JPH05506365A - Ｈｌａ ｄｑベータｄｎａタイピング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＬＡ　ＤＱベータＤＮＡタイピング 中の出願番号第６３２ｉ８０号の部分継続出願であり、前記出願は１９８９年８ 月１５日出願の同時継続中の出願番号第４９１．２１０号の部分継続出願であり 、前記出願は１９８６年８月２２日出願の現在は放棄された出願番号第８９９． ３４４４の継続出願であり、前記出願は１９８６年３月１３日出願の現在は放棄 された出願番号第８３９．３３１号の部分継続出願であって、それぞれをここに 参考として組入れる。

この発明は、個体のＨＬＡ　ＤＱＢ　（ＤＱベータまたはＤＱＢ）ゲッタイブを 決定するための方法および組成物に関するものである。好適な実施態様において 、本発明は、米国特許第４．６８３．２０２号、４．６８３，１９５号および４ ，９６５．１８８号に開示され、特許請求の範囲に記載された遺伝子増幅方法に 関連する。本発明の方法およびプローブは、クラスＩＩ　ＨＬＡ　ＤＱＢＩ遺伝 子の多形性対立遺伝子の検出に特に関連する。特に、特定のＨＬＡ　ＤＱＢＩ対 立遺伝子の存在または不在は、インツユリン−依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の 発症し易さの指標として機能する。従って本発明は、分子生物学、診断医学、法 医学の分野に関連する。

関連技術の記述 ヒトの主組織適合性複合体のクラス１１位置は、Ｂリンパ球細胞、活性化Ｔリン パ球細胞、マクロファージ、樹状細胞上で発現されるＨＬＡ　Ｄ細胞表面糖蛋白 質をコードする。個々にＤＲ，ＤＱ、ＤＰと称されるこれらの蛋白質は、アルフ ァおよび高度に多形性のベータサブユニットからなる異種二量体であり、ＴＩＨ 胞に対する抗原の提示について応答性である。高度に多形的なベータサブユニッ トにおける変異性は、Ｔ細胞レセプタおよび抗原ペプチド断片と相互作用するも のと考えられているアミノ末端細胞外領域に局在する。ＣＤ４リンパ球細胞のＴ 細胞レセプタによるＨＬＡｍ蛋白質／ペプチド断片複合体の認識は、Ｔ細胞の活 性化に導＜　（Ｂａｂｂｉｔら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１７　：　３５９ −３６１　；Ｂｕｕｓら、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５　：　Ｉ　３５３ −１３５８　：　Ｇｕｉｌｌｅｔら、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５　：　 ８６５−８７０　；　＃よび５ｅｔｔｅ　ら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ　３２８ 　：　３９５−３９９参照）。クラスｆ［ＨＬＡ蛋白質をコードする遺伝子は、 ヒトの第６染色体の短腕部に位置している。これらの遺伝子は、多形性が定義さ れるほとんどの配列が第２のエクソンに局在化して高度に多形性である。ＨＬＡ Ｄ領域の構造、配列および多形性は、ここに参考とじて組入れるＴｒｏｗｓｄａ ｌｅらの、１９８５、［ｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、８５：５−４３に記述されて いる。

ＨＬＡ　Ｄ領域遺伝子産物の多形性は、一般に、血清学的タイピング試薬により 、また同型接合のタイピング細胞（ＨＴＣ）への応答においてＴ細胞増殖が培養 にて測定される混合リンパ球培養（ＭＬＣ）反応によって定義される。ＨＬＡ　 ＤＱＢ１位置の多形性は、ＤＱω１．２．３および４　（ＷＨＯ命名委員会、１ ９９０）の特異性を定義する血清学的タイピング試薬を使用して検出されている 。特異性ＤＱω１は、最近血清学的サブタイプＤＱω５および６に細分化され、 またＤＱω３は、ＤＱω７．８および９に細分化されている。しかしながら、慣 用のタイピングでは、ＤＱω１．ＤＱω２およびＤＱω３特異性しか識別できな い。

細胞的（Ｏｄｕｍら、１９８７、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　２９　：１ ０１−１０９参照）、生化学的（Ｌｏｔｔｅａｕら、１９８７、Ｉｍ＋＋＋ｕｎ ｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２５　：　４０３−４０７参照）、および制限断片及多形 性（ＲＦ　Ｌ　Ｐ　、　Ｈｙｌｄｉｇ　−Ｎ１ｅｌｓｅｎら、１９８７、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｒ、　ＵＳＡ　８４　：　１６４４−１６ ４８、および米国特許第４，５８２，７８８号参照）の分析は、ＨＬＡ領域の多 形性の程度か、示されている血清学的および免疫学的方法より更に拡張されるで あろうことを示している。該ＲＦＬＰ方法は、７種のＤＱ特異性の同定に有用で ある。

しかしながら、ＲＦＬＰ技術は、ある限界を育している。変異配列を保持する対 立遺伝子は、変異ヌクレオチドが分析に使用される制限酵素の認識部位内にある 場合、あるいは多形的制限部位が特定のコード配列変異を伴う非平衡の連結中に ある場合にのみ同定可能である。更に、ＲＦＬＰ分析は、単にコード配列変異が 存在する証拠を与えるのみであって、該変異の正確な性質についての情報を与え るものではない。更にはこの方法は、労力がかかり、また大量の高分子量ＤＮＡ を必要とする。この後者の要求は、ゲノムＤＮＡの分解を生じる条件に置かれて いた試料を排除することになる。

ある種の医学的応用、特には臓器移植の分野において、正確なりＱタイピングは 重要であろう。また、タイピングは、疾患感受性の分子的基礎の研究にも有用で ある。

特に、ＤＱＢ　１およびＤＱＡＩの特定の対立遺伝子は、インシュリン−依存性 真性糖尿病へのかかり易さの指標として機能する（　Ｉ　Ｄ　ＤＭＳＴｏｄｄら 、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ。

３２９　：　５５９−６０４　；Ｈｏｒｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　６０１２−６０１６　；および Ｔｏｄｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ　３３８：５８７）。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の開発は、複雑なゲノムＤＮＡの分析および操 作を容易にした。ＰＣＲ工程は、極めて複雑な核酸混合物から出発して特定の核 酸配列を増幅することを可能とした。この工程は、ここに参考として組入れる米 国特許第４．６８３１９５号、第４．６８３．２０２号、第４，８８９，８１８ 号および第４．９６５．１８８号、ならびにヨーロッパ特許発行番号第２３７． ３６２号および第２５８．０１７号により完全に記述されている。

ＰＣＲ工程は、個体のクラス［Ｉ　ＨＬＡ　ＤＮＡのタイピングをも容易にした 。科学者らは、オリゴヌクレオチドプローブを設計し、これらのプローブを興味 ある配列の増幅に使用することによって、ゲノムＤＮＡのＤＲＢ位置の多形性第 ２エクソンを研究した。５ｃｈａｒｆらの１９８８、Ｈｕｍ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ２２　：　６１−６９の　”５ｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅ　Ｈ ＬＡ　ＤＲＢ　ａｎｄ　ＨＬＡ　ＤＱ　Ｂ　１ｏｃｉ　ｆｒｏｍ　ｔｈｒｅｅ　 Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ　ｖａｌｇａｒｉｓ　ｐａｔｉｅｎｔｓ”を参照。ＨＬＡ　 ＤＰタイピングのＰＣＨに基づく方法は、１９８９年５月４日出願の同時係属中 の出願番号第３４７．５０６号に、またＨＬＡ　ＤＲタイピングは１９９０年１ ２月６日出願の出願番号第６２３．０９８号に記述されており、これらをここに 参考として組入れる。

プライマが、制限酵素認識配列を含む場合には、増幅ＤＮＡを直接に配列決定ベ クター中にクローン化することができ、また増幅生成物のヌクレオチド配列を容 易に決定することができる。５ｈａｒｆらの１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ２３３： １０７６−１０７８による　“Ｄｉｒｅｃｔ　ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ　５ｅｑｕ ｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ　ａｍｐｌｉ Ｎｅｄｇｅｎｏｍｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ”と題された文献参照０該増幅ＤＮＡ は、配列−特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）プローブを使用する検出方法に よっても研究され得る。５ａｉｋｉ　らの、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２４　 ：　１６３−１６６による　”Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｅｎＺｙｍａｔｉｃａ ｌｌｙａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎａｎｄ　ＨＬＡ　ＤＱａ　Ｄ ＮＡｗｉｔｈ　ａｌｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 　ｐｒｏｂｅｓ　”　と題される文献参照。この研究は、試料核酸に対するプロ ーブハイブリダイゼーションを検出するためのド・ノドプロット技術も記述して いる。

本発明は、新規な方法および試薬を提供することによって、効率的で情報が充分 なりＱＢＩ　ＤＮＡタイピング方法に対する必要事項を満足するものである。こ れらの方法および試薬は、本方法によってタイピングされ、かつ同定され得る従 来知られていなかったＤＱＢ　１対立遺伝子の発見を導いた。

本タイピング系は、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡのタイピング（型別）、お よび組織、形質転換系、疾患状態、および細胞株のＤＱＢＩ対立遺伝子の発現に 関するタイピングおよび研究のために使用され得る。腫瘍細胞のようなりＱ抗原 を発現しないか、あるいは異常な血清学的活性を示す細胞は、容易にタイピング され得る。更には通常のものではない供給源、例えば考古学的ＤＮＡまたは記録 保存用試料等も、ＤＮＡ試料が分解され、あるいは分析のために極微量のみが利 用可能である場合にもタイピングされ得る。

ＰＣＲは、標的ＤＮＡ断片を百万倍以上に増幅することが゛でき、また本発明の 系はＰＣＲ生成核酸を使用することができるため、放射標識プローブを必要とせ ず、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の非放射標識に共有的に結合され た非同位体ＳＳＯが、検出のために充分な感度を与える。特異的に結合するＨＲ Ｐ−標識プローブは、発色性染料または化学発光基質による単純なドツトプロッ ト形式で、数分間程度で検出可能である。

発明の要約 本発明は、増幅および検出方法、全体および局所−特異的増幅プライマ、および 非同位体ＳＳＯプローブを提供し、これと同時に血清学的方法では識別できない ものを含めてＨＬＡ　ＤＱＢＩ対立遺伝子のタイピングのための迅速、簡単かつ 正確な系を提供するものである。

−側面において、本発明は試料中の核酸のＤＱＢ　１梨を決定する方法を提供す るもので、この方法は、（ａ）ＤＱＢＩ遺伝子第２エクソンの配列を増幅し、（ ｂ）いずれかの増幅核酸を、プローブが正確に相補的な配列に対してのみハイブ リッドし、該増幅核酸に安定して結合が維持される条件で、オリゴヌクレオチド プローブの組とハイブリッドさせ、および（Ｃ）増幅の生起の育無を測定するこ とを含んでなる。

別の側面において、本発明は本方法で使用するためのオリゴヌクレオチドプライ マを提供する。該プライマは、ＤＱＢ　１遺伝子の対立遺伝子のすべてに対して 特異的であり得、この場合、該プライマはＤＱＢ２　（ＤＸＢ）またはＤＰＢ　 １およびＤＲＢ遺伝子等の密接に関連する対立遺伝子を増幅しない。該プライマ は、特定遺伝子の対立遺伝子のある群について特異的であり得る。

また別の側面において、本発明は、試料中のＤＱＢ　１対立遺伝子の存在を検出 し、また型を決定するためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。該プロー ブは、放射性または非放射性標識により標識され、あるいは固体支持体に固定さ れ、またその両方もあり得る。

最後の側面において、本発明は本発明を実施するためのキットを提供するもので ある。このようなキットは、本発明のオリゴヌクレオチドプローブの１種以上を 含む。

場合により、キットは更に増幅用試薬を更に含み得る。

選択される増幅方法がＰＣＲである場合、そのような試薬はオリゴヌクレオチド プライマを含むが、ある種のキット形態においては熱安定性ポリメラーゼおよび ／またはデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートも実際上有用である。

図面の簡単な記述 図１は、例２に記述されるＤＱＢ　１およびＤＱＢ２の同時増幅の分析を示す。

図２は、例４に記述される非放射性ＨＬＡ　ＤＱＢＩタイピング系の結果を示す 。

本発明の詳細な記述 本発明は、ＨＬＡ　ＤＱＢＩタイピング系およびＤＱＢ１対立遺対立遺伝子分起 用特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯ）を提供する。本発明は、正確な タイピングを容易にする新規なプライマをも提供する。本発明は、ｃＤＮＡテン プレートを含む種々の供給源からの同型接合試料の型別に使用でき、また血清学 的方法によっては識別不能な対立遺伝子変異体の検出に使用することができる。

このタイピング系は、遂行が簡単かつ迅速なドツトプロット形式を使用し、数分 間で検出可能な信号を生成し、また組織のタイピングならびに個体の同定および 疾患感受性の測定に有用であることが示されるであろう。該方法は、従来報告さ れていないＤＱＢＩ対立遺伝子の同定に有用である。

好ましい実施態様において、本発明は、試料中に存在する１５種のＨＬＡ　ＤＱ ＢＩ対立遺伝子のいずれかを識別する方法を提供する。この方法において、１６ 種のＳＳＯおよび１組のプライマ対のみが必要とされる。これらの組成物および 方法は、１２０種の起こり得るＤＱＢｌゲッタイブのうち１１７種の分析を可能 とする。好ましくは、該ＳＳＯは西洋ワサビ接合−５ＳＯ（ＨＲＰ−３ＳＯ）で ある。

母集団中のＤＱＢ位置の多様性およびこれらの位置の多数の対立遺伝子は、特定 のＤＱＢ位置および試料中の核酸が由来する対立遺伝子の同定方法を困難なもの とする。本発明は、この測定に高い特異性を与え、従って試料が採取された特定 の個体を同定するために使用され得る。この識別能力は、本発明の応用を、法医 学の分野へと導く。

ＰＣＲｌまたは他の増幅方法は、極めて少量のＤＮＡ（または分解されたＤＮＡ ）を増幅するために使用することかてきるため、本発明は、頬のスワブ、１本の 毛髪、更には保存された古代の試料由来のＤＮＡ等の通常ではない供給源由来の ＨＬＡ　ＤＱＢＩをタイピングするために使用でき、従って例えば初期ヒト科等 の前史時代の供給源由来の対立遺伝子の分析を可能とする。

本発明に先行して、ヒトＤＱＢＩ対立遺伝子の配列分析は、１５種の異なるアミ ノ酸配列を同定している（Ｅｒｌｉｃｈら、１９９１ＳＤｊａｂｅｔｅｓ　４０ 　（４）　：　４７８−４８　Ｉ　、Ｂｕｇａｗａｎ　ら、ｌ９９１、Ｉｔｎｔ ｎｕｎｏｇｅｎｅｔｒｃｓ　３３：１６３−１７０、Ｈｏｒｎら、１９８８、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　６０１２−６０１６　ＨＳｃｈａｆ　 ら、１９８９、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６ 　：　６２１５−６２］、９．およびＦｒｏｎｅｋら、１９８８、Ａｍ、Ｊ。

Ｍｅｄ、８５　（Ｓｕｐｐｌ　６Ａ）　：　４２−４４）　、　ＰＣＲ増幅は、 霊長目におけるＤＱＢ多形性の系統発生的分析をも可能としくＧｙｌｌｅｎｓｔ ｅｎ　およびＥｒ１ｉｃｈ　、　Ｉ　９８９、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６　：　９４８６−９９９０）、４種の主な対立遺 伝子的系統または型、すなわちＤＱβ１ａ（ＤＱω５に対応）　、　ＤＱ１３　 ｌ　ｂ　（ＤＱω６に対応）、ＤＱβ２、ＤＱβ３およびＤＱβ４を明らかにし た。これらの対立遺伝子型は、積分化に先行し、かつヒト科の系統を発生した先 祖の種においても存在していた。現在知られている１５種のヒトＤＱＢ＋対立遺 伝子は、これらの古代の系統または対立遺伝子型の内で、より最近になって多様 化が生じたものと思われる（　Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ　およびＥｒ１ｊｃｈ　、 　１９９０、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳＡ　８７：１８ ３５−１８３９）。

ＤＱＢ　１位置の対立遺伝子配列の多様性は、現在まで検出可能な血清学的特異 性の数（ｎ＝７）よりもかなり多い（１５種の対立遺伝子）。特に、血清学的に はＤＱω１ならびにサブタイプＤＱω５およびＤＱＢとしてタイピングされる９ 種の異なるＤＱＢ　１が存在する。血清学的に検出できない多形性が、生物学的 特徴に深く関連することもあり得る。例えばＤＱＢ　Ｉ　’０５０３　（Ａｓｐ −５７）および’０５０１　（Ｖａｌ　−５７）および６０５０２　（５ｅｒ− ５７）は、１残基のみが異なり、そしてＤＱＢＩ　”０５０３以外のＤＱω５と しての型が、尋常性天庖癒について高い危険性を与えるが、その他の対立遺伝子 では異なる（　５ｃｈａｒｆらの１９８８、前出文献）。本発明の簡単、迅速か つ正確なりＱＢＩ多形性のタイピング方法は、疾患感受性、組織移植、個体の同 定、および人類学的遺伝学の領域で育用であろう。

本発明の研究面の能力は、直接的臨床的応用を不明確にすることはない。ＭＨＣ の遺伝子および遺伝子産物は、個体の免疫学的状態において中心的役割を演じ、 また特にＭＨＣ遺伝子産物は、疾患耐性および感受性に関連する。本発明は、試 料中のＭＨＣＤＱＢＩ遺伝子生成物の測定を可能とするため、本発明は、医学、 特に診断方法の分野にも応用を存する。

本発明は、ＤＱＢ　ｌ蛋白質生成物を含まないＤＮＡタイピング試料について好 適である。ＤＮＡタイピングをｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡの増幅により行 なうことができるため、本方法は、種々の細胞または組織由来のＨＬＡＤＱＢ　 １の発現の研究を促進し、またＨＬＡ　ＤＱＢＩの発現と、形質転換、自己免疫 、または他の症状との関連性の有無を決定するために使用することができる。

別の側面において、本発明はＩＤＤＭへの感受性の測定方法に関連する。ＩＤＤ Ｍは慢性の自己免疫疾患で、グルコース代謝の１１６が、インシュリンを産生す るランゲルハンス島のベータ細胞の免疫的破壊のために機能不全となる（ε１ｓ ｅｎｂａｒｔｈ、ｌ　９８６、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ。

３１４：１３６０−１３６８）。ＩＤＤＭは、他の多くの自己免疫疾患に加えて 、ＨＬＡ　クラスＵ抗原の血清学的に定義された対立遺伝子と関連付けられてい る（Ｓｖｅｊｇａａｒｄ　ら、１９８３．１ｍｍｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、７０　： 　１９３−２１８、およびＴｉｗａｉ　とＴｅｒａＳａｋｉの、ＨＬＡ　ａｎｄ 　ＤｉｓｅａｓｅＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ　（１９８５、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ）　）。

母集団の研究において、血清学的型ＨＬＡ−ＤＲ３およびＤＲ４は、正の、また ＤＲ２は負の関連をＩＤＤＭに対して育している。更に、影響される同胞対（ｓ ｊｂｌ　ｉｎｇｐａｉｒｓ）に共有されるＨＬＡハブロタイブのパターンＣＴｏ ｍｐｓｏｎおよびＢｏｄｍｅｒ　、８４−９３頁、纒、ＨＬＡ　ａｎｄＤｉｓｅ ａｓｅ　、　Ｄａｕｓｓｅｔ　ａｎｄ　Ｓｖｅｊｇａａｒｄ　、　Ｃｏｐｅｎｈ ａｇｅｎ。

Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ、１９７７　）　、および家族における疾患とＨＬＡの結 合についての分析は、ＩＤＤＭ感受性における第６染色体上のＨＬＡ領域の位置 を示唆している。今日において、希少ＤＲ２１ＤＤＭ患者で同定された異常ＤＲ ２ハブロタイブは、糖尿病に耐性を与える通常のＤＲ２ハブロタイブとは、ＨＬ Ａ　ＤＲＢＩおよびＤＱＢ１位置の両者について異なっている（　Ｔｏｄｄら、 １９８７、Ｎａｔｕｒｅ　３２９　：　５９９−６０４　：Ｈａｒｎら、１９８ ８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳＡ　８５：６０１２− ６０１６：およびＥｒ１ｉｃｈら、１９９０、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３９　：　９ ６−１０３）。

本発明は、ＴＤＤＭ耐性におけるＤＱＢ　１位置の役割を認識する方法を提供す る。例５は、本方法の異常ＩＤＤＭ家系のＤＱＢＩ遺伝子の第２エクソンの特徴 付けに対する応用を記述している。この例は、ＤＲＩおよびＤＲ２ハブロタイブ の分析も記述している（ここに参考として取入れるＥｒ１ｉｃｈらの、１９９１ 　、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　４０（４）：４７８−４８１参照）。この家系におい ては、母方の異常ＤＰＩと父方の異常ＤＲ２ハブロタイブとを受け継いだ３人の すべての同胞はＩＤＤＭを有し、これら２種のハブロタイブの組合せが、この家 系に見られる糖尿病の高い浸透度に関連することを示している。

本方法および組成物の応用は、疾患感受性因子の理解を進める手段を提供する。

更に、この系の識別能力は、高精度のＨＬＡ　ＤＱＢＩ適合が、拒絶または移植 片対宿主疾患の危険性を最小化するために臨界的である潜在的移植提供者のタイ ピングに育用であろう。Ｐｏ１ｌａｋらのｌ　９８３、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、１ｍｍ ｕｎｏ１．　３　：　３　４　１　−　３　５　１　の”Ｍｉｘｅｄ　ｌｙｍｐ ｈｏｃｙｔｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　１ｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　１ｄｅｎｔｉｔｙ　ｆｏｒ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ＨＬＡ 　Ｂ、　ＤＲｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　：　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｌｉｎ ｋａｇｅ　ｄｉｓｅｑｕｉｌｊｂｒｉｕｍａｎｄ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｄ Ｒａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｃ１ａｓｓ　ＩＩｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ“と題され る関連文献参照。疾患感受性の研究は、ＤＱβ対立遺伝子における単一ヌクレオ チドの差異が医学的に有意なものであることを示している。

５ｃｈａｒｆらの、１９８９、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ８６：６２１５−６２１９の、“５ｐｅｃｉｆｉｃ　ＨＬ　ＡＤＱβ　ａ ｎｄ　ＨＬＡ　ＤＲβ１　ａｌｌｅｉｅｓ　ｃｏｎｆｅｒｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉ ｌｉｔｙ　ｔｏ　Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ　ｖｕ１ｇａｒｉｓ’　と題される関連文 献参照。

上記の利点に加えて、本発明は、また従来未知であったＤＱＢ　Ｉ対立遺伝子の 同定方法、および関連プライマ、プローブ、ならびに任意のＤＱＢ　１対立遺伝 子の同定方法を提供する。このタイピング系を使用するＳＳＯプローブハイブリ ダイゼーションの異常パターンは、例５に示されるように新規な対立遺伝子を同 定する。

本発明は、正確なタイピングを容易にする核酸分節増幅用の多くのＤＱＢプライ マを提供する。これらのプライマは、下記表１に示されている。

」−↓ ＧＨ２９ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋７０　５’−ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＴＧ ＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＣＤＢ８６　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：４１　５’−ＣＴＧＣＡ ＧＧＧＴＣＧＴＧＣＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＧＵＧ７１　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ニア２　５’−ＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＧＣＤＢ ３７９　ＳＥＱ　［ＯＮＯニア７　５’−ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＴ ＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡ１５種のＤＱＢＩ対立遺伝子およびＤＱＢ２　（ＤＸＢ） 位置対立遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列リストセクションに 与えられる。各対立遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の識別子は、以下 に与えられる。下記表２および４は、同等な配列情報を、アミノ酸配列で定義さ れる１５種のＨＬＡ　ＤＱＢＩ対立遺伝子のいくつかは、静かな多形性に基づく サブタイプを存している。例えば、２種類の異なるＤＱＢ１″″０５０３　（従 来ＤＱβ１．３）のヌクレオチド配列（５７位のＡｓｐコドンについてＧＡＣ対 Ｇ　Ａ　Ｔ　；　５ｃｈａｒｆら、１９８９、前出文献参照）および２種類のＤ ＱＢ　１”０３０１（３８位のＡｌａコドンについてＧＣＧ対０ＣＡ）が同定さ れている。これらのサブタイプは、本方法において開示されているプローブによ り検出される。更に、２種類のＤＱＢＩ　”０３０３ヌクレオチド配列が報告さ れている（“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｈ ｅＨＬＡ　ｓｙｓｔｅｍ　”　１９９０、［ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３３ 　：　３０１−３０９）。

対立遺伝子　ヌクレオチド配列　アミノ酸配列ＤＱＢ　１．Ｉ　ＳＥＱ　［Ｄ’ ＮＯ・Ｉ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ＤＱＢ　１．２　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：３　Ｓ ＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：４ＤＱ８１．３　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：５　ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：６ＤＱＢ　１．４　ＳＥＱ　［ＤＮＯニア　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８ＤＱ Ｂ　１．５　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１０ＤＱＢ　１． ６　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ＝１１　ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ：１２ＤＱＢ　１．７　Ｓ ＥＱ　１０　ＮＯ：１３　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１４ＤＱＢ　１．８　ＳＥＱ　 ［ＯＮＯ：１５　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６ＤＱＢ　１．９　ＳＥＱ　１０　Ｎ Ｏ：１７　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ｌ８ＤＱＢ　２　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１９　 ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２０ＤＱＢ　３．２　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１　ＳＥＱ 　ｒＤ　ＮＯ：２２ＤＱＢ　３．３　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２３　ＳＥＱ　［Ｄ 　ＮＯ：２４ＤＱＢ　３．１　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：２５　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ： ２６ＤＱＢ　４．Ｉ　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：２７　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２８ＤＱ ８４．２　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：３０ＤＸＢ　ＳＥ Ｑ　［Ｄ　ＮＯ：３１　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：３２表２は、１５種のＤＱＢＩ対立 遺伝子のアミノ酸配列の整列およびＤＱＢ２　（ＤＸＢ）位置の配列を示す。Ｄ ＱＢＩ　”０３０２対立遺伝子は、１文字コードで記された共有配列を与える。

配列の相同性は、破線により示され、また文字は多形的残基を示している。プラ イマアニール化の位置が、示されたコードされるアミノ酸に相対的に、各プライ マについて示されている。各対立遺伝子の血清学的ＤＱω型も知られている場合 には示されている。命名されていない対立遺伝子および壓は、　“？″で示され ている。

表２ ＨＬ　Ａ　Ｉ）　Ｑ　Ｂ　１アミノ酸配列の整列表２に示されるプライマＧＨ２ ８およびＧＨ２９は、すべてのＨＬＡ　ＤＱＢ対立遺伝子の増幅に使用された（ 　Ｈｏｒｎら、１９８８、前出文献参照）。しかしながら、このプライマ対はＤ ＱＢＩ遺伝子の第２エクソン全体を増幅するものではなく、従っていくつかの多 形性領域の検出が妨げられた。更に、このプライマ対は、ＤＱＢ２対立遺伝子を 同時に増幅した。本発明は、ＤＱＢＩ対立遺伝子を増幅するが、連結する偽遺伝 子であるＤＱＢ２は増幅しない“ＤＱＢ　１特異的″ＰＣＲプライマを提供する ものである。また、本発明は、“群特異的”プライマを提供する。例えば、群特 異的プライマ対ＤＢＩ３０／ＤＢ８６は、ＤＱＢ　Ｉ°０２、ＤＱＢｌ”０３お よびＤＱＢｌ”０４対立遺伝子を増幅する。群特異的プライマ対ＤＢ　＋　３０ ／ＵＧ７１は、ＤＱＢｌ”０５およびＤＱＢｌ”０６対立遺伝子を増幅する。

該ＤＱＢＩ特異的プライマ対ＤＢ１３０／ＤＢＩ３１およびＤＢ　１３０／ＧＨ ２９は、ＤＱＢ　１に特異的であってＤＢ２を増幅しない。プライマＤＢ　ｌ　 ３０は、ＤＱＢ２と合致しない４個の塩基対を有している。プライマＤＢ１３１ は、プライマの３′末端から２番目の位置にＤＱＢ２と合致しない１個の塩基対 を含み、更にプライマの３′末端から３番目の位置に、ＤＱＢＩおよびＤＱＢ２ の両者に対して合致しない塩基対を含む。プライマ対ＤＢ１３０／ＤＢ１３１に よる増幅は、アミノ酸７８−９０をコードする第２エクソンの多形的配列の分析 を可能とする。この領域は、プライマ対ＤＢ　１３０／ＧＨ２９を用いて増幅さ れる配列の外側にある。しかしながら、プライマ対ＤＢ１３０／ＤＢ１３１は、 ＤＱＢ１．４（ＤＱＢ　１”　０６０１）を効率的に増幅できず、一方、プライ マ対ＤＢ　１３０／ＧＨ２９は、ＤＱＢｌ”０６０１を含めてすべてのＤＱＢＩ 対立遺伝子を効率的に増幅する。

プライマ対ＤＢ　１３０／ＧＨ２９は、ＤＱＢｌ”０４のコドン７８における静 かな多形性ＧＴＧ対ＧＴＡが、ＤＱＢｌ”０４対立遺伝子にハイブリッドさせた 場合に、プライマの３′末端から３ヌクレオチド離れて不一致を生じるにもかか わらず、ＤＱＢ　１対立遺伝子のすべてを効率的に増幅する。すべての対立遺伝 子の効率的増幅を確実なものとするために、アニール温度を低下させる、すなわ ち５５℃とすることもできる。

増幅に続いて、タイピングのためにＳＳＯプローブが使用される。対照プローブ は、ＤＱＢ　ｌの増幅が起きたか否かを測定するために使用した。ＤＱＢＩ　“ ＡＬＬ“プローブＵＧ８６は、ＤＱＢ２またはＤＱＢＩ”０４０１にはハイブリ ッドしない。本発明の１６種のプローブは、１５種のＤＱＢＩ対立遺伝子を識別 する。表ｒ［ｒは、これら１６種のプローブの各々の配列、対立遺伝子特異性な らびにハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を示す。

表３ 各プローブは、０．５％ＳＤＳおよび５ＳＰＥを上記表３に示される濃度および 温度において含むハイブリダイゼーション溶液（例えば、ＤＢ８０のためのハイ ブリダイゼーション溶液は０．５ＸＳＳＰＥを含む）と共に使用した。洗浄は、 Ｏ，ｌＸ５ＳＰＥと０．１％ＳＤＳを含む溶液中で、上記表３に示す温度におい て１０分間行なった。

プローブＤＢ１１４およびＤＢＩＩ５は、５７位のＡｓｐコドンについての静か な多形性、ＧＡＣ（ＤＱＢｌ、３．１）対Ｇ　Ａ　Ｔ　（Ｄ　Ｑ　Ｂ　１．３． ２）　（Ｓｃｈａｒｆら、１９８９、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８６　：　６２１５−６２１９）を 識別した。プローブＤＢ５１もまた、３８位のＡｌａコドンについての静かな多 形性、ＧＣＧ　（ＤＱＢ３．１．２）対ＧＣＡ　（ＤＱＢ３．１．１）を検出し 、これは同型接合１．７または１．８の固体を、１．７または１．８異型接合の 個体から識別するために有用である。

ＳＳＯと称される本発明の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは、本方法に おいて適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で使用した場合に、極 めて特異的に単一ヌクレオチド多形性を識別し得る。本発明のＳＳｏは、ＲＦＬ Ｐ法で使用されるプローブとは異なって、対立遺伝子が異なることのみならず、 対立遺伝子のどこがどのように異なるかを検出するために使用できる。

ＨＬＡ　ＤＱＢ１位置の広範囲の対立遺伝子の多様性は、他のクラスＩＩベータ 遺伝子と同様に主として第２工クソンに局在化している。一般に、第２エクソン 配列多形性のパターンは、種々の異なる対立遺伝子に見出される多形性分節の特 定の変異体を伴ってパッチワーク様である。原理的には、異なる対立遺伝子間で 共育されるそのようなエピトープは、共通の祖先、遺伝子変換、または収れん進 化を反映するであろう。オリゴヌクレオチドタイピングの目的では、この多形性 のパッチワークパターンは、多くの対立遺伝子が単一のオリゴヌクレオチドプロ ーブに対するハイブリダイゼーションによっては同定できず、代わりに、プロー ブのパネルとのハイブリダイゼーションの固有のパターンによって同定されるこ とを意味する。

表４は、ＨＬＡ　ＤＱＢＩ対立遺伝子およびＤＱＢ２（ＤＢＸ）位置のヌクレオ チド配列の整列を示す。局所的ＤＱＢＩ対立遺伝子の命名は、左側に示され、右 側は公的なＷＨＯＨＬＡの命名を示す。プローブのハイブリダイゼーション部位 も表中に示され、アステリスク（１）は、プローブ配列が非コード鎖と同等であ ることを示す。ＤＱＢＩ”　０３０２対立遺伝子のヌクレオチド配列が示され、 他の対立遺伝子についてはＤＱＢｌ”０３０２と異なるもののみが示され、また −は配列の同等性を示す。

表４ ＨＬＡ　ＤＱＢＩヌクレオチド配列 表４−続き タイピングに使用された１６ｐ１のＳＳＯプローブ中の８種は、コドン５３−５ ７近傍の最も変化し易い領域に位置している。他の８種のプローブは、表４に示 したように第２エクソンの他の５個の多形性領域に位置している。一般的に、個 体試料のＤＱＢ　ｌゲッタイブは、これらの１６種のプローブのハイブリダイゼ ーションパターンから推量される。表５は、どのような固存のプローブハイブリ ダイゼーションパターンが各ＤＱＢＩ対立遺伝子に対応するか示している。

発明プローブのＨＲＰ−３ＳＯは、示されるハイブリダイゼーションおよび洗浄 条件下で極めて特異的である。

同型接合３．１試料を異型接合３．１．３．３試料から識別すべきプローブＤ８ １５８は、３．２対立遺伝子に対してわずかに交差ハイブリッドする。下記の例 は、既知の同室接合および異型接合細胞株の非放射活性タイピングのためのこれ らのプローブの使用を例示するものである。表５に示された１６種のプローブの 組は、以下の異型接合性ゲッタイブ：１．５．１．７　：１．５＋　１．８　、 および１．６゜１．８型の３組については区別しない。これらのゲッタイブを識 別するには更にプローブが必要である。

本発明のＨＲＰ−３ＳＯは、使用が容易でかつ検出可能な信号が迅速に生成され る（典型的には１−１０分間）発色性または化学発光性基質を使用する検出方法 を可能とする。該ＨＲＰ−３ＳＯは、４°Ｃにて保存された場合には、活性の検 出可能な損失を生ずることなく２年間以上安定である。　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏ ｌｓ　：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　（Ｉｎｎｉｓ、　Ｇｅ１ｆ ａｎｄ、　５ｎｉｎｓｋｙおよびＷｈｉｔｅ　ａｌＳＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、　Ｉｎｃ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）中の、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ　およびＣｈ ａｎｇによる　“Ｎｏｎｊｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｌａｂｅｌｅｄ　ｐｒｏｖｅｓ 　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ”と題される文献参照０放射標識プローブを使用でき るが、本発明の重要な利点である優れた感度のため、必要ではない。検出のため のドツトプロット様式は、多数の試料の迅速なタイピングを可能とし、またＨＬ Ａ　ＤＱＢＩの対立遺伝子の頻度の測定に任用であろう。最近開発されたＰ　Ｃ Ｒ／Ｓ　Ｓ　ＯＤＱヘータタイピングの別法は、固定化ドツトプロット様式であ る。ここに参考として取入れる５ａｉｋｉ　らの１９８９、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６　：　６２３０−６２３４の＋Ｇｅ ｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｍｐＨｆ：ｅｄ　ＤＮＡｗｉｔｈ　ｒ ｔｎｔｎａｂｒｌｉｚｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｏＩｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｓ”と題される文献、および１９８９年１１月 ３０日出願の同時係属中の出願番号第３４７，４９５号を参照。

この方法においては、ＳＳＯプローブがフィルタに固定され（増幅ＤＮＡではな く）、−従って“逆ドツトプロット”と称される。

逆ドツトプロット法は、分析されるべき単一試料の、固定化プローブの列を含む 膜との単一のハイブリダイゼーションを許容する。慣用のドツトプロット様式は 、試料の数が使用するプローブの数を越える場合（例えば患者対対照または遺伝 研究の母集団）に育用である。逆ドットブａット様式は、臨床、診断および法医 学分析等のプローブより少ない数の試料の場合に育用である。

ここに開示されるプローブのパネルは、現在知られている１５種のＤＱＢ　ｌ対 立遺伝子の識別のみならず、プローブハイブリダイゼーションの新たなパターン により明らかにされる新たな対立遺伝子の検出も可能である。

新規なりＱＢ　１対立遺伝子１．９は、最初はＩＤＤＭ患者および彼の母親から の試料におけるＳＳＯプローブハイブリダイゼーションの異常パターンにより同 定され、次いでこれらの試料由来のＰＣＲ生成物のクローニングおよび配列決定 により確認された（例５参照）。この対立遺伝子は、第２エクソン配列のほとん どを、ＤＱＢ　＋”０５０２と共通に、また第３の高変異性領域をＤＱＢｌ　０ ０４と共通にして、　”組換え２対立遺伝子のように見える。

本発明は、ＨＬＡ　ＤＱＢＩタイピング用キットとして商業化に適している。こ のキットは、ＤＱＢ　１対立遺伝子タイピング用のプローブを含む。このような キットは、ＰＣＲまたは他の増幅手段のための試薬を含んでもよく、このような 試薬は、オリゴヌクレオチドプライマ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびヌ クレオシドトリホスフェートを含む。

以下の例は、本発明の例示的実施ｔＩ！様を示す。例は、本発明が、好適な実施 態様において、異なる供給源に由来する種々の試料について、簡単、迅速かつ正 確なりＱＢｌタイピングが可能なＨＬＡ　ＤＱＢＩタイピングのための非同位体 的ＰＣＲ／ＳＳＯ系を提供することが示ＨＬＡ　ＤＱＢ増幅条件の至適化 ヒトゲノムＤＮＡ、０．５−１．０μｇを、ここに参考として取入れる５ａｉｋ ｔ　らの、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９　：４８９−４９１中の”Ｐｒｉ ｍｅｒ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｍｐｌｉｆｉｃａｔＩｏｎ　 ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｔｈｅｒ＋ｎｏｓｔａｂｌｅ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙ ｍｅｒａｓｅ　’と題される文献、および５ｃｈａｒｆら、１９８Ｂ、Ｊ（１１ １１１，ｒｔｎｍｕｎｏｌ、　２２　：　６１−６９、および５ｃｈａｒｆら、 １９８９　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ロＳＡ　８６：６２１ ５−６２１９に記述されているように増幅した。試料ＤＮＡは、細胞株ＬＧＺお よびＬＵＶから回収され、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを含むｌＯｏμｌの 反応物中で増幅された。各プライマの組および１ｇＣ１ｔ濃度に対して３種類の 異なる温度プロフィールのＰＣＲを評価した。すべての増幅反応は、ＰＥＣＩサ ーマルサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ　ｆ！Ｉｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ｆｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ。

ＣＴ）およびＴａｑポリメラーゼを使用して行なった。

試料は、３５サイクルで増幅された。３段階ＰＣＲプロフィールは、９４℃で１ 分間のＤＮＡの変性、５５℃で３０秒間のプライマのアニール化、および７２℃ で３０秒間のＴａｑポリメラーゼによるプライマの伸長を含む。

２段階ＰＣＲプロフィールは、９４℃で１分間のＤＮＡの変性、および、６０゛ Ｃまたは６５°Ｃのいずれかで４０秒間のプライマのアニール化および伸長を含 んだ。負の対照（ＤＮＡ無し）を、汚染の検査のために常に含めた。

３μｍの増幅生成物を、３％ヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）、１％アガロースゲル に、増幅効率を監視するために負荷した。

プライマＧＨ２８、ＧＨ２９、ＤＢ１３０およびＤＢ３６０℃のアニール化およ び伸長工程によって増幅された試料が、他の試料の背景をほとんど、または全く 伴わずにより特異的な生成物を与え、またすべての場合において、１．５ｍＭの ＭｇＣ１ｔを含む反応緩衝溶液が、２．５　ｍＭのＭｇＣ１５を含む反応緩衝溶 液よりも高い特異性および効率的増幅を与えた。

例２ ＤＱＢＩおよびＤＱＢ２の同時増幅 例１に記述したプライマ対および反応条件が、ＤＱＢｌおよびＤＱＢ２を同時増 幅するか否か測定するために、同じ反応をＬＵＹ細胞株由来のＤＮＡを用いて反 復した。

増幅後、増幅ＤＮＡの小部分を変性させ、一連のナイロンフィルタに適用した。

次いで、これらのドツトプロットを次のようにＤＱＢ２およびＤＱＢＩ　“ＡＬ Ｌ”プローブとハイブリダイズさせた。各フィルタを、ハイブリダイゼーション 緩衝溶液中で、標識プローブのひとつと共にインキュベートした。各ＳＳＯプロ ーブは、非同位体的検出のために西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有 的に接合されている。

ドツトプロットを調製するために、各増幅ＤＮＡ試料の約５μｌを、０．４　Ｍ 　ＮａＯＨおよび２５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む変性溶液の９５μｌと混合し、得ら れた混合物をドツトプロットマニホルド（Ｂｉｏｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 　ＣＡ）を用いてあらかじめ湿らせた（水または２ＸＳＳＰＥ）ナイロンフィル タ（Ｂｉｏ　Ｄｙｎｅ　Ｂ、　Ｐａ１ｌ　Ｃｏｒｐ、、Ｇｌｅｎ　Ｃｏｖｅｒ。

ＮＹ、またはＧｅｎａｔｒａｎ　４５．　Ｐｌａｓｃｏ；Ｗｏｂｕｒｎ、　ＭＡ ）　ｌ、−適用した。２つ−組みの膜を調製した。ＤＮＡは、５ｔｒａｔａｌｉ ｎｋｅｒ”　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）　ＵＶラ イトボックスにより５０　ｍＪ／　ｃｍ”の線量で紫外線照射することによりナ イロンフィルタ上に固定した。

膜へをハイブリダイゼーション緩衝溶液中でＤＱＢ　２プローブＧＨ６３（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ、７１；５’−ＣＴＣＧＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＧ−３’　 ）と共に、また膜ＢをＨＲＰ−標識ＤＱ８１　″ＡＬＬ’プローブＵＧ８６（Ｓ ＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ、７４；５’−ＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡ− ３’　）　と共にインキュベートした。ハイブリダイゼーションを３ＸＳＳＰＥ 、０．５％ＳＤＳ中で５０°Ｃにて３０分間行なわせ、次いで０、ｌＸ５ＳＰＥ 、０．１％ＳＤＳを用いて４２°Ｃ水浴中で１０分間洗浄した。プローブＵＧ８ ６は、ＤＱＢ２またはＤＱＢ　１　°０４０１対立遺伝子とはハイブリッドしな い。プローブＧＨ６３（非コード配列）は、ＤＱＢ　２のみとハイブリッドする 。

ハイブリッドしたプローブの存在は、化学発光性基質（Ｅ　ＣＬ　；　Ａｍｅｒ ｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　ｒＬ）により、あるいは発 色染料基質ＴＭＢ　（３，３’、５．５’−テトラメチルベンジジン（Ｆｌｕｋ ａ　；　Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、　ＮＹ）により検出され、ＴＭＢは過酸化水素 の存在下、ＨＲＰによって青色沈殿に変換される。すべてのインキュベーション は室温にて、中程度の攪拌による。化学発光検出については、厳密な洗浄が行な われ、また、膜はｌ×ダルベフコＰＢＳ中でインキュベートされ、次いでＥＣＬ 検出キット中に１分間置き、Ｘ−線フィルムに１−５分間露光させた。

ＴＭＢを用いた検出のため、膜を緩衝溶液Ｃ（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、 ｐＨ５）中で５分間すすぎ、次いで０．１　ｍｇ／ｍｌのＴＭＢ　（保存はエタ ノール中２ｍｇ／ｍｌ）および０．０００１５％Ｈ２Ｏ２を含む緩衝溶液Ｃにて ２−１０分間インキュベートする。反応を、膜を０．０１Ｘ緩衝溶液Ｃですすぐ ことにより停止させ、次いで膜を記録のために写真撮影した。ＨＲＰ−標識オリ ゴヌクレオチド（７）ＴＭＢｉ：基づく検出用の試薬は、Ｐｅｒｋｉｎ−εＩｍ ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから商業的に入手可能であり、それ らの使用の詳細のプロトコールは、Ａｍｐｌｉ　Ｔｙｐｅ　Ｄ　Ｑ　ａ　ＤＮＡ 　’ｒｙｐｉｎｇ　Ｋｉｔ中の挿入物として入手可能であり、これをここに参考 として組入れる。

図１に示されるように、ドツトプロットの結果は、プライマＧＨ２８およびＧＨ ２９を用いて増幅された試料１および２は、両プローブにハイブリッドし、両部 位がほぼ同程度増幅されたことを示唆している。ＤＢ　１３０およびＤＢ１３１ を用いて３種の異なるアニール化温度で増幅された試料は、ＤＱＢ２プローブに ハイブリッドせず、一方、ＧＨ２８およびＤＢ１３１、またはＤＢＩ３０および ＧＨ２９を用いて増幅された試料は、ＤＱＢ２プローブと極めてわずかにハイブ リッドした。

例１および２のＰＣＲ増幅およびドツトプロットの結果は、ＤＢＩ　３０／ＤＢ Ｉ　３１プライマ対が、ＤＱＢ　１に特異的であり、ＤＱＢ２を増幅しないこと を示しており、従ってこれが一般のＤＱタイピングに好ましい対であることを示 している。更なる試験において、同型接合タイピング細胞（ＨＴＣ）株由来のＤ ＮＡ試料が、例１に記載されたようにして増幅された。興味深いことに、ＤＱＢ １．４　（ＤＱＢＩ　”０６０１）対立遺伝子は、ＤＢ１３０／ＤＢＩ３１プラ イマによる増幅が６５°Ｃにおいてはなされず、しかしながら、アニール化温度 が６０”Ｃまたは５５°Ｃまで下げられると、若干非効率的ではあるが該対立遺 伝子は増幅される。プライマ対ＤＢ　１３０／ＧＨ２９は、すべての公知のＤＱ Ｂ　１対立遺伝子を、ＧＨ２９プライマのハイブリダイゼーション領域のコドン ７８における静かな多形性（ＧＴＧ対ＧＴＡ）に帰因する不一致にもかかわらず 、特異的かつ効率的に増幅した。

ＤＱＢＩ　’０４０２対立遺伝子は、ＤＢ　１３０およびＤＢ１３１を用いた増 幅により決定したように、ＧＨ２９の３′末端から３個のヌクレオシドが不一致 であった（Ａ−Ａ）、にもかかわらず、ＨＴＣｓ　ＡＲＣ，ＯＬＮおよびＲ３Ｈ 由来のＤＱＢＩ　”０４０２対立遺伝子ならびに同じコドン７８　（ＧＴＡ）を 存する異型接合試料は、プライマ対ＤＢ　１３０／ＧＨ２９によって増幅し、前 記不一致が増幅を妨げないことを示している。しかして、該プライマ対ＤＢ　１ ３０／ＧＨ２９は、一定のＤＱＢｌタイピングのために好適な、必須の“位置特 異性”および“対立遺伝子範囲″を存している。

既に配列決定されている同型接合および異型接合細胞株を、ＨＬＡ　ＤＱＢＩタ イピングのための１６種のプローブ系の好適さを示すために使用した。１０種の 異なる細胞株由来のゲノムＤＮＡを、前述したようにプライマＤＢ１３０および ＧＨ２９、またはプライマＤＢ１３０およびＤＢ１３１を用いて、次の温度プロ フィールにて３５サイクルで増幅した７９４℃にてテンプレート変性を１分間お よび５５℃または６０°Ｃにてプライマのアニールおよび伸長を４０秒間。５μ ＩのＲＣＲ増幅生成物を、増幅に続いて膜上にスポットした。充分な増幅ＤＮＡ および変性溶液を、Ｉ６の複製膜を作るために調製した。一般に、増幅ＤＮＡが 限定的である場合、膜は０゜５％亜硫酸ナトリウム中、室温にて１０−２０分分 間上うして脱色され、ハイブリッドプローブは、該紙片を７０℃にて０．Ｉ　Ｘ ５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で１時間インキュベートすることにより除去される 。膜は、次いで再度ハイブリダイズされ得る。

膜は、表３に記載された１６種のＨＲＰ−標識プローブのそれぞれに、３０分− １時間で、ハイブリダイゼーション溶液ｍｌあたり１．５ρｍｏｌｅ使用してハ イブリッドされた。表３は、各プローブについて、配列、ハイブリダイゼーショ ンおよび洗浄条件を示す。図２は、既知の同型接合および異型接合細胞株に対す るＤＱＢＩタイピングの結果を示している。この図中、プローブの名称およびプ ローブ領域にコードされるアミノ酸配列を右側に示し、試料名を上に記しである 。

ＨＲＰ−標識プローブはいずれも、ここで使用されるハイブリダイゼーションお よび洗浄条件下、ＤＢ１５８プローブを除いて高度に特異的であり、同型接合３ ．１試料を異型接合３．Ｌ３．３試料から区別する。このプローブは、３．２対 立遺伝子とわずかに交差ハイブリッドする。

表６は、１０種の異なる試料に対するプローブの反応性に基づいたＤＱＢ　１ゲ ツタイブの付与を示し、ここで２種の試料は異型接合細胞株である。局部指示（ ｌｏｃａｌｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）は、プローブ特異性を示すために使用した 。

ＨＬＡ委員会の命名は、右側に示した。コンピュータアルゴリズムは、与えられ た試料について得られたプローブハイブリダイゼーションパターンを入力するこ とによってＤＱＢ　ｌゲッタイブを与えるように設計されている。

このようなプログラムは、１２０の可能なゲッタイブ中、わずか３種のみがこの プローブのパネルによって解析されないことを計算した。このプローブのパネル により解析されなかった３種のゲッタイブは、異型接合ゲッタイブ、１．５．　 ’１．７．１．５．１．８　；および１．６，１．８である。

例５ 新たなＨＬＡ　ＤＱＢＩ対立遺伝子の同定２人のＨＬＡが同じ同胞（ｓｉｂｌｉ ｎｇｓ）　（ＤＲＩ／ＤＲ２）がＩＤＤＭを育しく　Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、 １９８５、Ｄｉａ−ｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ８　：　４７７−４８０）　、第３（ やはりＤＲＩ／ＤＲ２）が最近ＩＤＤＭを発症したかなり異常な家系が同定され た。この家系において３人の同胞は母系ＤＲ１および父系ＤＲ２ハブロタイブを 共通して育し、すべてがＩＤＤＭならびに島抗体を育する。この衝撃的パターン は、これら２種のハブロタイブがあらかじめＩＤＤＭの傾向をもつことを示唆し ている。この家系における感受性の対立遺伝子を同定するために、２種のあらか じめ傾向をもったハブロタイブのＤＱＢＩ、ＤＲＢＩおよびＤＲＢ５位置の多形 的第２エクソンの配列を決定した（Ｅｒｌｉｃｈら、１９９１　、　Ｄｉａｂｅ ｔｅｓ前出文献参照）。

同胞および両親からのゲノムＤＮＡ試料を得た。ポリメラーゼ連鎖反応増幅およ びＨＬＡ　ＤＱＡ１位置のオリゴヌクレオチドタイピングは、ＰＥＣＩにより販 売されているＡｍｐｌｉ　Ｔｙｐｅ”　Ｄ　Ｑ　ａ　Ｄ　Ｎ　Ａタイピングキッ ト用の指示マニュアルに記載されているように行なった。

１００μ１（７）反応物は、標準ＰＣＲ塩、２００μＭ（７）各ｄＮＴＰ　、１ 　μｇのゲノムＤＮＡおよび２，５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐ　Ｅ　ＣＩ、 　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ、　Ａｍｐｌｉ　Ｔａｑ”　ＤＮＡポリメラーゼ）を 含み、３５サイクルについて：９５°Ｃで１分間の変性、５５°Ｃで３０秒間の アニソール化、および７２°Ｃで４５秒間の伸長がプログラムされたＰＥＣｌサ ーマルサイクラ−で反応を行なった。

ＰＣＲ生成物を、次いでＢａｍ旧およびＰｓｔ　Ｅ制限エンドヌクレアーゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）で消化し、フェノール：クロロホル ム抽出で精製し、そしてＣｅｎｔｒｉ−ｃｏｎ　３０　（Ａｍｉｃｏｎ）で透析 し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりＭ１３ａ＋ｐｌＢ中に連結した。得られた連結Ｄ ＮＡによってＥ、ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｇ　９８を形質転換し、該形質転換体をプラー ク調製に使用し、これを適切な位置のためにニックトランスレーションされたｃ ＤＮＡプローブを用いてプローブにかけた。正のプラークをＤ０９８のプレート に感染させるために使用し、融合プレートを翌朝Ｌｕｒｊａ培地（５ｍｌ）中に て靜かに振とうしつつ抽出した。テンプレートＤＮＡを興味ある各クローンにつ いてｍ製し、次いで配列決定した。多重ＰＣＲ、クローニング、および配列決定 反応を、新規配列の確認のために行ない、人工的ハイブリッドを生じる可能性が ある取込みの失敗が起こらず、シャフリングのミスプライム（Ｓａｉｋｉ　ら、 １９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９　：　４８７−４９１）が含まれていないこ とを確認した。ＤＮＡ配列決定は、ジデオキシ鎖停止方法（Ｓａｎｇｅｒら、１ ９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７）で行なった。ＤＱＢＩＤＮＡ配列は、オリ ゴヌクレオチドタイピングにより確認した。

ＤＲＩ／ＤＲ２同胞、母親および父親からのＤＮＡ試料を、ＤＱアルファ、ＤＱ Ｂ　１およびＤＲＢ位置のＰＣＲ増幅によって分析し、増幅ＤＮＡをＭ１３クロ ーニングにより特徴付けし、そしてジデオキシ鎖停止配列決定し、またＳＳＯプ ローブを用いたドツトプロットハイブリダイゼーションで特徴付けた（Ｅｒｌｊ ｃｈおよびＢｕｇａｗａｎ、１　９　３−２　９　８　頁、　Ｐ　ＣＲＴｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　 ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　。

Ｅｒｌｉｃｈ編、１９８９．５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ　；および５ａｉｋｉ、１９８６の前出文献）。

この家系の血清学およびＤＮＡタイピングは以下に示ＤＲＢ＋　”１５０１ Ｂ　Ａｌｌ、８ｗ３５．ＤＲ４ＤＱＡＩ′″０３０１．　ＤＱＢＩ　’０３０１ ゜ＤＩ？Ｂ　“０４− ＣＡ２６．８ｗ４９．ＤＲＩ　ＤＱＡＩ　”０１０２．　ＤＱＢＩ　”０５０４ ゜ＤＲＢＩｏｏｌｏｌ Ｄ　Ａ２５，８１８．ＤＲ２ＤＱＡＩ°０１０２．　ＤＱＢＩ　”０６０２゜Ｄ ＲＢＩ　”１５０１ 母親　Ｃ／Ｄ ＩＤＤＭ雄同胞　Ａ／Ｃ ＩＤＤＭ雄同胞　Ａ／Ｃ ＩＤＤＭ雄同胞　Ａ／Ｃ 非ＩＤＤＭ雄同胞　Ｂ／Ｄ 非ＩＤＤＭ雌同胞　Ａ／Ｄ 非ＩＤＤＭ雌同胞　Ｂ／Ｃ ＩＤＤＭ同胞中のＤＲ２ハブロタイブは、はとんどのＣａｕｃａｓｉａｎ　Ｄ　 Ｒ２ハブロタイブに共通する通常のＤＲＢ１対立遺伝子（Ｄｗ２または’１５０ １）を含んでいた（ＷＨＯ命名委員会、１９９０、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓ　 ３１　：１３１−１４０、ならびにＭａｒｓｈおよびＢｏｄｍｅｒＳｌ　９８９ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ　１０　：　３０５−３１２）　ｏこのハブロ タイブは、典型的には母方のＤＲ２ハブロタイブと同様に、ＤＱＡｌ対立遺伝子 １．２または”０１０２、およびＤＱＢＩ対立遺伝子１．５または”０６０２を 含んでいる。しかしながら、この家族においては、父方のＤＲ２ハブロタイブは 、ＤＱＡＩ対立遺伝子４．２または１０４０１およびＤＱＢ　ｌ対立遺伝子４． ２または”０４０２を含んでいる。このＤＱＡＩおよびＤＱＢ　１対立遺伝子の 組合せは、通常コーカサス人におけるＤＲ８ハブロタイブ上にのみ見出され、極 めて希である（く４％）。ＤＲ】ハブロタイブのＤＲＢＩ対立遺伝子は、通常の ＤＲ１配列”０１０１も含む。ＤＲＩハブロタイブは典型的にはＤＱＡ１対立遺 伝子’０１０１およびＤＱＢ１対立遺伝子”Ｑ　５０１を含む。しかしながら、 このＤＲＩハブロタイブは、ＤＱＡＩ対立遺伝子”０１０２および新規で先に報 告かないＤＱＢ　１対立遺伝子である以前ＤＱβ１１０５新と称されたものを含 み、これはＤＱＢＩ”０５０２と”０４０２対立遺伝子の間の“組換え“と思わ れる。このＤＱＢｌ　００５新対立遺伝子は、表２および４に示すようにＤＱＢ 　１　”０５０４　（ＤＩＱＢｌ、９）と改称されている。

この解釈は、最も高いＩＤＤＭ感受性か、２種の傾向を含んだハブロタイブの存 在と関連するという前提と一致する。通常のＤＲ２ハブロタイブと共に異常なり ＲＩハブロタイブを保育する母親（５５才）は、ランゲルハンス島細胞抗体（Ｉ ＣＡ）を存するが、ＩＤＤＭを有しておらず、正常の第１相インシュリン分泌を 予想的評価では維持していた。

ＤＲ２、Ｄｗ２ハブロタイブは、強度の負の関連を１ＤＤＭについて存し、従っ て″保護的”であるものと考えられ、一方ＤＲＩハブロタイブは、ＩＤＤＭと弱 い関連を有する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９８８、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅ ｔ。

２２：３ｌ−５０）。ＨＬＡ　クラスＩ【ハブロタイブのＤＱおよびＤＲ領領域 間で非平衡である強い連結があり、これらのハブロタイブ疾患が特定のクラス［ １対立遺伝子に関連すると考えることは困難であった。高度にあらかじめ傾向が 与えられたハブロタイブのＤＱＢＩおよびＤＲＢＩ対立遺伝子の異常な組合せを 存するものの分析は、上述した家系に観察されるように、傾向が与えられた対立 遺伝子の仮の同定を可能にする。ＤＲ２ハブロタイブにおいては、ＤＱＢｌ　” ０４０２対立遺伝子は、ＤＲＢ１対立遺伝子（”１５０１）が“保護的”ＤＲ２ ，Ｄｗ２ハブロタイブと同じであることから感受性に関連付けられる。従って、 このハブロタイブに関連する　“保護″に応答可能であると思われるものは、Ｄ Ｒ２，Ｄｗ２ハブロタイブ上の通常のＤＱＢＩ対立遺伝子”０６０２である。該 ＤＱＢ　］対立遺伝子は、異常ＤＲ２ハブロタイブ上に見出されるものであるが 、コーカサス人のＤＲ８ハブロタイブに見出されるＤＱＢＩ　”０４０２対立遺 伝子と同じである。ＤＲＢは、ＩＤＤＭと弱い関連をもつ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎの 前出文献）。類似するＤＱＢ　ｌ対立遺伝子”０４０１が、日本人のＤＲ４ハブ ロタイブに見出され、これはＩＤＤＭｉ、：正の関連をもつが（Ａｐａｒｉｃｏ ら、１９８８、［ｍ＋ｎｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２８　：２４０−２４６）、 Ｌ／かじながらこの母集団では、ＤＱＡＩ　°０３０１対立遺伝子と連結してい る。

ＨＬＡクラス［［配列の多形性およびＩＤＤＭの研究は、ＤＱＢｌ鎖の５７位の アミノ酸残基の電荷との一般的な相関を明らかにした（Ｍｏｒｅｌ　ら、１９８ ８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：８１１１−８１１５）、最近の研究では 、５７位のＡｓｐの存在自体が“保護的“であると報告されている。ＤＲ２ハブ ロタイブ上に見出されたＤＱＢ　Ｉ　°０４０２対立遺伝子は、５７位にＡｓｐ 残基を存していることから、例５に記述された結果は、Ａｓｐ　５７が完全に保 護であるとはいえないことを示している。

研究された４種のＤＲ２＋ＩＤＤＭ患者に見出される６個のＤＲ２ハブロタイブ のうち、５人の患者は表７に示すようにＡｓｐ５７を有している。

２　ＤＱＢｌ”０６０２　ＡＳＰ　ＤＲ２／ＤＲ−Ｉ　ＤＱＢｌ”０５０２　Ｓ ＢＲＤＲ２／ＤＲ３２ＤＱＢｌ”０６０３　ＡＳＰ　ＤＲ２／ＤＲ−Ｉ　ＤＱＢ １°０４０２　ＡＳＰ　ＤＲ２／ＤＲＩわずかに２人の患者がＤＱＢＩ　”０６ ０２対立遺伝子を存し、これはコーカサス人ＤＲ２ハブロタイブの９０％以上に おいて期待されるものである。多分、ＤＱＢ　１鎖の５７位の単一の残基ではな く、むしろ対立遺伝子ＤＱＢ１”０６０２の全体として耐性が与えられるのであ ろう。

ここに記述した方法は、新たなりＱＢ　１対立遺伝子、ＤＱ／３１　”０５新（ ＤＱＢ１．９およびＤＱＢＩ　”０５０４とも称され、異常ＤＲＩハブロタイブ 上に見出された）の同定を導いた。患者に観察されるＤＲＢ　１対立遺伝子（“ ＯＩ　０１）は、対照ＤＲＩハブロタイブ上に典型的に見出されるものであるこ とから、この対立遺伝子は、ＩＤＤＭ感受性の付与についても応答可能であり得 る。この新規なりＱＢ　ｌ対立遺伝子は、以前にＤＲ２＋ＩＤＤＭ患者において 同定されていた希少なりＱＢＩ対立遺伝子（”０５０２）　（Ｈｏｒｎ、１９８ ８、前出文献およびＥｒ１ｉｃｈら、１９９０、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３９　：　 ９６−１０３）と同様に５７位にＳｅｒを存する。該新規対立遺伝子は、”０５ ０２および°０４０２対立遺伝子の複雑な“組換え”であると思われ、この配列 は、ＤＱＢＩ　”０４０２分節のＤＱＢＩ　”０５０２対立遺伝子枠への挿入に よる、コドン５８と７４との閘あたりの推定の組換え部位を伴う遺伝子転換によ り生成したものと思われる。

ＨＬＡクラスＩＩ分子の構造モデルによると、ペプチド結合溝は、β−ヒダ状シ ートと２個のα−へリックスにより形成され、しかしてこの新規な対立遺伝子に おいては、α−へリックスをコードする分節は”０４０２と共通であり、一方Ｄ ＱＢＩ鎖の残る部分はＤＱＢＩ　”０５０２対立遺伝子に類似している。

例６ ＤＱＢ　ｌタイピング−逆ドツトプロット形式発明のこの実施態様において、Ｄ ＱＢ　１プローブは、膜に固定され、増幅された標的ＤＮＡが、膜結合プローブ とハイブリッドされる。タイピングプローブの組は、各プローブが組の他のすべ てのプローブと同じ温度および同じ塩濃度（および同じ洗浄条件ではハイブリッ ドが維持される）において特異的に標的配列にハイブリッドするように設計され る。増幅に使用されるＰＣＲプライマは、Ｐ　ＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌ　（１９９ ０、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡ）に記述されて いるようにビオチン化され、しかして膜結合プローブにハイブリッドする任意の 増幅ＤＮＡが、容易に検出され得る。

一実施態様において、検出は、ストレプトアビジン（ＳＡ）−接合西洋ワサビパ ーオキシダーゼを、膜結合プローブにハイブリッドした増幅ＤＮＡと反応させる ことにより行なわれる。しかしてＨＲＰは、ＳＡ−ビオチン相互作用を介して増 幅ＤＮＡに結合され、例えばテトラメチルベンジジンの酸化等の着色化合物の生 成等（米国特許第４，７８９，６３０号参照）、周知の種々の手段によって信号 発生のために使用し得る。

プローブは、いずれの手段により膜に固定されてもよいが、好適な方法は１３− ２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプローブを、より長い配列のポリ−ｄ Ｔによりテーリングすることを含む。得られたポリーｄＴテイルは、プローブを 膜に共存的に結合させる膜上のアミン基と反応させ得る。この反応は、ＵＶ照射 により促進される。

ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ　、　Ｒａ ｔｌｊｆｆ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｃａｌｓ　；下記の反応のためには、約１２０ 単位／μｌ、すなわち１００１００ｐ／μｌの濃度であろう）が、プローブ上に ポリーｄＴテイルを生成するために使用され得るが、商業的に利用可能なりＮＡ 合成装置にてテイル化プローブを合成することもできる。テイル化プローブを作 成するためにＤＮＡ合成装置を使用する場合には、テイルをプローブの５′末端 に置いて、望ましからぬ非成熟鎖の終止がテイル領域のはじめに起こらないよう にすべきである。

ＴｄＴ反応は、１ｘＴｄＴ塩、２００９０１０１のオリゴヌクレオチド、８００ μＭ　ｄＴＴ　、および６０単位のＴｄＴを含む１００μｌの体積で行なわれる 。ｌ０ＸＴｄＴ塩は、１，０００ｍＭＫ−カコジレート、１０ＤＩＭ　ＣＯＣｌ ２．２ｍＭ　ジチオスレイトール、２５０ｍＭ　トリス−ＣＩ、ｐｉ（７，６で あり、ＲｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙおよびＷｕの、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、６ ５　：４３−６２により記述されているように調製される。８ｍＭ　ｄＴＴＰの ＩＯＸ保存溶液を便利のためにｗＲｉｌ［することもできる（　ＮａＯＨにてｐ Ｈ７に中和）。

該ＴｄＴ反応は、３７°Ｃにて２時間で行なわれ、次いで１００μｍのＩ　Ｏｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８の添加により停止される。テイル化オリゴヌクレオチド の最終濃度は、１μＭ（ｌｐｍｏｌ／μｌ）であり、ホモポリマーチイルの長さ は、約４００残基である。テイル長は、オリゴヌクレオチドに対するｄＴＴＰの モル比を調節することにより変化させ得る。テイル化プローブは、使用まで一２ ０℃で保存され得る。

２種類の型のナイロン膜が、逆ドツトプロット形式には好適であり；　Ｂｉｏｄ ｙｎｅ　”ナイロン膜、０．４５ミクロンの孔径、Ｐａ１ｌ製、およびＢｉｏｔ ｒａｎｓ”ナイロン膜、０．４５ミクロンの孔径、ＩＣＮ製である。プローブは 、ＢｉｏＲａｄ製のＢｉｏ−Ｄｏｔ　７Ｍ　ドツトプロット装置によって極めて 便利に膜上にスポットされ得る。各プローブは、膜上（こ固有の離散的位置にス ポットされる。ド・ントブロ・ソト装置にかける前に、各テイル化プローブの約 ５〜ｌＯピコモルが、６０−１００μｌのＴＥ緩衝溶液とあら力）しめ混合され る。ドツトプロット後、膜を吸取り紙上（こ短時装置いて過剰な液体を除（。

次いで、膜をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製の５ｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ”＊のＵＶ光 箱（ｌｉｇｈｔ　ｂｏｘ　）中に置き、５０−６０ミリジュールの照射に曝して テイル化プローブをナイロン膜に固定する。簡単にすすいで（）１イブリダイゼ ーシヨン溶液中で約１５分間）未結合プローブを除いた後、該膜はビオチン化Ｐ ＣＲ生成物とのハイブリダイゼーシヨンの準備力（整う。２分の１〜１ピコモル （典型的な１００μＩＰＣＲ混合物の４分の１〜２分の１）のＰＣＲ生成物を、 各プローブパネルにハイブリダイゼーションのために加える。約５０μｌのスト レプトアビジン−西洋ワサビノぐ−オキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ、ＰＥＣｌから 商業的に入手可能、Ａｍｐｌｉ　Ｔｙｐｅ”　Ｄ　Ｑ　ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｔｙｐ ｉｎｇ　Ｋｉｔの指示マニュアル参照）の接合体を、この時点で便宜上加えても よいが、別途５Ａ−ＨＲＰインキュベーションおよび洗浄を室温にて、厳密な洗 浄後に行なった場合には、より良い信号が得られるであろう。

ハイブリダイゼーションは、典型的には５０℃にて３０分間、水浴中にて行なわ れ、ハイブリダイゼーション緩衝溶液は、０，５％ＳＤＳおよび３×〜５ＸＳＳ ＰＥ、最も普通には４×を含んでなる。厳密な洗浄は、水浴中にて、０．１％Ｓ ＤＳおよびｌＸ５ＳＰＥからなる洗浄溶液を用いて５０℃にて１５分間で行なわ れる。ｌ　ＸＰＢＳを用いる室温での３０分間の後洗浄は、信号の質を向上させ る。

逆ドツトプロット法において使用するテイル化プローブのハイブリッド領域は、 以下に示される。Ｘはイノシンである。標的配列、１文字のアミノ酸コード、お よび各プローブの対立遺伝子特異性も示されている。

ＤＥＨ９５ＥＱｒＤＮＯ：５Ｂ　ＴＲＨＩＹ　ＡＣＣＡＯＡＣＡＣＡＴＣＴＡ丁 ＡＡＣて：Ｇ　１．１−１．３，１６，１．７６非コード鎖からの配列を示す ５５°　・　・ ５５°　・　・　・　・　・ Ｂ−ＵＧ８６　６０°　・　・　・　・　・　・　・　・６５°　・　・　拳　 ・　・　・　） ＦＩＧ、１ 浄書（内容に変更なし） 要　約　書 ＨＬＡ　ＤＱＢＩ遺伝子の第２エクソンの特定の核酸配列を増幅するためのプラ イマ、および増幅されたＤＮＡに含まれる多形性配列を同定するためのプローブ が、種々の供給源からの試料のタイピングのため、および血清学的方法では識別 不能な対立遺伝子変異体の検出に使用され得る。このＨＬＡ　ＤＱＢＩタイピン グ系は、その遂行が簡単かつ迅速であるドツトプロット形式で使用することがで き、数分間で検出可能な信号を生じ、また組織タイピング、個体の同定、および 疾患にかかり易い個体の同定に使用することかできる。

手続ネｍ正書（賎） １−事件の表示 ＨＬＡ　ＤＱベータＤＮＡタイピング エフ、ホフマン　−　ラ　ロシュ　アーゲー４、代理人 ６、補正により増加する請求項の数 ７−補正の対象 明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文 国際調査報告　５ｒＴ／ＩＩぐＱ＋１ｎ６１ＱＬＰＣＴ／ＵＳ　９１１０９７９ ６

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）ＤＱＢＩ遺伝子第２エクソン配列を増幅し；（ｂ）いずれかの増幅核 酸を、プローブが正確に相補的な配列に対してのみハイブリッドし、該増幅核酸 に安定して結合が維持される条件で、オリゴヌクレオチドプローブの絹とハイブ リッドさせ；および（ｃ）増幅の生起の有無を測定する ことを含んでなる試料中の核酸のＤＱＢＩ型の決定方法。
2. ２．前記増幅工程がＰＣＲにより行なわれる請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記ＰＣＲ工程が、オリゴヌクレオチドプライマの対による増幅を含み、か つ前記プライマの少なくともひとつが、ＤＢ８６、ＤＢ１３０、ＤＢ１３１、Ｇ Ｈ２８、ＧＨ２９およびＵＧ７１からなる群から選択される請求の範囲第２項に 記載の方法。
4. ４．前記オリゴヌクレオチドプローブの組が、ＤＢ５１、ＤＢ５３、ＤＢ５４、 ＤＢ５５、ＤＢ６９、ＤＢ７８、ＤＢ７９、ＤＢ８０、ＤＢ１０５、ＤＢ１０７ 、ＤＢ１１０、ＤＢ１１４、ＤＢ１１５、ＤＢ１５８、ＤＢ１６２およびＵＧ８ ２からなる群から選択される２種類以上のプローブを含んでなる請求の範囲第１ 項に記載の方法。
5. ５．前記プローブが標識される請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．前記オリゴヌクレオチドプローブの組が、ＤＢ５１、ＤＢ５３、ＤＢ５４、 ＤＢ５５、ＤＢ６９、ＤＢ７８、ＤＢ７９、ＤＢ８０、ＤＢ１０５、ＤＢ１０７ 、ＤＢ１１０、ＤＢ１１４、ＤＢ１１５、ＤＢ１５８、ＤＢ１６２およびＵＧ８ ２である請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．前記プローブの組が固体支持体上に固定化され、かつ異なる各プローブが、 前記固体支持体上に識別できる離散的配置をもって局在する請求の範囲第１項に 記載の方法。
8. ８．前記プローブの組が、ＤＢ５５、ＤＢ６９、ＤＢ１５８、ＤＢ１７５、ＤＢ １８５、ＤＢ１９１、ＤＢ１９８、ＤＢ２００、ＤＢ２０１、ＤＢ２０３、ＤＢ ２３９、ＤＢ２４１、ＤＢ２５４、ＤＢ２５８、ＤＢ２６５、ＤＢ２６６、ＤＢ ２６７、ＤＢ２６８、ＤＢ２６９、ＤＢ２７０およびＤＢ２７２からなる群から 選択される２種類以上の構成体を含んでなる請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．前記プローブの組が、ＤＢ５５、ＤＢ６９、ＤＢ１５８、ＤＢ１７５、ＤＢ １８５、ＤＢ１９１、ＤＢ１９８、ＤＢ２００、ＤＢ２０１、ＤＢ２０３、ＤＢ ２３９、ＤＢ２４１、ＤＢ２５４、ＤＢ２５８、ＤＢ２６５、ＤＢ２６６、ＤＢ ２６７、ＤＢ２６８、ＤＢ２６９、ＤＢ２７０、およびＤＢ２７２である請求の 範囲第８項に記載の方法。
10. １０．ＧＨ２８、ＧＨ２９、ＤＢ８６、ＤＢ１３０、ＤＢ１３１およびＵＧ７１ からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマ。
11. １１．ＤＢ５ｌ、ＤＢ５３、ＤＢ５４、ＤＢ５５、ＤＢ６９、ＤＢ７８、ＤＢ７ ９、ＤＢ８０、ＤＢ１０５、ＤＢ１０７、ＤＢ１１０、ＤＢ１１４、ＤＢ１１５ 、ＤＢ１５８、ＤＢ１６２およびＵＧ８２からなる群から選択されるオリゴヌク レオチドプローブ。
12. １２．オリゴヌクレオチドプローブの組を含み、前記組が請求の範囲第１１項に 記載のプローブを含んでなるＤＱＢＩ　ＤＮＡダイビング用キット。
13. １３．オリゴヌクレオチドプライマの対を更に含む請求の範囲第１２項に記載の キット。
14. １４．熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを更に含む請求の範囲第１３項に記載のキッ ト。
15. １５．１種類以上のデオキシリボヌクレオシド５′−トリホスフェートを更に含 む請求の範囲第１４項に記載のキット。
16. １６．ＤＢ５５、ＤＢ６９、ＤＢ１５８、ＤＢ１７５、ＤＢ１８５、ＤＢ１９１ 、ＤＢ１９８、ＤＢ２００、ＤＢ２０１、ＤＢ２０３、ＤＢ２３９、ＤＢ２４１ 、ＤＢ２５４、ＤＢ２５８、ＤＢ２６５、ＤＢ２６６、ＤＢ２６７、ＤＢ２６８ 、ＤＢ２６９、ＤＢ２７０およびＤＢ２７２からなる群から選択されるオリゴヌ クレオチドプローブ。
17. １７．オリゴヌクレオチドプローブの組を含み、前記組が請求の範囲第１６項に 記載のプローブを含んでなるＤＱＢＩ　ＤＮＡダイビング用キット。
18. １８．オリゴヌクレオチドプライマの対を更に含む請求の範囲第１７項に記載の キット。
19. １９．熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを更に含む請求の範囲第１８項に記載のキッ ト。
20. ２０．１種類以上のデオキシリボヌクレオシド５′−トリホスフェートを更に含 む請求の範囲第１９項に記載のキット。