JPH0567159B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規な蛋白物質およびその蛋白物質を
有効成分とする抗腫瘍剤に関する。

［発明の背景］ 本発明者等は、先にトキソプラズマ原虫を物理
的に破砕することによつて得られる画分が生体内
において、インターフエロン（以下、IFNと略記
する。）を誘導する働きを見いだし、この知見に
基づいてIFN透導剤に関する特許出願（特開昭59
−27832号）を行つた。

すなわち、前記公開公報において、トキソプラ
ズマ原虫（以下、Tpと略記する。）を通常の超音
波破砕法、凍結乾燥法等によつて破砕し、これを
遠心分離（10000rpm以上、４℃程度）すること
によつて得た沈渣（虫体壁骨格画分）、および上
清を更に常法のゲル濾過法、膜濾過法等によつて
分子量分画して得た分子量が100000以上の水可溶
性画分、分子量が20000〜100000の水可溶性画分
ならびに分子量が4000以下の水可溶性画分から選
択される低毒性で生体内投与可能なIFN誘導剤に
係る発明を開示した。

本発明者等は、Tp水溶性成分中の生理活性物
質を精製単離すべく鋭意研究を継続した結果、超
高速遠心分離した上清成分として得られる分子量
分布の比較的狭い蛋白物質が優れた抗腫瘍作用を
有することを見いだし、本発明を完成した。

［発明の構成］ すなわち、本発明はトキソプラズマ原虫を物理
的に破砕した水溶性成分を100000G以上で遠心分
離し上清として得られる、主成分分子量が15000
〜20000の蛋白物質およびその蛋白物質を有効成
分とする抗腫瘍剤を提供したものである。

［製造方法］ 本発明に係る蛋白物質の作製原料としては、い
ずれのTp株をも使用することができるが、その
代表例としてトキソプラズマ・ゴンデイ
（Toxoplasma gondii）が挙げられる。Tpは、
通常入手されるものをそのまま用いてもよく、ま
たこれを常法に従い、動物体内でまたは組織培養
細胞で増殖させた後単離して用いることもでき
る。

Tpの物理的破砕は前記公開公報に記載されて
いるように常法に従い超音波破砕法および凍結融
解法を単独あるいは組み合せて行なうことができ
る。

すなわち、超音波破砕法による場合には、Tp
を例えば蒸溜水、生理食塩水やリン酸緩衝食塩水
（PBS）、塩平衡ハンクス液（（HBSS）等の適当
な緩衝液、好ましくは蒸溜水を用いて通常100
mg／ml（２×10⁹個Tp／ml）前後の溶液ないし希
釈液とし、これを４〜15℃の温度で３〜５分間程
度超音波処理することによつて行われる。また凍
結融解法による場合には、上記と同様にして調整
したTp含有液を、あらかじめ−20℃〜−80℃で
凍結し、次いで凍結物を約20〜37℃で融解する操
作を数回（通常５回程度）繰り返すことにより所
望の破砕物を収得することができる。

次いで、Tp破砕物中の不溶物を所望により遠
心（例えば、16000G、60分、４℃）等により除
去し、変性防止のために塩化ナトリウム溶液等を
加え等張とした後、100000G以上の超高速遠心
（例えば120分、４℃）を行うことによつて、上清
として主要成分分子量が15000〜20000のの本発明
の蛋白物質を溶液状態で得ることがきる。この蛋
白物質溶液は濾過滅菌を行い、適宜の濃度に調整
すればこれをそのまま、後述する抗腫瘍剤として
使用することができる。また真空凍結乾燥法等に
より単離して得られる粉末状の蛋白物質は、冷暗
所で保管することにより長期間その活性が維持さ
れる。

［本発明の蛋白物質とIFN誘起剤との関係］ 本発明の蛋白物質も特開昭59−27832号に開示
されているIFN誘導剤も、共にTpを物理的に破
砕して得られる蛋白物質である。

しかしながら、本発明の蛋白物質はTp破砕物
の水溶性成分を高速遠心分離し上清として得られ
る主成分分子量が15000〜20000の水に易溶性の成
分であるのに対し、特開昭59−27832号のIFN誘
導剤は、Tp破砕物の遠心分離（10000rpm以上、
４℃）沈渣および上清を更に常法により分子量分
画して得た分子量が100000以上、20000〜100000、
および4000以下のそれぞれ難溶性あるいは比較的
難溶性の成分である点で相違している。

したがつて、本発明の蛋白物質は、前記公報に
開示されている蛋白物質とは異なる新規な物質で
あると考えられる。

更に前記公開公報には、IFNを誘導する効果は
記載されているが、抗腫瘍作用についての具体的
な記載は全くない。

［抗腫瘍作用］ 本発明の蛋白物質は、マウスおよびラツトに対
する試験によつて、同種腫瘍、同系腫瘍および自
家腫瘍のいずれについても顕著な抗腫瘍作用を有
することが判明した。また免疫賦活物質オビオア
クチン（Obioactin、米国特許第4482543号参照）
の併用により相乗効果が認められた。

(1) 同種腫瘍に対する作用 (i) ICR／JCL系８〜12週齢雄マウス15匹の背
部皮下に、それぞれSarcoma180（Ｓ−180）
細胞１×10⁶cellsを移植した。このＳ−180担
癌マウスを５匹ずつの３群に分け、第１群を
対照とし、第２群に対してはＳ−180細胞移
植後１週間目ごとに、後記の実施例で製造し
た本発明の蛋白物質（トキソプラズマ溶解抗
原、以下、TLAと略記する。） 100μｇを軽質鉱物油（LMO）0.2mlの乳剤
として筋肉内投与し、第３群に対しては１週
目、２週目、４週目および５週目にオビオア
クチン40mg／Kgを併用して第２群と同様に
TLA乳剤を筋肉内投与した。これら３群の
マウスの腫瘍面積（長軸×短軸mm）を経時的
に測定したところ第１図に示すように、対照
群ａに比して、TLA単独投与群ｂでは著し
い増殖抑制効果を示し、７週目の生残率は対
照群の40％に対して100％であつた。

また第３群ｃは、第２群よりも更に顕著な
効果を示し、腫瘍細胞の生着阻止効果が認め
られた。

(ii) ICR／JCL系４〜５週齢雄マウス10匹に対
して、(i)と同様にしてＳ−180細胞を移植し
て担癌マウスを作製し、５匹ずつ２群に分
け、第１群を対照とし、第２群に対して(i)の
第２群と同様にＳ−180細胞移植１週目後か
ら毎週TLA100μｇのLMO（0.2ml）乳剤を筋
肉内投与し、腫瘍面積を経時測定して、第２
図ａ（対照群）、ｂ（TLA投与群）に示す結果
を得た。

４〜５週齢の若齢マウスではTLA単独の
投与でもかなりの生着阻止効果が認められ
た。

(2) 同系腫瘍に対する作用 BALB／c4週齢雄マウス20匹を３群に分け、
第１群を対照とし、第２群および第３群に
TLA100μｇのLMO（0.1ml）乳剤を、第２群につ
いては右大腿部筋肉内投与により、第３群につい
ては腹腔内投与により、２週間間隔で２回投与し
た。

初回のTLA投与後、４週目に同系マウスに
methylcholanthrene（MC）で誘発した腫瘍細胞
を５×10⁶MC−cells／ml含有するよう調整した
懸濁液0.2mlをマウス背部皮下に移植し、腫瘍面
積および生残率を測定し、第３図ａ（対照群）、ｂ
（大腿部筋肉内投与群）、ｃ（腹腔内投与群）に示
す結果を得た。すなわち、腫瘍細胞移植後３週間
ころから第２群および第３群に腫瘍細胞の増殖抑
制が認められ、この効果は筋肉内投与群（第２
群）でより顕著であり、生残率はMC−腫瘍細胞
移植後49日目で、第１群の20％に対し、第２群お
よび第３群では80℃であり、TLA投与群には有
意の延命効果が認められた。

(3) 自家腫瘍に対する作用 (i) Wistar系雄ラツト６〜８週齢10匹（150〜
200ｇ）の背部皮下にMC0.5mg含有パラフイ
ンペレツトをトラカールにて挿入し、５匹ず
つ２群に分け、第１群を対照とし、第２群に
に対してMC挿入と同時およびその後１か月
ごとにTLA0.5mg／bodyを生理食塩水溶液と
してラツト下肢大腿皮下に投与し、４〜６か
月間飼育して、腫瘍誘発状態を観察した。そ
の結果、第４図ｃに示すように対照群では第
１匹目の腫瘍発生から21日目ですべてのラツ
ト（100％）に腫瘍が発生したのに対し、
TLA投与群では腫瘍の発生率は40％であり、
腫瘍誘発の抑制効果が認められた。

(ii) (i)と同様にMC含有パラフインペレツトを
挿入して腫瘍を誘発させたラツトの中から、
腫瘍径が１cm以下（２×３mm）のものを10匹
選び出し、これらを５匹ずつ２群に分け、第
１群を対照とし、第２群に対して１週間ごと
にTLAを0.5mg／body投与し、腫瘍面積を経
時的に測定した。その結果、第４図ｂに示す
ように対照群に比較してTLA投与群には顕
著な腫瘍増大抑制効果が認められた。特に２
匹（40％）については腫瘍の増大はほとんど
停止した。

［急性毒性］ リツチフイールドおよびウイルコツクソン
（Litschfield ＆ Wilcoxon）の方法（Ｊ・
Pham.＆ Exp.Therapeutics，90，90，1949）
によりICR／JCL系成熟20ｇ雌マウス、各群３匹
に、それぞれTLA20、50、100、200、500、
1000、10000、50000μｇを１ml生理食塩水に溶か
し、腹腔内に投与したところ、投与後24時間では
いずれも死亡例を認めなかつた。

したがつて、LP₅₀値は腹腔内投与で2500mg／
Kg以上であるということができ、本発明の蛋白物
質の毒性は極めて低いことが明らかとなつた。

［抗腫瘍剤への適用］ 本発明の蛋白物質は、通常単独で水溶液あるい
は生理食塩水溶液として腫瘍細胞の転移抑制、生
着阻止の目的に使用することができる。

また、必要に応じて一般的に用いられているア
シユバントや各種の添加剤、例えば溶解補助剤、
軽質鉱油等の乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存
剤、着色剤等を添加した配合剤として使用するこ
ともできる。

本発明の抗腫瘍剤を投与される動物は特に制限
されず、ヒトのみならず例えばマウス、ラツト、
イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ
等の各種哺乳動物が対象となる。

これら動物およびヒトへの投与は通常の投与経
路、例えば筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与によ
り行うことができる。

投与量及び投与回数は動物種、投与経路、投与
目的（治療目的）等に応じて各回約1μｇ〜５
mg／Kgの範囲となるように適宜選択されるが、前
記のように有効成分である蛋白物質は極めて毒性
が低いので、投与量を厳密に管理する必要がない
ことも本発明の大きな利点である。

［実施例］ 本発明の蛋白物質を実施例により説明するが、
勿論本発明は下記の実施例の記載によつて限定さ
れるものではない。

実施例 TpRH株感染２日目のマウス腹腔内をハンク
ス緩衝液（HBSS）で洗浄し、その中に含まれる
Tpを遠心（750G、10分間、４℃）分離する。沈
渣に腹腔細胞などの夾雑物が含まれているので、
ナイロンメツシユカラムを用いて濾過し、可及的
に除去する。得られたTp虫体懸濁液をHBSS液
で３回遠心洗浄（750G、10分間、４℃）する。
沈渣のTp虫体を１ml当り２×10⁹個程度になるよ
うに滅菌蒸溜水を混和し、撹拌後、−70℃の冷凍
機を用いて凍結融解を３回繰り返す。ついで、超
音波処理（40W、１分間、Wakenyaku Cell
Disrupter Model Ｗ−220F）を５回行い、可及
的に虫体を破砕する。抽出溶解抗原から遠心
（16000G、60分間、４℃）で不溶物を除去し、得
られた上清に等量の1.7％塩化ナトリウム溶液を
加えて等張とする。

このように調整された等張液を超高速遠心
（144000G、120分間、４℃）して上清を採集し、
濾過滅菌を行つた後、真空乾燥して目的の蛋白物
質（TLA）を得、これを冷暗所に保存する。

このようにして調製単離されたTLAの理化学
的性質、その他の特性は下記のとおりである。

(1) 色および性状 淡黄色粉末状。

(2) 水溶性 易溶性。

(3) PH １重量％水溶液はPH6.4〜6.5を示す。

(4) 分子量および精製度 ゲル濾過法［GPC、カラム Gel−pack GL
−W550，10.7mmφ×300mm、溶離液PH７，
20mMリン酸緩衝液（500mM NaCl含有）、流
量1.0ml／min、日立高速液体クロマト装置655
型 UV280nm］を用いて既知物質による溶出
パターンからTLAの主成分分子量は15000〜
20000の範囲にあることが確認された。

部分精製度を検討するために、同一サンプル
をイオン交換クロマト法［カラム Gelpack
GL−K55D、８mmφ×100mm、ジエチルアミノ
基含有、溶離液Ａ：PH８、20mMトリス・塩酸
緩衝液、溶離液Ｂ：Ａ液＋500mM NaClで、
A100％→B100％のごとく30分間で完了するリ
ニアグラジエント法採用、流量1.0ml／min、
日立高速液体クロマト装置655型 UV200〜
300nm］で測定したところ、95％以上の純度で
単一ピークが認められた。

(5) 呈色反応 0.1重量％水溶液について、フエノール硫酸
反応、ローリンフオーリン法およびニンヒドリ
ン反応テストを実施したところ、いずれも陽性
であり、糖、ペプチド結合およびアミノ酸を含
有する蛋白物質であることが確認された。

(6) 蛋白含量 フオーリンローリー法に従い、カゼインを用
いて作成した検量線から、TLA中の蛋白含量
を求めたところ、約90％であつた。

(7) 紫外線吸収スペクトル 試料の0.1W／Ｖ％水溶液を調整し、日立紫
外線吸収スペクトロフオトメーター200−20型
で測定したところ、第５図に示すように260nm
付近に最大吸収、278nmに肩を有するスペクト
ルが得られた。

(8) 核酸含量 液体クロマトグラフ（日立655−Ａ型）によ
り、TLAは、主体としてヒポキサンチン、
UMP、AMPおよびGMPを少量（１％以下）
含有していることが判明した。

(9) 安定性 ４℃の恒温および室温にて、それぞれ６か月
放置したTLA（４℃…Ａ、室温…Ｂ）を溶解
し、PHおよび呈色反応試験を行つたが異常は認
められなかつた。

また、ＡおよびＢそれぞれ100μｇをLMO
（0.1ml）の乳濁液として、正常マウス３匹ずつ
に２回投与し、B.rodhainを１×10²／head接
種し、対照と比較したところ、対照正常マウス
３匹は11〜12日で死亡し、Ａ群およびＢ群はそ
れぞれ３匹のうち１匹が死亡し２匹が生残し
た。

すなわち、B.rodhain感染に対する免疫モジ
ユレーター作用で賦活作用は消失しなかつた。

更に、１重量％水溶液を37℃で１時間加温し
ても免疫賦活作用は消失しなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ，ｂおよびｃは、ICR／JCL系８〜10
週齢雄マウスの同種腫瘍（Ｓ−180）に対する本
発明の蛋白物質の抗腫瘍作用およびオビオアクチ
ンとの併用による作用を示すグラフであり、第２
図ａおよびｂは、ICR／JCL系４〜５週齢雄マウ
スについて同じくＳ−180に対する本発明蛋白物
質の抗腫瘍作用を示すグラフであり、第３図ａ，
ｂおよびｃは、BALB／ｃ雄マウスの同系腫瘍
（MC誘発腫瘍）細胞の生着に及ぼす本発明蛋白
物質の阻止作用を示すグラフであり、第４図ａお
よびｂは、Wistar系雄ラツトの自家腫瘍の誘発
および抑制に対する本発明蛋白物質の作用を示す
グラフであり、第５図は、本発明蛋白物質の紫外
線吸収スペクトル図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ トキソプラズマ原虫を物理的に破砕した水溶
   性成分を100000G以上で遠心分離し上清として得
   られる、主成分分子量が15000〜20000の蛋白物
   質。 ２ トキソプラズマ原虫を物理的に破砕した水溶
   性成分を100000G以上で遠心分離し上清として得
   られる、主成分分子量が15000〜20000の蛋白物質
   を有効成分とする抗腫瘍剤。 ３ オビオアクチンを併用する特許請求の範囲第
   ２項に記載の抗腫瘍剤。