JPH05508393A - 硝子体の酵素による辺縁部網膜剥離法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は硝子体網膜界面の酵素による破壊に関するものであり、そして特に外科 的な硝子体切除に伴う硝子体の酵素による辺縁部網膜剥離または完全な除去に関 するものである。

眼の容量の４１５を占めている連結組織部分である硝子体は眼の組織を構造的お よび代謝的に支持しており、そして眼内圧力の維持を助けながら同時に網膜への 光の到達を可能にしている。この構造体は前部ではレンズおよび毛様体上皮によ りそして後部では網膜により結合されている。硝子体は半一固体の高度に透明な ゲルとして存在しており、そして約９９％の水および１％のコラーゲンを含む高 分子類、ヒアルロン酸、多数の同定されていない可溶性グリコ蛋白質類、糖類お よび種々の低分子量代謝物からなっている。硝子体内の主要な構造蛋白質である ＩＩ型コラーゲンは非常に規則的でありそしてこの高度に希釈されたゲルの機械 的性質にとって必須である。寿命の最初の数年間は硝子体は高密度の皮質および 半流体の中央硝子体に区別されており、青年初期には硝子体の破壊が始まって、 液化された腔の生成および後半の年では硝子体ゲル内の原線維ストランドの生成 をもたらす。

硝子体と網膜との間の正常な解剖学的結合が多くの領域において生じているが、 正常な硝子体調膜付着に関する分子的基礎は依然としてわかっていない（図１参 照）。最も強い硝子体調膜付着の区域である硝子体基部は鋸状縁にまたがってお り、そして前部−後部経線中で約３．２ｍｍの測定値を有している（図１参照） 。それの前部境界には後部毛様体軸が付随しており、後部境界は鋸状縁から徐々 に赤道に向かって年令に応じて拡張している。硝子体基部の領域中の網膜基底板 とコラーゲン原線維との間の連結は正常人間では非常に強いため、それらを分離 しようとして硝子体を引っ張った時には、硝子体皮質が硝子体の残部から破れる かまたは網膜および毛様体の細胞の一部が眼壁から破れてしまう。

換言すると、結合は硝子体ゲル自身のものより機械的に強い。それより弱いが硝 子体調膜結合の他の区域が「皮質性の穴」の境界に存在しており、それらは眼の 円板（「乳頭周囲」）、窩の周り（「後部硝子体基部」、主要網膜器官に沿って 、および発生異常の視力を含んでいる。強い硝子体調膜結合の二次的部位はしば しば変性または炎症性病変の縁に現れて、網膜の表面上に牽引尖軸点を与え、そ れがしばしばそれの剥離をもたらす。

硝子体および／または付随する「膜」　（網膜周囲、線維性）の一部の外科的除 去である硝子体切除法が、もし治療しなかったら失明の可能性のある種々の病原 性、手術性、または手術後症状の治療または予防用に指示されている。典型的に は、硝子体切除法は正常な硝子体網膜界面に影響を与える合併症を伴って行われ る。これらの合併症は３種の基本的範躊に分けることかできる：１）硝子体と網 膜との間の二次結合の成長、例えば脈絡網膜の部位におけるまたは網膜血管新生 付近に成長するもの：２）部分的または完全な硝子体剥離を生じる網膜と硝子体 との間の正常な付着の損失、並びに３）硝子体網膜界面に沿っておよび／または 硝子体枠内での細胞状および／または線維状膜の生成。硝子体手術の指示は、増 殖性網膜症、合併される破裂性の網膜剥離、網膜周囲膜生成、二次的（病理学的 ）硝子体剥離、硝子体斑牽引、早産網膜症を伴う網膜剥離、硝子体出血、穿孔性 外傷、白内障除去、内眼球炎、持続性の増殖性−次硝子体並びに硝子体に二次的 に影響を与える多数の手術性および手術後合併症も包含している。はとんどの場 合の硝子体網膜病理学の主要な関心事は網膜破壊の発生でありそして最終的には 網膜剥離である。網膜剥離は、直ちに治療しないと、光受容細胞（電気刺激への 光刺激の導入に寄与する細胞）の死滅をもたらしそしてその結果視力の損失をも たらす。例えば、不完全な硝子体剥離の場合には、硝子体ゲルが光円板および／ または斑のところで網膜とそして硝子体基部と連結したままである。これらの付 着部位に伴う二次的な線維増殖が硝子体乳頭および／または硝子体斑牽引をもた らし、それらが網膜中の破壊を生じる可能性がある。

硝子体網膜異常の他の例である増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）は依然として網膜 剥離をもたらす最も悲惨な型の硝子体網膜疾病である。最も一般的である型のＰ ＶＲでは、網膜剥離後に網膜色素上皮細胞が硝子体骨路中に泳動しそしてその中 で増殖して、細胞（および線維細胞）膜の生成をもたらし、それが網膜を収縮さ せて破壊および／または網膜剥離をもたらす。これらのおよび他の膜の網膜表面 からの剥離および／または離層は硝子体切除法における標準的工程になっている 。しかしながら、これらの工程は大きな手術上の危険性を与えるものであり、そ して最も頻繁には網膜破壊および剥離を生じる。さらに、外科医が種々の道具を もって網膜表面に近づきすぎた時または丈夫な硝子体調膜付着部位において大き すぎる吸引力が硝子体にかけられた時に、網膜破壊は起きる可能性がある。

手術技術の継続中の開発および改良にもかかわらず、網膜破壊および剥離の発生 は主として硝子体調膜結合の基本的な機構および生物学にかかわる知識の欠如の ためにしばしば不可避である。異常な硝子体付着および収縮の原因を理解しよう とするなら、異常な硝子体調膜付着から生じる網膜剥離の予防および処置におけ る主な進歩には硝子体網膜界面上の詳しい解剖学的、生化学的および生理学的研 究が必要であろう。

先行技術は神経網膜、毛様体上皮および後部レンズ表面から眼の硝子体、Ｗ！膜 周囲膜および／または線維細胞膜を硝子体切除法の補助として効果的に確実に選 択的および完全に辺縁部網膜剥離する方法を開示していない。

ムールヘッド（Ｍｏｏｒｈｅａｄ）他（網膜（Ｒｅｔｉｎａ）、５　：　９８− １００，１９８５　；　Ａｒｃｈ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、　）、１０１　：　 ２６５−２７４．１９８３）は、除去前の線維膜の部分的消化にょる線維増殖性 組織および上皮膜の除去を促進させるためのバクテリア性コラゲナーゼ（クロス トリジオペブチダーゼＡ）を用いる酵素の助けを借りる硝子体切除法を開示して いる。

バクテリア性コラゲナーゼは線維膜の部分的消化により作用し、それにより硝子 体内線維増殖性組織の除去を促進させると言われている。

コープ（Ｃｏｐｅ）の米国特許番号４，１７４，３８９は、コラゲナーゼの投与 による哺乳動物の眼領域の硝子体中に置がれているコラーゲン原線維の選択的溶 解方法を開示している。コープ特許によると、硝子体がコラゲナーゼと接触した 時に相当な量の液化が起きる。

シェハブ（Ｓｈｅｈａｂ）他（Ｉｎｖｅｓｔ、　０ｐｈｔｈａｌｉｏｌ−ｖｉｓ 、　Ｓｃｉ、　５ｕｐｐｌ、、２７：３１７．１９８６）は、硝子体切除法全体 に必要な時間を測定することにより摘出したでの豚の眼の硝子体を液化するため のコラゲナーゼおよびコンドロイチナーゼＡＢＣを含む６種の酵素の有効性を開 示している。

ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）の米国特許番号４．６９６．８１６は、プロテオグリカ ン類および不規則的に分散されたコラーゲン繊維を含有している核髄質の選択的 な化学的髄核分解を生じる酵素コンドロイチナーゼＡＢＣまたはＡＣを使用する 人間における椎骨間円板の処置方法を開示している。

ヤマガタ（Ｙａｍａｇａｔａ）他（ケミカル・アブストラクツ（Ｃｈｅｗ、　Ａ ｂｓｔｒａｃｔｓ）、６８：８４５１１ｇ、１９６８）は、酵素コンドロイチナ ーゼＡＢＣがコンドロイチン硫酸類Ａ、Ｂ、およびＣをｐＨ８において選択的に 減成させることを開示している。

外科的な硝子体切除法の補助として硝子体の酵素による完全な除去または辺縁部 網膜剥離のための改良方法に関する要望が存在しており、該方法は硝子体網膜付 看に寄与する成分（類）の同定を基にしている。

発明の要旨 本発明の目的の中では、哺乳動物の眼の神経網膜、毛様体上皮および後部レンズ 表面から眼の硝子体、網膜周囲膜および／または付随している上膜を硝子体切除 法の補助として選択的および完全に辺縁部網膜剥離する方法の提供、硝子体調膜 付着においてフンドロイチン硫酸−含有プロテオグリカンが包含されているとい う発見に基づ（該方法の提供、並びに眼に悪影響を与えずに実施することができ る硝子体の改良された辺縁部網膜剥離方法の提供が挙げられる。他の目的の一部 は明白であろうしそして一部は以下で指摘されている。

簡単には、本発明は哺乳動物の眼の神経網膜、毛様体上皮および後部レンズ表面 から眼の硝子体、網膜周囲膜および／または線維細胞膜を硝子体切除法の補助と して選択的および完全に辺縁部網膜剥離する方法に関するものであり、該方法は 該眼に硝子体調膜付着部位に特異的に限局化されているコンドロイチン硫酸グリ コサミノグリカン／プロテオグリカンを破壊および／または減成させるのに適し ている有効量の酵素を投与しそしてそれにより該硝子体および／または網膜周囲 膜の完全な辺縁部網膜剥離を可能にすることからなっている。本発明を実施しそ してそのような完全な辺縁部網膜剥離を達成する際に使用するのに好適な酵素は コンドロイチナーゼＡＢＣである。

図面の簡単な説明 図１は、正常な硝子体網膜連合を描写している人間の眼の経線部分の図式的表示 である。硝子体と網膜との間の最も強い付着は硝子体基部（１および２と標識が 付いている）で生じ、それには鋸状縁（１）および毛様体軸（２）が付随してい る。それより弱い付着が周囲および中央網膜と硝子体（４）との間で、並びに硝 子体と後部レンズ被膜との間で生じる。さらに、強い付着部位が眼神経頭部（図 ６参照）および斑の周囲に存在している。図１の挿入図は、典型的な硝子体切除 法の結果を描写している図式的表示である。硝子体の大きなカフが硝子体基部の 領域中に残っており、硝子体のこの領域はこの領域中の硝子体と網膜との間の強 い付着のために除去できないことに注意すべきである。この残存硝子体はしばし ば骨格として作用し、その中に細胞が異常に泳動して、除去するために追加手術 を必要とする上皮膜を生成する。

図２−４は、抗−コンドロイチン硫酸抗体を用いて培養された猿の眼の鋸状縁お よび毛様体軸の蛍光顕微鏡写真である。組織を対照用の猿（図２Ａ−Ｂ）　、酵 素処置なしの硝子体切除された１１１（図３Ａ−Ｂ）、並びにコンドロイチナー ゼＡＢＣを用いる処置および硝子体切除法後の１（図４Ａ−Ｂ）から得た。対照 用の猿および酵素処置なしの硝子体が切除された猿の両者では、抗−コンドロイ チン硫酸の強い結合が硝子体基部中に鋸状縁および毛様体軸に沿って存在してい た。対照的に、酵素処置および硝子体切除法を受けた猿では抗−コンドロイチン 硫酸の結合がなかった。電子顕微鏡観察（示されていない）により、硝子体基部 が酵素処置を受けた猿では除去されていたが硝子体切除されたまたは対照用の猿 では除去されていなかったことを確認された。

図５−７は、対照用の猿の中央網膜中（図５）および眼神経頭部周辺（図６）の 硝子体網膜界面の蛍光顕微鏡写真である。抗−コンドロイチン硫酸の結合は弱い 硝子体調膜付着の領域である中央網膜に沿っては存在していない。対照的に、コ ンドロイチン硫酸の結合は網膜と硝子体の間の丈夫な結合領域である眼神経頭部 （乳頭領域）の周辺に存在している（矢印参照）。図７は、猿の眼からの中央網 膜の一部（図５と比較）を網膜周囲膜と共に描写している。網膜と網膜周囲膜と の間のコンドロイチン硫酸抗体の強い結合に注意すべきであり（矢印参照）、同 様な結合は正常な眼では観察されない（図５）。

図８および９は、対照用（図８Ａおよび９Ａ）とコンドロイチナーゼＡ、　Ｂ　 Ｃ処置を受けた（図８Ｂおよび９Ｂ）猿の眼の鋸状縁および毛様体軸の光顕微鏡 写真である。硝子体（ｖ；図８Ａおよび９Ａ）は芯硝子体切除法後にコンドロイ チナーゼＡＢＣ処置を受けていない眼では容易に見える。対照的に、コンドロイ チナーゼＡＢＣ処置を受けた眼では組織学的に検出可能な硝子体（Ｖ）は網膜（ Ｒ）に隣接して観察されず（図８Ａ）、酵素工程直後に部分された摘出眼ではコ ンドロイチナーゼＡＢＣ処置後の硝子体の不存在が見えた（図９Ｂ）。

図１０ＡおよびＩＯＢは、対照用（図１ＯＡ）およびコンドロイチナーゼＡＢＣ 処置された（図１０Ｂ）猿の眼からの硝子体基部領域中の猿の網膜（Ｒ）および 硝子体（Ｖ）の部分の透過電子顕微鏡写真である。

正常では硝子体が付随されているコラーゲン線維（矢印頭部、図１ＯＡ）は図１ ０Ａ中では容易に見えたが、硝子体が辺縁部網膜剥離された眼では見えなかった （図１０Ｂ）。硝子体が内部境界膜（矢印、図１０ＡおよびＩＯＢの両方）から 明白に適切に辺縁部網膜剥離されて内部境界膜は無傷のままであることに注意す べきである。

図１１は、抗−コンドロイチン硫酸抗体の培養後の１７週目の胎児からの網膜の 一部を描写している蛍光顕微鏡写真である。この人間発育の初期段階においてさ え、抗−コンドロイチン硫酸の強い結合が硝子体基部内で観察された。

図１２は、抗−コンドロイチン硫酸抗体を用いる培養後の硝子体基部領域中の成 人網膜の一部の蛍光顕微鏡写真である。硝子体基部内のコンドロイチン硫酸の強 い免疫限局化並びに結合強度が鋸状縁のすぐ後で減少することに注意すべきであ る。

図１３は、観察された全ての哺乳動物種（豚、牛、羊、鼠、兎、猿、人間）中で コンドロイチン硫酸プロテオグリカンと丈夫な硝子体調膜付着部位との連合を示 している犬の網膜の毛様体軸と連合された硝子体基部に対する抗−コンドロイチ ン硫酸抗体の結合を描写している蛍光顕微鏡写真である。そして、 図１４は、猿のレンズ被膜の後部面と連合された硝子体に対する抗−コンドロイ チン硫酸抗体の結合を描写している蛍光顕微鏡写真である。

好適態様の記載 本発明に従うと、コンドロイチン硫酸すなわち比較的大きい分子量のブロテグリ カンと結合されているグリコサミノグリカンが硝子体調膜付着に寄与する分子で あること、並びに硝子体がそのような硝子体調膜付着の部位に特異的に限局化さ れているフンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン／ブロテグリカンを破壊およ び／または減成させるのに適している酵素の投与により硝子体を選択的にそして 完全に辺縁部網膜剥離または除去できること、が見いだされた。コンドロイチン 硫酸ブロテグリカンが硝子体と網膜との開の丈夫な付着の領域に関連していると いう発見が硝子体調膜付着の領域中の特異的な化学的部分の存在の最初の認識に 寄与しておりそして丈夫な付着のこれらの部位からの硝子体の選択的なそして完 全な酵素による辺縁部網膜剥離または除去が可能になる。

コンドロイチン硫酸（グリコサミノグリカン／ブロテグリカン）に対して向けら れた単クローン性抗体を用いて、硝子体基部内および視神経頭部を循環している 硝子体調膜付着の部位におけるこの分子の強い限局化を同定した（図２−７参照 ）。抗体結合の分布は網膜と硝子体との間の最も丈夫な付着の領域であることが 知られている硝子体網膜界面の領域に直接対応しており、コンドロイチン硫酸が 正常な硝子体調膜付着の維持において機能し得ることを示している。この仮定は 、コンドロイチン硫酸−含有プロチクリカン類が他の細胞系中の細胞と細胞外マ トリックスとの間の付着に介在する細胞表面関連受容体として機能するという事 実により支持された。多くのグリカン側鎖が結合されている芯上白質からなるコ ンドロイチン硫酸プロテオグリカン類は細胞膜と、（１）疎水性断片を介する芯 上白質の血漿膜中への直接的挿入、（２）イノシトール−含有燐脂質への芯上白 質の共有結合、または（３）それ自体で一体性血漿膜せい船ある受容体に対する 芯上白質またはグリカン側鎖の非−共有結合を含む多数の方法で連合されている 。３種の配置のいずれでも、硝子体切除前または切除中のコンドロイチン硫酸（ 硝子体中）と網膜との間の結合を破壊させる能力により、（１）手術の全体的時 間を劇的に短縮でき、そして（２）硝子体の完全な除去を行うことができ、それ により硝子体切除法および硝子体の不完全な除去に伴う手術性および手術後の合 併症の大きい割合を相当減少させるという点で意義ある外科的進歩が供される。

他の系で細胞−細胞外マトリックス付着における役割を演じることが知られてい る分子であるコンドロイチン硫酸が硝子体と網膜との間の最も丈夫な付着の領域 と関連しているという私の発見は、硝子体調膜付着の領域中の特異的化学的部分 の存在を同定しそしてこれらの丈夫な付着の部位から硝子体を選択的に除去また は辺縁部網膜剥離するための知識を供するという研究に基づいている。以下に記 されている研究は、硝子体基部および正常な硝子体調膜付着の他の領域並びにそ れらに付随している強い抗−コンドロイチン硫酸−結合の領域は標準的な硝子体 切除法中に除去されなかったことを示している。さらに本発明に従うと、下記の 研究は硝子体切除法の補助として硝子体調膜付着の部位に特異的に限局化してい るコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン／プロテオグリカンを破壊および／ または減成させるのに適している有効量の酵素の投与により、眼の硝子体および ／または網膜周囲膜が眼の神経網膜、毛様体上皮および後部レンズ表面から選択 的にそして完全に辺縁部網膜剥離できるということを示している。以下に示され ている結果は、コンドロイチン硫酸の免疫反応性が完全になくそして硝子体基部 が完全に除去または辺縁部網膜剥離されることを示している（図４参照）。これ らの結果は、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン／プロテオグリカンが硝 子体調膜付着における主要な役割を演じることも支持している。さらに、酵素投 与後の光または電子顕微鏡によると網膜または毛様体毒性の兆候は見られなかっ た。

本発明の実施においては、硝子体調膜付着の部位に特異的に限局化しているコン ドロイチン硫酸グリコサミノグリカン／プロテオグリカンを破壊および／または 減成させるのに適しているいずれの酵素でも哺乳動物の眼の神経網膜、毛様体上 皮および後部レンズ表面から硝子体および／または上皮膜を完全に辺縁部網膜剥 離するために使用できる。使用される酵素はプロテアーゼを含まないグリコサミ ノグリカン類、例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ，コンドロイチナーゼＡＣ，コ ンドロイチナーゼＢ１コンドロイチン４−スルファターゼ、コンドロイチン６− スルフアターゼ、ヒアルロニダーゼおよびβ−グルクロニダーゼ、であることが できる。

本発明に従い硝子体および／または網膜周囲膜の完全な辺縁部網膜剥離を得るた めに必要な該酵素の投与量は処置時間により変動するであろう。一般的には、処 置期間が短ければ短いほど大量の酵素投与量が必要であろうし、そして逆もそう であり、全ての場合に適している有効投与量は網膜または毛様体毒性を避けるよ うなものである。最も広範には約１−１０．０００単位の酵素を使用することが できる。より好適には約１００−１０００単位の酵素が使用され、ここで単位は ３７℃、ｐＨ８゜Ｏにおいてコンドロイチン硫酸からの毎分１マイクロモルの不 飽和三糖類の生成に触媒作用を与える酵素の量であると定義されている。上記の 投与量は完全に辺縁部網膜剥離される１ミリリツトルの硝子体容量当たりの酵素 の単位としても示されており、そしてこれに基づくと例えば１ｒｎｌ当たり０． ０５−０．１単位程度の低さであることができる。また、示されている如く、処 置時間は使用される投与量により変動しそして例えば１分間程度の短さから数時 間までの期間の範囲であることができる。

酵素は薬学的に許容可能なまたは濃縮された量の酵素を緩衝溶液と混合すること により製造された適当な緩衝溶液の形状で投与することが好適である。例えば酢 酸ナトリウムもしくはトリス緩衝液の如き緩衝液またはしばしば硝子体切除法中 で使用されそしてテキサス州フォート・ワースのアルコンにより製造されている 均衡された塩溶液などの当技術に既知の適当な緩衝溶液を使用することができる 。本発明の実施において有用な酵素は約４．５−９．０のｐＨにおいて有効であ るが、約８のｐＨにおいて最大の有効性を示す。本発明の方法の実施において使 用される酵素の緩衝された溶液に関する好適なｐＨ範囲は従って約７−８である 。

酵素は当技術で既知の種々の投与方式により眼に投与することができる。これら には、眼に対する硝子体内、硝子体上、レンズ下および後眼房投与が包含される 。

以下に記されている研究の他に、別の研究を犬および解剖人間の眼でも行った。

両種とも、猿と同様に、コンドロイチン硫酸は丈夫な硝子体調膜付着の硝子体基 部内および他の部分内に特異的に限局化されているようである（図９−１１参照 ）。別の研究が猿および人間解剖の眼でも行われ、摘出眼のくさびはフンドロイ チナーゼＡＣ，コンドロイチナーゼＡＢＣ，またはコンドロイチン６−スルフア ターゼを含有しているリンゲル溶液中で培養された。これらの各酵素は種々の基 部に対する抗−コンドロイチン硫酸抗体の結合をなくしそして完全な辺縁部網膜 剥離を得た。

別の組の実験は抗−コンドロイチン硫酸免疫反応性が網膜と種々の病理学におい て成長する網膜周囲膜との間に存在しているかどうかの測定に関して行われた。

網膜周囲膜を有する１匹の猿（図７）および増殖性硝子体（ＰＶＲ）または網膜 周囲皮膜を有する多数の人間では、抗−コンドロイチン硫酸抗体の強い結合が膜 と網膜との間で観察された。これらの結果は、コンドロイチン硫酸が網膜と網膜 周囲膜との間の付着に介在しているかもしれないことを示唆していた。本発明の 実施によりこの付着を破壊させる能力はこれらの膜の外科的除去に一般的に伴う 重い合併症を軽減させることができる。

下記の実施例は本発明の詳細な説明するものである。

実施例１ 人間、猿、および豚の銀杯を、製造したでの１００ミリモルのカコジル酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ７，４）中４．０％ホルムアルデヒド中での１−４時間にわた る浸漬により、固定した。銀杯を削り、カコジル酸塩緩衝液中で最低６時間にわ たりすすぎ、ジョンソンおよびブランクスの処方（カレント・アイ・リサーチ（ Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、　）、３　：　９６９−９７４．１９８４） に従いアクリルアミド中に埋め込み、そして−２１°Ｃにおいて低温槽上で切断 した。数例では、固定しないで組織を直接アクリルアミドまたはＯ，Ｃ，Ｔ、埋 め込み媒体中に埋め込んだ。１ミクロン厚さの切片に関しては、銀杯を４．０％ のホルムアルデヒドで固定しそして２．０％のホルムアルデヒドおよび３．０％ のスクロースを含有しているカコジル酸塩緩衝液中に１−４週間貯蔵した。網膜 片にティッシュ・チク・Ｏ，Ｃ，Ｔ、埋め込み媒体中に設置されている２３モル のスクロースを浸潤させ、液体窒素中で急速凍結し、そして超ミクロトーム上で 寒冷切断装置を用いて切断した。

切片をコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン類またはプロテオグリカン類に 対する種々の単クローン性抗体に１−２時間にわたり室温において加湿環境中で 呈し、燐酸塩で緩衝された食塩水中で充分すすぎ、そして次に、適宜、蛍光−接 合山羊抗−ハツカネズミＩｇＧまたはＩｇＭに３０−６０分間にわたり同様な条 件下で呈し、再びすすぎ、そしてオリンパス・ヴアノクス顕微鏡上での蛍光上顕 微鏡法により試験した。

写真をコグツクトリーＸフィルム上で８００の露光指数を用いて製造した。

これらの研究の結果は、試験した全種において抗−コンドロイチン硫酸抗体が硝 子体基部および乳頭周囲領域と強く結合していることを示していた（図１−１３ 参照）。コンドロイチン硫酸抗体結合の分布はこれらの２種の組織間の最も丈夫 な付着領域であることが知られている硝子体網膜界面の領域に直接対応しており 、そしてコンドロイチン硫酸は従って最も強い硝子体調膜付着の領域中に存在し ていると同定される。

実施例２ コンドロイチン硫酸が硝子体調膜付着に含まれていることをさらに確認するため に、種々の年令の３匹の猿の右眼で標準的硝子体切除法を行って、上記のコンド ロイチン硫酸−結合領域が硝子体切除法中に除去されたかどうかを試験した。こ れらの動物の左眼は対照用として使用した。

これらの研究の結果は、正常な硝子体調膜付着の硝子体基部および他の領域並び に強い抗−コンドロイチン硫酸−結合のそれらの付随領域は、硝子体基部を除去 するために予定した作業を行った場合でさえも、標準的硝子体切除法中に除去さ れなかった（図３参照）。

実施例３ 標準的硝子体切除法により通常は除去されない強い硝子体調膜付着性領域が眼に プロテアーゼを含まないコンドロイチナーゼＡＢＣを注入することにより除去で きるかどうかを測定するために実験を行った。この酵素は標準的硝子体切除法後 に１匹の猿の右眼に注入された。酵素を含有している溶液は硝子体洗浄および摘 出前に２０分間そのままにされた。

眼は抗−コンドロイチン硫酸抗体を使用する光免疫細胞化学法並びに電子顕微鏡 法の準備がなされており、左眼は対照用として使用された。一般的な組織学およ び免疫細胞化学法を基にすると、結果はコンドロイチン硫酸免疫反応性が完全に なくそして硝子体基部が完全に辺縁部網膜剥離されたかまたは除去されたことを 示していた（図４参照）。さらに、光または電子顕微鏡によると硝子体または毛 様体毒性の兆候は観察され酵素の硝子体内注入後１時間で硝子体の硝子体基部お よび他の領域を毛様体上皮および神経網膜から完全に辺縁部網膜剥離するために 必要なプロテアーゼを含まないコンドロイチナーゼＡＢＣの最大および最小有効 投与量を制定するために研究を行った。年令が４オ一８才の健康で且つ眼の合併 症のない４匹のジノモロガス猿に対して工程を行った。全ての場合、猿は眼底鏡 法および超音波法で酵素工程の前および後の両者で試験された。

動物に麻酔をかけ、そして標準的硝子体切除工程を用いて６００μｍの硝子体芯 を除去した。４匹の猿のそれぞれにおける硝子体の除去量を２５Ｕ、１００Ｕ、 ｌｌ０Ｕ、１５０Ｕ、および２４０Ｕのプロテアーゼを含まないコンドロイチナ ーゼＡＢＣおよび０．０３Ｍ酢酸ナトリウムを含有している殺菌性の均衡された 塩溶液で交換した。全ての場合、生じた硝子体はそれぞれの猿の実験用の眼の中 で操作用顕微鏡を通して観察された。動物を１時間にわたり麻酔をかけ、注入さ れた酵素の停滞を防ぎ且つ周囲硝子体を酵素に呈するために頭を１５分毎に回転 させた。

１時間の酵素露呈後に、実験用および対照用の眼の両者を再び超音波法により試 験した。この工程の直後に、動物を殺害し、両眼を摘出しそして二分した。それ ぞれの眼の半分を通常の組織学／病理学用に４％バラホルムアルデヒド中で固定 させそしてそれぞれの眼の他の半分を一般的な透過電子顕微鏡を用いる観察用に １／２強度力ルノフスキー固定液中で固定した。４％バラホルムアルデヒド中で 固定されたそれぞれの眼の一部を、眼の組織上での酵素処理の推定される悪影響 の通常の組織学的観察用に使用した。全ての場合、右眼は対照眼として使用され そして実験用の眼と同じに処理された。

全体試験、眼底鏡法、音波写真法、通常の組織学／病理学、免疫細胞化学法およ び一般的な透過電子顕微鏡に基き、結果を以下の如（まとめることができる： １．２５ＵのコンドロイチナーゼＡＢＣを１時間の処置期間にわたり接種した猿 では、硝子体は部分的に辺縁部網膜剥離された。全体的には、硝子体基部領域中 の一部の硝子体は依然として鉗子により把握されていた。硝子体が残存している ことがさらに通常の組織学的菌株、抗−コンドロイチン硫酸抗体、および透過電 子顕微鏡により考証された。酵素処置の他の影響は眼ではみられず、網膜、網膜 色素上皮、光神経頭部、毛様体上皮、レンズ、および角膜は全て上記の工程後に 正常であった。

２．１００．１５０Ｕ、および２４０Ｕのプロテアーゼを含まないコンドロイチ ナーゼＡＢＣで処置された猿では、硝子体は１時間後に完全に辺縁部網膜剥離さ れた。通常は硝子体基部に存在している硝子体の密な集積を得ることはできず、 そして硝子体に付随した分子および構造体は通常の組織学的観察、抗−コンドロ イチン硫酸抗体または透過電子顕微鏡によっては検出されなかった。全ての他の 眼の構造体はこれらの２個の眼では正常であった。

実施例５ ５匹のジノモロガス猿を使用し、猿に１０．２０．５０、および１００Ｕのプロ テアーゼを含まないコンドロイチナーゼＡＢＣを接種させて、実施例４を繰り返 した。下記の改変以外は実施例４と同じ工程を使用した。注入用に使用された均 衡された塩溶液は３７℃にあらかじめ暖められておりモして０゜０３Ｍ酢酸ナト リウムに調節されていた。−実験では、プロテアーゼを含まないコンドロイチナ ーゼＡＢＣをトリス酢酸塩緩衝液でな（むしろ均衡された塩溶液中で希釈したが 、結果における差異は見られなかった。酵素による辺縁部網膜剥離の前および後 に硝子体試料を集めた。これらの留分中の蛋白質は、辺縁部網膜剥離工程の前お よび後に蛋白質特徴を比較するために、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動により分離された。１個の眼では、酵素を気体−流体交換技術により加えて他 の酵素分配方法を研究した。硝子体内容物が絶えず確実に撹拌されているように するために、頭部を実施例４より頻繁に回転させた。コンドロイチナーゼＡＢＣ の純度は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法および蛋白質加水分解法に より試験されたが、プロテアーゼ活性の証拠は使用された酵素中では見られなか った。

全体試験、眼底鏡法、音波写真法、通常の組織学／病理学、免疫細胞化学法およ び一般的な透過電子顕微鏡に基き、結果を以下の如（まとめることができる： １．１０Ｕ、２０Ｕ、および５０ＵのコンドロイチナーゼＡＢＣを接種した猿で は、硝子体は部分的に辺縁部網膜剥離された。しかしながら、全ての場合、後部 硝子体および前部硝子体はそれぞれ後部網膜および後部レンズ表面から剥離され ていた。しかしながら、硝子体は硝子体基部の一部領域に結合されて残存してい た。酵素処置の他の影響はこれらの眼ではみられず、これらの動物においては網 膜、網膜色素上皮、光神経頭部、毛様体上皮、レンズ、および角膜は全て上記の 工程後に正常であった。

２、猿を１００Ｕのプロテアーゼを含まないコンドロイチナーゼＡＢＣで処置し た。これらの動物の１匹では硝子体が１時間の処置後に完全に辺縁部網膜剥離さ れたが、他の猿ではそうでなかった。多分、後者は酵素の眼への注入前にそれを 濾過しようとする試みのためであり、そして硝子体を辺縁部網膜剥離するための この投与不能性によるものではなかった。他の眼では、硝子体は辺縁部網膜剥離 され、硝子体に付随した分子および構造体は通常の組織学的観察、抗−コンドロ イチン硫酸抗体または透過電子顕微鏡によっては検出されなかった。全ての他の 眼の構造体はこれらの眼では正常であった。

実施例６ １０．１５．２０．３０、および４５分間の処置期間後に２００Ｕのプロテアー ゼを含まないコンドロイチナーゼＡＢＣを投与して実施例４および５の工程を繰 り返して、下記の結果を得た。

１０分間の処置期間に関しては硝子体は辺縁部網膜剥離されず、そして１５分間 の処置期間に関しては硝子体は部分的にだけ辺縁部網膜剥離された。

２０．３０、および４５分間の処置期間に関しては硝子体は完全に辺縁部網膜剥 離された。

実施例７ ２時間の処置期間後に７５Ｕのプロテアーゼを含まないコンドロイチナーゼＡＢ Ｃを投与して実施例４および５の工程を繰り返して、硝子体の完全な辺縁部網膜 剥離を得た。

穿刺後に硝子体内に注入された２０Ｕのプロテアーゼを含まないコンドロイチナ ーゼＡＢＣの投与は、レンズ転位、大量の眼窩浮腫、および網膜剥離を生じた。

実施例８ ３０分間の処置期間にわたり４０Ｕのβ−グルクロニダーゼを死後くさびに投与 して実施例４および５の工程を繰り返して、硝子体の部分的な辺縁部網膜剥離を 得た。

９０分間の処置期間にわたるそれぞれ３５ＵのカテプシンＡＳＢ、およびＤの投 与は硝子体の辺縁部網膜剥離を生じなかった。

３０分間の処置期間にわたりそれぞれ４０ＵのヘパリチナーゼＩおよびＨを死後 くさび投与すると、硝子体の部分的な辺縁部網膜剥離を得た。

上記を考慮すると、本発明のいくつかの目的が達成されそして他の有利な結果が 得られた。

本発明の範囲から逸脱しない限り上記の方法では種々の変更を行うことができる ので、以上の記載中に含まれているかまたは添付図面中に示されている全ての事 柄は説明用と解釈すべきでありそして限定用の意味で解釈すべきではない。

図、４Ａ 図、５ ＦＩＧ、８Ａ ＦＩＧ、８Ｂ ＦｔＧ、９Ｂ Ｂ −鯖−−卒−−■噂−−−―−−伊＋−―−−−−φ−−■――−−１−−−− ９偶−１−１Ｆ１Ｇ、１０Ａ ＦＩＧ、ｔＯＢ ０Ｂ ＦＩＧ、ｌＩ Ｆ　ｉ　０．１２ 要　約 哺乳動物の眼の神経網膜、毛様体上皮および後部レンズ表面から眼の硝子体、網 膜周囲膜および／または線維細胞膜を硝子体切除法の補助として選択的および完 全に辺縁部網膜剥離する方法において、誤録に硝子体調膜付着部位に特異的に限 局化されているコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン／プロテオグリカンを 破壊および／または減成させるのに適している有効量の酵素を投与しそしてそれ により該硝子体および／または網膜周囲膜の完全な辺縁部網膜剥離を可能にする ことからなる方法。

国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の眼の神経網膜、毛様体上皮および後部レンズ表面から眼の硝子体 、網膜周囲膜および／または線維細胞膜を硝子体切除法の補助として選択的およ び完全に近縁部網膜剥離する方法において、該眼に硝子体網膜付着部位に特異的 に限局化されているコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン／プロテオグリカ ンを破壊および／または減成させるのに適している有効量の酵素を投与しそして それにより該硝子体および／または網膜周囲膜の完全な近縁部網膜剥離を可能に することからなる方法。
2. ２．該酵素がプロテアーゼを含まないグリコサミノグリカナーゼである、請求の 範囲１に記載の方法。
3. ３．該酵素がプロテアーゼを含まないコンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチ ナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチン４−スルファターゼ、コン ドロイチン６−スルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、およびβ−グルクロニダー ゼからなる群から選択される、請求の範囲２に記載の方法。
4. ４．該有効量が約１−１０，０００単位の間の該酵素である、請求の範囲１に記 載の方法。
5. ５．該有効量が約５０−１０００単位の間の該酵素である、請求の範囲１に記載 の方法。
6. ６．該酵素を該眼に硝子体内、硝子体下、レンズ下または後眼房投与により投与 する、請求の範囲１に記載の方法。
7. ７．該酵素を薬学的に許容可能な緩衝溶液の形状で投与する、請求の範囲１に記 載の方法。
8. ８．該溶液が酢酸ナトリウムで緩衝されている、請求の範囲７に記載の方法。
9. ９．該酵素がコンドロイチナーゼＡＢＣである、請求の範囲３に記載の方法。