴＨｒｐ０ｐｇ／ｍｌの値を差し引いてｌ
ｏｇ／ｌｏｇグラフにプロットした結果を図２に示す。
検出感度は約１０ｐｇ／ｍｌほどであった。
【００２４】このように、ＩｇＹを用いることによっ
て、ＥＩＡを用いてのＰＴＨｒｐの検出に関しては最高
の感度を示した。
て、ＥＩＡを用いてのＰＴＨｒｐの検出に関しては最高
の感度を示した。
【図１】図１は鶏由来の本発明の抗ＰＴＨｒｐ抗体とラ
ビット由来の抗ＰＴＨｒｐ抗体のヒトＰＴＨｒｐに対す
る抗体価を比較したものである。
ビット由来の抗ＰＴＨｒｐ抗体のヒトＰＴＨｒｐに対す
る抗体価を比較したものである。
【図２】図２は本発明の抗ＰＴＨｒｐ抗体を用いてヒト
ＰＴＨｒｐを測定する場合の検量線の１例を示す。
ＰＴＨｒｐを測定する場合の検量線の１例を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒト副甲状腺ホルモン関連蛋白質（ＰＴ
Ｈｒｐ）に対する親和性が１×１０7 Ｌ／mol 以上であ
ることを特徴とするＰＴＨｒｐに対するポリクローナル
抗体。 - 【請求項２】 請求項１に記載のポリクローナル抗体の
製造方法であって、ＰＴＨｒｐにより鳥類を免疫感作
し、該免疫感作された鳥類により産卵された卵から該抗
体を採取することを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34954992A JPH06201691A (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | ヒト副甲状腺ホルモン関連蛋白質に対する高親和性ポリクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34954992A JPH06201691A (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | ヒト副甲状腺ホルモン関連蛋白質に対する高親和性ポリクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06201691A true JPH06201691A (ja) | 1994-07-22 |
Family
ID=18404474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34954992A Pending JPH06201691A (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | ヒト副甲状腺ホルモン関連蛋白質に対する高親和性ポリクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06201691A (ja) |
-
1992
- 1992-12-28 JP JP34954992A patent/JPH06201691A/ja active Pending
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