JPH05506569A - 細胞毒性細胞特異性プロテアーゼ関連分子及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞毒性細胞特異性プロテアーゼ関連分子及び方法発明の背景 これは１９８７年１月１３日付で出願された同時係属出願第００２，９６０号の 一部継続である。

本発明はプロテアーゼ阻害剤に関する。

胸腺由来（Ｔ）リンパ球は免疫系において主要な役割を果たす。Ｔ細胞系の成熟 は３つの異なる段階＝　（ａ）多分化能性幹細胞からＴ細胞前駆体の産生、（ｂ ）胸腺における分化及び（ｃ）末梢組織への成熟細胞の移動からなる。胸腺内に おけるＴ細胞の成熟は非抗原依存性である。しかしながらそれらが胸腺を出ると 、抗原との相互作用でそれらは分化の最終ステップに移行して成熟細胞になる。

これらの最終ステップは複雑であって、他の細胞及び可溶性エフェクター分子と の相互作用を伴う。

いくつかの部分組のＴ細胞が活性化された末梢Ｔ細胞の中から認識された。３種 の主なりラス：ヘルパー、サプレッサー及び細胞毒性がある。ヘルパーＴリンパ 球は細胞−細胞接触又は因子の合成及び分泌のいずれかにより免疫応答（体液性 及び細胞性の双方）を増強する。これらの因子は、抗原特異性シグナルに応答し て合成されるが、抗原特異性又は非抗原特異性のいずれかである。

サプレッサーＴリンパ球は再び直接的に又は可溶性因子を介していずれかで他の Ｔリンパ球の機能を阻害する。

細胞毒性１９２６球は細胞性免疫反応におけるエフェクター細胞である。それら は細胞の表面における外来抗原を特異的に認識し、それらと結合し、標的細胞を 溶解させる。細胞毒性１９２６球はりウマチ様関節炎のような自己免疫疾患を引 き起こすか又は悪化させることが知られており、同種移植片拒絶及び移植片対宿 主疾患にも関与している。

細胞毒性Ｔリンパ球誘導溶解のプロセスにおける様々なステップは、例えばＢｅ ｒｋｅ、（１９８３）　Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．Ｒｅｖ、７２：５：Ｎａｂｈｏｌｚ 　＆　ＭａｃＤｏｎａｌｄ、（１９８３）　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｉａ＋ｕｎｏ１ ．ｌ：２７３で一部詳細に分析された。Ｐａｄａｃｋ　＆　Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒ ｇ、（１９８４）Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１８０：６９５及びＨｅｎｋａｒｔ　ｅ ｔ　ａｌ、、＜１９８４）　Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、１８０ニア５による最近の研究では、ＣＴＬ及びナチュラルキラー細胞 でみられる濃細胞質顆粒が経膜チャンネル関与メカニズムで標的細胞溶解に直接 関与していることを示唆した。

細胞毒性１９２６球、ナチュラルキラー細胞及びキラー（Ｋ）細胞の一般的記載 は５ｔｌｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂａ５ｌｃ　＆Ｃ１１ｎＪｃａｌ　Ｊｉｍｕｎ ｏｌｏｇｙ、２２７−３１（Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉ −ｏｎｓ、Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ、Ｃａ、、１９８４）　で含まれている。

発明の要旨 一般に、本発明はＣＣＰＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベク ターを特徴とする。

もう１つの面において、本発明はｃｃｐ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を 含んでなるベクターを特徴とする。

もう１つの面において、本発明はｈｃｃＰ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列 を含んでなるベクターを特徴とする。

もう１つの面において、本発明はｈｃｃｐｘタンパク質をコードするＤＮＡ配列 を含んでなるベクターを特徴とする。

もう１つの面において、本発明はＣＣＰＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を 含んでなるベクターがら発現される実質上純粋なＣＣＰＩタンパク質を特徴とす る。

実質上純粋とは９５重量％以上の純度がありかつタンパク質が天然で会合するタ ンパク質、脂質及び炭水化物を含まない調製物を意味する。

もう１つの面において、本発明はＣＣＰ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を 含んでなるベクターから発現される実質上純粋なＣＣＰ２タンパク質を特徴とす る。

もう１つの面において、本発明はｈｃｃＰ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列 を含んでなるベクターがら発現される実質上純粋なｈｃｃＰ１タンパク質を特徴 とする。

もう１つの面において、本発明はｈｃｃｐｘタンパク質をコードするＤＮＡ配列 を含んでなるベクターから発現される実質上純粋なｈｃｃｐｘタンパク質を特徴 とする。

もう１つの面において、本発明は次式のペプチド。

＾５ｌ）−Ｖａｌ−＾ｓｐ−＾１ａ；Ａｌａ−Ｐｒｏ−＾ｓｐ−＾Ｉａ；Ａｌａ −＾５ｎ−Ｐｒｏ−＾１ａ：Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ；Ａｌａ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−Ｐｈｅ；Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−＾５ｐ−Ｐｈｅ；Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−＾５ｎ −Ｐｈｅ；Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ；又はＰｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐ ｈｅを特徴とする。

ここで用いられる競合的阻害という用語は、阻害剤がプロテアーゼの正常基質と 競合するように遊離プロテアーゼと結合する阻害に関する。競合的阻害は例えば Ｌｅｈｎｆｎｇｅｒ、ＢｌｏｃｈｅＩｎｆｓｔｒｙ、１９７−２００（Ｗｏｒｔ ｈ、２ｄ　ｅｄ、１９７５）で記載されている。

ここで用いられるプロテアーゼという用語は、ペプチド結合を加水分解して開裂 させる酵素に関する。

細胞毒性リンパ球、例えば細胞毒性Ｔリン３球Ｃ時にはＴキラー細胞とよばれる ）及びナチュラルキラー細胞は参考のためここに組み込まれるＪａｎｄｌ、Ｂｌ ｏｏｄ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　（血液：血液学のテキ ストブック）（Ｌｉｔｔｌｅ、Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、、Ｂｏｓｔｏｎ、１ ９８７）　で記載されている。

ここで用いられるセリンプロテアーゼという用語は、酵素の活性部位にセリン残 基を有するプロテアーゼに関する。

ここで用いられるペプチドという用語はタンパク質及び短すぎてタンパク質とし て特徴付けられないペプチドを含む。通常５０００以上の分子量を有するペプチ ドがタンパク質として特徴付けられる。

ここで用いられる細胞毒性細胞プロテアーゼという用語はあらゆるプロテアーゼ 、好ましくはネズミＣ１１遺伝子のタンパク質コード配列と３０％以上の相同性 、更に好ましくは５０％以上の相同性を有してプラスミンとは異なる部位で開裂 するセリンプロテアーゼに関する。

細胞毒性細胞プロテアーゼは好ましくは細胞毒性リンパ球で、更に好ましくは排 他的に細胞毒性リンパ球のみで発現される。

細胞毒性リンパ球はそれらの細胞毒性活性の一部としてプロテアーゼを産生ずる が、それらのうち一部は、我々が発見したのであるが、体の他の細胞で産生され るプラスミンのようなプロテアーゼにより開裂される部位とは異なる部位でタン パク質を開裂する。これらのプロテアーゼは細胞毒性細胞プロテアーゼ群のメン バーである。

本発明の阻害分子は、それらが細胞毒性細胞プロテアーゼで認識される唯一の開 裂部位に似ていることから、細胞毒性細胞プロテアーゼ、例えば細胞毒性リンパ 球により産生されるプロテアーゼを排他的に阻害することができる。このため免 疫障害にかかった又は同種移植片拒絶を経験したヒトはその疾５壱又は拒絶プロ セスに関与する細胞毒性リンパ球を阻害するために本発明の分子を投与でき、投 与された分子は例えば血餅の溶解又は他の正常プロテアーゼ依存性機能を妨げた りしない。

本発明の他の特徴及び利点は好ましい態様の下記説明及び請求の範囲から明らか になる。

好ましい態様の説明 好ましい態様の構造、合成及び用法は、図面の簡単な説明された後で記載されて いる。

図面 図１は混合リンパ球培養物におけるプロテアーゼｍＲＮＡ発現（・）と細胞活性 化との相互関係について示した図である。

図２は２種のプロテアーゼコードｃＤＮＡの部分的なヌクレオチド配列比較であ る。

図３は上記ｃＤＮＡの１つのヌクレオチド配列及びそれがコードする予想タンパ ク質構造である。

図４は５種のセリンプロテアーゼの部分的なアミノ酸配列比較である。

図５はＣｅＦ２の配列である。

図６はｈｃｌｌ、即ちネズミＣ１ｌ遺伝子のヒトアナログの配列である。

図７はｈｃｃｐｘ遺伝子の制限地図である。

図８はｈｃｃｐｘ遺伝子のヌクレオチド配列である。

図９はｈｃｃｐｘ遺伝子によりコードされる予想ｃＤＮＡ配列である。

図１０はｈｃｃｐｘ及びＣＣＰ遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸 配列である。

図１１は本発明の一部のプロテアーゼ阻害剤のアミノ酸配列である。

表１は組織移植片の浸潤細胞中におけるＣ１１ｍＲＮＡの発現について示す。

表２はＣＣＰＩと様々なタンパク質との相同性の程度について示す。

表３はシクロスポリンＡ混合リンパ球反応からの細胞の細胞毒性に関する本発明 のペプチドの効果について示す。

表４はＣｏｎＡ及びインターロイキン２で活性化された細胞毒性Ｔ細胞の細胞毒 性に関する本発明のペプチドの効果について示す。

添付物は酵素及び基質構造のコンピューター補助分析の詳細な例を示すＭｕｒｐ ｈｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆ ｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４：１９０−２０４のコピ一本発 明の阻害分子は例えば細胞毒性リンパ球により産生される細胞毒性細胞プロテア ーゼの活性を競合的に阻害するが、その一方で他の細胞タイプにより産生される プロテアーゼ又は細胞毒性細胞プロテアーゼを産生ずる細胞により産生されるい ずれか他のプロテアーゼの活性を阻害しない。好ましくは、阻害分子はペプチド である。

細胞毒性リンパ球は特徴的な組の細胞毒性関連プロテアーゼを合成するが、これ らは他の部分組のリンパ球においてはあったとしても著しく低いレベルで発現さ れるだけである。細胞毒性関連プロテアーゼは２群、即ちエフェクタープロテア ーゼ又は非エフェクタープロテアーゼに分割できる。エフェクタープロテアーゼ は細胞毒性リンパ球が標的細胞と接触した場合にそれから放出され、標的細胞の 膜でタンパク質を壊すか又は標的細胞に侵入して、細胞内タンパク質を加水分解 し、細胞破壊を起こす。非エフェクタープロテアーゼはリンパ球からエフェクタ ープロテアーゼ（又は他のエフェクター分子）を産生及び／又は放出する酵素プ ロセスに関与している。エフェクタープロテアーゼ又は非エフェクタープロテア ーゼいずれかの作用を阻害することは、標的細胞を破壊する細胞毒性リンパ球の 能力を阻害することになる。

好ましいペプチドはプロテアーゼにより認識される開裂部位を構成する２つのア ミノ酸を含み、３〜２０（更に好ましくは３〜５）のアミノ酸残基を有する。そ れより短いペプチドも好ましいが、それはそれらが一般に容易に細胞内に取り込 まれるからである。そのペプチドは、例えばＺｒｅｊｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔ　ｉｅ ｓ　、　３３Ｂ−３７、４２７−３８（Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｆｅｄ＋ｓａｎ　、　Ｎ 、　Ｙ、　、　１９１１３）で記載された部位のような他のプロテアーゼにより 認識される開裂部位を含んでいてはならない。

下記例１ではマウスの細胞毒性Ｔリンパ球で排他的に発現される２つの遺伝子の 単離、クローニング及び特徴が記載されている〔どちらの遺伝子も生物における 他のタイプの細胞において発現されないか又は非常に低いレベル（ｍＲＮＡ５分 子／細胞以下）で発現されるだけであることをもっばら意味する〕。例２はその ２遺伝子の配列決定、その遺伝子の１つがコードするプロテアーゼのアミノ酸配 列の決定及びそのプロテアーゼの特徴について記載している。例３はヒト細胞毒 性Ｔリンパ球で排他的に産生される細胞毒性細胞プロテアーゼ（ｈＣＣＰｌ）に ついてコードするヒト遺伝子（ｈｃｌｌ）の同定及び単離について記載している 。例４はもう１つのヒト細胞毒性細胞プロテアーゼ、ヒト細胞毒性細胞プロテア ーゼＸ　（ｈＣＣＰＸ）についてコードする遺伝子の単離、クローニング及び特 徴について記載している。例５はｈｃｃｐｘ遺伝子の配列決定、ｈｃｃｐｘプロ テアーゼのアミノ酸配列決定及びそのプロテアーゼの特徴について記載している 。例６は細胞毒性細胞プロテアーゼの三次元構造の決定及びそのプロテアーゼの 競合的阻害剤として作用できるペプチドの構造について記載している。

例７は本発明のいくつかの阻害剤について記載している。

例８は実質上純粋なプロテアーゼの産生及び阻害剤のデザインにおけるそれらの 用法について記載している。

伊１１ 細胞−細胞毒性Ｔ細胞系ＭＴＬ２．８．２及びＭＴＬｌｌ、１はＢｌｅａｃｋｌ ｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、（１９ｇ２）　Ｊ、１ｉＩｌｕｎｏ１．１２ｇ＋７５８で 記載されたようにＣＢＡ／Ｊマウスから得た。

ＥＬ４．ＥｌはＦａｒｒ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８０）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ ２５：２５５５で記載されたＥＬ４細胞系のインターロイキン２　（ＩＬ−２） 産生変異体である。ＣＨＩはＣＢＡ／Ｊ　αＣＢＡ／Ｊ　Ｘ　ＢＡＬＢ／ｃ抗原 特異性ヘルパーＴ細胞系である。それは１０％牛脂児血清及び１００μＭ２−メ ルカブトエタノール（ＲＨＦ　Ｍ）で補充されたＲＰＭＩ　１６４０培地におい て放射線照射Ｆ工肺臓細胞で継続的再刺激により２日間混合リンパ球培養物から 産生じた。ヒト細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を得るため、末梢血リンパ球をＲ ＨＦＭ中でインキュベートし、０及び７８目に放射線照射同種細胞で刺激し、１ ０日日目回収した。用いられた胎児由来細胞はＴｅｈ　ｅｔ　ａｌ、、（１，９ ８５）Ｊ、ｌｍ１ｕｎｏ１．１３５＋１５８２で記載されている。細胞活性化過 程で、ＣＢＡ／Ｊマウスからの膵臓細胞を同数のマイトマイシンＣ処理ＥＬ４． Ｅｌ細胞又はＣｏ　ｎ　Ａ　（２μｇ／ｉｆ）のいずれかと共にＲＨＦＭ（１０ ６細胞／１）及び精製Ｉ　Ｌ　−２（Ｒｉｅｎｄｅａｕ　ｅｔ　ａｌ、、（１９ ８３）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：１２１１４で記載されている）中でイ ンキュベートした。サンプルを１白目〜６日目に取出し、Ｓｈａｗ　ｅｔ　ａｌ 、、（１９７８）Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、　１２０　：１９７４で記載された 操作により細胞毒性活性に関して調べ、サイトドツト（ｃｙｔｏｄｏｔ）ハイブ リッド形成により分析した。

ｃＤＮＡライブラリー組立て一二本鎖ｃＤＮＡをＧｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａ ｎ、（１９８３）　Ｇｅｎｅ、２５：２Ｂ３前記載されたようなＭＴＬ、２．８ ．２ｍＲＮＡ４μｇから合成した。

フラッシュ末端を最大化するためＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡポリメラー ゼのフレノウ断片で修復後、リン酸化ＥｃｏＲＩリンカ−ＣＰ　−Ｌバイオケミ カルズ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を７０＋ａＭトリスＨＣＩ、ｐ Ｈ７゜６　／　１０　ｌＩＭＭ　ｇ　Ｃｌ　２　／　５　ＩＩＭジチオトレイト ール／　１　ｉＭＡＴＰ／１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ中１４℃で一夜かけてｃ ＤＮＡに結合させたＣＧｏｏｄｍａｎ　＆　ＭａｃＤｏｎａｌｄ。

（１９７９）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎｚｙＩＩｏｌ、６８ニア５）　ｏ　Ｅ　ｃ 　ｏ　ＲＩで切断後、生成物を５ｍｌセファロース４Ｂカラムでランし、放出さ れた分画をプールし、エタノール沈降させた。ｃ　ＤＮＡを６６ｎＭトリスＨＣ Ｉ、ｐＨ７，６／６．６μＭＭｇＣＩ　２　／　１０　ｍＭジチオトレイトール ／１ｍＭＡＴＰ中でＥｃｏＲＩ／細菌アルカリホスファターゼ処理ｐＵｃ１３（ Ｐ−Ｌバイオケミカルズ）に結合させた。

反応液を３７℃に５分間加熱し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの添加前に急速冷 却し、１４℃で２時間インキュベートした。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ　 ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　８　Ｂ細胞をＭａｎｉａｔｌｓ　ｅｔ　ａｌ、ｊｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　（ 分子クローニング：実験マニュアル＞（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、。

１９８２）で記載されたＣ　ａ　Ｃ１２／　Ｒｂ　Ｃ１操作によりコンピテント 化し、結合されたｃＤＮＡで形質転換させた。

白色コロニー（インサートを含むもの）を９６ウ工ル微量滴定プレートに並べ、 ２０％グリセロール含有ＬＢ培地中−７０℃で貯蔵した。

示差スクリーニング−コロニーをニトロセルロースフィルターで三重に複製し、 ６時間増殖させ、しかる後クロラムフェニコール（１００μｇ／ｇｌ）上で１２ 時間にわたり増幅させた。細菌を溶解させ、フィルターをＭａｎｉａｔｉｓ、前 掲で記載されたように前洗浄して細菌砕片を除去した。４２℃で１２〜２０時間 にわたるブレハイブリッド形成は２×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　’　ｓ） 溶液（１×デンハーツ溶液−０，０２％ポリビニルピロリドン１０．０２％フィ コール（Ｆｉｃｏｌｌ）／　０　、　０２％牛血清アルブミン）　、４ＸＳＥＴ 緩衝液（１ｘＳＥＴ緩衝液−０，６Ｍ　ＮａＣ１１０，１２Ｍ）リスＭＣＩ、ｐ Ｈ８／１ｍＭＥＤＴＡ）　、０．１％ＮａＤｏｄＳＯ酵母４ゝ ｔＲＮＡ１００μｇ／ｓ　］及びポリ（Ａ）１２５μｇ／ｌ〔シグマ（Ｓｉｇｍ ａ）　〕を含有した５０％（ｖｏｌ／ｖａｔ）ホルムアミド中で行った。同緩衝 液中におけるハイブリッド形成ではＴプライマー２０μｇ／ｌ〔コラボレーテイ ブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、ウオールサ ム、ＭＡ）；５０　ｉＭ　ト’）　スＨＣＩ　（ｐＨ８−３）　；　１０　ｔｓ ＭＭ　ｇ　Ｃｌ　２；５１Ｍジチオトレイトール、各５００μＭのｄＧＴＰ、ｄ ＡＴＰ及びｄＴＴＰ　；　７０ｍＭＫＣ１；　３０ｔｔＣＩ　（ＩＣｉ　−３７ ＧＢｑ）の〔α−３２Ｐ〕　ｄＣＴＰ〔ニューイングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、３００　Ｃ１／＋ｅ＋ｅｏｌ　）　；及 び１５単位のトリ骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素と共に４２℃で６０分間かけて ｍＲＮＡから合成されたｃ　ＤＮＡプローブ１〜５　ｘ　１０　”　ｃｐｔａ／ ｍｌを含有していた。

鋳型ＲＮＡを１．５ＭまでＮａＯＨの添加によりハイブリッド形成させた。サン プルを３分間煮沸し、セファデックスＧ５０カラムクロマトグラフイーで分別し た。フィルターを５ｘＳＥＴ緩衝液中２２℃で１５分間しがる後２ＸＳＥＴ緩衝 液１５０％ホルミアミド中４２℃で２０分間洗浄し、増感スクリーンでフィルム 〔コダックＸ−オマットＡ　Ｒ（Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ　ＡＲ）　）に７０ ℃で１〜３日間露出させた。ハイブリッド化されたプローブはフィルターを蒸留 水中で１０分間煮沸することにより除去した。

プロット分析−サイトドツトはＷｈｉｔｅ及びＢａｎｃｒｏｆｔＣ１９１１２） 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７：１１５８９で記載されたように製造した。

プロット−ハイブリッド形成分析のため、全細胞質ＲＮＡ（１０μｇ）又はポリ （Ａ）”　ｍＲＮＡ　（２μｇ）を６．３％ホルムアルデヒド１５０％ホルムア ミド中５５℃で変性させ、０．６６％ホルムアルデヒド含有０．８％アガロース ゲル上でサイズ分別した。ＲＮＡをＴｈｏｍａｓ　（１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７：５２０１で記載されたようにニトロ セルロースに移した。プラスミドＤＮＡを５ｏｕｔｈｅｒｎ　（１９７５）　Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、２６：３６５で記載されたようにＥｃｏＲｌで切断し、０ ．７％アガロースゲル上でランし、ニトロセルロースに移した。フィルターを８ ０℃で２時間ベーキングし、しかる後２０＋ｗＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）　 、２ｉＭピロホスフェート、１００μＨＡＴＰ、５ｘデンハーツ溶液、０．７５ ＭＮａＣ１，０，０７５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）、１００μｇ／ｍ　Ｉ のサケ精子ＤＮＡ、０．１％ＮａＤｏｄＳ０　５０．ｃｚｇ／ｍｌのポリ（Ａ） 及び２．５４ゝ ｄＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含有した５０％ホルムアミド中４２℃で６〜１２時間プレハ イブリッド形成させた。ハイブリッド形成はＩ　Ｘ　１０６ｃｐＩｌ／１で比活 性Ｉ　Ｘ　１０８ｃｐ１Ｍ／μｇ　（７）ニックトランスレートされたプラスミ ド〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）キット〕と共に同緩衝液中で行った。

結果−ライブラリーの三重コピーを最初にＭＴＬ２．８．２ｍＲＮＡから合成さ れたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓ次いでオートラジオグラフィー及び洗浄後にヘル／＜− Ｔ細胞ｃＤＮＡ、最後に胸腺細胞ｃＤＮＡとハイブリッド形成させた。ライブラ リーの３コピー中少なくとも２つにおいてキラー細胞ｍＲＮＡとより高いハイブ リッド形成シグナルを示すコロニーを拾い出した。再び三重て再ス゛クリーニン グ時に、これら１２１コロニー中３６は明うかにＣＴＬ特異性のようであった。

これらのコロニーから単離されたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩて切断し、一連 の交差ハイブリッド形成を行った。２つのクローンを更に詳細な分析のために選 択した・ライブラリーにおいて最も豊富であるらしく８つの他のインサートと強 く交差ハイブリッド形成したためクローンＢＩＯ及びすべての８１．０関連クロ ーンとではなくＢ１０と弱く交差ハイブリッド形成したためクローンＣ１１（１ つの他のＣ１，１関連配列かみつかった）。

様々な細胞及びｍ織から製造されたサイトドツトをニックトランスレートされた ＢＩＯ及びＣ１ｌとハイブリッド形成させた。ドツト当たりの細胞数は１０４で あった。プローブＣ１ｌに関するデータは同様であるため、議論しない。最大シ グナルはＭＴＬ２．８．２、即ちｃＤＮＡライブラリーを得るために用いられた キラー細胞系で検出された。弱いが但し陽性のシグナルはＭＴＬ−１１１、即ち 低レベルの細胞毒性を有しかつＩＬ−２及び抗原非依存性になるＭＴＬ２．８． ２の変異体で観察された。類似レベルの発現はＴｅｈ　、前掲のネズミ胎児胸腺 に由来する新規Ｔ細胞クローンで観察された。全部で２０を超える細胞毒性Ｔ細 胞系及び培養物を試験したところ、すべてがＢＩＯ及びＣ１１発現に関して陽性 であった。

ナチュラルキラー（ＮＫ）及びＴキラー（Ｔ　Ｋ）細胞をＭａｎｙａｋ　ｅｔ　 ａｌ、（１９８９）　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１４２：３７（１７−３７１３で５ 己載された方法により精製、培養し、Ｃ１ｌ　ｍＲＮＡの発現に関して試験した 。ＩＬ−２中におけるＮＫ細胞の培養は用量依存的にｉ）溶解活性、ｉｆ）キマ ーゼ及びトリプターゼ酵素活性及び１ｉｉ）全ｍＲＮＡレベルのＣ１ｌ遺伝子を 誘導した。Ｃ１ｌ　ｍＲＮＡは培養５〜７日目にピーク活性に達した。同様の結 果がＴＫ細胞でみられた。

抗原に応答してＩＬ−２を分泌するマウス胸腺細胞又はヘルパーＴ細胞系（ＣＨ Ｉ）のいずれにおいてもＢＩＯ又はＣ１ｌの発現に関する証拠はなかった。マウ ス脳、マウス肝臓及びヒトＣＴＬ系も同様にこの実験の高厳重条件下で陰性であ った。加えて、ＢＩＯ又はＣ１ｌの発現に関する証拠は抗原特異性因子（Ｋｖｏ ｎｇ　ａｔａｌ、（１９ｇ４）Ｊ、ｌＩＩｌｌＭｕｎｏｌ、１３３：６５３　： ｌを分泌するヘルパーＴ細胞ハイブリドーマでみられなかった。陰性サンプルが ハイブリッド形成しうるＲＮＡを含んでいたことを保障するため、すべてのサイ トドツトをリンパ球特異性プローブ又はオリゴ（ｄＴ）もしくはＴ細胞抗原レセ プターβ鎖遺伝子［Ｈｅｎｄｒｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　Ｎａｔｕｒ ｅ、３［］８：１５３）のいずれかで再プローブ探査した。シグナルのレベルは 様々であったが、すべてのサンプルは陽性であった。

肺臓細胞懸濁物のＢ細胞に関して富化させるため、すンバ球をベトリ皿で付着細 胞から分離し、しかる後抗Ｔｈｙ１．２抗血清で処理した。次いで富化されたＢ 細胞をリボ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）　、Ｃｏ　ｎ　Ａ又はＲＨＦＭ培地でインキュベ ートした。２４時間後に細胞を回収し、サイトドツトを調製し、フィルターをＢ ＩＯ又はＣ１ｌでプローブ探査した。いずれの配列の発現もどのサンプルにおお いても検出できなかった。しかしながら、プロットを免疫グロブリンμＨ鎖プロ ーブ［Ｃａ１ａＩ！ｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ、２８４：４５ ２３とハイブリッド形成させた場合には、強い陽性シグナルがＬＰＳ刺激細胞で みられた。

ポリ（Ａ）”　ＲＮＡを様々な細胞源から単離し、変性アガロースゲル上でラン し、ニトロセルロースに移した。

同フィルターを最初にニックトランスレートされたＢＩＯｌしかる後Ｃ１ｌ及び 最後にプローブ１０、即ち様々な細胞タイプでｍＲＮＡを検出するクローン化遺 伝子でプローブ探査した（Ｐａｅｔｋａｕ　ｅｔ　ａｌ、、ｉｎＣｏｎｔｅｍｐ ｏｒａｒｙ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌｏｇｙ　（分 子生物学における現代トピックス）、　１０：３５（Ｓ、Ｇｉｌ目ｓａｄ、。

ＰＩｅｎｕｍ、Ｎ、Ｙ、、１９８４）　：ｌ　、プローブ１０は２種の異なるネ ズミ細胞毒性Ｔ細胞クローン、ＭＴＬ２．８．２及びＭＴＬｌｌ、１において単 一バンド（約９００塩基）を検出した。胸腺細胞、抗原特異性ヘルパー細胞系又 はネズミ胸腺腫ＥＬ４からのＲＮＡにおいてバンドは検出されなかった。プロッ トをＣ１ｌで再プローブ探査した場合、再び２つの細胞毒性Ｔ細胞クローンのみ がバンドを示した。しかしながら、ＢＩＯとは異なり、このプローブは一方が約 ９００塩基及び他方が１２００塩基である２つのバンドとハイブリッド形成した 。プローブ１０はすべての細胞サンプルにおいてバンドを検出した。加えて、プ ロット−ハイブリッド形成分析を１１種のＣＴＬ系、２種のヘルパーリンパ球系 、脳細胞、肝細胞、３種のヘルパーＴ細胞系、未刺激及びＬＰＳ刺激Ｂリンパ球 並びに１種のＢ細胞ミエローマを含めたいくつかのネズミ細胞からのポリ（Ａ） ”　ＲＮＡで行った。これらのうち、活性な細胞毒性Ｔ細胞のみがＢＩＯ及びＣ １ｌと／Ｘイブリッド形成するｍ　ＲＮ　Ａを発現した。すべてのトラックがハ イブリッド形成しうるＲＮＡを含んでいたことを保障するため、プロットをプロ ーブ１０と再ハイブリッド形成させた。予想されたサイズのバンドがすべてのト ラックでみられた。

サイトドツト及びプロットーハイブリッド形成分析からの結果は、ＢＩＯ及びＣ １１双方がネズミ細胞毒性Ｔリンパ球特異性であることを示す。

ＣＢＡ／Ｊ　（Ｈ−２ｋ）膵臓細胞をマイトマイシンＣ処理ＥＬ４細胞（図ＩＡ ）又はＣｏｎＡ　（図ＩＢ）のいずれかで刺激した。刺激後６日間の各々に関し て、細胞毒性のレベルをＥＬ４　（Ｈ−２ｂ）（ロ）、５１９４（Ｈ−２ｄ）（ △）及びＲ１（Ｈ−２ｋ）（○）細胞系に対するクロム放出アッセイで測定した 。サイトドツトもこれら日数の各々で調製し、プロットをニックトランスレート されたＢＩＯ及びＣ１ｌとハイブリッド形成させた。データはＣ１ｌが区別でき ない結果を示したためＢＩＯに関してのみ表した。相対的ＢＩＯｍＲＮＡレベル （・）はＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートリーダーで走査デンシトメトリーにより調べた 。同種特異的応答（図ＩＡ）において、細胞毒性のピークは４日月に観察された が、Ｂ１０又はＣ１ｌ　ｍＲＮＡ発現のピークは３及び４日目にあるようであっ た。ＣｏｎＡ刺激細胞における殺活性のピーク（図ＩＢ）　も４日目であったが 、しかしながらｍＲＮＡ発現のピークは３日目に非常に鋭かった。双方の実験に おいて、ｍＲＮＡ発現は６日目までにバックグラウンドレベルに減少したが、こ の日における細胞毒性はまだ有意のレベルであった。サイトドツトを３２Ｐ末端 標識オリゴ（ｄＴ）とハイブリッド形成させた場合、全ｍ　ＲＮ　Ａのピークは ２日目にみられた（データ示さず）。

図１で示された実験結果はＢＩＯ及びＣ１１ｍＲＮＡの最大発現が２４時間まで インビボ同種間又は分裂促進因子誘導細胞毒性応答に関する細胞毒性のピークに 先行することを示し、このためそれら双方が溶解プロセスで重要であるタンパク 質についてコードする遺伝子に関して一次的必要条件を満たす。

現場ハイブリッド形成実験では、不適合心臓同種移植片に浸潤する１９２３球の うち高割合がインビボでＣ１ｌ遺伝子を発現することを示す。現場ノ＼イブリ・ ソト′形成操作及びすべての関連技術の完全な詳細はＭｕｅｌｌｅｒｅｔ　ａｌ 、（１９８８）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７：１１２４−１１３６でみられる 。

これらの実験における移植はＭｕｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ｇ）Ｊ、Ｅ ｘｐ、Ｍｅｄ、１６７：１１２４−１１３８及びｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏ ｎ、２３：１７１て、成熟ＢＡＬＢ／ｃＪ　（Ｈ−２ｄ）マウスが腎臓莢膜下に 同ドナー動物からの移植片を受容した。移植後２．４．６．８．１０及び１２２ 日目、３匹の実験及び２匹のコントロール動物を殺し、移植片から５μｍ凍結切 片を調製した。現場／％ビイブリッド形用の標識プローブ（よＭｕｅｌｌｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、（１９８８）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１８７：１１２４−１１３６ でｇ己載されかつ以下で記載されたように製造した。

Ｃ１ｌ遺伝子の１．１ｋｂ断片を標準技術で転写ベクターｐＳＰＴ６７２のポリ リンカー中に組込んでサブクローニングした。このベクターはマルチクローニン グ部位の５−及び３′末端で各々ＳＰ６及びＴ７プロモーターを有する。適切な 制限酵素によるそのベクターの直鎖イヒ後、センス及びアンチセンスプローブは ＳＰ６ボリメラ−ゼ及びＴ７ポリメラーゼ〔双方ともニューイングランド・バイ オラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ）製、ベバリー。

ＭＡ）反応と最終濃度１２μＭで（Ｓ−３５）ＵＴＰ［Ｎｏ、５Ｊ１３０３、ア マージャム社（ＡｖｅｒｓｈａＩＩＣｏｒｐ、）。

アーリントンハイツ、ＩＬ）を用いて製造した。標識されたヌクレオチドは反応 混合物の他の試薬を加える前に乾燥させた。典型的な反応液（３５μＬ）は７μ Ｌ５ＸＳＰ６緩衝液（最終濃度；４０ｍＭトリスＨＣＩ、ｐＨ７、９；　５ＩＩ ＭＭｇ　Ｃ１；　２ＩＩＭスペルミジン）；３．５μＬ１０Ｃ１ｆｆ１Ｍジチオ トレイトール（ＤＴＴ）；３．５μしりボヌクレオチド（ＣＴＰＳＡＴＰ及びＧ ＴＰ；ｐＨ７，４の１００へペス中で各１０ｍＭ）；３．５μＬ牛血清アルブミ ン（ＢＳＡ）５ｍｇ／Ｉｌｌ：１μＬルナシン（Ｒｎａｓｉｎ）４０　Ｕ／μＬ （−ニーイングランド・バイオラボ）：１μＬ直鎖化ＤＮＡ鋳型１μｇ／μＬ、 １３．５μＬＨ２０を含有していた。ＳＦ３及びＴ７反応液を４０℃及び３７℃ で各々９０分間インキュベートした。ＤＮＡ鋳型を３７℃で１５分間かけてＤＮ Ｎアーゼ［２Ｕ／μｇＤＮＡ　、ワーンングトン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）　 〕で切断した。

次いてＲＮＡプローブをフェノール／クロロホルムで抽出し、パイオーミルＰ６ ０スピンカラムで分離し、１０”ｃｐ中標識プローブ当たり酵母ｔＲＮＡ７．５ μｇを加えた後にエタノール沈降させた。次いでプローブをトリスＥＤＴＡ　（ ＴＥ）に２　ｘ　１０９ｃｐｍ／μして再懸濁し、２分間煮沸し、−７０℃で凍 結貯蔵した。ハイブリッド形成のため、このプローブをホルムアミド（最終濃度 ５０％）、硫酸デキストラン（１０％）　、ＤＴＴ（１００ＩＩＭ）　、ＮａＣ ｌ　（３００ｉＭ）　、ｐＨ７，５のトリスＨＣｌ　（２０＋ｇＭ）　、ＥＤＴ Ａ　（５ａ＋Ｍ）　、デンハーツ溶液（１×）と２×１０６ｃｐＩＩ／μＬハイ ブリツド形成溶液の濃度で混合した。

現場ハイブリッド形成はＡｎｇｅｒｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　Ｉｎ５ｉ ｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｔｈｅ 　ＣＮＳ　（現場ハイブリッド形成：　ＣＮＳへの適用）、に、Ｖａｌｅｎｔｉ ｎｏ、Ｊ。

Ｅｂｅｒｖｉｎｅ及びＪ、Ｂａｒｃｈｕｓ、ｅｄｓ、ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｌｖｅ ｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、４２−７０に従いＭｕｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１ ９Ｈ）　Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、１６７：１１２４−１１３６で修正されたように実施した。５μｍ厚ク リりスタット切片をポリーＬ−リジン（シグマケミカル社）コートガラススライ ド上におき、ＩＸリン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に溶解された４％バラホルムアル デヒド中で２０分間かけて固定させ、ＰＢＳでリンスし、グレード化エタノール で脱水した。スライドは現場ハイブリッド形成に用いられる前に４℃でこの段階 において貯蔵した。異なる細胞群に関する現場ハイブリッド形成はシャントン（ Ｓｈａｎｄｏｎ）細胞遠心機でポリーＬ−リジンコートガラススライド上にスピ ンされた選別細胞で行った。これらの細胞スピン調製物をクリオスタット切片に 関して記載されたように固定してハイブリッド形成させた。固定された切片又は 細胞スピン調製物を３７℃で３０分間にわたりｐＨ８，０の１００ｍＨトリスＨ ＣＩ及び５０ｍＭＥＤＴＡ中プロテイナーゼＫ〔ヘーリンガー・マンハイム（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ連邦共和国〕１μｇ／ｍｌで 処理した。スライドを４％パラホルムアルデヒド中で２０分間かけて再び後固定 させた。組織切片における遊離アミノ基は０．ＩＭトリエタノールアミン中０． ２５％無水酢酸による１０分間の処理でアセチル化した。ハイブリッド形成ステ ップのために、１０６ＣｐＩＩＳ−３５ＵＴＰ標識標識ＲＮＡプローブ含有ノブ イブリッド形成溶液記）１０μＬを各切片におき、シリコーン処理カバースリッ プ（１８Ｘ１８ａ＋ｌ＋）でカバーし、ラバーセメントでシールした。切片を４ ６℃で１６〜１８時間ハイブリッド形成させた。しかる後、スライドを５０％ホ ルムアミド、２ＸＳＳＣ（ＳＳＣ−ｐＨ７の０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．３ Ｍクエン酸ナトリウム）、ｐＨ７，５の２０ｍＭトリス及び５ｍＭＥＤＴＡ含有 溶液中で全２時間にわたり５６℃で４回交換して洗浄した。第一洗浄後、ＲＮＮ アーゼ（２０Ｈｇ／ｌｌ１ｌ）及びＲＮアーゼ（Ｉ　Ｕ／１）　（双方ともシグ マケミカル社から得た）による３７℃で３０分間の切断ステップを含めた。スラ イドをＮＴＢ−２ヌクレアトラツクエマルジヨン〔イーストマンコダック（Ｅａ ｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ）、ロチニスター、ＮＹ）に浸し、６００■Ｈ酢酸アン モニウムで１．２希釈し、４℃て８日間露出させた。スライドをコダック現像液 Ｄ１９で２．５分間かけて現像し、コダック定着液で５分間かけて定着させた。

対比染色は４％ギームサ（Ｇｉｅｍｓａ）染色〔フィッシャー・サイエンテイフ イ・ツク社（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｒｉｃ　Ｃｏ、）、オレンジノく一 グ、ＮＹ：ｌ　で１０〜１５分間行った。各動物から、２つの切片を標識Ｃ１ｌ アンチセンスプローブ（細胞質Ｃ１ｌ　ｍＲＮＡに相補的な配列）と各々ハイブ リッド形成させ、１つの切片を標識Ｃ１ｌセンスプローブと各々ノ＼イブリ・ン ド形成させた。

Ｃ１１特異性プローブとの現場ノ＼イブリッド形成の結果は、拒絶同種移植片に おける細胞浸潤物が高割合のＣ１１転写物発現細胞を含有していることを証明し た。

検出可能レベルのＣ１ｌ　ｍＲＮＡを有する浸潤細胞のト切片を０１１遺伝子の 放射性同位元素標識ＲＮＡアンチセンスプローブとハイブリッド形成させた。表 １における結果は浸潤領域の単位面積（ＩＩＩ１１２）当たりにおける陽性細胞 数として表示されている。同種移植片を有する３匹の動物及び同系移植片を有す る２匹の動物を試験し、各動物の２切片及び各プローブを評価のために用いた。

表１ 検出可能レベルのＣ１ｌ　ｍＲＮＡ を有する浸潤細胞の出現頻度 移植後　同種移植片　同系移植片 検出可能レベルのＣ１ｌ　ｍＲＮＡを有する第一細胞は同種移植片を有する動物 及び同系移植片を有する動物の双方において移植後２日目にみられた。しかしな がら、これらの陽性細胞はこの時点で極端に少なく、正常には同動物のどの切片 でもみられなかった。移植後４日目に、実験動物は同系移植片を有するコントロ ール群よりも５〜１０倍高いＣ１ｌ＋細胞の出現頻度を示した。その遺伝子を発 現する炎症細胞の出現頻度は同種移植後４〜１２日目に劇的に増加し、この期間 中コントロール動物の場合よりも少なくとも８倍高かった。

コントロール動物の１つにおいて、同系移植片は壊死し、生存同系移植片細胞は 移植後８日目に検出できなかった。表１に含まれなかったこの動物は同時点で他 のコントロール動物よりも５〜１０倍多いＣ１１ｍＲＮＡ＋細胞を有していた。

しかしながら、移植後８日目に実験動物と比較した場合、陽性細胞の出現頻度は なお−５０％低かった。マウスが同種移植片を受容した後最初の４日間において 、はぼ同等数のＣ１ｌ＋細胞が浸潤細胞の中にみられた。

細胞当たりのＣ１ｌ特異性ｍＲＮＡの量は、単一細胞上における銀粒子の数とし て測定した場合、実験動物における全観察期間中に着実に増加したが、これはそ の遺伝子がおそらく同種抗原及び／又は媒介物質による局所誘導後も長期間にわ たり発現されたことを示す。コントロール動物において、発現レベルは移植後４ 日間以上たってからもほんのわずかに増加した。

Ｃ１１転写物陽性細胞の表現型はＭｕｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ。

（ＬＨｇ）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７：１１２４−１１３８で詳述されたよ うに決定した。簡単には、同種移植片の小片をコラゲナーゼで切断し、単離され た浸潤Ｔ細胞から得られた懸濁液を後の現場ハイブリッド形成のためにケイ光活 性化細胞選別機で選別した。６日前に心筋移植片を受容した６匹の動物の同種移 植片の浸潤細胞及び膵臓細胞をプールし、それらの表現型に従い選別した。ＣＤ ８＋部分組におけるＣ１ｌ陽性細胞の出現頻度は同動物の肺臓よりも同種移植片 の浸潤物の場合に通常１０〜２０倍高かった。浸潤物からのＣＤ４＋細胞の回収 率は常に非常に低く、この部分集団における陽性細胞の出現Ｍ度は浸潤細胞のＣ Ｄ８＋部分組の場合よりも少なくとも１０倍低かった；分析された８４のＣ１ｌ 　ｍＲＮＡ＋細胞のうち８２はＣＤ８”　（９８％）、２つはＣＤ４”　（２％ ）であった。

選別細胞からの細胞スピン調製物においては、Ｃ１１転写物陽性細胞が芽球様Ｃ Ｄ８＋細胞の中で主にみられた。

細胞懸濁液及び組織切片の二重染色において、同種移植片浸潤細胞及びＣ１１転 写物陽性細胞の中でＣＤ４−１ＣＤ８−又はＣＤ４“、ＣＤ８”Ｔ細胞の有意寄 与に関する証拠はみられなかった。

例２ クローンＢＩＯ及びＣ１ｌはＳｔａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１４３：１６１　のジデオキシ法に従い配列決定した。

ＢＩＯ及びＣ１ｌの配列分析（図２）は、それらが互いに関連しており、それら がコードする推定タンパク質がセリンプロテアーゼに特徴的な短鎖領域Ａｓｐ− ３ｅｒ−Ｇｌｙ−ｃ＋ｙ（キモトリプシンの周辺５ｅｒ１９５に相同的な配列） を含むことを示す。

プローブとしてＢＩＯ及びＣ１ｌにより、もう１つのＣＴＬ相補的ＤＮＡ　（ｃ ＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングしたが、その場合に１０００塩基対以上 のインサートをλｇｔｌＯに組込んでクローニングした。４万の組換え体をスク リーニングし、Ｃ１ｌに相当する３９のプラークを単離した。

Ｃ１ｌとハイブリッド形成した１４００塩基対のｃＤＮＡインサートを配列分析 のために選択した。分子量２５，３１９のコードされた予想タンパク質配列は図 ３で示されている。推定開始コドンは潜在的リポソーム結合部位ｃｃｕｕｃｃｃ で先行されており［Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ　ｅｔａ＋、（１９７８）　Ｃｅ１ ｌ、１３：５５１　）　、ポリアデニル化シグナル配列ＡＡＵＡＡＡ　ＣＰｒｏ ｕｄｆｏｏｔ　＆　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、（１９６Ｇ）　Ｎａｔｕｒｅ、２［ｉ３ ：２１１〕はポリ（Ａ）領域からすぐ上流に生じる。予想された最初の１２アミ ノ酸のうち１０は疎水性であって２位におけるアミノ酸（Ｌｙｓ）は塩基性であ り、これはこの配列が分泌又は細胞内小器官位置を指示するシグナルとして作用 しうろことを示唆する。ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデー ション（ＮａｔｆｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎ ｄａｔｉｏｎ；　Ｎ　Ｂ　ＲＦ　）　タンノくり質配列データバンクの調査では 、Ｃ１ｌでコードされるタンパク質かい（つかのセリンプロテアーゼと似ている ことを示した（表２）。

配列がＤａｙｈｏｆｆアルゴリズムＣＤａｙｈｏｆｆ、ｉｎ　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、５：１ （Ｓｕｐｐ、３）（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏａ＋ｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓ、Ｆｏ ｕｎｄ、、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，。

１９７９）　）に従い最適に並べられた場合、相同率は通常３０〜４０％であっ た。最大相同性はラット肥満細胞プロテアーゼタイプＩＩ　（ＲＭＣＰ　Ｉ＋） でみられたが、これはＣ１ｌでコードされる２１５アミノ酸のうち１０９と一致 するアミノ酸を有しており、５１％の一致／鎖長（Ｗａｔｃｈ／ｌｅｎｇｔｈ） を示した。セリンプロテアーゼにおいて活性部位の触媒トライアット（旧Ｓ　Ｎ 　Ａｓｐ１０２及び、５７ Ｓｅｒ１９５）を形成することが知られたアミノ酸残基はすべてＣ１ｌでコード されるタンパク質でみられた（図３、Δ）。セリンプロテアーゼの中に高度に保 存されているこれらの残基周辺の配列はＣ１１遺伝子産物でも保存されている。

実際に、主としてこの領域周辺における保存のために、Ｃ１ｌでコードされるタ ンパク質はストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉ ｓｅｕｓ）からの原核プロテアーゼトリプシン及びＢ型に対してでさえもやや相 同性（２０９残基の約３０％）であるらしい。

Ｃ１ｌ及びＢＩＯでコードされる細胞毒性Ｔリンパ球特異性タンパク質（ＣＣＰ ）は各々ＣＣＰＩ及びＣＣＰ２として呼ばれる。図４において、最適のタンパク 質並び方はＣＣＰ　１と共にＲＭＣＰｌｌ、牛キモトリプシン、牛トリプシン及 びＣＣＰ２　（全配列が示されていないためナンバリングせす）に関して示され ている。

ＣＣＰ２の全配列はＣ１ｌ及びＣＣＰＩに適用された操作の適用によって得るこ とができる。ＣＣＰ２の全配列は図５で示されている。

ＲＭＣＰｌｌは非定型肥満細胞の顆粒中にみられる細胞内セリンプロテアーゼで ある。ＣＣＰＩとＲＭＣＰｌｌとの高レベルの相同性は、ＲＭＣＰｌｌがそれを セリンプロテアーゼ超科で例外的にするい（つかの構造的特徴を有しているため 特に興味深い。タンパク質ＣＣＰＩはＲＭＣＰｌｌと正確に同じ位置でシスティ ンを含むが、これはＲＭＣＰｌｌとの相同性により３つのジスルフィド結合を形 成している。これらはキモトリプシン、トリプシン及びエラスターゼにおいて同 位置で生じる。ＣＣＰｌ及びＲＭＣＰｌｌの双方は原核生物からの数種を含めた 他のすべての公知セリンプロテアーゼに存在しかつキモトリプシンにおいてＣｙ Ｓ１９１をＣｙＳ２２０と連結するジスルフィド結合を欠く。ＣＣＰ　１及びＲ ＭＣＰｌｌの双方において、これら２つのハーフシスティンのうち第一はフェニ ルアラニンで置き換えられ、一方第二のハーフシスティンは他の残基と一緒に欠 失された。Ｃｙｓ　１９１とＣｙｓ２２°とのリンケージは基質結合部位のフン ホメーションを安定化する上で重要と考えられる（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ　ｅｔａｌ 、（１９７８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７：）Ｉｌｌ）　。ＣＣＰ　１及びＲＭＣ ＰＩＩにおけるその不存在はその部位でひいては基質特異性に関して有意の変化 を導くことがある。

Ｒｋ・ｆｃｐＨのみで既にみられかつ基質結合性を変えると考えられた他の２つ の一次構造変化は予想ＣＣＰＩタンパク質にも存在する。ＲＭＣＰｌｌ及びＣＣ ＰＩにおいて、そのアミノ酸は活性部位セリンの６残基前におけるアラニンであ る。キモトリプシン様プロテアーゼにおいてそれはセリンであり、トリプシン様 プロテアーゼにおいてはアスパラギン酸である。この位置における残基はＳ□結 合部位の底部に存在し、そのため低極性側残基への変化は基質中のＰ□位置で疎 水性アミノ酸に関する優先性を示すことになる。更に、キモトリプシンにおいて 基質のＰ　及びＰ３残基と水素結合を形成する配列５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ２１ ６はＣＣＰｌ及びＲＭＣＰＩＩにおいて５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙで置き換えられ ているが、これも再び変化した基質特異性を示唆する。これら変化の双方はＣＣ Ｐ２でもみられる。

ＣＣＰＩに存在しないいくつかのＲＭＣＰＩ＋特異的差異の１つは、キモトリプ シンの９９位においてアスパラギンに代わるイソロイシンへの置き換えである。

はとんどの哺乳動物セリンプロテアーゼにおいてこの残基は疎水性であり、実際 にＣＣＰＩにおいてそれはフェニルアラニンであるらしい。しかしながら、はと んどのＲＭＣＰＩ＋特異的変化はＣＣＰＩタンパク質に存在しており、これはＣ ＣＰＩの基質結合部位がＲＭＣＰｌｌの場合と似てかつ他の補乳動物セリンプロ テアーゼの場合と有意に異なることを示唆している。

例３ ヒト細胞毒性Ｔリンパ球で排他的に発現されるプロテアーゼの構造を決定して唯 一のタンパク質開裂部位を認識する初期ステップは、ヒト細胞毒性１９２３球特 異性ｃ　ＤＮＡをクローニングすることである。

ヒト細胞毒性Ｔリンパ球細胞系、例えばコリエル・インスティテユート・フォア ・メディカル・リサーチ（Ｃｏｒｉｅｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄ ｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、コープウッド・アンド・デービス・ストリート 、カムデン、ＮＪに寄託されたその系統の１つからのポリＡ”　ＲＮＡを標準操 作により二本鎖相補的ＤＮＡ合成用の鋳型として用いる。次いでＥｃｏＲＩ認識 配列を標準法によりｄｓｃＤＮＡの末端に結合させ、得られた分子を低融点アガ ロース上でサイズ選択し、しかる後すべて慣用的操作によりλｇｔｌｌのＥｃｏ ＲＩ部位に挿入する。次いてこれらの組換え分子をλフアージヘッド〔ギガバッ ク・プラス（Ｇｉｇａｐａｃｋ　ｐｌｕｓ）、ストラジーン（Ｓｔ　ｒａｇｅｎ ｅ）］中にパッケージ化し、大腸菌Ｙ１０８８を感染させるために用いる。組換 え分子保有プラークからのＤＮＡは対応ヒト遺伝子を確認するため標準操作によ りＢＩＯ及びＣ１１から得られた放射性プローブとハイブリッド形成させる。ス クリーニングは偽陽性の可能性を最少化するため二重に行う。ｈｃｌｌ、即ちＣ １ｌのヒト対合物は上記操作を用いて発見された。

いかなる陽性プラークからのファージＤＮＡも単離し、慣用的操作を用いてプラ スミドベクターｐ　Ｕ　Ｃ１，３で直ちに再クローニングする。次いで大量のこ れら組換えプラスミドＤＮＡを次の分析のために単離する。ヒト細胞毒性１９２ ８球特異性クローンは制限酵素切断及び最後に配列分析により特徴付けできる。

加えて、それらの互いの関係は標準交差ハイブリッド形成及びヘテロ二本鎖マツ ピングで研究することもできる。

単離された遺伝子の組織特異性発現及び転写物サイズはＢＩＯ及びＣ１ｌに関し て記載されたのと同じ方法を用いて確立できる。前記のようなノーザンプロット 分析を用いて、いくつかの異なる細胞系（すべてＡＴＣＣから入手）をｈｃｌｌ の発現に関して試験した。ＣＥＭ−ＣＭ３　（急性リンパ芽球白血病）　、ＣＣ ＲＦ−ＣＥＭ（急性リンパ芽球白血病）　、ＣＣＲＦ−ＳＢ　（急性リンパ芽球 白血病）　、ＲＰＭＩ　７６６６　（Ｂリンパ芽球）、ＤＬＤ−１（結腸腺癌） 及びＣＲＬ−７１２３（膵臓系）はすべてｈｃｌｌを発現できなかった。ヒト胸 腺細胞及び末梢血リンパ球も陰性であった。分裂促進因子で活性化された細胞溶 解Ｔ細胞、インターロイキン２、抗Ｔ細胞レセプター抗体又はフコースはすべて ｈｃ１１発現に関して陽性であった。ヒト細胞毒性Ｔ細胞系も陽性てあった。こ のため、ｈｃｌｌの発現は細胞毒性Ｔ細胞に特異的であるらしい。

ヒト遺伝子の細胞毒性及び発現レベル間の相互関係も上記方法を用いて試験でき る。ｈｃｌｌの発現はそれが発現された細胞の細胞溶解活性と相関していること がわかった。ｈｃｌｌの発現はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞で検出 された。ＬＡＫ細胞を得るための操作は本質的にＲｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａ ｌ、（１９８５）　Ｎ、Ｅ、ｄ、Ｍｅｄ、３１３：１４８５　の操作である。

ヒト細胞毒性ニリン３球特異性遺伝子の発現が毒性と相関している場合、その遺 伝子は（Ｂ１０及びＣ１ｌ遺伝子で行われたように）標準法で配列決定される。

遺伝子配列から、プロテアーゼの構造が決定でき、プロテアーゼ構造のコンピュ ーター分析を０１１遺伝子の場合のように実施する。次のコンピューター分析で は酵素の活性部位の位置を示すことができ、競合的阻害剤として作用しうるペプ チドの適切な配列が決定できる。

ｈｃｌｌを前記のように配列決定したところ、ネズミ遺伝子Ｃ１ｌと非常に類似 していることがわかる（図６）。ｈｃｃＰｌ、即ちｈｃｌｌでコードされるタン パク質の活性部位はネズミタンパク質ＣＣＰＩの活性部位と非常によく似ている 。最も重要なことに、ＣＣＰＩのようにｈＣＣＰ　１はＳｌでＡｒｇを有するら しく、これはの差異はＡｒｇから２残基下流における芳香族アミノ酸の置き換え である。ｈｃｌｌ及びＣ１ｌてコードされるタンパク質の類似性のために、ある ものを阻害するために合成された阻害剤は他も阻害するはずである。

ｈＣＣＰ　１の部分的精製品はトリプシン及びキモトリプシンにより認識される 部位で開裂しない。

バイオプシーサンプルとの現場ハイブリッド形成によるｈｃ１１遺伝子発現の分 析では、ｈｃｌｌが移植心臓を拒絶した患者の心組織で発現されることを示す。

現場ハイブリッド形成及び関連操作は前記のように実施した。

例４ ヒト胎盤ゲノムライブラリーは、λシャロン４Ａ中において、ネズミ細胞毒性細 胞プロテアーゼＣＣＰＩ−４に対応する放射性同位元素標３　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの 混合物と共に４１℃で２０％ホルムアミド及び６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１ ５Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）中でハイブリッド 形成によりスクリーニングした（Ｂｌｅａｃｋ、ｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ ８）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

２３４：１５３−１５９及びＬｏｂｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９７Ｂ）　５ｃｉｅｎ ｃｅ、２３２：８５８−８６１〕。

陽性プラークの１つからのファージＤＮＡは、ネズミブローブとハイブリッド形 成するが但し高度ｆＨ密条件下でｈＣＣＰｌとハイブリッド形成しない６．３ｋ ｂＲｃ。

ＲＩ断片（及び究極的に１．５ｋｂＢａｍ断片）を与えた（図７）。予備配列分 析では、１．５ｋｂ断片がネズミ細胞毒性プロテアーゼと高度に相同性であるタ ンパク質についてコードすることを示した。このためこの遺伝子はヒト０６２群 の新しいメンバーであるが、但しｈｃｃｐｌとは異なる。

ｈｃｃｐｘは細胞毒性細胞から発現される。ポリＡ＋ＲＮＡを静止及び活性化末 梢血リンパ球から精製し、プローブとして１．５ｋｂゲノム断片を用いてノーザ ンプロット分析に付した。転写物は活性化細胞中に明らかに存在するが、非刺激 コントロールからのＲＮＡには存在しない。時々少量の転写物がおそらく細胞汚 染のせいで非刺激細胞中でみられるが、しかしながらその転写物は常に刺激で誘 導される。

様々なＣＣＰ群メンバー間における高レベルの相同性のために、交差ハイブリッ ド形成が生じつる。ネズミ遺伝子のケースにおいて、ＣＣＰＩは転写物す′イズ の差異のおかげで他から区別できる。しかしながら、ｈｃｃｐｌ及びｈｃｃｐｘ で検出される転写物は移動性の面で非常に類似している。したがって、高度厳密 洗浄条件を用いて交差ハイブリッド形成を最少化させた。４１℃で洗浄の場合、 １．５ｋｂプローブはヒト及びマウス細胞毒性細胞の双方において転写物を検出 する。しかしながら５５℃のとき、シグナルはマウス転写物との交差ハイブリッ ド形成のせいで、このマウス細胞系が極端に高レベルのプロテアーゼ転写物を発 現するとしても、ヒトＲＮＡでみられる場合よりも著しく低い。ヒト−ヒト及び ヒト−マウス同一性は双方とも約７０％であり、このため我々は活性化ヒト細胞 からのＲＮＡにおいて高度厳密洗浄条件下でみられるシグナルがｈｃｃｐｘ転写 物との特異的ハイブリッド形成のせいであると考えている。

加えて、検出可能なシグナルはＣＥＭ−ＣＭ３、ｃｃＲＦ−ＣＡＭ、ＣＣＲＦ− ３Ｂ　（急性リンパ芽球白血病）　、ＲＰＭＩ　７６６６　（ＥＢＶ形質転換Ｂ リンパ芽球）　、ＤＬＤ−１（ＰＭ、腺癌）　、ＣＲＬ−７０２０（胸腺）　、 ＣＲＬ−７１２３（肺臓）並びに単離されたばかりの新鮮なヒト肺臓細胞及び胸 腺細胞を含めてＡＴＣＣから得られたいくつかのヒト細胞系からのＲＮＡサンプ ルにおいてこのプローブを用いて検出されながった。

烈」− 図７において太線で示された領域のヌクレオチド配列は図８で示されている。こ の配列とネズミＣＣＰ遺伝子の配列との比較では、エキソンに相当する領域にお いて高レベルの相同性（〜７０％同−率）及びイントロンに相当する領域におい て相違性を示した。そのイントロン（図８における下線領域）をそれらがネズミ 配列で生しる場合と正確に同じ位置におくことにより（全部で４つのネズミ遺伝 子は正確に同じ位置でイントロンを有する；Ｌｏｂｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ｇ ）　ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒｙ、２７＋８９４１−６９４６　）　、ｃＤＮＡ の配列が決定できた（図９）。エキソン３．４及び５に相当するｃＤＮＡを単離 し、イントロンの位置関係を確認する。この遺伝子でコードされる予想タンパク 質は鎖長が２４６アミノ酸である（分子量−２７，３１８）。アミノ酸配列は図 ９でヌクレオチド配列の下に示されている。このタンパク質はジエンバンク（Ｇ ｅｎＢａｎｋ）データベースでみられなかった。しかしながら、それは様々なセ リンプロテアーゼと相同性である。最高レベルの同一性は細胞毒性細胞プロテア ーゼ（ヒト７０％）、ネズミ（６１％）、カテプシンＧ（ヒト５７％）及び肥満 細胞プロテアーゼ（４０〜５０％）とであった。加えて、有意レベルの同一性（ 〜３０％）は多くの他のトリプシン及びキモトリプシン様酵素でみられた。この タンパク質はセリンプロテアーゼで、細胞毒性細胞に関連しており、それはヒト 細胞毒性細胞プロテアーゼＸ（ｈ　ｃ　ｃ　ｐ　ｘ＞と呼ばれる。

ｈｃｃｐｘ配列とネズミ遺伝子から予想される配列との並び方（図１０）は高度 の一次配列類似性を示し、ｈｃｃｐｘがＣＣＰ遺伝子と共通した多くの特徴を有 することも示している（Ｂｌｅａｃｋｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）　ＦＥ ＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、２３４：１５３−１５９　）　、　ｈ　ＣＣＰ　Ｘは非常 に塩基性であり（１４％塩基性、６％酸性アミノ酸）、１８残基の疎水性リーダ ー配列の後に成熟プロテアーゼアミノ末端１１ｅ残基に先行する推定チモーゲン ジペプチドを含む。

そのタンパク質の塩基性はプロテオグリカンに結合した顆粒内にそれらを留める 上で役割を果たすと考えられる［５ｔｅｖｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ｇ）　 Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ＩｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉａ ｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４０：９３−１０８］　ｏすべてのｃｃｐ、グランザイム 、ＲＭＣＰＩ及びＩ＋とカテプシンＧでみられる２つの配列＋２１〜＋　２４　 （ｌｉｅ　ｌｉｅ　ＧｌｙＧ＋ｙ）及び＋２９〜＋　３６　（Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　 Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　ＴｙｒＭｅｔ　Ａｌａ）もジスルフィド結合を形成す る６つのシスティン残基の場合のようにｈｃｃｐｘで保存されている（Ｊｅｎｎ ｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ｇ）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　ｌｉｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４０：３３−４８）　ｏセ リンプロテアーゼの活性部位を形成する触媒トライアット残基（図１０で“１゛ でマークされている）はすべて正確な位置に存在している（Ｎｅｕｒａｔｈ　（ １９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ、２２４：３５０）　、セリンプロテアーゼで高度 に保存されるこれらの周囲の配列も保存されている。

ＣＣＰＩ及び２の双方は基質特異性を規定する上で重要と考えられる領域におい て通常にはない残基を含んでいる［Ｌｏｂｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８Ｂ）　５ｃ ｉｅｎｃｅ、２３２：８５８−８８１及びＭｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ ｇ）　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、４：１９０−２０４）　、加えて、それらは他のセリ ンプロテアーゼにおいて基質結合ポケットのサイズを制限する上で重要であるジ スルフィド結合を欠いている。次いで類似の結果が他のＣＣＰ及びグランザイム に関してみられた（Ｂｌｅａｃｋｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１１）ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２３４：１５３−１５９及びＭａｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（ １９８７）Ｃｅ１１．４９・８７９−６８５　］。ここで記載されたプロテアー ゼはこれらの同部位で通常にはない残基も有し、ジスルフィド結合を欠いている 。しかしながら、このタンパク質でみられるアミノ酸のパターン、即ち活性部位 Ｓｅｒに対して−６、＋１５〜＋１７及び＋２５位におけるＴｈｒ、５ｅｒ−Ｔ ｙｒ−Ｇｌｙ及びＧＩｙは現在までに特徴付けられたネズミブロテアーゼのいず れにも相当しない。ｈｃｃｐｘは通常にはない基質特異性も有しているのであろ う。

ｃ　ＤＮＡ含有プラスミドから精製されたインサートをランダムブライミングで 標識し、ヒト中期スプレッドにおける現場ハイブリッド形成用のプローブとして 用いた。

その遺伝子はＱｌｌ、２における染色体１４で単−座に存在している。ｈｃｃＰ ｌについてコードするヒト遺伝子は同領域に位置する。マウスにおいてＣＣＰＩ 、ＣｅＦ２、ＣｅＦ２及びＣｅＦ２についてコードする遺伝子はすべてＴ細胞抗 原レセプター座のα鎖に近い染色体１４に位置している［Ｂｒｕｎｅｔ　ｅｔ　 ａｌ、（１９８Ｂ）　Ｎａｔｕｒｅ、３２２：２８８−２７１）。

例６ Ｃ１ｌてコードされるプロテアーゼＣＣＰＩの三次元構造はコンピューター分析 で予想した。プロテアーゼの構造及びその特徴的基質を予想するための比較分子 モデリングの使用は、未知構造のタンパク質が既知三次元構造のタンパク質と比 較的相同的である場合に特に信頼できる。関連タンパク質及びそれらの基質の既 知三次元構造の大データベースの存在も非常に役立つ。細胞毒性細胞プロテアー ゼのケースにおいて、これら基準の双方が合わせられる。

（ＣＣＰＩ及び他の非関連セリンプロテアーゼに適用されるような）モデル組立 て操作は添付物としてここに含まれるＭｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ｇ） 　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ。

Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４：１９０−２０４で詳細に記 載されている（添付物で言及されるコンピュータープログラムＭＵＴＡＴＥはカ ナダ、アルバータ大学、医学微生物学部のＤｒ、Ｒ，Ｒｅａｄから入手できる） 。簡単には、そのプロセスは未知構造のタンパク質の配列を既知三次元構造のタ ンパク質である鋳型タンパク質の配列と並べてみることで開始する。高度に相同 的なタンパク質のケースにおいて並び方は直接的である：配列が並べられ、鋳型 タンパク質のコンピューター解析モデルが未知タンパク質の構造のモデルを得る ために修正される。次いで鋳型の各アミノ酸の側鎖を未知構造のタンパク質の対 応アミノ酸の側鎖で置き換える。置換え側鎖コンホメーションは可能であれば置 き換えられる側鎖コンホメーション、即ち鋳型のコンホメーションを追跡するた めに調整される。これが可能でなければ、好ましい側鎖アングルは好ましい側鎖 コンホメーションの辞書から選択される。

次の改善としては許容されないほど近い非結合分子内接触を除去するためモデル を調整すること、欠失及び挿入ループの配置を調整することがある。最終ステッ プにおいて請求められた構造はいかなる残留した許容されないほど近い非結合内 容物も除くために調整される。

基質構造の予想はいくつかのタイプの情報から引き出される。この操作はブロモ アーゼの演鐸された三次元構造の試験及びプロテアーゼの触媒部位におけるキー 位置でアミノ酸残基の同一性の分析から開始する。この情報は密接に関連したプ ロテアーゼの基質における反応部位と比較される。次いでその基質の配列はモデ ル化タンパク質の触媒部位と相補的な配列を得るために変えることができる。

ＣＣＰＩの分析では活性部位がヒスチジン、アスパラギン酸及びセリン残基をバ ックに有することを示すが、これはそれがセリンプロテアーゼであることを意味 する。

更にコンピューター分析では、この活性部位がいずれか他の公知真核セリンプロ テアーゼで認識される開裂部位とは異なる開裂部位（Ａｓｐ残基のＣリンケージ と隣接アミノ酸ＰｈｅのＮリンケージとの間）でタンパク質を開裂することを示 した。この演鐸された開裂部位は、天然開裂部位の全部又は一部を模倣すること により、プロテアーゼの活性部位に結合してそれを競合的に阻害できる合成ペプ チドの合成を可能にする。

例７ 基質のアミノ酸残基はＰ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　−Ｐ　−Ｐ　−Ｐ　″と表示され、 プロテアーゼによる開裂はＰ、及びＰ　′の間で生じる。酵素の結合ポケットの 対応相互作用アミノ酸はｓ　ｓ　ｓ　ｓ　ｓ　−ｓ　−５′Ｓ　′と表示され、 例えばＳｌがＰ工と相互作用する。

ＣＣＰＩのコンピューター解析三次元構造では、基質と相互作用しうる結合ポケ ットの残基がＰｒｏ　Ｈ−Ｃｙｓ　４２；Ｈｉｓ　５７−Ａ５ｎ　６５；Ｌｅｕ 　３２；Ｉｌｅ　４１；ｌｌｅ　７３；Ｔｙｒ　１５１；Ｇｌｙ　１５３　；Ｐ ｈｅ　９９；Ｓｅｒ　２１４−Ａｓｐ　２１９；Ｐｈｅ　１９１−８ｅｒ　１９ ５；Ａｒｇ　２２６；及び＾ｓｎ　１７４−Ａｒｇ　１７５であることを示す（ Ｍｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ、。

添付物の１９８−２００頁参照）。最も重要な予想はＳｌがＡｒｇ　２２６に相 当することである。これは開裂部位Ｐ１において酸基質特異性（おそらくＡｓｐ ）を予測する。

この特異性は真核セリンプロテアーゼの中で独特である。

Ｓ２はコンピューター分析によるとＰｈｅ　９９であるらしく、Ｐ２において小 さなアミノ酸、例えばＭａｌを示す。ｓ３及びＳ４における塩基性残基の存在は Ｐ３及びＰ４において酸性残基を予想する。これらの考慮事項から導いて、基質 の残基Ｐ　−Ｐ　−に相当する阻害ペプチドを合成した。これらのペプチドは図 １１で示されている。細胞毒性Ｔリンパ球の細胞毒性に関する阻害剤の効果は表 ３及び４で示されている。

表３ 溶解％ コントロ一ル細胞毒性１５％　１５％　１５％　１５％＋１００μｇ／ｍｌペプ チド　８％　１３％　１２％　９％コントロール細胞毒性３０％　３０％　３０ ％　３０％＋５０μｇ／ｍｌペプチド　１９％　１７％　１７％　２３％細胞毒 性はシクロスポリンＡ誘導混合リンパ球反応（ＣｓＡ−ＭＬＲ）からの細胞で測 定した。肺臓細胞はＲＰＭ１１６４０　Ｃギブコ・ラボラトリーズ（Ｇ　Ｉ　Ｂ ＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、グランドアイランド、ＮＹＥ、１０％（Ｖ／ Ｖ）牛胎児血清（ギブコ・ラボラトリーズ）、１０−’Ｍ２−メルカプトエタノ ール及び１０１Ｍヘベス緩衝液（シグマ、セントルイス、ＭＯ）（ＲＨＦＭ）の 培地中にワイヤメツシュを介して膵臓を押し付けることにより無菌的に得た。レ スポンダ−細胞（１〜２×１０６／１）をＲＨＦＭプラス３００μ１ｇ／ｍｌ　 Ｃｓ　Ａ及び２００単位／１１　インターロイキン２中最終容量４１〔コスタ− （Ｃｏｓｔｅｒ）　６ウエルクラスター〕又は２５１（コスタ−７５ｃ−組織培 養フラスコ）で同数の同種スティミュレーター細胞（Ｃｓ源から１５００ｒａｄ ）と同時培養した。培養物を５％ＣＯ２及び９０％相対湿度中３７℃でインキュ ベートした。−次ＭＬＲ培養物から細胞を回収し、ＲＨＦＭで洗浄し、しかる後 ２〜５Ｘ１０５細胞／１の細胞密度でサイトカインと共に２４又は４８時間にわ たり再培養した。一部の実験において、生存細胞を勾配密度遠心により単離した 。細胞毒性アッセイのため、細胞を丸底微量滴定プレート（最終容量２００μＬ ）中ストン、ＭＡ）で標識された１０４標的細胞と共にインキュベートした。３ ７℃で４時間後、懸濁液１００μＬをカウントのため各ウェルから取出した。特 異的溶解は下記のように計算した： 自然放出は５１Ｃｒ標識された標的のみをインキュベートすることにより得られ 、標的細胞からの全放出では１％ザップーイソトン（Ｚａｐ−１ｓｏｔｏｎ）溶 解剤〔コールター−エレクトロニクス・オブ・カナダ社（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌ ｅｃｔｒｏｎｉｃｓｏｒＣａｎａｄａ、Ｌｔｄ、）、ミシソーガ、オンタリオ〕 と共にインキュベートした。

表４ 未処理　前処理 ペプチド　コントロール　エフェクター　エフェクターＥＦ２３９４　５４％　 ９０％　５８％ＥＦ２３９５　６１％　８６％　７８％ＥＦ２３９６　５４％　 ７３％　５０％ＥＦ２３９７　５４％　８７％　５０％ＥＦ２３９８　５４％　 １０７％　８９％ＥＦ２３６８　５４％　１００％　７５％ＥＦ２３６９　５４ ％　１００％　２８％ＥＦ２３７２　５４％　９７％　３５％ＥＦ２３７３　５ ４％　８７％　４０％ＣｏｎＡ及びインターロイキン２（ＩＬ２）で活性化され た細胞毒性Ｔ細胞における細胞毒性。細胞毒性Ｔ細胞は１０　μｇ／＋ｅｌＣｏ 　ｎ　Ａ及びＩＯＵ／ｗｌＩＬ２を用いて活性化した。細胞溶解活性を標準クロ ム放出アッセイで測定した。標的を１００μｇ／ｓ　ｌペプチドで３時間前処理 し、しかる後前処理された１００μｇ／ｍ　ｌペプチド又は未処理エフェクター のいずれかと混合した。すべての結果は５；１のエフェクタ一対標的においてで ある。結果は表１の凡例で記載されたように計算されている。

例８ 本発明のｃ　ＤＮＡクローンは、豊富な量の精製細胞毒性プロテアーゼを形成す るために、細胞毒性細胞プロテアーゼのコード配列を発現ベクター中に挿入して 発現系で望ましいタンパク質を発現させることにより用いることができる。これ らの操作は当業者に周知である。

精製プロテアーゼの所有は阻害剤分子のデザインのため大いに簡素化された代替 アプローチを可能にする。表３及び４における結果を得るために用いられた極端 に厄介で複雑な免疫学上のアッセイよりもむしろ、所定基質における精製プロテ アーゼの酵素作用は精製プロテアーゼが入手できる場合に直接基質の開裂により 追跡できる（配列特異的プロテアーゼ開裂はＨａｒｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９ ８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ、２３：２９９５−３００２で記載されたような標準チオ エステルベースアッセイで追跡できる）。これによれば多数の潜在的阻害剤を比 較的容易に試験できる。精製プロテアーゼベースアッセイは多数の可能な潜在的 阻害剤をスクリーニングするため単独で又はコンピューター分析で得られた合理 的デザインファクターと組合せて用いることができる。次いで陽性化合物はそれ らの免疫抑制性質に関して試験される。

阻害剤ペプチド合成 本発明の阻害ペプチドは標準固相合成、例えばｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニ ルアミノ酸が０．７５＋ａＭＣＩ−ｇ−１含有クロロメチル樹脂又は０．３５ｍ ＭＮＨｇ−１含有ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂のいずれかに結合され、 しかる後望ましいペプチドを産生するため望ましいアミノ酸残基が連続的に加え られる方法によって製造できる。合成反応はＢｕｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９ ７５）Ｂｉｏｃｈｅｇｉｓｔｒｙ、１４：３８９２及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、 （１９８３）　Ｊ、Ａｉｅｒ。

ＣｈｅＩｌ、Ｓｏｃ、８５：２１４９で記載された装置及び技術を用いてポリエ チレンフリット装備の７０１ポリプロピレンシリンジ中で実施する。カップリン グの完全性は標準ニンヒドリン試験で調べる。Ｃ末端アミノ酸はＳｔｅｗａｒｔ 　ｅｔ　ａｌ、。

５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（固相ペプチ ド合成）（ｖ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ｅｄ、１９７０）又はＰｉｅｔｔａ　ｅｔ 　ａｌ、、１９７０．ｃｈｅｌ。

Ｃｏ＋＋ｖ、６５０で記載された操作を用いて結合させる。合成ペプチドのＨｐ ｌｃ精製はベックマンＯＤＳカラム（１０Ｘ　２５０　ａｍ）を用いて行う。

合成ペプチドのアミノ酸分析は所望であればダーラム（Ｄｕｒｒｕｍ）Ｄ　−５ ００アナライザーを用いて実施する。そのペプチドにおけるンステイニル残基は Ｍｏｏｒｅ（１９６８）の方法の修正法を用いてシスティン酸として定量される が、その場合に１００１ペプチドが０℃で２時間にわたり２．０１過ギ酸（３０ ％Ｈ２ｏ２１１＋８８％ＨＣＯＯＨ９ｍｌ）で酸化される。過ギ酸はＮ２を用い て４０℃でリアクティーサーム（Ｒｅａｃｔ　１−Ｔｈｅｒｌｌ）で除去し、し かる後蒸留水０．５１を残渣に加えて再蒸発させる。

次いで産物は６Ｎ　ＨＣＩを用いて加水分解させる。遊離スルフヒドリル基はＥ ｌｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９５９）の方法を用阻害分子は細胞毒性細胞、例 えば細胞毒性リンパ球の有効な阻害剤である。このような細胞の活性を破壊する 標的細胞の阻害は橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自 己免疫萎縮性胃炎、アジラン病、重症筋無力症、若年型糖尿病、グツドパスチャ ー症候群、尋常性天庖癒、類天庖癒、交感性眼炎、水晶体ブドウ膜炎、自己免疫 溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝 硬変、活動性慢性肝炎ＨＢ　−ｖｅ、特発性肝硬変（一部のケース）、潰癌性大 腸炎、シエーグレン症候群、全身深在性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ジスコイ ドＬＥ、皮膚筋炎、硬皮症、リウマチ様関節炎及び可能であれば多発性硬化症の ような自己免疫疾患にかかった患者と他の哺乳動物、例えば牛のような様々なタ イプの家畜における類似疾患を治療するために用いることができる。このような 阻害は同種移植片（レセプターと同種で遺伝学的に相違するメンバーであるドナ ーからの組織又は器官移植片）拒絶及び移植片対宿主疾患を治療するためにも用 いることができる。

ペプチドは２５〜５００　ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ　、好ましくは５０〜１００　ｍ ｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で哺乳動物に投与できる。哺乳動物に投与された場合（ 例えば経口、静脈内、非経口、経鼻又は半割による）、そのペプチドは細胞を破 壊する細胞毒性１９２３球の能力を阻害し、ひいては前記障害に関して有効な治 療を施すため細胞性免疫応答を阻害する。

細胞毒性リンパ球のみで発現されるプロテアーゼについてコードする遺伝子とハ イブリッド形成しうる核酸プローブ（標準法で製造される）は様々な有用／１イ ブリ・ンド形成アッセイで用いることができる。例えば、このようなプローブは 例えばＣＯＸ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、ｌＯＬ：４８５ の現場ノ＼イブリッド形成法により移植組織で細胞毒性１９２３球をモニターす るために使用できる。移植された組織におけるそのリンノく球の存在は、その組 織力く宿主生物で拒絶されていてかつ適切な免疫療法力く施されるべきであると いう指示である。

そのプローブはリンホカイン活性化キラー細胞の潜在的細胞毒性を評価するため にも使用できる。腫瘍患者を治療する上でこのような細胞の産生及び使用（こつ ０て（よＲｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｎ、Ｅｌ、Ｍｅｄ、 ３Ｌ３：１４８５て記載されている。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇはヒト末梢血リン、＜ 球力曵宿主１こ再導入された場合に腫瘍細胞を攻撃するキラー細胞を産生させる ためにインターロイキン−２（リンホカイン）でどのように治療されるかについ て記載して０る。そのプローブは標準法により治療リン、＜球の核酸との７１イ ブ１ノソド形成アツセイで用いることができる。そのア・ソセイでは細胞におけ るプロテアーゼコード遺伝子の発現レベルを調べることにより活性化キラー細胞 が産生された程度をモニターする。

他の９様も下記請求の範囲内に属する。

相対的　ｍＲＮＡレベル 相対的　ｍＲＮＡレベル 細胞毒性％ ＮＯＯ＋−＋ｋ　Ｌｎ　ｕ）ｅ）ｔ５　ＬＯｕ’５ｃｎｕ＝＋　ｃｏ　ｒ−ロω へＮζへ　ζ　ζ■Ｓ　１．ＯロＮψ　■　ωロω＋ｌ＋ｌ＋１＋−１　ｍ　ｍ ｍｍ　＋−＋　−一一一　−へ−５Ｍへい　い　ｈ哨ｈ ロ　（：）（ＮＯ（Ｎ　へ４へ へ　へへへ　へ　へヘヘ ＦＩＧ、　７ ０Φ　ＣＬＪ　０（０＜　Ｃ）Ｃ！ＯＯＣＪ　Ｏｕ　０りＯｕ　ＯｆＪコφコω コ―コφフＣ／）　ＶＩ＞の＞４−Ｊメコニψシ　コニ二二ニニニ―口し［Ｆ］ ＞　ｌ　＞　ＯＪ■■飄０メ　メーーー〇−一のｍ−−の−ψ−ψ−■−〇−− −−−ω−−−−　−ΦくΦΣΦ（（：ＣＬＤ　Ｃｊ（口くΦくロωロψ−−− −−　ロＯＦ−１１−Ｉ　Ｐ−１００−Ｆ−１−ｆｆ　５　ｊ　ｊ　＋ｒ０００ ００）　００　Ｃ０＞１−≧ロシψ＞口〉し　ψ≧ψ■Ｃロロ０−―　＝コーフ ー２フコココーニーの＋メーーー■　−一メーーーｌ−１−メニ　００のＱ■ω ■■の■ｅ　ｌ−ｔ、り（■−ロ＜ｃりη　＝ローくＱくく乙−←　−一〉−〉 〉−一一一ローーーの００二のの　ののφ　のしのψφψ　−ψ−の口０のψの φ−■■■＋の−ψ−−シ＞＞＞■＞＞＞≧　の≧の一−≧メジ論＜Ｅ＞１＜＜ ＜＜＜＜　（Ｊ−ＣＪ　ｕｃ／）ＬＪ−Ｉｕ−＞−＞−＜＜−一一一ψ−二０Ｃ ＯＣＣＣＣＣＯ：）Ｏ−コーコＯＱ■の一〇−二ｕＣＩ−＞０の−の−ψψのの 　−一一一の　−〇−一　の−と−二ψ：ψニーωく工く乙＜＜＜＜　Ｃりエロ ー〉　ロ―ロ乙　（−−＋　（＋−（ヒくヒＬ−−０１（００１１−０（Ｌ）Ｏ ＯＪ　（１）ＱＯｉＱＣＱ：ｌＱｃ／）Ｑ　ｌ／）Ｌ−ｃｌ’ｌ■の■αの二〇 ■ｃｏｗ−１−、（Ｑ−ｕ−≧φしの−の−の≧の　メメＸ：にψ：ψ二φ＞　 （（（＋−工−乙一　Ｑくくく口くΦ（ＣＪ（Ｃ−１−一エ―乙くユくエロ　０ ０ＩＯ（１）ＯひＯＬ−ψ−φロψ−コ■のの　−≧−〉ニーＸ−≧Ｌ　Ｌ−ｕ ｕ＞ｕｌ−！ｆｆ　＞ｃｏ＞−＞ｒｏｍ−シー　ｃｏ−（ＯＬ、、　（０−ｃｅ ＋　−ｃｏ−Ｑ−乙くニー−く乙ｗ　−＞−＜−＞ｗ＜−＜　＞口＞　（＞　ｌ ｊ　＞　！　＞ｌｊコ　］　コ　コＬコｏ′ｌ　ｅψ＝のＣの二φ二φ　コ０コ ０コ０コＬコ０　コＵＵコフ（ＩＪ（ＩＪ（Ｌ）　■の■Ｌ　−メー洲−メーメ ー≧　の−■−０−■のＱ−υ■■のの一一一　−ω−く　００００００口ＱＱ Ｑ　−ｍ＝（Ｌ−１−ψ−龜　−のの−二部！！！、！！ご二ご！己二ミよ２三 竺三注、＝り粘も藁８＝已＝已竺竺竺氏玩（（（（（（（（＜（−（ロヒーく口 ＳΦヒ　φ−のくのくωくのく　→←ヒくくＱ（：ｅｎＱｅＩＴＱＯＩＱＯＷ） 　Ｌ−）＋ｕｕｌ−１−Ｑｌｌ／）ＣＱ　ｕｕｌ−１−Ｌ−（ｆｉ　ｌ＋　０Ｌ −ｕｏロー−Ｌ＋ψＬ＋のｌ＋φ−一　ニー二ψ：■し−）　■■００■　“　 ｆｆ　Ｌ−ＱＪ４）Ｌ−Ｌ−１−Φ（（＜　（ｃｃ（ｃｍ＝１−　！ｌ−＜ヒψ （１：　：ｌ！：ｕ　Ｃ／）Ｃ／）φφψ　く　ヒ　乙ωの乙龜要　約　書 その分子が投与された哺乳動物において細胞毒性細胞プロテアーゼの生物活性を 阻害することができるペプチド。

国際調査報告 １．、Ｉ＋＋、、、＋＋、、、１４工、、−，−ＰＣＴ／ｌＪｓ９１１００３４ ０ＰＣ丁／１．！１ｉＱ１１００３Ｊｎ ＣｎｎＨｎｕｐｄ　ｆｒｒｍ　ｕｈ卯Ｌ　２　１ｕｕｐｐｌｓ闘ｎｔａｌｌ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＣＰ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクター。
2. ２．ＣＣＰ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクター。
3. ３．ｈＣＣＰ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクター。
4. ４．ｈＣＣＰＸタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクター。
5. ５．請求項２のベクターから発現される実質上純粋なＣＣＰ１タンパク質。
6. ６．請求項３のベクターから発現される実質上純粋なＣＣＰ２タンパク質。
7. ７．請求項４のベクターから発現される実質上純粋なｈＣＣＰ１タンパク質。
8. ８．請求項５のベクターから発現される実質上純粋なｈＣＣＰＸタンパク質。
9. ９．下記式のペプチド： 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】；又は 【配列があります】。