JPH05506357A

JPH05506357A - 酵母株同定用マーカー

Info

Publication number: JPH05506357A
Application number: JP91509477A
Authority: JP
Inventors: ピータリング，ジェニー　エリザベス; ヘンシュク，ポール　アンソニー; ラングリッジ，ピーター
Original assignee: ルミニス　ピーティーワイ　リミテッド
Priority date: 1990-05-25
Filing date: 1991-05-27
Publication date: 1993-09-22
Also published as: WO1991018986A1; CA2083694A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵母株同定用マーカー略語：　ＧＵＳ　β−グルクロニダーゼ：ＭＵＧ　４−メチル　ウンベリフェリル　グルクロニリド：　５ＳＰＥＯ，１８Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエンｆｌｆトＵウム（ｐＨ７，０）、０．００１　Ｍ　ＥＤＴＡ；ｘ−ｇｌｕｃ　５ −ブロモ−４−クロロ−３−インドリル　グルクロニリド。

発明の背景ワイン醗酵は、酵母の純粋培養接種を応用することから始まって、進歩し続けている。本実験により、異種菌株を広範囲なワインの製造に利用できるようになり、しかも醗酵が非常に確実で制御された状態で行われるようになり、結果的にはワインの香気が損なわれるのを最小限に抑えられる（１）。ごく最近では、活性ドライ酵母を利用することにより、ワイン製造者は異種菌株のワイン学的特性をより広い範囲で活用できるようになった。しかしながら、ワイン製造の原料には数多くの未知な微生物が含まれており、その中にはワインの香気を損なったり腐敗させたりする微生物もある。したがって、醗酵中に特定のワイン酵母株を同定および調査するための適切な方法が、菌株の接種および滅菌工程の最適化を図る上で必要とされている。

酵母株同定において遺伝子マーカーが使用できる可能性が認められるようになり、慎重にマークされたワイン用菌株が、１９８４年にＶｅｚｉｎｈｅｔおよびＬａｃｒｏｉｘにより開発された（２）。ワイン用菌株は「マーク化Ｋｌ」（“ｍａｒｋｅｄｋｌ’　）として市販されているが、これはラルビン■（Ｌａｌｖｉｎ　Ｖ）酵母群から天然の突然変異体を選抜することにより開発されたものであり、ジウロンおよびエリスロマイシン耐性遺伝子で２重にマークされている。マークされた菌株に−１を含む一連の研究は、醗酵中の酵母群の速度論に対する洞察を可能にしたが（３，４）　、選抜したワイン用酵母菌が容易にマークできないという点において依然として制限を受けている。

ここでは、組換えＤＮＡ実験技術を用い、Ｅ、ｃｏＬｉのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をマーカーとして好ましい酵母株に導入する操作を記載する。

ＧＵＳ遺伝子は、線虫の、さらに最近では植物の遺伝子発現の研究で用いられるリポータ−遺伝子系として開発されたものである（５．６）。酵母株におけるマーカーとしてのこのＧＵＳ系の利点としては、５ａｃｃｈａｒｏｒｌＩｙｃｅｓ　ｃｅｒａｖｉｓｉａｅにおいてその潜在的に存在する量が少ないこと、およびその分析が蛍光分析法、分光分析法および寒天プレートテストにより容易に行われることが挙げられる。

発明の概要本発明は、酵母のプロモーターおよびターミネータ−配列に連結しているβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コード領域を含む新規なプラスミドを提供するものであり、それにより前記コード領域は酵母内で発現可能となる。好ましいプロモーターおよびターミネータ−配列としては、酵母内での発現を可能にするものであれば如何なるものでもよく、特に好ましいのは５ａｃｃｈａｒｏａｙｃｅｓｃｅｒｅυ１ｓｉａｅのアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターおよびターミネーター配列である。

本発明のプラスミドは、プロモーターおよびターミネータ−配列をＧＵＳ遺伝子に連結させ、その結果得られた新規な構築体を適当なキャリヤープラスミドに挿入することにより得られる。好ましくは、そのキャリヤープラスミドは、宿主である酵母の染色体上のＤＮＡ配列と実質的に同一であるＤＮＡ配列を含むものであり、それによりその新規な構築体が染色体に組込まれるのを助ける。好ましいキャリヤープラスミドはｐＷＸ５０９であり、ＳＭＲＩ−４１０遺伝子を含む。

ＳＭＲｌ　−４１０遺伝子には：（ａ）選択マーカーとして有用であること、および（ｂ）配列が酵母の」」遺伝子とほぼ同一である、という２つの機能があるため、新規な構築体の宿主染色体への組込みを促進する。

キャリヤープラスミドは、宿主染色体に組込むことにより、その新規な構築体を酵母株（例えば、工業用あるいは倍数体の酵母株、特にはワイン酵母株）へ導入するのに用いられる。そして、ＧＵＳ活性の試験は、全酵母数におけるマークされた菌株の比率をめるのに用いることができる。

ＧＵＳ酵素の基質の多くは自然輸送では酵母細胞膜を透過することができない。

したがって、本試験法は、（ａ）ＧＵＳ酵素の基質（例えばＸ−ｇｌｕｃまたはＭＵＧ）を酵母株のサンプルに添加すること：（ｂ）酵母株の細胞膜を透過させること；（Ｃ）検出可能な量のＧＵＳ酵素反応生成物が生成するのに十分な時間、酵母株をインキュベートすること：および（ｄ）前記生成物をテストすること、よりなる。

ＧＵＳ遺伝子は酵母株を調査するためのマーカー遺伝子として、特に工業的なアルコール醗酵プロセスの分野において用いられる。

本発明の一つの具体例として、ＧＵＳ遺伝子は混合培養醗酵物中のキラー酵母株を調査するために用いられる。

マークされた酵母キラー株は、混合培養接種系において、醗酵条件下での感受性酵母株に対するキラートキシンの効果を直接定量するために用いることができる、ということがわかっている。広範囲の酵母株が容易にマークできるので、この分析法は適用において制限を受けず、さらに混合培養醗酵におけるキラー酵母株の単純で明確な定量方法を提供するものである。

図面の簡単な説明第１図は、ＧＵＳベクターの組立を示す。

第２図は、ｐＡＷ２２０の地図を示す。

第３図は、キラー活性の寒天プレート検定法による結果を示す。寒天（ｐＨ４，２、０，００３％メチレンブルー）には−昼夜培養されたａＡＭＣ株が接種され、キラー活性がテストされる菌株を固型培地上にのせる。ＩＩＡは公知のキラー株であり、２Ａは公知の感受性株である。

ａＡＭ株はＩＩＡと同じように応答し、生育したバッチの周囲にクリアゾーンおよびメチレンブルーで染色された境界線を形成する。

第４図は、ａＡＭ株およびａＡＭＣ株より分離した染色体のトランスバース・オルタネ−ティング会フィールド（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ　ｆｉｅｌｄ）電気泳動の結果を示す。

第５図は、キラー株であるＩＩＡおよび３ＡＭ、および感受性株である２Ａおよび３　Ａ　Ｍ　Ｃ由来のｄｓＲＮＡ種の電気泳動の結果を示す。

第６図は、３ＡＭ（・）および３ＡＭＣ（０）の酵母生育曲線（図面Ａ）および糖料用性曲線（図面Ｂ）を示す。

第７図は、コントロールの単一培養醗酵および混合培養醗酵による生育曲線を示す。図面Ａ：コントロールである単一培養醗酵の生育曲線。記号：・３ＡＭ；０３ＡＭＣ：ロ５Ａ、図面Ｂ：混合培１１ｓ酵の生育曲線。記号：・３ＡＭおよび５Ａが２：Ｉの比率で接種されている；０３ＡＭＣおよび５Ａが２＝１の比率で接種されている：■３ＡＭおよび５Ａが１：１の比率で接種されている：Δ３ＡＭＣおよび５Ａが１：１の比率で接種されている。

第８図は、コロニー形成単位（ｃｆｕｓ／ｍｌ）で表された混合培養醗酵における各菌株の生育曲線を示す。図面Ａ：３ＡＭ（・）および５Ａ（ロ）がｌ＝１の比率で接種された混合醗酵。図面Ｂ　：　３　ＡＭＣ（０）および５Ａ（ロ）が１：ｌの比率で接種された混合醗酵。図面Ｃ：３ＡＭ（・）および５Ａ（ロ）が２：１の比率で接種された混合醗酵。図面Ｄ　＋　３　ＡＭＣ（０）および５Ａ（ロ）が２＝１の比率で接種された混合醗酵。

第９図は、全酵母細胞数の百分率で表された混合醗酵における各菌株の割合を示す。図面Ａ：３ＡＭ（・）および５Ａ（ロ）がｌ：ｌの比率で接種された混合醗酵。

図面Ｂ：３ＡＭＣ（○）および５Ａ（ロ）がＩＩＩの比率で接種された混合醗酵。図面Ｃ：３ＡＭ株（・）および５Ａ（ロ）が２＝１の比率で接種された混合醗酵。図面Ｄ　：　３　ＡＭＣ（０）およびＳＡＣ口）が２：ｌの比率で接種された混合醗酵。

第１０図は、異なる接種比率で行った５Ａ株との混合塔ＩＩ醗酵時の全細胞集団に対するキラー株３ＡＭの比率の経時変化。記号＋３ＡＭと５Ａの比率・２　：　１　；０１：ｌ：■ｌ：２：ロｌ：４゜発明の詳細な説明好ましい具体例を以下に記載する。

実施例■：ワイン用酵母のためのマーカー系の構築試料および方法菌株および培地：酵母株ＡＷＲＩ　３Ａ（ＡＷＲＩ７９６としても公知）はオーストラリア・ワイン・リサーチ・インスティテユート（＾ｕｓｔｒａｌｉａｎ　ｗｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒＣｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）り入手した。全ての組み換えプラスミドの増幅にはＥ、ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｈ５ａ株を用いた。酵母生育培地はＹＰＤ（１％酵母抽出物（Ｄｉｒｃｏ）　、　２％バクトーペプトン（Ｄｉｒｃｏ）および２％グルコースまたは５Ｄ（０，６７％　アミノ酸を含まないバクト酵母窒素ベース（Ｄｉｒｃｏ）および２％グルコース〕である。プラスミドｐＷＸ５０９はＧ。

Ｐ、　Ｃａ５ｅｙ　（Ａｎｈｅｕｓｅｒ−ｂｕｓｃｈ　Ｃｏ、、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ）より入手した。プラスミドｐＫＬＧ４はＶ、　Ｗａｌｂａｔ　（ＳｔａｎｒｏｒｄＬｌｎ　ｉ　ｖｅｒｓ　ｉ　ｔｙ）より人手した（プラスミドｐＫＬＧ４は市販品として人手することもできる）。

ＧＵＳベクターのＷｊｌＭ：ＤＨ５ａの形質転換はＨａｎａｈａ口の方法（３０）に従って行った。迅速なプラスミドの分離はＩｓｈ−ＨｏｒｏｗｉｃｚおよびＢｕｒｋｅにより記載されている（３１）ように行った。ＤＮＡフラグメントはＧＥＮＥＣＬ　Ｅ　Ａ　Ｎ　（８１０１ｏｔ）キットを用いて、業者の指示に従って分離された。フラグメント末端の脱リン酸化は、業者の指示どおり、ＤＮＡに１ユニツトの仔つシ腸のアルカリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ− Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、緩衝液中で３０分間、３７℃でインキュベートすることにより行われた。ＤＮＡの連結はＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて指示された緩衝液中で行われた。

酵母の形質転換および分析：酵母細胞の形質転換はＩｔｏ　らの方法（３２）を用いて行った。形質転換体はスルホメトウロンメチル（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＳＤ培地上で選抜された。ＤＮＡは全て、Ｄａｙ＋ｓ　らの方法（３３）に従って形質転換体から分離された。サザン・プロッティングおよびハイブリダイゼーションは５ｏｕｔｈｅｒｎの方法（３４）に若干の修正を加えた方法により行った。用いた膜はハイボンドＮ　＋　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）であり、ＤＮＡの固定は膜を紫外線光に５分間さらすことにより行った。ハイブリダイゼーションは、４％ポリエチレングリコール４０００．２ＸＳＳＰＥ、Ｉ％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、０．５％プロットおよびキャリヤーＤＮＡ　（最終１度が０．５ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液中で４２℃で行われた。ＤＮＡプローブはＡｍｅｒｓｈａｍから入手したオリゴラベリング・キッドを用いて行った。

パルスフィールドゲル電気泳動ニドランスバース・オルタネ−ティング・フィールド電気泳動（ＴＡＦＥ）はジェネリン（Ｇｅｎｅｌｉｎｅ）　（Ｂｅｃｋｍａｎ）ユニットを用いて行った。酵母の染色体は業者の指示に従って寒天プラグ中で調整した。電気泳動は、１５０ｍＡの定常電流：パルス時間が６０秒で１８時間、その後３５秒で６時間で行った。

醗酵試験：２００ｇ／ｌの還元糖を含有するライン・リースリング種のぶどう液を用いた。醗酵は空気止めが付いた２５０ｍ１容三角フラスコ内で行った。その果汁液は接種前に窒素ガスを通し、醗酵は嫌気的条件下で攪拌しながら（およそｌ　００ｒ、ｐ、ｍ、）　１８℃で行った。サンプルは醗酵間にゴム製の膜で覆われた取出し口から針と注射器を用いて嫌気的に取り出した。

サンプルは屈折計を用いて糖レベルを分析し、酵母生育は分光分析による６　５０　ｎｍにおける吸光度を測定することによりめた。還元糖および酢酸の濃度はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ４ａｎｎｈｅｉｍの専用キットを用いて決定した。

ワイン中の二酸化イオウはＲａｎｋｉｎとＰｏｃｏｃｋの方法（３５）に従って測定した。アルコール含有量は近赤外の反射率（３６）によってめた。

ＧＵＳ検定：夏１豊定：酵母細胞が生育して末期対数期に達したところで、遠心分離して１ｍｌのベレツトとし、細胞をＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＰＯ＋　ＤＨ７，Ｉ　ＯｍＭ　β−メルカプトエタノール、ｌｏｍＭ　Ｎａｇ　ＥＤＴＡ、０．１　％　サルコシル、０．ｌ　％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）中で再懸濁した。

その後ガラスピーズ（Ｓｉｇｍａ、　１０００〜１０５０ミクロン）をおよそ体積の半分に加え、その懸濁液を【０分間１０００ｒ、　ｐ、　ｍで遠心分離した。その後、上清を取り出し、細胞抽出物として用いた。

１〜５０μｌの抽出物は０．５ｍｌの検定緩衝液（（ｍＭ　ＭＵＧを抽出緩衝液に含むもの）を添加し、３７℃でインキュベートした。様々な時間毎に１００μ Ｉのサンプルを検定混合物より取り出して、９００μｌの反応停止緩衝液（０，２Ｍ　ＮａＣＯ５）を添加した。その後、各溶液をキセノンランプを有する蛍光分光光度計（Ａｍｉｎｃｏ　５ＰＦ−１２５”）により励起波長３１３５ｎｍ、放射波長４５５ｎｍで検定した。１００　ｎＭ　〜Ｉ　、［ＺＭの４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）　（Ｓｉｇｍａ）の標準溶液を対照として調製した。１ｒＭのＭＵが１００相対単位に相当した。

プレート検定：酵母コロニーは５０〜１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇｌｕｃを含有する固形ＹＰＤ培地で生育した。およそ３６時間生育させた後、（１，１ＭのＮ　ａ　Ｐ　０ＨｐＨ７，０，１％のサルコシル、５０μｇ／ｍｌのＸ−ｇｌｕｃおよび０．７％のアガロースからなる溶液をブレート上に薄く覆うように注ぎ、放置した。３７℃で４〜５時間インキュベートした後、形質転換を起こしたコロニーには青い沈澱物が認められた。

結果ＧＵＳベクター構築Ｅ、ｃｏＬｉ　β−グルクロニダーゼ遺伝子の酵母のマーカー遺伝子としての有効性は、生育過程における遺伝子の維持および十分な遺伝子発現に依存するものである。

ＧＵＳコード領域は、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＣＩ）のプロモーターおよびターミネータ配列を用いることにより発現した。ＧＵＳ遺伝子はプラスミドｐＫＬＧ４よりＨｉｎｄｌｌ断片として分離され、ベクターＡＡＨ５のＨｉｎｄｌ［部位に連結した（３７）。ＡＤＣｌのプロモーターについて正しく配置しているＧＵＳコード領域を有するクローンが同定された（プラスミドｐＡＷ２１９）。消化はＢａｍＨＩで行われた。この消化によりＡＤＣ１発現シグナルと並んでいるＧＵＳ遺伝子が切断された（第１図参照）。

プラスミドｐｗｘ　５０９　（３８）はワイン酵母株の染色体■に組み込まれ、醗酵条件下酵母の特性に悪影響を与えることなく保持されることが示されている。ＧＵＳ＋ＡＤＣＩシグナルのカセットはベクターｐＷＸ５０９のＢａｍＨＩサイトにクローンされ、プラスミドｐＡＷ２２０を得た（第２図）。

形質転換および醗酵実験プラスミドｐＡＷ２２０上の５ＭＲ１−４１０遺伝子はその配列において宿主染色体上の上玉Ｕ遺伝子とほぼ同一であり、一つの塩基が点突然変異を起こすことにより除草剤耐性の表現型となる。したがって、２つの配列間には、上止ｍ遺伝子をターゲットとして相同組み換えによりＳＭＲＩ−４１０を組み込むのに十分な程度の相同性がある。組換えは形質転換する前にプラスミドｐＡＷ２２０をＰｖｕｌＩで消化することにより促進され、この時両端にＳＭＲＩ−４，１０配列を有する直鎖状の分子を生じる。ＤＮＡ末端は非常に形質転換されやすい状態になっており、組込みは上上工主遺伝子上のＰｖｕｒ１ｔ！６位で最も起こりやすい。このことから、このＧＵＳカセットの隣接して位置する２つの土上り主遺伝子が存在し、そのうちの一方には形質転換された細胞に除草剤耐性を付与するＳＭＲＩ−４１０突然変異を含んでいることがわかるであろう。

ＰｖｕｌＩで消化されたプラスミドｐＡＷ２２０をＩｔＱらの方法（９）によりワイン酵母ＡＷＲＩ　ａＡ株に導入式した。形質転換体は除草剤スルホメツロンメチル（１０μｇ／ｍｌ）に対する耐性により選抜した。その後、形質転換されたコロニー（ＡＷＲＩ　３ＡＭと呼ぶ）が、ＧＵＳ構築体が存在するものとして選別された。全ＤＮＡが分離されＰｖｕＩＩで消化された。それにより、ＧＵＳベクター構築体は損失を受けていない状態で染色体ＤＮＡから遊離した。さらに、ＧＵＳ配列を確認するためにプラスミドｐＫＬＧ４のＨｉ　ｎｄｌ［［断片を用いてサザン・ハイブリダイゼーションを行った。形質転換株にはおよそ９ｋｂのバンドかはっきりと確認され、これはＧＵＳ構築体の存在を示すものである。

形質転換株におけるＧＵＳ構築体の染色体の存在場所が決定された。損失を受けていない染色体が、ＴＡＦＥユニットでのパルスフィールドゲル電気泳動により分離され、ＧＵＳ配列へのサザン・ハイブリダイゼーションにより選別されて、３＾Ｍ株から調製された。この分析から、ＧＵＳ構築体はまさに上上工↓遺伝子が位置する染色体（ＸＩＩＩ）に特異的に組み込まれていることがわかった。

このａＡＭ株を用いて、酵母のワイン学的特性における形質転換の有効性を調べるための醗酵実験を行った。

３種の異なる形質転換体が分離され、それぞれ異なる発端培地への接種に用いられた。コントロール、つまり形質転換されていない酵母ＡＷＲＩ　３Ａの３つのコロニーも発端培養物に接種された。これら６種の培養物はライン・リースリング種ぶどう液の入ったフラスコに各々２本ずつ、４ＸＩＯ’細胞／ｍｌの濃度で接種した。醗酵は嫌気的条件下１８℃で行われた。サンプルを一定時間毎に採取し、酵母の生育の測定（６１０ｎｍにおける光学密度を測定することによる）および糖含有量の測定（屈折率による）を行った。屈折率は、コントロール醗酵物および形質転換醗酵物共に、それぞれの値の平均値とし、それをもとにして２本の糖料用性曲線を記した。

コントロールと形質転換株の醗酵曲線にはそれ程大きな差はなかった。

醗酵が終丁した時点で、ｐＨ１還元糖、二酸化イオウ、アルコールと酢酸の濃度を全１２サンプルについて測定し、各パラメーターに対して平均値をとった（下記第１表参照）。ここでもまた、２種の菌株には大きな差は認められなかった。

最後に、全細菌集団中のＧＵＳ構築体の安定性を調べるために、醗酵が完了した３＾Ｍａｉ酵物か酵母サンプルを採取し、ＧＵＳ活性の検定を行った。

およそ５００コロニーを、以下に記載するｘ−ｇｌｕｃプレート法により分析したところ、これらのコロニーには全てＧＵＳ活性が認められた。この結果により、導入された構築体は、醗酵の抑圧下で生育中の酵母細胞集団中に保持されており、スルホメトウロンメチルにより選抜されないことがわかる。

１」− ＃２種の菌株間の分散率参Ｆ、Ｐｒｏｂは分散率の確率を表すＡＷＲｌ　−３＾　−コントロールである未修飾の酵母ＡＷＲＩ−３ＡＭ　−修飾された酵母ＧＵＳ検定 β−グルクロニダーゼは基質ｘ−ｇｌｕｃを分解してインドキシル誘導体を遊離するが、その誘導体は酸化されてインディゴブルー色素を生成する。青い沈澱の生成によりＧＵＳ活性を確認することができる。形質転換された酵母細胞を３７ ℃でＸ−ｇｌｕｃを含有する生育培地中で最初にインキュベートした場合、３時間以上経過してもＧＵＳ活性は認められなかった。この結果の一つの解釈として、酵母細胞がｙ；−ｇｌｕｃ基賀を取り込むことができない、と言うことができる。そこで形質転換された細胞を、Ｘ−ｇｌｕｃと共にインキュベートする前に、（透過性の障壁を破壊するために）ガラスピーズを入れて２分間攪拌した。この処理により、３７℃でインキュベート後１時間以内に青い沈澱が生じた。これらの結果より、ＧＵＳ構築体はうまくワイン酵母株に導入され、発現したことがわかる。しかしながら、Ｘ−ｇｌｕｃは細胞には取り込まれず、しかも細胞中に拡散することもできなかった。

これらの結果を念頭において、酵母コロニーにおけるＧＵＳ活性の検定を行う方法を考案した。酵母菌は適当に希釈されてＹＰＤ培地（ｘ−ｇｌｕｃを含有）にプレートされ、単一の、適度に広がったコロニーを得た。

３０℃でおよそ３６時間インキュベートした後、０．７％のアガロースおよび１％サルコシルを溶解させた溶液をコロニーの上に注ぎ、放置した。３７℃で４〜５時間インキュベートした後、形質転換されたコロニーに青い沈澱が認められた。この方法により、全酵母集団におけるマーク化された菌株の比率は、白いコロニーに対する青いコロニーの比率を計算することで簡単に測定できる。

ＧＵＳ活性をさらに迅速に分析するために、１％サルコシル存在下、酵母細胞のサンプルをｘ−ｇｌｕｃと共に、濃青の沈澱が生じるまでインキュベートすることも可能である。白いコロニーに対する青いコロニーの比率は顕微鏡観察により測定される。

ＧＵＳ活性を分析するもう一つの方法として、ＭＵＧ基質を用いる方法がある。

すなわち、β−グルクロニダーゼはこの化合物を分解して蛍光物質を生成する。

この検定法は感度が非常に高く、ＧＵＳＩ素活性の測定に用いた。

実施例■：マーカー系の応用背景酵母におけるキラー活性は、５ａｃｃｈａｒｏｒｘｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株について１９６３年に１ｌｅｖａｎとＩＪａｋｏｗｅｒによって初めて報告された（７）。キラー酵母は、同属の感受性株を、あるいはごく低頻度ではあるが異種菌株を死滅させるポリペプチドトキシンを分泌する（８．　！ｌ）。

これまでの研究では、５ａｃｃｈａｒｏｒｔｒｙｃｅｓのトキシンが感受性酵母の細胞壁上にあるレセプターに結合する蛋白質であり、細胞膜内外の電気化学的勾配、さらには細胞内のイオンバランスを崩すことが示されている（１０．１１）。

トキシンの産生およびそれに対する免疫性は、細胞Ｍで遺伝されている二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡプラスミドにより決定され、一方、それはＭ−ゲノムとして知られ（１２）、Ｌ−ゲノムと呼ばれるもう一つのｄ　５ＲＮＡ種を含有する細胞内にのみ見出される。２つのｄｓＲＮＡはウィルス様粒子に存在し、Ｌ−ｄｓＲＮＡによりコード化された外被のための蛋白質を要求する０２．１３）。

キラー酵母は、トキシンの特性に基づき、■【のグループ（Ｋｌ〜に１１）に分類されている（１４．１５）。

５ａｃｃｈａｒｏｒｒｒｙｃｅｓに特徴的なものは最初の３グループ（Ｋ１％に２およびに３）に分類される。５ａｃｃｈａｒｏｒａｙｃｅｓ　トキシンは低ｐＨ（２，０）で可逆的に不活性化され、ｐＨが５．０以上で不可逆的に不活性化される（１５）。さらに、Ｋ１の生物学的活性はｐＨ４，６〜４．８の範囲で最適であるのに対して、Ｋ２はｐＨ４，２〜４．７の範囲で最適な活性を示す（１６）。Ｋ１と比べてに２）キシンは広範囲のｐＨ領域（２，８〜４．８）で安定であり、従ってワイン醗酵にはより適している。

キラー活性は、ヨーロッパやロシア、南アフリカおよびオーストラリアを含む世界の様々な地域の既設のぶどう園およびワイン醸造工場から分離される酵母に見出されている。このように広範囲にわたって存在していることにより、キラーワイン酵母のワイン学的な重要性に対する関心が集まっている。理論上、選抜されたキラー酵母は、ぶどう液醗酵中における好ましくない５ａｃｃｈａｒｏ−ｒｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ野性型菌株の生育を抑制するために接種された菌株として用いることができることになるであろう。さらに、キラー相互作用が異なる属種の酵母間でも起こることが報告されているので（１８，１９）　、５ａｃｃｈａ−γｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅυ１ｓｉａｅのような広いスペクトルを持つキラー酵母株を遺伝学的に作り出すことが可能である（２０）。

これまでの研究により、キラートキシンの感受性酵母株に対する有効性が評価されるようになった。しかし、報文では、醗酵条件下でのキラー活性の発現において食い違いがある（４．２１．２２）。ワイン醗酵中のキラー株および感受性株の細胞集団の生育を速度論的にめようとする試みは、混合培養において生育させた場自、２種の菌株の同定が困難であるため制約を受けている。今日まで用いられてきた方法には、ｉ）生育速度（２３）、あるいは硫化水素の産生（２４）により区別できるキラー株および感受性株の選択、ｉｉ）栄養要求性でかつ呼吸不全なキラー株の変異株、およびそれらが同定できる適切なプレート条件の使用（２５，２６，２７）、Ｉｌｉ＋）コロニーの形態上の違いにより区別できるキラー株および感受性株の使用（２８）、およびｉｖ）コロニーから直接キラー活性を検定すること（２９）が挙げられる。これらの方法は全て、そこに含まれる検定が手間も時間もかかること、あるいは特異的な性質を有するキラー株だけが研究可能であること、という事実から制約を受けてしまう。

試料および方法菌株および培地：感受性５ａｃｃｈａｒｏｔａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＷＲＩ　５Ａ（ＡＷＲＩ　１３８としても公知である）、ＡＷＲＩ　２Ａ　（ＡＷＲＩ　７２９）、およびキラー株ＡＷＲＩ　Ｉ　ＩＡ　（ＡＷＲＩ　９２Ｆ）はオーストラリア・ワイン・リサーチ・インスティテユートより入手した。

マークされたキラー株３ＡＭ　（ＡＷＲＩ　７９６）の調製法については前記されている。酵母生育培地はＹＰＤ　（１％酵母抽出液（［１ｉｆｃｏ）　、２にバクトーベプトン（Ｄｉｒｃｏ）および２％グルコース）を用いた。

キラー株３ＡＭの除去：３ＡＭ株の培養はＹＰＤ培地で２８℃、−昼夜行った。

０．９％ＮａＣＩ中で段階希釈液が調製され、０．１　％アリコート（およそ１００細胞を含む）をＹＰＤプレートに塗布し３７℃でインキュベートした。４８時間インキュベートした後で、単一のコロニーを任意に選択し、以下に記載するようなキラー活性の検定を行った。

除去した菌株の検定：　ＹＰＤ培地（１％寒天を含む）をオートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌した。４９℃まで冷却した後、培地を０．０５Ｍの酒石酸緩衝液でｐＨ。

４．２に緩衝化した。培地をプレートに注ぐ前にメチレンブルー（０，００３！％ｗ／ｖまで）およびキラー感受性株５Ａ（１ａＳＩｌＩｌ胞／ｍ＋まで）を培地に添加した。そして熱処理後、分離したコロニーをこれらの検定用プレートにパッチし、１８℃でおよそ７２時間インキュベートした。生育阻害（クリアゾーン）がなくなったこと、および青く染色された細胞がパッチされたコロニーの周囲になくなったことで除去が行われたと判定した。

ｄｓＲＮＡ分離：ｄｓＲＮＡ抽出操作は本質的にはＦｒ１ｅｄとＦｉｎｋに記載された方法（４０）に従った。ＲＮＡのサンプルは１．５％のアガローススラブゲル上、定常３１４１００ｍＡでの電気泳動により分析した。ゲルは臭化エチジウムで染色され、短波長ＵＶ光箱の上で撮影された。

ハルスト・フィールド・ゲル電気泳動ニドランスバース・オルタネ−ティング・フィールド電気泳動（ＴＡＦＥ）はＧ　ｅ　ｎ　ｅ　Ｉ　ｉ　ｎ　ｅ　（Ｂａｃｋｍａｎ）　ユ＝　ｙトを用いて行った。酵母染色体は業者の指示に従いアガロースプラグ上で調製した。電気泳動は１５０ｍＡの定常電流で行われた。パルス時間は６０秒で１８時間、その後３５秒で６時間だった。

醗酵試験二発端培養は、三角フラスコに入れた１０ｍ１のＹＰＤ培地に一白金耳の酵母を接種し、２８℃で激しく通気しながらインキュベートした。２４時間後、細胞密度を顕微鏡を用いてカウントすることによりめた。サンプルはライン・リースリング種のぶどう液（２００ｍｌ）に接種され、密度を５Ｘ］Ｏ’細胞／ｍｌにした。このぶどう液には２２０ｇ／Ｉの還元糖が含まれており、ｐＨは３．１であった。醗酵は空気止め付の２５（１ｍｌ容三角フラスコ内で行った。ぶどう液は接種前に膜ろ過により滅菌され、醗酵は１８℃で攪拌しなカラ（約１０　Ｏｒ、ｐ、ｍ、　）行った。サンプルは、ゴムの膜で覆われた取出し口から針と注射器を用いて嫌気的に取出した。

サンプルは、屈折計を読むことにより醗酵の進行度を分析し、酵母の生育は分光測光による６　５０　ｎｍにおける吸光度を測定することにより分析した。酵母細胞集団におけるマーク化された菌株の比率を分析するために、滅菌した０、９％のＮａＣＩ中でサンプルの段階希釈が行われ、０．１ｍｌの試料をＹＰＤ培地上にプレートした（２００〜５００細胞を含む）。プレートを以下に記載する方法により検定した。

ＧＵＳプレート検定：酵母コロニーを固体ＹＰＤ培地上で３６時間、２８℃で生育させた。その後、０．１ＭＮａ２ＨＰＯｔ　、ｐＨ７、ＩＮサルコシル、ｘ− ｇＩｕｃ　（１００−１５０μｇ／ｍ？）および０．７Ｎアガロースを含有する溶液をプレート上に注いで薄く広げ、放置した。３７℃で４〜６時間インキュベートした後、マークされたコロニーには青い沈澱が認められた。

結果ＡＷＲＩ　ａＡＭ株の除去醗酵におけるキラートキシンの効果を特異的に分析するために、遺伝子組成は等しいがＭ−ｄｓＲＮＡゲノムの存在だけが異なり、したがうてキラー毒素の産生能力が異なる２つの菌株を比較する実験を計画した。

キラー株３ＡＭは予めＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＧＵＳ遺伝子でマークされている（３９）。この系によりマーク化された菌株は、簡単なプレート検定を行って、その結果コロニー中に青い沈澱を生成することにより、混合酵母集団の中で容易に同定することができる。ａＡＭ株は熱処理によりＭ−ｄｓＲＮＡプラスミドが除去でき（４１）、この除去された、言い換えれば感受性であるコロニーはキラープレートアッセイにより同定された。３ＡＭの周囲にある明確な阻害ゾーンは３ＡＭＣの周囲には見られなかった。これは３ＡＭＣ株がキラー毒素を産生巳なかったことを示している（第３図参照）。

分離されたａＡＭＣ株が本当に３ＡＭ株由来のものであるかを確認するために、パルスト・フィールド・ゲル電気泳動により２つの菌株の核型を決定した。全染色体を分離し、トランスバース・オルタネ−ティング・フィールド（ＴＡＦＥ）システムで電気泳動した（第４図参照）。２つの菌株には同一の電気泳動パターンが得られ、共通の遺伝的な素地があることを示唆した。ａＡＭＣ株はａＡＭ株由来であるので、Ｇ　Ｕ　５−ｊｌ伝子を受け継ぎ、したがってマークされた菌株でもある。

最終的に、ｄｓＲＮＡはａＡＭ株および３ＡＭＣ株から分離され、標準的な電気泳動技術により分析された（第５図参照）。Ｍ−ｄｓＲＮＡゲノムを表すバンドはａＡＭ株に存在し、３ＡＭＣ株にはない。

さらに、酵母生育および醗酵速度に及ぼす除去操作の影響を調べるために、ａＡＭ株および３ＡＭＣ株について醗酵実験を行った。各々の菌株の発端培養物ははライン・リースリング種のぶどう液の入ったフラスコに、５×１０６細胞／ｍｌの濃度で各々３本ずつ接種した。サンプルを一定間隔毎に取出し、酵母生育および醗酵の進行程度を調べた。各菌株の平均値を時間に対してプロットした（第６図参＠）。生育および醗酵率においてｓＡＭ株と３ＡＭＣ株には大きな差はなかった。

醗酵中のキラー活性の分析ライン・リースリング種のぶどう液におけるａＡＭ株と３ＡＭＣ株のキラー活性を、各菌株を感受性５ａｃｃｈａ−ｒｏｒｒｔｙｃｅｓ株５Ａと共に接種することにより分析した。各菌株（３ＡＭ、３ＡＭＣおよび５Ａ）の純粋接種物としてのコントロール醗酵も行った。また、各醗酵は、嫌気的条件下穏やかに攪拌しながら、１８℃で２本ずつ行った。その後、マークされた菌株（３ＡＭまたは３　Ａ　Ｍ　Ｃ）を同定するためにＧＵＳプレート検定を行った。マークした菌株のコロニーは、この検定の結果濃い青色になり、簡単に同定できる。

この検定の有効性を確実にするために、コントロール醗酵についてもＧＵＳプレート検定を行った。コントロール５Ａの醗酵物におけるプレート検定は一貫して陰性であり、天然の酵母細胞にはＧＵＳ活性の素地がないことを強調するものであった。しかし、コントロール３ＡＭおよび３ＡＭＣ醗酵物では、マークした菌株数に対して９９〜１００％の値を示した。言い換えれば、マークした菌株のコロニーはこのＧＵＳ検定により青くならないこともあるのである。これが発生する頻度は常に全プレート総数の１％未満であり、経時的に増加することはなかった。潜在的に存在するこのような逆戻りが起こる頻度を、この分析中は常に考慮に入れた。

以下の混合培養醗酵を行った。

ｉ）３ＡＭと５Ａの接種比率がそれぞれ１：ｌであるもの：ｉｉ）３ＡＭＣと５Ａの接種比率がそれぞれｌ：ｌであるもの：ｉｉ）３ＡＭと５Ａの接種比率がそれぞれ２：１であるもの；およびｉｖ）３ＡＭＣと５Ａの接種比率がそれぞれ２：１であるもの。

これらの混合醗酵は、３種のコントロール醗酵と同様に正常な生育速度を示した（第７図参照）。

混合塔Ｉ！醗酵における各菌株の生育の経時変化（ココニー形成単位／ｍ１）を第８図に記した。接種比率が１：１の時キラー株３ＡＭの比率は著しく増加したが、一方、除去ａＡＭＣ株は別の同一条件下の感受性株に対して優位性を発揮しなかった。キラー細胞と感受性細胞の割合が醗酵中ずっとｌ：Ｉのままである、という有り得ない仮定を試験するために統計的な分析法が用いられた。

“ｇｏｏｄｎｅｓｓ　ｏｒ　ｆｉｔ”　（ｒ適合性に優れる」）試験（すなわち、正常試験）では、ｐ　＜＜０．００１の危険率で、この有り得ない仮定は否定された。しかしながら、除去菌株醗酵体対感受性株醗酵体で行った同様の分析は、醗酵中の２つの菌株の比率がずっと１：１である、というこの有り得ない仮定を支持するものであった。

接種系におけるａＡＭ株と３ＡＭＣ株の比率を高くする（比率２：ｌ）と、ａＡＭ株の優位的な効果はより明確になったが、ａＡＭＣ株はここではいずれの時間においても明らかな変化を示さなかった。混合培養醗酵におけるａＡＭ株の優位性は、各菌株の百分率を醗酵時間に対してグラフ化した時さらに明確になった（第９図）。

接種比率がｌ：ｌでは、３ＡＭは３日後にはおよそ８０％に増加したが、それよりも高い接種比率２：ｌでは、３ＡＭは最終的に全酵母細胞数の９７％を占めた。注目すべき重大な点は、少ない比率ではあるものの、５Ａ株が醗酵中ずっと生存していることである。これは、醗酵終了後には感受性株は認められなかったとするキラー活性に関する従来の報告（２８，２９）とは対照的である。

キラー活性に対する接種比率の影響明確なキラー活性が観察できる、感受性細胞に対するキラー細胞の最低比率を決定するための実験を行った。

ａＡＭ株と５Ａ株の接種比率がそれぞれｌ：２と１＝４である混合醗酵は上述の条件下で行われた。

醗酵中の様々な時間に、サンプルの全細胞集団に対するａＡＭ株の比率を調べた（第１Ｏ図）。ａＡＭ株の比率は、全細胞集団の５０％以上の比で接種された時明らかに増加した。しかし、接種時に５０％未満である場合は比率は変化しなかった。

考察従来の研究では、醗酵過程において３Ａ株におけるＧＵＳマーカー遺伝子は１００％安定であることが示されてきた（３９）。しかし、これらの実験において多数のコロニーサンプルを分析したところ、この構築体が不安定であることがわかってきた。この不安定性は、マーク化された菌株（３ＡＭまたは３ＡＭＣ）の各々を単一培養で接種して行ったコントロール醗酵において発見された。

これらの醗酵体からのサンプルは、ＧＵＳプレート検定に対して殆ど陰性であり、かつその反応頻度が総プレート数の１％未満であるコロニーを生じた。時折、この検定に対する反応性においてセクターされるコロニーが発見されたが、これは相同組換えによる遺伝子の切り出しく４５）、あるいは体細胞交叉後の遺伝子の欠損（４６）を示唆するものであった。不安定性の先生頻度は醗酵中には増加せず、コントロールの３ＡＭおよび３ＡＭＣ醗酵では直接定量できなかった。

本マーキング系により、ぶどう液の醗酵において、キラー株（３ＡＭ）と同じ菌株からの除去誘導体（３ＡＭＣ）の接種効果を直接比較できるようになった。キラー株および除去株の電気泳動的に調べた核型は、共通する遺伝子構造が存在することを強く示唆し、ｄｓＲＮＡ種の分析は、除去菌株でのＭ−ｄｓＲＮＡゲノムの欠損を示すものであった。ａＡＭ株およびａＡＭＣ株の生育速度または醗酵曲線には、如何なる相違も認められなかった。したがって、ａＡＭ株と３ＡＭＣ株とを比較することにより、特性の相違は直接Ｍ−ｄｓＲＮＡプラスミドの存在に、さらにはに２キラートキシンの産主に基づくものであると言える。

同じ醗酵条件下で、除去ａＡＭＣ株が全細菌集団の５０％のままであるのに対して、キラー株は８０％まで増加した。醗酵中、５Ａに対して優位性を示すＪＡＭ株のこの能力は、おそら＜３ＡＭ株によるキラートキシンの産生によるものであり、キラー株による各々の生育速度の差によるものではないと思われる。したがって、我々は、キラートキシンがこれらの醗酵条件下で重要な活性を示す、と結論づけることができる。この結果はワイン醸造学者にとって特に興味深いものである。何故ならば、３Ａ株から産生されるに２トキンンはｐＨ４，２で最大活性を示すことが報告されており（１７）、０れは一般的なぶどう果汁よりも０．５〜ｌ高いｐＨ値であるからである。

キラー活性がぶどう果汁の醗酵において報告される場合、混合培養醗酵のキラー細胞の比率が５０％未満である時、効果的なキラー作用が起こるかどうかに関して食い違いが生じる。Ｈｅａｒｄ　とＦｌｅｅｔ（２８）は、キラー細胞と感受性細胞の比率がおよそＩニアの場合にはキラー作用が認められなかったと報告しているのに対して、一方ではキラーｍ胞と感受性細胞の比率が１：１０以下の場合でのキラー活性が報告されている（２３．２５．２６）。

我々の結果では、感受性細胞に対するキラー細胞比率をおよそ２：１まで増加させることにより、３ＡＭ株による醗酵物が著しく優勢になり、醗酵終了時には総混合細胞集団の９７％を占めた。しかしながら、キラー細胞と感受性細胞の比率が１：２またはＩ：４である場合には効果的なキラー作用が起こらないことが明らかであった。培地の組成や醗酵条件、および菌株の感受性の違いが、キラートキシンの効果に関する報告の食い違いの要因であると言うことができる。

醗酵を導（ために選抜された酵母培養物をぶどう果汁に接種している国々では、ワイン製造におけるキラー株に関する事柄に注目している。この関心は、ぶどう果汁に天然に存在する酵母もおそらく　「純粋」培養醗酵において重要な役割を果たす（２２，４２）ことが認められて以来強くなっている。これらの天然の酵母には、Ｋｌｅｏｅｃｋｅｒａ。

Ｃａｎｄｉｄａ　、　ＨａｎｓｅｎｕＬａおよび５ａｃｃｈａｒｏｒｕｙｃｅｓ属の細菌種が含まれる。キラーＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓワイン酵母株は醗酵過程において天然の５ａｃｃｈａｒｏａｙｃｅｓ酵母を抑制する上で効果的に働くであろうし、他の種属の菌株を調節するための広範囲のキラー酵母が設計できる可能性がある。これらの理由により、効果的なキラー活性が行われるための適切な醗酵条件を決定するために、さらに研究を行う必要がある。　このＧＵＳマーク化系は、混合培養において広範囲のキラー株が迅速に明確に同定できる方法を提供するものである。この系は、醗酵中のキラー活性をより良く理解するために用いられるものである。

考察および結論本明細書において記載されるＧＵＳ−ヘクター構築体は、例えば主な選択マーカーとしてＳＭＲＩ−４１０遺伝子を用いる等の形質転換操作により、一連の酵母株に導入可能である。結果によれば、この構築体は、ワイン酵母株の基本的な機能を損なったり醗酵能力に影響を与えることなしに、酵母ゲノム上の特定の部位に組込まれることができる。さらに、一旦ゲツムに組込まれると、この構築体は醗酵過程において安定に保持される。

ＧＵＳマーカーの検定は、蛍光分析法、分光分析法または寒天プレート検定法により行うことができるａＸ−ｇｌｕｃまたはＭＵＧ基質の酵母細胞膜の自然透過はここで記載されている実験の時間範囲内では起こらなかったが、この問題は検定操作において人工的な透過を起こさせることにより克服された。全酵母細胞数におけるマークされた菌株の比率をめる方法が記載されている。

本発明のマーカー系は、異なる醗酵条件下における接種菌株の調査に応用される。一連の醗酵条件下において、接種されたぶどう果汁および未接種のぶどう果汁を用いたＨｅａｒｄとＦｌｅｅｔによる最近の研究（４２，４３，４４）によれば、５ａｃｃｈａｒｏ贋ｙｃｅｓ株が果汁のアルコール醗酵において必ずしも主要な生物ではないことが示唆されている。これらの研究には、ぶどう果汁の醗酵における５ａｃｃｈαγｏａｙｃｅｓの野性株の発生および重要性に関する知識が欠けているだけでなく、様々なワイン学的環境下における接種菌株の詳細な調査が必要である。本明細書で記載されているＧＵＳ系により、広範囲の酵母株がマークできるようになり、醗酵過程における明確な同定および調査方法が提供されるものである。

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１１、　５ｋｉｐｐｅｒ、Ｎ、ａｎｄ　Ｈ，Ｂｕｓｓｅｙ、Ｍｏｄｅ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆｙｅａｓｔ　ｔｏｘｉｎｓ：　ｅｎｅｒｇｙ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ　ｆｏｒ　５ａｃｃｈａｒｏｒｘｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｋｉｌｌｅｒ　ｔｏｘｉｎ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１２９：　６６８−６７７　（１９７７）。

１２−　Ｂｏｓｔｉａｎ、Ｋ、＾、、Ｈｏｐｐｅｒ、Ｊ、Ｅ、、ＲＯｇｅｒｓ、Ｄ、Ｊ。

ａｎｄ　Ｔｉｐｐｅｒ　Ｄ、Ｊ、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｒ　ｔｈｅｋｉｌｌｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ−１ｉｋｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｄｓＲＮ＾ｇｅｎｏｍｅ　ｏｒ　５ａｃｃｈａｒｏＲｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｘａｅ：　Ｍ−ｄｓＲＮ＾ｅｎｃｏｄｅｓ　ｔｏｘｉｎ、Ｃｅ１ｌ　＋９：　４０３−４］４　（１９８０）。

１３、Ｈａｒｒｉｓ、ＩＪ、Ｓ、、Ｖｉｒｕｓ−１ｉｋｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ａｎｄｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　ｋｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　ｎｏｎ−ｋｉｌｌｅｒｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　５ａｃｃｈａｒｏａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ　１：　１８１−１７４　（１９７８）。

１４、Ｎａｕｍｏｙ、Ｇ、１．　ａｎｄ　Ｔ、１．　Ｎａｕｍｏｖａ、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、　Ｘ１ｌｌ。

Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｒ　ｋｉｌｌｅｒ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　５ａｃｃｈａ−ｒｏｆｆｉｙｃｅｓ　ｆｒｏｒｎ　ｄｉＲｅｒｅｎｔ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、　Ｇｅｎｅｔｉｋａ９：　１４０−１４５　（１９７３）。

１５、Ｙｏｕｎｇ、Ｔ、Ｗ、ａｎｄ　Ｙａｇｉｕ、ＩＪ、Ａ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｒ　ｔｈｅｋｉｌｌｅｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｙｅａｓｔｓ　ａｎｄ　１ｔｓｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｎｔｏｎｒｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ　Ｊ。

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Ｓｈｉｍａｚａｋｉ、Ｔ、、Ｔｏｔｓｕｋａ、Ａ、、１（ａｒａ、Ｓ、、ａｎｄＨ，Ｉ（、Ｄｉｔｔｒｉｃｈ、１９８５．Ｋ１１ｌｅｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｒｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔｓ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｋｉｌｌｅｒｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔｓ、Ｊ、Ｆｅｒｒｎｅｎｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、６３：　４２］−４２９゜１７、Ｒｏｇｅｒｓ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｅ、＾、Ｂｅｖａｎ、１９７８．Ｇｒｏｕｐ　ｃｌａｓ−ｓｉｆ’１ｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｋｉｌｌｅｒ　ｙｅａｓｔｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｃｒｏｓｓ１８、Ｒａｄｌｅｒ、Ｆ、、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｍ、Ｄｅｎｎｅｒｅｔ。

１９８５−　Ｋ１１ｌｅｒ　ｔｏｘｉｎｓ　ｉｎ　ｎｅｗ　１ｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅｙｅａｓｔｓ　Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ　ｕｖａｒｕｒｘ　ａｎｄ　ＰｉｃｈｉａｋＬｕｙｖｅｒｉ、　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｌｅｔｔ、　２９：　２６９−２７２゜１９、　Ｒｏｓｉｎｉ、　Ｇ、　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｋｉｌｌｅｒ　５ｔｒａｉｎｓｏｆ　ＨａｎｓｅｎｕＬａ　ａｎｏｔｘａｌａ　ｖａｒ、ａｎｏｒｒｒａＬａ　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈａ−ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｙｅａｓｔ　５ｐｅｃｉｅｓ、Ｃａｎ、Ｊ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３１：　３００−２　（１９８５）。

２０、Ｂｏｏｎｅ、Ｃ，，５ｄｉｃｕ、＾、Ｍ、、Ｗａｇｎｅｒ、Ｊ、、Ｄｅｇｒｇ。

Ｒ，，５ａｎｃｈｅｓ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｈ，Ｂｕｓｓｅｙ、１９９０．　Ｉｎｔｅ−ｇｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　Ｋｌ　ｋｉｌｌｅｒ　ｔｏｘｉｎ　ｇｅｎｅ　ｉｎｔ。

ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｍａｒｋｅｄ　ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔｓ　ａｎｄ　１ｔｓｅｌｅｃｔ　ｏｎ　ｖｅｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ、＾ｍ、Ｊ、Ｅｎｏｌ、Ｖｉｔｊｃ。

４１：　３７−４２゜２１、Ｃｕ１ｎｉｅｒ、Ｃ，ａｎｄ　Ｃ，Ｇｒａｓ、Ｅｎｑｕｅｔｅ　ｓｕｒ　１ａｒｅｐａｒｔｉｔｉｏｎ　ｄｅｓ　１ｅｖｕｒｅｓ　ｋｉｌｌｅｒｓ　ｅｎ　Ｆｒａｎｃｅ。

Ｖｉｖｎｅｓ　ｅｔ　ｖｉｎｓ　３Ｆｌ：　２５−２７　（１９８３）。

２２、Ｌａｆｏｎ−Ｌａｌ’ｏｕｒｃａｄｅ、Ｓ、ａｎｄ　Ｐ、Ｒｒｂｅｒｅａｕ−Ｇｇｙｏｎ。

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｗｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｐｒｏｇ、　ｌｎｄ、帽ｃｒｏｂｉｏ１．１９：　１４５（１９８４）。

２３、Ｂａｒｒｅ、　Ｐ、Ｌｅ　ｍｅｃａ旧ｓｍｅ　ｋｉｌｌｅｒ　ｄａｎｓ　ＩａＣＯｎＣｕｒｒｅｎＣｅ　ｅｎｔｒｅ　５ｏｕｃｈｅｓ　ｄｅ　１ｅＶｕｒｅｓ。

εｖａ１ｕａｔｉｏｎ　ｅｅｔ　ｐＢｓｅ　ｅｎ　ｃｏｍｐｔｅ、Ｂｕｌｌ、Ｏ，１，Ｖ。

６４１−６４２：　６３５−６４３　（１９８４）。

２４、　Ｒｏｓｉｎｉ、　Ｇ、　ＥｆＴｅｔ　ｄ’ｕｎｅ　Ｉｅｖｕｒｅ″ｋｉｌｌｅｒ”　ｄｅＳａｃｃｈａｒｏｒｘｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｓｕｒ　ｕｎｅ　５ｏｕｃｈｅ　ｄｅｌｅｖｕｒｅ　５ｅｎｓｉｂｌｅ　ｄｅ　ｌａ　ｍｅｍｅ　ｅｓｐｅｃｅ　ｎｏｎｐｒｏｄｕｃｔｒｉｃｅ　ｄｅ　Ｈ２Ｓ　ｅｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎｅｅ　ｐｕｒ　Ｉａｖｉｎｒｒ：ｃａｔｉｏｎ　ｄａｎｓ　ｕｎ　ｍＮ１ｅｕ　ｄｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍ１ｘｔｅ。

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２５−　Ｈａｒａ、　Ｓ、、　Ｉｉｍｕｒａ、　Ｙ、　ａｎｄ　Ｆ、　０ｔｓｕｋａ、　Ｂｒｅｅｄｉｎｇｏｒ　ｕｓｅｆｕｌ　ｋｌｌｌｅｒ　ｗＩｎｅ　ｙｅａｓｔｓ、Ａｒｎ、Ｊ−Ｅｎｏｌ。

Ｖｉｔｉｃ、３２：　２８−３３　（１９８０）。

２８、Ｈａｒａ、Ｓ、、Ｎｍｕｒａ、Ｙ、、Ｏｙａｍａ、Ｈ，、Ｋｏｚｅｋｉ、Ｔ、。

Ｋｉｔａｎｏ、に、ａｎｄ　０ｔｓｕｋａ、に、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆｃｒｙｏｐｈｉｌｉｃ　ｋｉｌｌｅｒ　ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔｓ、Ａｇｒｉｃ、Ｂｊｏｌ。

Ｃｈｅｍ、４５：　１３２７−１３３４　（１９８１）。

２７、　５ｅｋｉ、Ｔ、、Ｃｈｏｉ、Ｅ、Ｈ，ａｎｄ　Ｄ、Ｒｙｕ、Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔＩｏｎｏｆ　ｋ目＋ｅｒ　ｗＩｎｅ　ｙｅａｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ、Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ。

帽ｃｒｏ、　４９：　１１２１−１２１５　＜１９８５）。

２８、Ｈｅａｒｄ、Ｇ、Ｍ、ａｎｄ　Ｆｌｅｅｔ、Ｇ、Ｈ，０ｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ａｎｄｔａｔｉｏｎ、Ａｐｐｌ、ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、３３：　２１７１−２１７４　（１９８７）。

２９、Ｌｏｎｇｏ、Ｅ、、Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ、Ｊ、Ｂ、、Ｃａｏｓａｄｏ、Ｊ、、Ｃａ１ｏ。

Ｐ、ａｎｄ　Ｔ、Ｇ、Ｖｉｌｌａ、Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｋｉｌｌｅｒ　ｅ４ｆｅｃｔ　ｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｍ１ｘｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆＳａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＦＥＲＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｌｅｔｔｅｒｓ　７１：　３３１−３３６　（１９９０）。

３０、Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ、５ｔｕｄｉｅｓ　Ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃａｄｉ　ｗｊｔｈ　ｐｌａｓｒｎｉｄｅｓ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｊｏｌ、　□」虹５５７−５８０　（１９８３）。

３１、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｒｃｚ、Ｄ、ａｎｄ　Ｂｕｒｋｅ、Ｊ、Ｆ、Ｒａｐｉｄ　ａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｃｏｓｍｉｄ　ｃｌｏｎｊｎｇ、　Ｎａｃｌｅｊｃ　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅｓ。

紅２９８９−２９９８　（１９８１）。

３２、　１ｔｏ、Ｈ，、Ｆｕｋｕｄａ、Ｙ、、Ｍｕｒａｔａ、Ｋ、ａｎｄ　Ｋｉｎ＋ｕｒａ、Ａ。

Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｒ　１ｎｔａｃｔ　ｙｅａｓｔ　ｃｅＬＩｓ　ＬｒｅＩＬｔｅｄｗｉｔｈ　ａｌｋａｌｉ　ｃａｔｉｏｎｓ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３：１６３−１６８　（１９８３）。

３３、Ｄａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、、Ｔｈｏｍａｓ、Ｍ、、Ｃａｍｅｒｏｎ、Ｊ、Ｒ，、Ｓｔ。

Ｊｏｈｎ、　Ｔ、Ｐ、、５ｃｈｅｒｅｒ、Ｓ、ｈｎｄ　Ｐａｄｇｅｔｔ、Ｒ，Ａ。

Ｒａｐｉｄ　ＤＮＡ　１ｓｏｌａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄ−ｉｚａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、Ｖｏｌ。

６５、Ｇｒｏｓｓ、Ｌ、ａｎｄ　Ｍｏ１ｄｔｖｅ、に、（ｅｄｓ、）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ　４０４−４１１　（１９８０）。

３４．５ｏｕｔｈｅｒｎ、［！、Ｍ、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｈｔｌｌＩｏｎｇ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　５ｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅｓｉｓ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８：　５０３−５１７　（１９７５）。

３５、Ｒａｎｋｉｎｅ、Ｂ、Ｃ，ａｎｄ　Ｐｏｃｏｃｋ、Ｋ、Ｆ、Ａｌｋａｌｉｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｒ　５ｕｌｆｕｒ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｉｎ　ｗｉｎｅ、Ａｕ５ｔ。

１１ｉｎｅ　Ｂｒｅｗ、５ｐｒｉｔ　Ｒｅｖ、９１：　６２，６４．６６　（１９７２）。

３６、Ａｎｏｎ、　Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｆａｒ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅＴｅｃｈｎｉｃｏｎ　２６０　１ｎｆｒａ−ａｎａｌｙｓｅｒ、Ｂｒａｍ＆　ＬｕｅｂｂｅＡｕｓｔｒａｌｉａ。

３７、Ｇｕｓｔａｖ、Ａ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ｕｓｉｎｇｔｈｅ　ＡＤＣＩ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、Ｖｏｌｌｏｌ、（ｅｄｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ１９２−２０１゜３８、Ｃａ５ｅｙ、Ｇ、Ｐ、、Ｗ＋ｊ　Ｘ１ａｏ　ａｎｄ　Ｒａｎｋ、Ｇ、Ｈ，Ａ　ｃｏｎ−ｖｅｎｉｅｎｔ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒ　「ｏｒ　ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　１ｎｄｕｓｔｒｉａ１　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　５ａｃｃｈａｒｏ−ｒｔｚｙｃｅｓ　ｙｅａｓｔ　：　ＳＭＲＩ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔ。

ｔｈｅ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ　ｓｕｌｆｏｍｅｔｕｒｏｎ　ｍｅｔｈｙｌ、Ｊ、Ｉｎ５ｔ。

Ｂｒｅｗ、９４：　９３−９７　（１９８８）。

３９、Ｐｅｔｅｒｉｎｇ、Ｊ、Ｅ、、Ｈｅｎ５ｃｈｋｅ、Ｆ、＾、ａｎｄＬａｎｇｒｉｄｇｅ、Ｐ、Ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏＬｉ　β−Ｇｌｕｃｒｏｎｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅ　ａｓ　ａ　ｍａｒｋｅｒ　ｆａｒ　５ａｃｃｈａｒｏ−ｒｘｙＣｅＳ　ｙｅａｓｔ　５ｔｒａｌｎ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｍ、Ｊ。

Ｅｎｏｌ、Ｖｉｔｉｃ、４２：　６−１２　（１９９１）。

４０、Ｆｒ１ｅｄ、Ｈ，Ｍ、ａｎｄ　Ｇ、Ｆｉｎｋ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｅｈｅｔｅｒｏｄｕｐＬｅｘ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｒ　ｋｉｌｌｅｒ″　ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｒｒｏｔｎ　ｙｅａｓｔ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、６９：　２８４６−２８４９　（１９７８）。

４１、Ｗｉｃｋｎｅｒ、Ｒ，Ｂ、”Ｋ１１ｌｅｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ”　ｏｆ　５ａｃ−ｃｈａｒｏａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｃｕｒｉｎｇ　ｂｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｔｅｌｅｖａｔｅｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、上Ｕ工１１５−１２６　（１９７４）。

４２、Ｈｅａｒｄ、Ｇ、ＩＪ、ａｎｄ　Ｆｌｅｅｔ、Ｇ、Ｈ，Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆｎａｔｕｒａｌ　ｙｅａｓｔ　ｆｌｏｒａ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｊｏｎｏｆ　１ｎｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｎｅｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ−ｍｅｎｔａｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５０：　７２７−７２８　（１９８５）。

４３、Ｈｅａｒｄ、Ｇ、Ｍ、ａｎｄ　Ｆｌｅｅｔ、Ｇ、Ｈ，０ｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ａｎｄｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎ−ｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｏｔｎｅ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎ　ｗｉｎｅｓ、　ＦｏｏｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　＾ｕｓｔｒａｌｉａ　３８：　２２−２５　（＋９８６）。

４４、Ｈｅａｒｄ、Ｇ、Ｍ、ａｎｄ　Ｆｌｅｅｔ、Ｇ、Ｈ，Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆｔｅｍｐｅｒｇｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｐ）ｌ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｒ　ｙｅａｓｔｓｐｅｃｉｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒａｐｅｊｕｉｃｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　６５．二２３−２８　（１９８８）。

４５゜５ｔｒｕｈｌ、に、、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｄ、Ｔ、、５ｃｈｅｒｅｒ、Ｓ。

ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ、Ｈｉｇｈ（ｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒａ＋ａ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ：　＾ｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｈｙｂｒｉｄ　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７６：　１０３５−１０３９　（１９７９）。

４６、Ｒｏｅｄｅｒ、Ｇ、Ｓ、ａｎｄ　Ｓ、Ｅ、Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｍｉｔｏｔｉｃ　ｒｅｃｏｍ−ｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔ、４：　２６３−２６７　（１９８８）。

日ｇｕｒｅ　１゜Ｆｉｇｕｒｅ　２Ｆｉｇｕｒｅ　３゜ ε Ｆｉｇｕｒｅ　５、Ｔａｍｅ　（ｈａｕｒｓｌＦｉｇｕｒｅ　６゜ＯＴＯＯ２００３００Ｔｉｍｅ　（ｈａｕｒｓｌＯＴＯｏ　２００　３００丁ｒｍｅ　（ｈｏｕｒ：すＦｉｑｕｒｅ　７゜Ｆｉｎｕｒｅ　８゜日ｇｕｒｅ　９゜日ｇｕｒｅ　１０゜要旨本発明は、酵母プロモーターおよびターミネータ−配列と連結されたβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする領域を含有する新規なプラスミドを提供するものであり、これにより前記コード領域は酵母で発現可能となる。好ましいプロモーターおよびターミネータ−配列は、酵母での発現可能にするものであれば如何なるものでもよく、特に好ましいのはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｙｉｓｉａｅのアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターおよびターミネータ −配列である。本発明のプラスミドはプロモーターおよびターミネータ−配列をＧＵＳ遺伝子に連結させ、それによって得られる新規な構築体を適当なキャリヤープラスミドに挿入することにより作られる。キャリヤープラスミドは、宿主染色体への組込みにより新規な構築体を酵母株に導入するために用いられる。そしてＧＵＳ活性の検定は全酵母数におけるマークされた菌株の比率をめるために用いられる。

国際調査報告ＩＩＩｊｅｒ＋＋ａｊｌｏｎ＋＋ｌ　Ａｐａ＋　１１１１１１１　Ｔ１６．　Ｋ ηｍ　９１／ｌＸＥ２２Ｇ

Claims

【特許請求の範囲】

１．酵母のプロモーターおよびターミネータ配列に連結されているβ−グルクロニダーゼコード領域よりなるＤＮＡ配列。
２．前記β−グルクロニダーゼコード領域がＥｓｃｈｅ−ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来である、請求の範囲１記載のＤＮＡ配列。
３．前記プロモーターおよびターミネータ配列がアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターおよびターミネータ配列である、請求の範囲１または２記載のＤＮＡ配列。
４．前記プロモーターおよびターミネータ配列がＳａｃ−ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である、請求の範囲１乃至３のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列。
５．請求の範囲１乃至４のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列を含有するプラスミド。
６．プラスミドｐＡＷ２２０。
７．酵母のプロモーターおよびターミネータ配列をβ−グルクロニダーゼ遺伝子に連結させ、得られた構築体をプラスミドに挿入することよりなる、請求の範囲５または６に記載のプラスミドの製造方法。
８．（ａ）酵母のプロモーターおよびターミネータ配列をβ−グルクロニダーゼ遺伝子に連結させること、（ｂ）得られた構築物を、実質的に宿主酵母染色体のＤＮＡ配列と同じであるＤＮＡ配列を含有するキャリヤープラスミドに挿入すること、および（ｃ）β−グルクロニダーゼ遺伝子を酵母のプロモーターおよびターミネータ配列と共に宿主酵母染色体に組み込むために、工程＝の組換えプラスミドを使用することよりなる、β−グルクロニダーゼコード領域を酵母菌株に組み込む方法。
９．キャリヤープラスミドがＳＭＲ１−４１０遺伝子を含む、請求の範囲８に記載の方法。
１０．担体プラスミドがｐＷＸ５０９である、請求の範囲８または９に記載の方法。
１１．酵母株がキラー酵母株である、請求の範囲８乃至１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．（ａ）グルクロニダーゼ遺伝子に対する基質を酵母株のサンプルに添加すること；（ｂ）酵母株の細胞膜に浸透させること；（ｃ）β−グルクロニダーゼ酵素反応による生成物が検出可能な量生成するに十分な時間酵母株をインキュベートすること；および（ｄ）前記生成物を試験することよりなるβ−グルクロニダーゼ活性の試験法。
１３．前記基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニドまたは４−メチルウンベリフェリルグルクロニリドである、請求の範囲１２に記載の試験法。
１４．前記酵母株が請求の範囲１乃至４のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列を含む、請求の範囲１２または１３に記載の試験法。
１５．請求の範囲１乃至６のいずれか一つに記載の、実質的にここにおいて記載されているＤＮＡ配列またはプラスミド。
１６．請求の範囲７乃至１１のいずれか一つに記載の、実質的にここにおいてで記載されている方法。
１７．請求の範囲１２乃至１４のいずれか一つに記載の、実質的にここにおいて記載されている試験法。