JPH0616550A

JPH0616550A - ベルノダリンを有効成分とする免疫抑制剤

Info

Publication number: JPH0616550A
Application number: JP4194621A
Authority: JP
Inventors: Naohiro Washida; 尚洋鷲田; Noriko Yoshida; 紀子吉田; Koichi Koshimizu; 弘一小清水; Hajime Daito; 肇大東
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1992-06-30
Filing date: 1992-06-30
Publication date: 1994-01-25

Abstract

(57)【要約】【構成】次の構造式：【化１】で示されるベルノダリンを有効成分とする免疫抑制剤。【効果】本発明の実施によりベルノダリンを有効成分
とする免疫抑制剤が提供される。本発明による免疫抑制
剤は、Ｔ細胞依存性抗体産生を抑制し、臓器移植や免疫
異常、自己免疫疾患の治療に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ベルノダリン（Vernod
alin) を有効成分とする新規な免疫抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年になって急速に発達した医学上の技
術の代表的なものに臓器移植が挙げられる。臓器移植
は、これまで致命的とされてきた心疾患、肝臓疾患、腎
臓疾患などの臓器不全に悩む患者にとっては大きな福音
とも言える。しかし、臓器移植に伴う問題としては、移
植臓器に対する拒絶反応や移植片宿主反応（ＧＶＨＲ）
などへの注意が必要である。このため、ステロイド剤や
６−メルカプトプリン、サイクロスポリンなどの免疫抑
制剤が使用される。しかし、これらの免疫抑制剤は種々
の副作用が問題となっており、新しい免疫抑制剤の開発
が望まれている。

【０００３】また最近は、アレルギーなど自己免疫疾患
への免疫抑制剤の投与も行われており、免疫抑制剤の用
途は広がっている。一方、本発明者らは熱帯アフリカの
霊長類の非栄養的摂取植物の成分研究を進める過程で、
霊長類が疾病時に採食し、病状の回復につながったこと
が観察されているベルノニア・アミグダリナ（Vernonia
amygdalina)から生理活性成分を抽出し、その薬理活性
を確認してきた。熱帯アフリカに広く自生するキク科灌
木であるベルノニア・アミグダリナが野性チンパンジー
により薬用的に摂取されていることに着目し、その生理
活性成分の研究を行った。これらの生理活性成分の中
で、セスキテルペンの一種であるベルノダリンは強い苦
味を有する物質であり、クプチャン（Kupchan)らによ
り、ＫＢ細胞に対する抗腫瘍効果が確認されている(S.
M. Kupchan, et.al., The Journal of Organic Chemist
ry, vol.34, 3908-3911(1969))。

【０００４】このキク科灌木ベルノニア・アミグダリナ
は、西アフリカにおいてはその独特の苦味が好まれ、伝
統的な民族料理の材料として用いられており、安全性も
問題はない。さらに興味深いことに、本発明者らは、今
回ベルノダリンがＴ細胞の分化増殖に抑制的に働き、選
択的に免疫を抑制することを初めて見出した。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
知見に基づいてなされたもので、ベルノダリンを有効成
分とする新規な免疫抑制剤を提供することを課題とす
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、ベルノダリン
を有効成分とする新規な免疫抑制剤である。本発明に使
用するベルノダリンは、上記クプチャンらの文献に基づ
いて、ベルノニア・アミグダリナから抽出することがで
きる。ベルノニア・アミグダリナ乾燥葉から、クロロホ
ルム抽出、ｎ−ヘキサン−メタノール抽出、シリカゲル
クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等により精製し、ベルノ
ダリンを得る。このようにして精製されたベルノダリン
は、無色の油状物質として得られ、メタノール、エタノ
ール、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルスルフォ
キシドなどの有機溶媒に溶解し、水に不溶性の次の構造
式を有する物質である。

【０００７】

【化２】

【０００８】ベルノダリンを免疫抑制剤として使用する
ためには単独、もしくは製剤化して投与することができ
る。製剤化する場合には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆
粒剤などの形態とすることができる。また注射剤とする
こともできる。免疫抑制剤として投与する場合は、これ
らの製剤を１日１ないし３回、ベルノダリン換算で 0.0
1mg/kg〜10mg/kg を投与することで、Ｔ細胞依存性の抗
体産生を抑制し、したがって免疫を抑制することができ
る。

【０００９】

【実施例】以下に実施例、実験例を示し、さらに本発明
を詳細に説明する。実施例１注射剤ベルノダリンを10％エタノール水溶液に５mg/ml の濃度
になるように溶解し、次いで、20倍量の滅菌生理食塩水
を加え混合し、0.22μm のフィルターで濾過滅菌し、２
mlずつバイアル瓶に分注し密栓した。

【００１０】実験例１本実験例は、実施例１で調製した注射剤を用い、ベルダ
リンのＴ細胞依存性抗体産生能に及ぼす効果を確認し
た。 (1) マイトージェンによるリンパ球増殖反応の測定（方法）ＤＢＡ／２マウス（雌、７週齢）の脾臓を摘出
し、単細胞浮遊液を無菌的に調製した。溶血後、10％牛
胎仔血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ−1640培地に１×10⁶
細胞／mlの濃度で浮遊させた。96ウェルプレートを用い
て、マウス脾細胞懸濁液(100μl)をコンカナバリンＡ
（Con A) 1μg/ml、あるいはリポ多糖（ＬＰＳ）40μg/
mlと等量混合し、これに実施例１で調製したベルノダリ
ン溶液を添加し、37℃、５％ＣＯ₂環境下で３日間培養
した。培養終了後、 0.5μCiのトリチウムチミジンを添
加し、37℃で６時間インキュベートした。その後、５％
トリクロロ酢酸不溶性画分をガラスフィルターにて得
て、これを液体シンチレーションカウンターで測定し、
トリチウムチミジンのＤＮＡへの取り込みを求めて細胞
増殖反応を調べた。

【００１１】（結果）ベルノダリンの添加量とトリチウ
ムチミジンの取り込みとの関係を図１に示した。ベルノ
ダリンのマイトージェンによる脾臓細胞の増殖反応に対
する効果は、１〜２μg/mlの濃度で抑制がわずかに認め
られたが、Ｔ細胞マイトージェンであるCon A 刺激によ
る脾臓細胞の増殖に対しては、ベルノダリンは１〜２μ
g/mlの濃度で顕著なトリチウムチミジンの取り込み抑制
を示した。またＢ細胞マイトージェンであるＬＰＳを用
いて脾臓細胞を刺激した場合、ベルノダリン濃度 0.5〜
１μg/mlでは取り込みが促進され、２μg/mlでは強い抑
制を示した。

【００１２】以上の結果から、ベルノダリンはＴ細胞特
異的抑制を示すことが確認された。 (2) Ｔ細胞非依存性抗体産生能の測定（方法）ＤＢＡ／２マウス（雌、７週齢）の脾臓を摘出
し、単細胞浮遊液を無菌的に調製した。溶血後、10％Ｆ
ＣＳ添加ＲＰＭＩ−1640培地で洗浄した細胞１×10⁶個
をベルノダリンと混合し、20μg のＬＰＳ存在下（総量
１ml) 、24ウェルプレートを用いて、37℃、５％ＣＯ₂
環境下で３日間培養した。培養終了後、脾臓細胞を１×
10⁷個／mlとなるように、無血清ＲＰＭＩ−1640培地で
再浮遊し、抗体産生細胞液とした。ＲＰＭＩ−1640−ア
ガロース液 400μl 、25％羊赤血球（ＳＲＢＣ）液50μ
l 、抗体産生細胞液50μl 、モルモット補体20μl を混
合し、プラスチックシャーレに薄く層にし、37℃で２時
間インキュベート後、プラーク形成細胞（ＰＦＣ）数を
測定した。また (1)と同様にトリチウムチミジンの取り
込みを測定し、細胞の生存性を確認した。

【００１３】（結果）Ｔ細胞非依存性抗体産生応答に対
するベルノダリンの効果を表１に示した。トリチウムチ
ミジンのDNA への取り込みは、ベルノダリン 1〜0.13μ
g/mlの濃度範囲でコントロールに対して 231〜861 ％を
示しており、顕著なＢ細胞の増殖が認められた。しかし
この細胞増殖に対し、抗体産生はコントロールの82〜44
％を示しており、用量依存的な抗体産生の抑制が認めら
れた。ＬＰＳによる脾臓細胞の抗体産生細胞への分化段
階にベルノダリンが抑制的に作用している可能性が考え
られた。（表１はＴ細胞非依存性抗体産生応答能とＤＮ
Ａ合成能の用量依存性を示す）。

【００１４】

【表１】

【００１５】(3) Ｔ細胞依存性抗体産生能の測定（方法）完全フロイントアジュバントと50％ＳＲＢＣ懸
濁液を等量混合してエマルジョンを作製し、ＤＢＡ／２
マウス（雌、７週齢）に 0.2mlを腹腔内投与して免疫し
た。３週間後に脾臓を摘出し、単細胞浮遊液を無菌的に
調製した。溶血後、10％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−1640培地
で洗浄した細胞１×10⁶個と、ＳＲＢＣ2.5×10⁶個に実
施例１で調製したベルノダリン溶液を加え、10％ＦＣＳ
添加ＲＰＭＩ−1640培地で総量を１mlとした。次いでシ
リコンコートしたガラス試験管中で37℃、５％ＣＯ₂環
境下で５日間培養した。培養終了後、脾臓細胞を５×10
⁷個／mlとなるように無血清ＲＰＭＩ−1640培地で再浮
遊し、抗体産生細胞液とした。ＲＰＭＩ−1640−アガロ
ース液 400μl、25％ＳＲＢＣ50μl、抗体産生細胞液50
μl、モルモット補体20μlを混合し、プラスチックシャ
ーレに薄く層にし、37℃で２時間インキュベート後ＰＦ
Ｃ数を測定した。

【００１６】さらにＰＦＣで用いた脾臓細胞懸濁液 200
μl を96ウェルプレートに分注し、0.5 μCiのトリチウ
ムチミジンを添加し、37℃で６時間インキュベートし
た。反応終了後、５％トリクロロ酢酸不溶性画分をガラ
スフィルターにて得て、これを液体シンチレーションカ
ウンターで測定し、トリチウムチミジンのＤＮＡへの取
り込みを求めて細胞傷害活性を調べた。

【００１７】（結果）Ｔ細胞依存性抗体産生応答に対す
るベルノダリンの効果を表２に示した。ベルノダリン１
μg/ml及び 0.5μg/mlの濃度のとき、抗体産生能はコン
トロールに対する抑制が98％と58％を示しており、顕著
な抗体産生抑制活性が認められた。またトリチウムチミ
ジンのＤＮＡへの取り込みは、コントロールに対し、80
％および42％に抑制されており、細胞数の減少がＰＦＣ
数の減少となって現れた。しかし、いずれの濃度におい
ても細胞数の減少よりも強くＰＦＣの減少が見られるた
め、Ｔ細胞依存性の抗原による抗体産生系に対しても、
ベルノダリンは抑制活性を示すことが確認された。（表
２はＴ細胞依存性抗体産生応答能とＤＮＡ合成能の用量
依存性を示す）。

【００１８】

【表２】

【００１９】実験例２本実験例では、実施例１で調製した注射剤を用い、ベル
ダリンのイン・ビボ抗体産生に及ぼす効果を確認した。（方法）ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、11週齢) １群３匹に
ベルノダリン注射剤を５、2.5、1.25および0.63mg/kg
の用量で、４日間連続して腹腔内投与を行い、最終日に
0.2ml の羊赤血球（濃度25％) で腹腔内免疫した。４日
後脾臓及び血清を採取し、脾臓は抗体産生能の測定に用
いた。

【００２０】脾臓細胞を５×10⁷個/ml となるように無
血清ＲＰＭＩ−1640培地で浮遊液を作製し、抗体産生細
胞液とした。ＲＰＭＩ−1640−アガロース液 400μl 、
25％ＳＲＢＣ50μl 、抗体産生細胞液50μl 、モルモッ
ト補体20μl を混合し、プラスチックシャーレに薄く層
にし、37℃で２時間インキュベート後、ＰＦＣ数を測定
した。

【００２１】また非働化した血清を96ウェルＵ底プレー
トにて0.15M 塩化ナトリウム添加リン酸塩緩衝液(pH7.
4) を用いて２倍系列希釈し、１％羊赤血球を同量添加
混合し、室温で一晩静置した。赤血球凝集の認められる
最終希釈率を求めて、その逆数を抗ＳＲＢＣ抗体力価と
した。

【００２２】（結果）イン・ビボの抗体産生試験系に対
するベルノダリンの効果を表３に示した。ベルノダリン
を５、2.5 、1.25および0.63mg/kg となるようにＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスに４日間連続して投与した場合、5mg/kg投
与群の抗体産生能がコントロールに対し58％を示してお
り、顕著な抗体産生抑制活性が認められた。また血清中
のＳＲＢＣに対する抗体力価を凝集反応で見たところ、
コントロールに対し71〜14％の抑制を示し、用量依存性
に抗体力価の減少が観察された。ベルノダリンの４日間
連続腹腔内投与においても体重の減少や異常解剖所見は
認められなかった。本発明免疫抑制剤は、きわめて安全
な薬剤であることが確認された。（表３はイン・ビボ抗
体産生応答能と赤血球凝集反応を示す）。

【００２３】

【表３】

【００２４】

【発明の効果】本発明の実施によりベルノダリンを有効
成分とする免疫抑制剤が提供される。本発明による免疫
抑制剤は、Ｔ細胞依存性抗体産生を抑制し、臓器移植や
免疫異常、自己免疫疾患の治療に使用することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】実験例１において、マイトージェンによるリン
パ球の増殖反応をトリチウムチミジンの取り込みを指標
として測定した結果を示すグラフである。図において、
マイトージェンは、Con A 0.5 μg/ml(-●-)、ＬＰＳ20
μg/ml(-■-)を使用した。マイトージェン非添加(-○-)
をコントロールとした。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の構造式：【化１】で示されるベルノダリンを有効成分とする免疫抑制剤。