JPH06141895A - フィブリノゲンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 トロンビン活性を有する蛋白及び磁性粒子を
含有してなるフィブリノゲン定量乾燥試薬と検体を混合
しその凝固時間を測定することにより検体中のフィブリ
ノゲンを定量する方法において、該乾燥試薬の粘度がそ
の最小値に対して１．０５倍〜２倍に上昇した点を終点
とし、検体を添加してから該終点までの時間を凝固時間
とすることを特徴とするフィブリノゲンの定量方法 【効果】 本発明のフィブリノゲン定量方法を用いた検
体中フィブリノゲン濃度の定量は、磁性粒子の運動シグ
ナルの負の傾斜を用いたフィブリノゲン定量方法と比し
て、定量範囲が広い。従って、磁性粒子の運動シグナル
の負の傾斜を用いてのフィブリノゲン定量方法における
定量範囲から外れたフィブリノゲン濃度を有する血漿を
希釈倍率を変えて再測定するという操作は現実的に不要
となった。さらに、本発明のフィブリノゲン定量方法を
用いてフィブリノゲンを定量した結果と従来の溶液試薬
を用いてフィブリノゲンを定量した結果との一致性は良
好であった。又、定量の再現性も好成績が得られ、より
信頼性のある測定を可能ならしめた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フィブリノゲン定量乾
燥試薬を用いたフィブリノゲンの定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フィブリノゲンの定量は、活性化部分ト
ロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間とともに血
液凝固能の異常・正常を調べる検査、あるいは出血多量
の患者等に対しての緊急検査として広く採用されている
検査項目である。

【０００３】従来のフィブリノゲン定量方法としては、
トロンビン試薬溶液を用いる方法とトロンビンを含有し
た乾燥試薬を用いる方法との２種の方法に大別される。

【０００４】トロンビン試薬溶液を用いたフィブリノゲ
ン定量方法で一般的に使用されているのは、Ｃｌａｕｓ
ｓによって見いだされたトロンビン時間法（Ｃｌａｕｓ
ｓＡ，Ｇｅｒｉｎｕｎｇｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｈｅ
ＳｃｈｎｅｉｏｍｅｔｈｏｄｅＺｕｒ Ｂｅｓｔｉｍ
ｕｎｇ ｄｅｓ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ，Ａｃｔａ
Ｈｅａｍａｔ，１７，２３７，１９５７）である。該ト
ロンビン時間法は、一定量のトロンビンによるフィブリ
ノゲンのフィブリンへの変換速度は主としてフィブリノ
ゲン濃度に依存することを利用したものである。

【０００５】該定量方法の測定法は、まず血漿を任意の
緩衝液に希釈し、この希釈液を予備加温後、トロンビン
を含む試薬溶液を加えて凝固時間を測るものである。該
測定法の終点は、透過光の減衰を検知する光学的測定あ
るいは粘度上昇を検知する物理学的測定で見いだす方法
がとられている。該測定法での凝固時間とは、トロンビ
ン試薬溶液を添加してから前出の終点までの時間を指
す。

【０００６】この定量方法及びこの定量方法に用いられ
るトロンビン試薬は広く世の中に受けいれられている。
しかし、トロンビン試薬を用いるフィブリノゲン定量方
法は、凍結乾燥されたトロンビン試薬を使用時毎に蒸留
水等で復元しなければならないこと（復元溶液は長期の
保存に耐えない。）、血漿希釈液を予備加温しなければ
ならないこと等で、測定するまでに時間を要するという
欠点があった。さらに検体の一度の希釈での定量範囲が
狭いため、定量範囲より低濃度のフィブリノゲンを含有
した血漿の場合は、希釈倍率を下げて再測定し、また、
定量範囲より高濃度のフィブリノゲンを含有した血漿の
場合は、希釈倍率を上げて再測定しなければならないと
いう欠点があった。

【０００７】一方、トロンビンを含有した乾燥試薬を用
いてフィブリノゲンを定量する方法は、近年になって考
えられたもので、特表平３−５０４０７６号公報にその
方法が示されている。該測定方法に用いられるトロンビ
ンを含有した乾燥試薬は、任意のトロンビン試薬溶液及
びプラスミノゲン試薬溶液とを混合し、さらに該混合液
に磁性粒子を添加した溶液を反応スライドに一定量分注
し、その後、凍結乾燥したものである。

【０００８】該乾燥試薬を用いた測定方法は、トロンビ
ンを含有した乾燥試薬を任意の反応保持手段上に置き、
次にトロンビンを含有した乾燥試薬に一定量の血漿を加
え、その直後に振動磁場と静止永久磁場の組合せをか
け、該トロンビンを含有した乾燥試薬中に含有される磁
性粒子を運動させ、磁性粒子の運動シグナルを光学的に
モニターするところに特徴がある。該運動シグナルの下
降及び上昇がトロンビンを含有した乾燥試薬内の粘度上
昇及び下降に対応していることを利用して血漿中のフィ
ブリノゲン濃度とプラスミノゲン活性化因子濃度を同時
に測定できる可能性を示唆している。即ち、血漿を添加
して直後に現れる磁性粒子の運動シグナルの負の傾斜の
大きさは血漿中のフィブリノゲン濃度に比例し、磁性粒
子の運動シグナルがプラトーに達してから再度上昇し始
める溶解開始時間は、血漿中のプラスミノゲン活性化因
子の濃度に反比例するとしている。尚、上記公報におい
て、該乾燥試薬を用いたフィブリノゲンの定量に関する
技術的手段、その効果についての具体的説明、及び溶液
試薬を用いた従来の定量方法との一致性等についての具
体的記載はなんらなされていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上記したようなトロン
ビンを含有した乾燥試薬を用いてフィブリノゲンが定量
できれば、測定するまでに時間がかかるという現状の問
題点は克服できる。しかし、本発明者が特表平３−５０
４０７６号公報に準じて、乾燥試薬を作製し、該乾燥試
薬と任意の血漿とを用いて測定した結果、得られる磁性
粒子の運動シグナルのの負の傾斜の大きさにあまり再現
性がみられないことがわかった。又、既知濃度のフィブ
リノゲンを含有する血漿を上記の方法で複数測定してみ
たところ、得られる磁性粒子の運動シグナルの負の傾斜
の大きさが血漿中のフィブリノゲン濃度に対応していな
い場合がかなりあることもわかった。

【００１０】従って、特表平３−５０４０７６号公報に
示されているトロンビンを含有した乾燥試薬並びに測定
方法を用いてのフィブリノゲンの定量は実際には困難で
あることが判明した。

【００１１】本発明者は、乾燥試薬中にトロンビン活性
を有する蛋白、磁性粒子の他にアミノ酸もしくはその塩
又は糖類を含有させると、血漿との溶解性が良好な乾燥
試薬が得られることを見い出した。該試薬を用いると得
られる磁性粒子の運動シグナルの経時的変化が再現良く
得られ、それによって、上記に示した磁性粒子の負の傾
斜の大きさからフィブリノゲンを定量する方法を用いた
場合でも一定の濃度範囲ではある程度定量が可能となっ
た。しかし、負の傾斜の大きさを計測する計測範囲を厳
密に規定しないと負の傾斜の大きさが血漿中のフィブリ
ノゲン濃度に対応しない場合があること、及び該計測範
囲を規定してもその定量可能な範囲は狭いということが
わかった。さらに、得られる負の傾斜の大きさが上記計
測範囲にかなり影響を受けるため、製造条件の微小な変
化が試薬の溶解性の微小な遅延につながった場合、得ら
れる負の傾斜の大きさに再現性が得られないことが多々
あることもわかった。

【００１２】従って、特表平３−５０４０７６号で報告
されている負の傾斜の大きさからフィブリノゲンを定量
する方法は現実には有効な定量手段とはいえない。

【００１３】本発明が解決しようとする課題は、上記従
来技術の欠点を補う新しい技術、即ち、フィブリノゲン
定量範囲が広く且つ再現性のよいフィブリノゲンの定量
方法の開発である。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記技術
課題を解決すべく、トロンビンを含有するフィブリノゲ
ン定量乾燥試薬及び該試薬中に含まれる磁性粒子の運動
シグナルを光学的にモニターできる血液凝固測定装置を
使用して鋭意研究したところ、磁性粒子の運動シグナル
の一定の範囲、即ち粘度上昇変化の一定の範囲を終点と
すると、検体を添加してから該終点までの経過時間は検
体中のフィブリノゲン濃度に極めて良い相関があること
をつきとめた。さらに、該経過時間をフィブリノゲン定
量に利用した場合、現状よりその定量範囲が拡大するこ
とを見いだし、本発明を完成し、ここに提案するに至っ
た。

【００１５】即ち、本発明は、トロンビン活性を有する
蛋白及び磁性粒子を含有してなるフィブリノゲン定量乾
燥試薬と検体を混合しその凝固時間を測定することによ
り検体中のフィブリノゲンを定量する方法において、該
乾燥試薬の粘度がその最小値に対して１．０５倍〜２倍
に上昇した点を終点とし、検体を添加してから該終点ま
での時間を凝固時間とすることを特徴とするフィブリノ
ゲンの定量方法である。

【００１６】本発明に使用するトロンビン活性を有する
蛋白及び磁性粒子を含有してなるフィブリノゲン定量乾
燥試薬は、特に限定されず、特表平３−５０４０７６号
公報で示されたフィブリノゲン定量乾燥試薬も使用でき
るが、試薬溶解性の優れているフィブリノゲン定量乾燥
試薬が好適に使用できる。即ち、トロンビン活性を有す
る蛋白、磁性粒子、及びアミノ酸もしくは塩又は糖類を
含有してなる試薬溶解性に優れるフィブリノゲン定量乾
燥試薬が好ましく採用される。

【００１７】上記フィブリノゲン定量乾燥試薬の調製方
法を例示すれば、トロンビン活性を有する蛋白を任意の
緩衝液に溶解し、次に、該溶解液に磁性粒子と添加剤と
してアミノ酸もしくはその塩又は糖類とを添加して最終
溶液とした後、該最終溶液を任意の反応スライドに一定
量分注し、凍結後、凍結乾燥する方法が採用できる。

【００１８】上記調製方法において使用する反応スライ
ドは、フィブリノゲン測定時、フィブリノゲン定量乾燥
試薬内の粘度上昇を磁性粒子の運動シグナルの減衰とし
て光学的にモニターできる反応スライドであれば、特に
限られるものではない。例示すると、図１及び図２に示
したような反応スライドが挙げられる。図１は、反応ス
ライドを上方から見た図である。図１の点線で囲んだ部
分が、フィブリノゲン定量乾燥試薬を調製するための最
終溶液の分注口と検体添加口とからなる主要部である。
主要部の構造を詳しく示したのが、図２である。白色の
ポリエステル板Ｃにまず、透明色のポリエステル板Ｂを
貼合わせ、次に、貼合わせた透明色のポリエステル板Ｂ
の上にさらに透明色のポリエステル板Ａを貼合わせて主
要部を構成する。フィブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶
液は、図１に示す分注口から注入され、Ｄの部分に該最
終溶液が充填される。この種の反応スライドを使用した
場合、通常上記のフィブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶
液を２０〜３０μｌ分注する。

【００１９】以下に述べるフィブリノゲン定量乾燥試薬
中の各構成成分の含量は、特に断わりがない限り、図１
及び図２に示した反応スライドを使用して最終溶液を２
５μｌ分注し、次いで凍結乾燥した場合のスライド１枚
当りの重量及び活性を示す。

【００２０】フィブリノゲン定量乾燥試薬に用いるトロ
ンビン活性を有する蛋白は、フィブリノゲンをフィブリ
ンへ変換できる蛋白を指す。この蛋白として牛由来トロ
ンビン、ヒト由来トロンビン、トロンビン様活性を有す
るヘビ毒蛋白等が知られているが、本発明においては、
その由来は限定されない。フィブリノゲン定量乾燥試薬
に含有されるトロンビン活性量は、特に限定されず、通
常０．０５ＮＩＨＵ以上で選べば良いが、０．５ＮＩＨ
Ｕ〜１．５ＮＩＨＵの範囲が好適である。ところで、上
記トロンビン活性を有する蛋白は、凍結乾燥品として一
般に販売され容易に入手できるので、これを用いるのが
簡便である。

【００２１】該乾燥試薬に用いる磁性粒子は、公知のも
のが何等制限なく使用できる。例えば、四三酸化鉄粒
子、三二酸化鉄粒子、鉄粒子、コバルト粒子、ニッケル
粒子、酸化クロム粒子等が挙げられるが、得られる磁性
粒子の運動シグナルの強度の点で四三酸化鉄の微粒子が
好適に使用される。 磁性粒子の粒子径は特に限定され
ず、通常平均粒子径０．０１〜１０μｍのものから選べ
ば良いが、０．１〜３μｍの平均粒子径のものが推奨で
きる。フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有される磁性粒
子の量は、特に限定されず、通常２×１０^ー6ｇ〜２×１
０^ー4ｇの範囲で選べば良いが、２×１０^ー5ｇ〜１．２×
１０^ー4ｇの範囲が好適である。

【００２２】該乾燥試薬に必要に応じて用いるアミノ酸
又はその塩としては、中性アミノ酸もしくはその塩，酸
性アミノ酸もしくはその塩、又は塩基性アミノ酸もしく
はその塩のいずれを使用してもよいが、フィブリノゲン
定量乾燥試薬に検体を添加した際の溶解性がより良好な
点及び得られる磁性粒子の運動シグナルがより再現性の
ある点で酸性アミノ酸又はその塩が好適に使用できる。
代表的な酸性アミノ酸またはその塩を例示すると、グル
タミン酸，グルタミン酸ナトリウム，アスパラギン酸，
アスパラギン酸ナトリウム等が挙げられる。また、中性
アミノ酸又はその塩としては、Ｌ−グリシン、Ｌ−グリ
シン塩酸塩、Ｌ−アラニン等が、塩基性アミノ酸又はそ
の塩としては、Ｌ−リジン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−ア
ルギニン等が挙げられる。乾燥試薬に含有されるアミノ
酸又はその塩の量は、０．０２ｍｇ〜１ｍｇの範囲で選
べばよいが、０．２ｍｇ〜０．８ｍｇの範囲が好適であ
る。

【００２３】同じく該乾燥試薬に必要に応じて用いる糖
類は、単糖類及び多糖類等の任意の糖類を選べば良い
が、得られる磁性粒子の運動シグナルがより再現性のあ
る点で単糖類が好適に使用できる。代表的な単糖類を例
示するとグルコース，フルクトース等が挙げられる。ま
た、多糖類としては、ショ糖、乳糖、デキストリン等が
挙げられる。乾燥試薬に含有される糖類の量は、０．０
２ｍｇ〜１ｍｇの範囲で選べばよいが、０．２ｍｇ〜
０．８ｍｇの範囲が好適である。

【００２４】乾燥試薬において、上記アミノ酸もしくは
その塩、又は糖類を使用しない場合は、試薬の溶解性が
悪くなり、その結果磁性粒子の運動シグナルが得られず
定量ができにくい傾向にある。また、これら以外の添加
物を使用した場合は、同様に試薬の溶解性が悪く磁性粒
子の運動シグナルが得られないケースがあり、運動シグ
ナルが得られたとしても試薬の溶解性にばらつきがみら
れ、その結果運動シグナルの経時変化に再現性がみられ
ず結局再現性良く正確な定量ができない。

【００２５】凍結乾燥に先立ち、トロンビン活性を有す
る蛋白、磁性粒子、及びアミノ酸もしくはその塩又は糖
類を含有させ調整する緩衝液は、ＰＨ６．０〜ＰＨ８．
０の間で緩衝作用があるものであれば特に限定されな
い。例示すれば、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨ７．
３５）又は２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．４）等が好
適なものとして挙げられる。

【００２６】上記必須成分を含む緩衝液溶液、即ちフィ
ブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶液の乾燥方法は、特に
限定されないが、得られる磁性粒子の運動シグナルの強
度やフィブリノゲン濃度と凝固時間との相関等の点から
凍結乾燥方法が好ましい。

【００２７】該凍結乾燥方法は特に限定されない。例示
すると、フィブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶液を図１
に示した分注口から反応スライドに分注した後、該反応
スライドをドライアイスや液体窒素で瞬間凍結する等の
一般的な凍結方法が使用できる。又、凍結された最終試
薬の乾燥法も特に限定されないが、前出の凍結した反応
スライドを真空状態で−３０℃から室温まで７時間から
１３時間かけて直線的に温度上昇させる方法が好まし
い。

【００２８】本発明でいう終点は、該乾燥試薬に検体を
添加してからの粘度が最小値に対して１．０５倍〜２倍
に上昇した点とすることが必須である。特に、再現性の
点から粘度がその最小値に対して１．４〜１．７倍に上
昇した点が終点として好適に採用される。終点が粘度の
最小値の１．０５倍未満では感度が低いし、その最小値
の２倍を越えると定量範囲が狭くなるという欠点を有す
る。

【００２９】尚、本発明の乾燥試薬の粘度変化のモニタ
ーは、該試薬中に含まれる磁性粒子を利用して行える。
該粘度変化のモニター方法は特に制限されない。モニタ
ー方法を具体的に例示すると、フィブリノゲン定量乾燥
試薬を任意の反応保持手段上に置き、次いで該試薬に一
定量の検体を加え、その直後に振動磁場と静止永久磁場
の組合せをかけ、試薬中に含有される磁性粒子を運動さ
せ、その磁性粒子の運動シグナルを光学的にモニターす
る方法が挙げられる。

【００３０】使用できる装置を例示すると、商品名ＣＧ
０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］，商品名ＣＯＡＧ−１［和光
純薬工業（株）販売］等が挙げられる。

【００３１】上記装置を利用する場合、乾燥試薬の粘度
変化に逆対応する磁性粒子の運動シグナルの経時変化が
得られる。この場合で本発明を説明すると、粘度の最小
値は乾燥試薬中の構成成分が全部溶解した点、即ち、検
体を添加してから直後に得られる磁性粒子の運動シグナ
ルのピーク値となる。ここで、運動シグナルのピーク値
をＸとし、粘度上昇が進行して、ある粘度に達した時点
のシグナル値をＹとすると、この時点の粘度上昇はＸ／
Ｙ倍となる。つまり、運動シグナルのピーク値に対し、
シグナル強度の減衰が（Ｘ−Ｙ）×１００／Ｘ（％）と
なった時点が粘度上昇がＸ／Ｙ倍になった時点に相当す
る。即ち、粘度がその最小値の１．０５倍となる点は、
磁性粒子の運動シグナルのピーク値に対して約５％減衰
した点に相当する（図３参照）。

【００３２】本発明でいう凝固時間は、検体を添加して
から上記終点までの時間を指す。得られる凝固時間は、
フィブリノゲン濃度に相関している。

【００３３】該凝固時間を利用しての血漿中ののフィブ
リノゲン定量法は特に限定されない。代表的な例を示す
と、まず、フィブリノゲン濃度が既知で且つ濃度の異な
る３種類の血漿を任意の希釈緩衝液に希釈し、該希釈液
を検体として使用し、上記の方法でそれぞれの血漿に対
応する凝固時間を得た後、それを基に検量線を作製す
る。次に、任意の血漿を前出と同じ希釈緩衝液に同希釈
倍率で希釈し、該希釈液を検体として使用し、上記の方
法でそれぞれの血漿に対応する凝固時間を得た後、前に
作製した検量線を使用して任意の血漿のフィブリノゲン
濃度を見いだす方法が挙げられる。尚、該方法に使用さ
れる検量線は両対数グラフでＸ軸をフィブリノゲン濃度
とし、Ｙ軸を凝固時間とした検量線が好適である。

【００３４】

【発明の効果】本発明の方法による検体中のフィブリノ
ゲン濃度の定量は、特表平３−５０４０７６号公報に示
されている磁性粒子の運動シグナルの負の傾斜を用いた
フィブリノゲン定量方法と比して、定量範囲が広い。従
って、磁性粒子の運動シグナルの負の傾斜を用いてのフ
ィブリノゲン定量方法における定量範囲から外れたフィ
ブリノゲン濃度を有する血漿を希釈倍率を変えて再測定
するという操作は現実的に不要となった。

【００３５】又、本発明の方法を用いてフィブリノゲン
を定量した結果と従来の溶液試薬を用いてフィブリノゲ
ンを定量した結果と極めて良く一致する。更に、定量の
再現性も好成績が得られ、より信頼性のある測定を可能
ならしめた。

【００３６】

【実施例】本発明を一般的に説明してきたが、以下の具
体的な実施例を参照することによりさらに理解できる。
ここに示す実施例は説明の目的だけのものであり、特記
しないかぎり限定の意図は有しない。

【００３７】実施例１ フィブリノゲン濃度と凝固時間
の相関性 使用するフィブリノゲン定量乾燥試薬は以下の方法で調
製した。

【００３８】トロンビン試薬（デイド社製）に純水を加
えて、１００Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作製した。
該水溶液と３．０％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和
物（和光純薬工業製）を含有した３０ｍＭＨＥＰＥＳ
（同仁化学製）緩衝液（ＰＨ７．３５）とを１：２に混
合した。さらに該混合液に最終濃度５ｍｇ／ｍｌになる
ように磁性粒子（レアメタリック社製）を添加混合し
て、凍結乾燥試薬用最終溶液とした。該最終溶液２５μ
ｌを図１、図２に示す反応スライドに分注した。該反応
スライドを液体窒素で瞬間凍結し、凍結後、凍結乾燥す
ることで、凍結乾燥試薬を作製した。凍結乾燥の条件
は、真空状態で、−３０℃から３０℃まで１３時間かけ
て直線的に上昇させる方法で行った。

【００３９】フィブリノゲンを定量する装置としては，
ＣＧ０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用した。

【００４０】上記フィブリノゲン定量乾燥試薬と血液凝
固測定装置ＣＧ０１とを使用して、得られる凝固時間と
フィブリノゲンの濃度との相関性を調べた。

【００４１】終点の検知方法及び凝固時間の認識方法
は、図３に示した磁性粒子の運動シグナルのピーク値に
対して３０％減衰した点を終点とし、検体を添加してか
ら該終点までの時間を凝固時間とする方法を採用した。
即ち、図３中のＡが終点であり図３中のＢが凝固時間で
ある。尚、上記の終点は、粘度上昇度１００／７０（約
１．４３）倍に相当する。

【００４２】凝固時間とフィブリノゲン濃度との相関性
を調べる方法は、以下のように行った。先ず、９００ｍ
ｇ／ｄｌのフィブリノゲンを含有するヒト血漿と、フィ
ブリノゲン欠乏ヒト血漿（ジョージキング社製）とを使
用して、３０〜９００ｍｇ／ｄｌまでのヒト血漿の希釈
系列を作製した。次いで、該希釈系列の血漿をそれぞれ
オーレン緩衝液（シグマ社製）で２０倍希釈した。そし
て、血液凝固測定装置ＣＧ０１に上記凍結乾燥試薬をセ
ットし、前出の希釈液２５μｌを添加し、上記の方法で
各々の希釈液の凝固時間を求める。最後に、両対数グラ
フのＸ軸をフィブリノゲン濃度とし、Ｙ軸を得られる凝
固時間としてデータをプロットし、作製したグラフに直
線性が見られるか否かで相関性の有無を調べ、又、プロ
ットがどの濃度から直線から外れるかで定量範囲を調べ
た。

【００４３】図４にフィブリノゲン濃度と得られる凝固
時間との相関図を示した。図４から、フィブリノゲン濃
度と凝固時間との間では直線関係が得られ、極めて良好
な相関があることが明確に認められる。又、図４の結果
は、血液凝固能検査で必要とされる５０〜８００ｍｇ／
ｄｌのフィブリノゲン濃度範囲の全領域が一度に定量で
きることを示している。

【００４４】比較例１ 従来法の負の傾斜法とフィブリ
ノゲン濃度との相関性 使用するフィブリノゲン定量乾燥試薬を実施例１の凍結
乾燥試薬とし、フィブリノゲンを定量する装置としてＣ
Ｇ０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用して、得られる負の
傾斜の傾きとフィブリノゲン濃度との相関性を調べた。

【００４５】負の傾斜の測定は次のように行った。図５
に示しているように、まず、運動シグナルのピーク値を
記録しておき（図５中のＡ）、次に運動シグナルがピー
ク値を達してから５秒後の運動シグナル値（図５中の
Ｂ）を記録し、最後に、両運動シグナル値を使用して１
秒間についての運動シグナルの変化量を負の傾斜として
算出した。即ち、今比較例での負の傾斜の計測範囲は磁
性粒子の運動シグナルがピークに達してからの５秒間
で、図５中の記号を用いて負の傾斜を表せば、（Ａ−
Ｂ）／５［カウント／ｓｅｃ］となる。

【００４６】負の傾斜とフィブリノゲン濃度との相関性
を調べる方法は、以下のように行った。先ず、８００ｍ
ｇ／ｄｌのフィブリノゲンを含有するヒト血漿と、フィ
ブリノゲン欠乏ヒト血漿（ジョージキング社製）とを使
用して、５０〜８００ｍｇ／ｄｌまでのヒト血漿の希釈
系列を作製した。次いで、該希釈系列の血漿をそれぞれ
オーレン緩衝液（シグマ社製）で２０倍希釈した。そし
て、血液凝固測定装置ＣＧ０１に上記凍結乾燥試薬をセ
ットし、前出の希釈液２５μｌを添加し、上記の方法で
各々の希釈液の負の傾斜を算出した。最後に、Ｘ軸をフ
ィブリノゲン濃度とし、Ｙ軸を得られる負の傾斜として
データをプロットし、作製したグラフに直線性が見られ
るか否かで相関性の有無を調べた。

【００４７】図６に検体中フィブリノゲン濃度と得られ
る負の傾斜との相関図を示した。図６からわかるよう
に、検体中フィブリノゲン濃度が高くなるにつれて、得
られる負の傾斜は大きくなるが、実施例１で示したよう
な直線性は得られない。従って、磁性粒子の運動シグナ
ルの負の傾斜を用いた検体中フィブリノゲン濃度の定量
は現実には困難であることが判明した。

【００４８】実施例２ 終点を変更した場合のフィブリ
ノゲン濃度と凝固時間の相関性 使用するフィブリノゲン定量乾燥試薬を実施例１の凍結
乾燥試薬とし、フィブリノゲンを定量する装置としてＣ
Ｇ０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用して、磁性粒子の運
動シグナルのピーク値に対する減衰の割合を変えて終点
をとった場合の検体中フィブリノゲン濃度と凝固時間の
相関性を調べた。

【００４９】終点として、得られる磁性粒子の運動シグ
ナルのピーク値に対して１０，２０，３０及び４０％減
衰した点を取り、検体を添加してから該終点までの時間
をそれぞれの凝固時間とした。尚、これらの点は、粘度
上昇度で表すと １００／９０（約１．１）倍，１００
／８０（１．２５）倍，１００／７０（約１．４３）
倍，１００／６０（約１．６７）倍に各々相当する。

【００５０】凝固時間とフィブリノゲン濃度との相関性
を調べる方法は、以下のように行った。先ず、６００ｍ
ｇ／ｄｌのフィブリノゲンを含有するヒト血漿と、フィ
ブリノゲン欠乏ヒト血漿（ジョージキング社製）とを使
用して１００〜６００ｍｇ／ｄｌまでのヒト血漿の希釈
系列を作製した。ついで、該希釈系列の血漿をそれぞれ
オーレン緩衝液（シグマ社製）で２０倍希釈した。そし
て、血液凝固測定装置ＣＧ０１に上記凍結乾燥試薬をセ
ットし、前出の希釈液２５μｌを添加し、上記の方法で
各々の希釈液の凝固時間を求める。最後に、両対数グラ
フのＸ軸をフィブリノゲン濃度とし、Ｙ軸を得られる凝
固時間としてデータをプロットし、作製したグラフに直
線性が見られるか否かで相関性の有無を調べた。

【００５１】図７にフィブリノゲン濃度と得られる凝固
時間との相関図を示した。図７のＡのグラフは磁性粒子
の運動シグナルのピーク値に対して１０％減衰した点を
終点とした場合の得られる凝固時間とフィブリノゲン濃
度の関係を示したグラフ、Ｂのグラフは磁性粒子の運動
シグナルのピーク値に対して２０％減衰した点を終点と
した場合の得られる凝固時間とフィブリノゲン濃度の関
係を示したグラフ、Ｃのグラフは磁性粒子の運動シグナ
ルのピーク値に対して３０％減衰した点を終点とした場
合の得られる凝固時間とフィブリノゲン濃度の関係を示
したグラフ、Ｄのグラフは磁性粒子の運動シグナルのピ
ーク値に対して４０％減衰した点を終点とした場合の得
られる凝固時間とフィブリノゲン濃度の関係を示したグ
ラフである。図７からわかる通り、本発明の粘度変化範
囲内で磁性粒子の運動シグナルのピーク値に対する減衰
の割合（粘度上昇度）を変えて終点を取った場合、得ら
れる凝固時間と検体中フィブリノゲン濃度との間にはす
べて極めて良好な相関性がある。

【００５２】実施例３ 凝固時間の再現性 使用するフィブリノゲン定量乾燥試薬を実施例１の凍結
乾燥試薬とし、フィブリノゲンを定量する装置としてＣ
Ｇ０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用して、凝固時間の再
現性を調べた。尚、終点の検知方法及び凝固時間の認識
方法は、実施例１の方法を採用した。

【００５３】試験方法は、まず、１５０ｍｇ／ｄｌ及び
４００ｍｇ／ｄｌのフィブリノゲンを含有する血漿をオ
ーレン緩衝液（シグマ社製）でそれぞれ２０倍希釈す
る。次ぎに、ＣＧ０１に上記試薬をセットし、前出の希
釈液２５μｌを添加し、２種の希釈液の凝固時間をそれ
ぞれ求めた。この操作を５回行い、再現性を調べた。

【００５４】結果を示したのが表１である。表１から、
得られる凝固時間には再現性が見られることが明白であ
る。

【００５５】

【表１】

【００５６】実施例４ 溶液状測定試薬を用いる従来方
法と本発明法との相関 ヒト血漿４１検体を用い、フィブリノゲン定量乾燥試薬
と本発明のフィグリノゲン凝固時間測定方法とを用いて
フィブリノゲンを定量した結果と溶液状の試薬を用いる
従来の方法でフィブリノゲンを定量した結果との一致性
を比較した。

【００５７】溶液状の試薬を用いる従来の方法を使用し
てのフィブリノゲンの定量は、試薬をデータファイ・フ
ィブリノゲン（デイド社製）とし、測定装置をＫＣ−１
０（アメルング社製）とし、データファイ・フィブリノ
ゲンの能書に示された方法で定量した。

【００５８】フィブリノゲン定量乾燥試薬と本発明のフ
ィブリノゲン凝固時間測定方法とを用いてのフィブリノ
ゲンの定量は、以下のように行った。使用するフィブリ
ノゲン定量乾燥試薬は、実施例１の凍結乾燥試薬を使用
し、フィブリノゲンを定量する装置として、ＣＧ０１
［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用して行った。尚、終点の検
知方法及び凝固時間の認識方法は、実施例１と同様な方
法をとった。

【００５９】まず、ヒト血漿をそれぞれオーレン緩衝液
（シグマ社製）で２０倍希釈した。次いで、ＣＧ０１に
上記凍結乾燥試薬をセットし、前出の希釈液２５μｌを
添加し、上記の方法で各々の希釈液の凝固時間を求め
る。最後に、実施例１の図４に示したグラフを検量線と
して使用して、得られる凝固時間から血漿中のフィブリ
ノゲン濃度を見いだす方法を使用した。

【００６０】図８にフィブリノゲン定量乾燥試薬と本発
明のフィブリノゲン凝固時間測定方法とを用いて定量し
たフィブリノゲン定量値と溶液状の試薬を用いる従来の
方法で定量したフィブリノゲン定量値の相関図を示し
た。

【００６１】図８から、フィブリノゲン定量乾燥試薬と
本発明のフィブリノゲン凝固時間測定方法とを用いて定
量したフィブリノゲン定量値と溶液状の試薬を用いる従
来の方法で定量したフィブリノゲン定量値とは良く一致
しており相関性が高いことが明白である。

【００６２】比較例２．終点を変更した場合のフィブリ
ノゲン濃度と凝固時間の相関性 使用するフィブリノゲン定量乾燥試薬を実施例１の凍結
乾燥試薬とし、フィブリノゲンを定量する装置としてＣ
Ｇ０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用して、磁性粒子の運
動シグナルのピーク値に対して本発明の粘度変化範囲外
の減衰割合の点を終点とした場合の検体中フィブリノゲ
ン濃度と凝固時間の相関性及び再現性を調べた。

【００６３】終点として、得られる磁性粒子の運動シグ
ナルのピーク値に対して，３％，３０％及び６０％減衰
した点を取り、検体を添加してから該終点までの時間を
それぞれの凝固時間とした。尚、これらの点は、各々粘
度上昇度１００／９７（約１．０３）倍，１００／７０
（約１．４３）倍，１００／４０（２．５）倍に相当す
る。

【００６４】凝固時間とフィブリノゲン濃度との相関性
を調べる方法は、以下のように行った。先ず、８００ｍ
ｇ／ｄｌのフィブリノゲンを含有するヒト血漿と、フィ
ブリノゲン欠乏ヒト血漿（ジョージキング社製）とを使
用して５０，９０，１００，２００，４００，６００，
８００ｍｇ／ｄｌの７種類のヒト血漿の希釈系列を作製
した。ついで、該希釈系列の血漿をそれぞれオーレン緩
衝液（シグマ社製）で２０倍希釈した。そして、血液凝
固測定装置ＣＧ０１に上記凍結乾燥試薬をセットし、前
出の希釈液２５μｌを添加し、上記の方法で各々の希釈
液の凝固時間を求める。尚、各々の血漿希釈液について
３回測定した。最後に、両対数グラフのＸ軸をフィブリ
ノゲン濃度とし、Ｙ軸を得られる凝固時間（３回測定の
平均値）としてデータをプロットし、作製したグラフに
直線性が見られるか否かで相関性の有無を調べた。図９
にフィブリノゲン濃度と得られる凝固時間との相関図を
示した。図８のＡのグラフは磁性粒子の運動シグナルの
ピーク値に対して３％減衰した点を終点とした場合の得
られる凝固時間とフィブリノゲン濃度の関係を示したグ
ラフ、Ｂのグラフは磁性粒子の運動シグナルのピーク値
に対して３０％減衰した点を終点とした場合の得られる
凝固時間とフィブリノゲン濃度の関係を示したグラフ、
Ｃのグラフは磁性粒子の運動シグナルのピーク値に対し
て６０％減衰した点を終点とした場合の得られる凝固時
間とフィブリノゲン濃度の関係を示したグラフである。
図中の点「・」は、３回測定の平均値であり、図中の縦
線は、３回測定の測定値の振れ幅である。

【００６５】図９から、磁性粒子の運動シグナルのピー
ク値に対して本発明の粘度変化範囲外である３％減衰し
た点を終点とした場合は、感度が低く、且つ同時再現性
が悪いため正確なフィブリノゲン定量ができない不具合
点があることがわかる。同様に、磁性粒子の運動シグナ
ルのピーク値に対して６０％減衰した点を終点とした場
合は感度は高いものの、２００ｍｇ／ｄｌ未満の血漿は
終点が取れず凝固時間が得られないため、定量範囲が狭
いという不具合点があることがわかる。

【００６６】図９から、感度が高く、定量範囲が広く、
且つ再現性も良好なものは、本発明に規定した粘度変化
範囲内の磁性粒子の運動シグナルがピーク値に対して３
０％減衰した点を終点とした場合であることが明白であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 フィブリノゲン定量乾燥試薬に使用する代表
的な反応スライドの例である。

【図２】 図１の反応スライドの部分分解図である。

【図３】 フィブリノゲン定量乾燥試薬を使用してフィ
ブリノゲン量に対応する凝固時間を得る場合の終点解析
方法を示した図である。

【図４】 図３の終点解析法を使用して得られる凝固時
間と血漿中フィブリノゲン濃度の関係を示した図であ
る。

【図５】 磁性粒子の運動シグナルの負の傾斜を算出す
る方法を表した図である。

【図６】 図５の方法で得られる負の傾斜と血漿中フィ
ブリノゲン濃度との相関性を示した図である。

【図７】 磁性粒子の運動シグナルのピーク値に対する
減衰の割合を変えて終点をとった場合の得られる凝固時
間とフィブリノゲン濃度との相関性を示す図である。

【図８】 本発明の方法でのフィブリノゲン定量値と従
来の溶液法でのフィブリノゲン定量値の相関図である。

【図９】 磁性粒子の運動シグナルのピーク値に対して
本発明と異なる減衰割合の点を終点とした場合の得られ
る凝固時間とフィブリノゲン濃度との相関性を示す図で
ある。

【符号の説明】

Ａ 透明樹脂板 Ｂ 透明樹脂板 Ｃ 白色樹脂板 Ｄ 試薬充填部

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トロンビン活性を有する蛋白及び磁性粒
   子を含有してなるフィブリノゲン定量乾燥試薬と検体を
   混合しその凝固時間を測定することにより検体中のフィ
   ブリノゲンを定量する方法において、該乾燥試薬の粘度
   がその最小値に対して１．０５倍〜２倍に上昇した点を
   終点とし、検体を添加してから該終点までの時間を凝固
   時間とすることを特徴とするフィブリノゲンの定量方
   法。