JPH06113852A - オリゴヌクレオチドを用いるイネ品種の識別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の配列からなるオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いて、ポリメラーゼチェイン反応によ
りイネ（ Oryza sativa L. ）植物のゲノムＤＮＡを増
幅し、該増幅ゲノムＤＮＡを電気泳動にて分離後、増幅
ゲノムＤＮＡの視覚検出を行なうことを特徴とするイネ
（ Oryza sativa L. ）品種の識別方法。 配列 5'−ＧＴＴＣＧＧＴＣＣＡＣ−3' 【効果】 本発明方法は、本発明で用いられるオリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼチ
ェイン反応を利用することにより、イネ（ Oryza sativa
L. ）品種をより簡便にかつ効率よく識別する効果を有
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチドを
用いるイネ（ Oryza sativa L. ）品種の識別方法に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、イネ（ Oryza sativa L. ）品種
の識別方法として、たとえば草丈、穂の形や大きさ、籾
の形や大きさ、玄米の形や大きさ、葉の形等の形態の差
異による方法、穂、籾、玄米、葉等の色の差異による方
法、出穂期、耐冷性、病虫害抵抗性、日長に対する反応
等の生理的特徴の差異による方法、アイソザイム、貯蔵
タンパク質等のタンパク質レベルの差異による方法が知
られている。一方、最近では、ＲＦＬＰ法（Restrictio
n Fragment Length Polymorphism)によるイネ（ Oryza
sativa L. ）品種の識別方法が、たとえば Z.Y.Wang a
ndS.D.Tanksley、GENOME、第32巻、第1113頁から第1118
頁（1989年）等に記載されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、形態、
色、生理的特徴の差異による方法では、実際に前記の形
質について調査可能になるまで栽培し、その品種の特徴
を調査するしかなかった。このため、大規模な栽培施設
や労力が要求され、栽培期間に相当する時間がかかるこ
とになる。また、タンパク質レベルの差異による方法で
は、品種を識別するのに十分な差異が得られにくく、ま
た経験や労力を要する。一方。ＲＦＬＰ法による識別方
法では、ゲノムＤＮＡの制限酵素処理、サザンブロット
ハイブリダイゼーション（標識ＤＮＡプローブとのハイ
ブリッド形成）等に非常に労力がかかる。したがって、
イネ（ Oryza sativa L. ）品種のより簡便なかつ効率
よい識別方法の開発が待ち望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の状
況を鑑み、よりすぐれたイネ（ Oryza sativa L. ）品
種の識別方法を見出すべく鋭意検討を重ねた結果、ある
特定の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用いて、ポリメラーゼチェイン反応を利用すること
により、イネ（ Oryza sativa L. ）品種のより簡便な
かつ効率よい識別方法を見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記の配列からなるオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼチェイ
ン反応によりイネ（ Oryza sativa L. ）植物のゲノム
ＤＮＡを増幅し、該増幅ゲノムＤＮＡを電気泳動にて分
離後、増幅ゲノムＤＮＡの視覚検出を行なうことを特徴
とするイネ（ Oryza sativa L. ）品種の識別方法（以
下、本発明方法と記す。） 配列 5'−ＧＴＴＣＧＧＴＣＣＡＣ−3'（以下、配列番
号１と記す。） を提出するものである。

【０００５】本発明方法は、たとえば、品種の純度検
定、保存中における変異株のチェック、係争裁定および
親子鑑定（Ｆ１植物検定を含む）等においてきわめて有
用である。すなわち、対象植物を充分成長するまでの長
期間栽培して所期の品種であるか否かを検定する手間を
省略して、前記の対象植物の種子、幼植物等の段階で直
ちに所期の品種であるか否かの検定を行なうことが可能
であり、これは品種の純度検査において検査の迅速・簡
素化、保存中における変異株のチェックにおいて原原種
生産・遺伝種子資源の保存状態の検査の迅速・簡素化、
登録品種の権利侵害があった場合の係争裁定において栽
培環境等で変化しない等の高度な証拠の提出の迅速化お
よび親子鑑定（Ｆ１植物検定を含む）において品種改良
の効率化、Ｆ１種子生産での品質管理の低コスト化にな
る。

【０００６】本発明方法においてイネ（ Oryza sativa
L. ）植物のゲノムＤＮＡは、たとえば最新農学実験の
基礎、東北大学農学部農学科編、1990 東京・（株）ソ
フトサイエンス社発行および生物化学実験のてびき ３
核酸の分離・分析法 泉美治ら共編 1986年京都・
（株）化学同人等に記載される通常のＤＮＡ抽出方法に
よって行なうことができる。具体的には、たとえば、供
試植物の緑葉等の組織を液体窒素中で磨砕する（種子を
用いる場合は、たとえば種皮を除いた後の組織を用いる
ことが望ましい。）。該磨砕物に臭化セチルトリメチル
アンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液を添加して、インキュベ
ート後、クロロホルム−イソアミルアルコールを加えて
よく混和する。遠心分離により水層を分離・回収し、こ
れにイソプロピルアルコールを加えて混和する。遠心分
離により沈澱部を回収後、たとえばＥＤＴＡ等含有の緩
衝液を加えて溶解し、RNase 処理する。処理後、フェノ
ール、フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコー
ル、クロロホルム−イソアミルアルコールの順序で溶媒
を置換する。置換処理後、エタノールを加えてよく混和
し、遠心分離によりゲノムＤＮＡを得る方法をあげるこ
とができる。

【０００７】本発明方法で用いられるオリゴヌクレオチ
ドは、たとえばβ−シアノエチルホスホアミダイト法や
チオホスファイト法を用いる市販の自動ＤＮＡ合成装置
によって得ることができる。

【０００８】本発明においてイネ（ Oryza sativa L.
）植物のゲノムＤＮＡの増幅は、本発明方法で用いら
れるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポ
リメラーゼチェイン反応により行なう。ポリメラーゼチ
ェイン反応は、変性工程、プライマーのアニーリング工
程およびＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程からなるＤ
ＮＡ複製サイクルを繰り返して行なう反応であり、たと
えばSaiki ら、Science、第 230巻、第1350頁から第135
4頁（1985年) やWilliamsら、Nucleic Acids Researc
h、第18巻、第22号、第6531頁から第6535頁（1991年)
等に通常の方法が記載されている。

【０００９】本発明において上記ポリメラーゼチェイン
反応として、たとえば、あらかじめ本発明オリゴヌクレ
オチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類の塩基（dATP、dT
TP、dCTP、dGTP）およびイネ（ Oryza sativa L. ）植
物のゲノムＤＮＡを加えた約1.0mM から約4.0mM 、好ま
しくは約1.5mM から約3.0mM の塩化マグネシウム等を含
有する増殖用緩衝液中で、約２０回から約５０回、好ま
しくは約２５回から約４０回ＤＮＡ複製サイクルを繰り
返して行なうことをあげることができる。さらに、ポリ
メラーゼチェイン反応における各工程は、たとえば下記
の条件等で行なうことができる。変性工程は、たとえ
ば、通常約９０℃から約９５℃、好ましくは約９４℃か
ら約９５℃で、約１分間から約３分間、好ましくは約１
分間から約２分間加熱することにより行なう。プライマ
ーのアニーリング工程は、たとえば、通常約３０℃から
約６０℃で、好ましくは約３５℃から約５５℃で、約１
分間から約３分間、好ましくは約１分間から約２分間プ
ライマーとインキュベートすることにより行なう。プラ
イマーは本発明オリゴヌクレオチドを単独で用いる、ま
たは併用することができる。ＤＮＡポリメラーゼによる
伸長工程は、たとえば、通常約７０℃から約７３℃、好
ましくは約７２℃から約７３℃で、約１分間から約４分
間、好ましくは約２分間から約３分間耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ処理すること等により行なう。耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼとしては、たとえば、宝酒造株式会社製の耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の市販のものをあげることが
できる。

【００１０】上記方法により得られた増幅ゲノムＤＮＡ
は、通常ＤＮＡの分離に用いられる電気泳動法によって
分離される。一般には、1000塩基対以下の短かいＤＮＡ
断片の分離では、約３％から約２０％のポリアクリルア
ミドゲルが、また、それ以上に長いＤＮＡの分離では約
0.2％から約２％のアガロースゲルをあげることができ
る。好ましくは、約１％から約２％のアガロースゲルが
適している。電気泳動に用いられる緩衝液としては、Tr
is−リン酸系（pH7.5-8.0)、Tris−酢酸系（pH7.5-8.
0)、Tris−ホウ酸系（pH7.5-8.3)等があげられ、好まし
くはTris−酢酸系をあげることができる。また必要に応
じて、ＥＤＴＡ等を添加することもできる。電気泳動の
条件としては、たとえば、１００Ｖ、４０分間および５
０Ｖ、８０分間等をあげることができる。サイズマーカ
ーとしては、ラムダＤＮＡを制限酵素Hind IIIによって
完全加水分解したもの、たとえば、宝酒造株式会社製の
市販のものを用いることができる。

【００１１】本発明方法において増幅ゲノムＤＮＡの視
覚検出としては、たとえば、エチジウムブロミド等のフ
ェナントリジン系の色素で、かつ核酸と相互作用するよ
うな物質を用いる染色法によって、ＤＮＡを検出する方
法をあげることができる。該染色法は、あらかじめ電気
泳動に用いられる緩衝液に、たとえば、終濃度として約
0.5μg/mlのエチジウムブロミド等の物質を加えておく
と、暗所で２５４nmまたは３６６nm等の紫外線をゲルに
照射することによって、電気泳動中でも、ＤＮＡとエチ
ジウムブロミドの結合体の赤色バンドを検出できるが、
通常、電気泳動終了後に、ゲルをエチジウムブロミド等
の物質の溶液に約１５分間から約６０分間浸してから暗
所で２５４nmまたは３６６nm等の紫外線をゲルに照射す
ることによって、ＤＮＡとエチジウムブロミドの結合体
の赤色バンドを検出する。結果、検出された増幅ゲノム
ＤＮＡの存在有無によってイネ（ Oryza sativaL. ）
品種を区別することが可能となる。必要に応じて電気泳
動によって分離された各種サイズ（分子量）の増幅ゲノ
ムＤＮＡの存在有無を組み合せることによってもイネ
（ Oryza sativa L. ）品種を識別することができる。
さらに、プライマーとして、本発明方法で用いられるオ
リゴヌクレオチドとイネ品種の識別に用いることのでき
る他のオリゴヌクレオチドの組み合せにより併用すれ
ば、より詳細で、正確な品種間の識別を可能にする。ま
た同定の精度または品種間の識別能力をさらに高める場
合、プライマーのアニーリング工程の温度、反応用緩衝
液中のマグネシウム濃度等のポリメラーゼチェイン反応
の条件を変化させて同一な挙動を示すか否かを調べるこ
とにより可能である。

【００１２】

【実施例】以下、実施例についてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例になんら限定されるもので
はない。

【００１３】実施例１ （ゲノムＤＮＡの抽出） イネ（ Oryza sativa L. ）品種として、黄金晴（ジャ
ポニカ、以下、品種番号１と記す。）、アケノホシ（ジ
ャポニカ、以下、品種番号２と記す。）、コシヒカリ
（ジャポニカ、以下、品種番号３と記す。）、日本晴
（ジャポニカ、以下、品種番号４と記す。）、関東１３
８号（ジャポニカ、以下、品種番号５と記す。）、オオ
チカラ（ジャポニカ、以下、品種番号６と記す。）、ト
ヨハタモチ（ジャポニカ、以下、品種番号７と記
す。）、Ｓ２０１（ジャポニカ、以下、品種番号８と記
す。）、Calrose 76（ジャポニカ、以下、品種番号９と
記す。）、天摩（ジャポニカ、以下、品種番号１０と記
す。）、科晴３号（ジャポニカ、以下、品種番号１１と
記す。）、雲粳２１号（ジャポニカ、以下、品種番号１
２と記す。）、台中６５号（ジャポニカ、以下、品種番
号１３と記す。）、Bahia(ジャポニカ、以下、品種番号
１４と記す。）、Lido（ジャポニカ、以下、品種番号１
５と記す。）、IRAT 13(ジャヴァニカ、以下、品種番号
１６と記す。）、Dubovsky 129（インディカ、以下、品
種番号１７と記す。）、トヨニシキ（ジャポニカ、以
下、品種番号１８と記す。）、Lokt-jan（ジャヴァニ
カ、以下、品種番号１９と記す。）、ＩＲ３６（インデ
ィカ、以下、品種番号２０と記す。）、青二矮（インデ
ィカ、以下、品種番号２１と記す。）、紅陽矮（インデ
ィカ、以下、品種番号２２と記す。）、密陽２３号（イ
ンディカ、以下、品種番号２３と記す。）、Krishna(イ
ンディカ、以下、品種番号２４と記す。）、Mahsuri(イ
ンディカ、以下、品種番号２５と記す。）、ＲＤ３（イ
ンディカ、以下、品種番号２６と記す。）、台中在来１
号（インディカ、以下、品種番号２７と記す。）、Chin
surah Boro II(インディカ、以下、品種番号２８と記
す。）、BG367-4(インディカ、以下、品種番号２９と記
す。）、Ｌ２０１（ジャヴァニカ、以下、品種番号３０
と記す。）、Kartuna(ジャヴァニカ、以下、品種番号３
１と記す。）、Mudgo(インディカ、以下、品種番号３２
と記す。）、Saji（ジャヴァニカ、以下、品種番号３３
と記す。）を用いた。上記のイネ（ Oryza sativa L.
）植物の各種品種の緑葉組織（生重量３ｇ）を細かく
切り刻んで、該組織片を約１００ｍｌの液体窒素中に１
分間浸し、凍結させた。該凍結物を乳鉢と乳棒を用い
て、液体窒素中で粉末状にした後、液体窒素を気化させ
た。得られた粉末をあらかじめ６０℃に保温しておいた
１０mlの２％(w/v) ＣＴＡＢ溶液に入れ、よく混合し
た。６０℃で、３０分間インキュベート後、さらに等量
のクロロホルム−イソアミルアルコール（クロロホル
ム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え、１５分
間振とう混合した。該混合物を遠心分離（１９４０ｇ，
１５分間）して得られる水層を回収して、これに０．７
倍量のイソプロピルアルコールを加え、振とう混合し
た。該混合物を遠心分離（１９４０ｇ，１５分間）して
得られる沈澱を回収した。５分間風乾させた後、これに
１ｍｌの１mM ＥＤＴＡを含有する２０mM Tris−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、懸濁した。沈澱が完全に
溶解した後、２．５ユニットの RNase（ベーリンガーマ
ンハイム社製）を加え、３７℃で、４５分間インキュベ
ートした。さらに１ｍｌのフェノールを加え、１０分間
振とうした。そして遠心分離（１９４０ｇ、１０分間）
によって得られた水層を回収後、これに０．５ｍｌのフ
ェノールと１ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコー
ル（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）
を加え、１０分間振とうした。これを遠心分離（１９４
０ｇ，１０分間）して得られた水層を回収し、次に１ｍ
ｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（クロロホル
ム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え、１０分
間振とうした。これを遠心分離（１９４０ｇ，５分間）
して得られた水層を回収し、次に０．１ｍｌの３Ｍ酢酸
ナトリウムおよび２．５ｍｌのエタノールを加え、数回
振とう混合した。遠心分離（１９４０ｇ、１０分間）に
よって得られた沈澱を回収後、該沈澱に１ｍｌの７０％
のエタノールを加え、洗浄した。６０分間風乾によりエ
タノールを除去して、イネ（ Oryza sativa L. ）植物
の各種品種のゲノムＤＮＡを約 １００μｇ得た。

【００１４】実施例２ あらかじめプライマーとして４０ピコモルの配列番号１
で示される配列からなる本発明方法で用いられるオリゴ
ヌクレオチド（宝酒造株式会社製委託合成物）、 2.5ユ
ニットの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社
製） 1.0ナノモルの４種の各々塩基（dATP、dTTP、dCT
P、dGTP）および 0.1μｇの実施例１で得られた各種の
イネ（ Oryza sativa L. ）品種のゲノムＤＮＡを加え
た0.01％ゲラチン、５０mMの塩化カリウム、 1.5mMの塩
化マグネシウムを含有する１０mMのTris−塩酸緩衝液(p
H8.3) 中で、ポリメラーゼチェイン反応を行なった。反
応液量は２０μｌとし、反応液の蒸発を防ぐために約２
０μｌのミネラルオイルを添加した。上記のポリメラー
ゼチェイン反応における各工程は下記の条件で行なっ
た。変性工程は９４℃で、５分間加熱し、プライマーの
アニーリング工程は５５℃で、２分間プライマーとイン
キュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は７
２℃で、３分間耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理する第１
サイクルを１回行なった後、変性工程は９４℃で、１分
間加熱し、プライマーのアニーリング工程は５５℃で、
２分間プライマーとインキュベートし、ＤＮＡポリメラ
ーゼによる伸長工程は７２℃で、３分間耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ処理する第２サイクルを４０回行ない、さら
に変性工程は９４℃で、１分間加熱し、プライマーのア
ニーリング工程は５５℃で、２分間プライマーとインキ
ュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は７２
℃で、１０分間耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理する第３
サイクルを１回行なう。得られた増幅ゲノムＤＮＡは、
1.5％アガロースゲルを用いて、１mM ＥＤＴＡを含有
する４０mM Tris−２０mM酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）中
で、５０Ｖ、８０分間電気泳動して分離した。その際に
サイズマーカーとして、宝酒造株式会社製のｐＨＹ Ｄ
ＮＡマーカーを用いた。分離終了後、ゲルを 0.5μg/ml
のエチジウムブロミド水溶液に３０分間浸漬してから暗
所で２５４nmの紫外線をゲルに照射することによって、
ＤＮＡとエチジウムブロミドの結合体の赤色バンドを検
出した。結果を表１〜３に示した。約 890、約 790bpの
増幅ゲノムＤＮＡが検出され、３３品種のイネ（ Oryza
sativa L. ）植物を４タイプに識別することができた。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】

【表３】 ＊ ＋：増幅ゲノムＤＮＡが検出された。 −：増幅ゲノムＤＮＡを検出できなかった。

【００１８】実施例３ ポリメラーゼチェイン反応におけるプライマーのアニー
リング工程を５５℃のかわりに４５℃で行なった以外は
実施例２と同様な試験を行なった。結果を表４〜６に示
した。約 950、約 900bpの増幅ゲノムＤＮＡが検出さ
れ、３３品種のイネ（ Oryza sativa L. ）植物を４タイ
プに識別することができた。

【００１９】

【表４】

【００２０】

【表５】

【００２１】

【表６】 ＊ ＋：増幅ゲノムＤＮＡが検出された。 −：増幅ゲノムＤＮＡを検出できなかった。

【００２２】実施例４ ポリメラーゼチェイン反応におけるプライマーのアニー
リング工程を５５℃のかわりに３６℃で行なった以外は
実施例２と同様な試験を行なった。結果を表７〜９に示
した。約1500、約 900bpの増幅ゲノムＤＮＡが検出さ
れ、３３品種のイネ（ Oryza sativa L. ）植物を４タイ
プに識別することができた。

【００２３】

【表７】

【００２４】

【表８】

【００２５】

【表９】 ＊ ＋：増幅ゲノムＤＮＡが検出された。 −：増幅ゲノムＤＮＡを検出できなかった。

【００２６】実施例５ （各種のオリゴヌクレオチドを
用いる品種の識別方法） 品種番号１から３３の各種のイネ（ Oryza sativa L.
）品種の種子からゲノムＤＮＡを実施例１に準じて抽
出し、本発明で用いるオリゴヌクレオチドを別々に用い
て、前記の実施例に準じて増幅ゲノムＤＮＡを検出す
る。検出される増幅ゲノムＤＮＡに基づき各種の本発明
オリゴヌクレオチドにおける品種タイプを区別し、さら
に該品種タイプから各種品種を識別する。結果、表１０
〜１２に示すように１０タイプに識別することができ
る。

【００２７】

【表１０】

【００２８】

【表１１】

【００２９】

【表１２】

【００３０】実施例１２ （品種の純度検査） 種子生産のために栽培された品種番号７（トヨハタモ
チ）のイネ（ Oryza sativa L. ）植物から種子を得
る。該種子５０粒を育苗培土をつめたポットに１粒ずつ
播種して温室内で栽培する。健全に生育した幼植物２０
個体から各々のゲノムＤＮＡを実施例１に準じて抽出
し、本発明で用いるオリゴヌクレオチドを用いて、実施
例２に準じて増幅ゲノムＤＮＡを検出する。検出される
増幅ゲノムＤＮＡと品種番号７のイネ（ Oryza sativa
L. ）品種が本来所有する増幅ゲノムＤＮＡ（約 790b
p）および所有しない増幅ゲノムＤＮＡ（約 890bp）と
の差異を調べる。結果、品種番号７のイネ（ Oryza sa
tiva L. ）品種が本来所有する増幅ゲノムＤＮＡ（約 7
90bp）および所有しない増幅ゲノムＤＮＡ（約 890bp）
と異なる増幅ゲノムＤＮＡが検出された供試種子は不純
物であり、この数より純度を算出することができる。な
お、純度検査の精度を高めるには複数のオリゴヌクレオ
チドを併用することにより可能である。

【００３１】実施例１３ （保存中における変異株のチ
ェック） 遺伝種子資源として保存された品種番号２８のイネ（ O
ryza sativa L. ）品種の種子５０粒から各々のゲノム
ＤＮＡを実施例１に準じて抽出し、本発明で用いるオリ
ゴヌクレオチドを用いて、実施例２、３および４の各々
に準じて増幅ゲノムＤＮＡを検出する。検出される増幅
ゲノムＤＮＡと品種番号２８のイネ（ Oryza sativa
L. ）品種が本来所有する増幅ゲノムＤＮＡ（約1500b
p，約 950bp，約900bp,約 890bp, 約790bp ）との差異
を調べる。結果、品種番号２８のイネ（ Oryza sativa
L. ）品種が本来所有する増幅ゲノムＤＮＡ（約1500b
p，約 950bp，約900bp,約 890bp, 約790bp ）と異なる
増幅ゲノムＤＮＡが検出された供試種子は変異株であ
り、この数より変異率を算出することができる。なお、
変異率の精度を高めるには複数のオリゴヌクレオチドを
併用することにより可能である。

【００３２】実施例１４ （係争裁定での利用） 登録品種の種子２０粒を育苗培土をつめたポットに１粒
ずつ播種して温室内で栽培する。健全に生育した幼植物
１０個体からゲノムＤＮＡを実施例１に準じて抽出し、
本発明で用いられるオリゴヌクレオチドを用いて、実施
例２、３および４の各々に準じて増幅ゲノムＤＮＡを検
出する。次に実施例５に準じて検出される増幅ゲノムＤ
ＮＡに基づき品種タイプを区別し、さらに該品種タイプ
から登録品種の識別タイプを決定する。イ号品種の種子
１０粒を育苗培土をつめたポットに１粒ずつ播種して温
室内で栽培する。健全に生育した幼植物５個体からゲノ
ムＤＮＡを実施例１に準じて抽出し、本発明で用いられ
るオリゴヌクレオチドを用いて、実施例２から４に準じ
て増幅ゲノムＤＮＡを検出する。次に実施例５に準じて
検出される増幅ゲノムＤＮＡに基づき品種タイプを区別
し、さらに該品種タイプから品種の識別タイプを調べ
る。結果、登録品種の識別タイプとイ号品種の識別タイ
プの比較により、同一品種であるかほぼ推定する証拠を
迅速に、精度よく、かつ環境等で変化ぜずに得るここと
ができる。なお、同定の精度をさらに高めるにはポリメ
ラーゼチェイン反応の条件をさらに変化させて同一な挙
動を示すか否かを調べることにより可能である。

【００３３】実施例１５ （親子鑑定での利用：Ｆ１植
物検定） 品種番号１７のイネ（ Oryza sativa L. ）品種を母親
とし、品種番号１８のイネ（ Oryza sativa L. ）品種
を父親として得られた植物の種子５０粒から各々のゲノ
ムＤＮＡを実施例１に準じて抽出し、本発明で用いるオ
リゴヌクレオチドを用いて、実施例２、３および４の各
々に準じて増幅ゲノムＤＮＡを検出する。検出される増
幅ゲノムＤＮＡと品種番号１７のイネ（ Oryza sativa
L. ）品種が本来所有する増幅ゲノムＤＮＡ（約1500b
p, 約950bp,約 900bp, 約890bp ）および品種番号１８
のイネ（ Oryza sativa L. ）品種が本来所有する増幅
ゲノムＤＮＡ（約 900bp, 約890bp,約 790bp）との差異
を調べる。結果、母親および父親由来の約 1500bp,約 9
50bp, 約900bp,約 890bp ,約 790bp の増幅ゲノムＤＮ
Ａを所有する供試植物が識別され、Ｆ１植物であること
を迅速に判定できる。

【００３４】

【発明の効果】本発明方法は、本発明で用いられるオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラー
ゼチェイン反応を利用することにより、イネ（ Oryza
sativaL. ）品種をより簡便にかつ効率よく識別する効
果を有する。

【配列表】

【００３５】配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTTCGGTCCAC 10

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の配列からなるオリゴヌクレオチドを
   プライマーとして用いて、ポリメラーゼチェイン反応に
   よりイネ（ Oryza sativa L. ）植物のゲノムＤＮＡを
   増幅し、該増幅ゲノムＤＮＡを電気泳動にて分離後、増
   幅ゲノムＤＮＡの視覚検出を行なうことを特徴とするイ
   ネ（ Oryza sativa L. ）品種の識別方法。 配列 5'−ＧＴＴＣＧＧＴＣＣＡＣ−3'