JPH05506209A

JPH05506209A - 色素原基質

Info

Publication number: JPH05506209A
Application number: JP91501386A
Authority: JP
Inventors: アーリエリ，サロー
Original assignee: クロモイエニツクス・アクチエボラーグ
Priority date: 1989-12-12
Filing date: 1990-12-03
Publication date: 1993-09-16
Anticipated expiration: 2014-08-03
Also published as: WO1991009052A1; DE69030102T2; EP0505428B1; DE69030102D1; US5334703A; SE8904188D0; JP2929555B2; ES2098344T3; EP0505428A1; AU6957991A; ATE149516T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】色素原基質発明の分野本発明は、生理学的液体、食品、医薬等の中の細菌エンドトキシンの定量的測定に使用される新規な色素原合成基質に関する。

発明の背景細菌エンドトキシンはグラム陰性菌によって産生され、はとんどの研究者により敗血症の発症に極めて重要な因子であると考えられている。エンドトキシンの定量に関しては、エンドトキシンがカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙ−ｐｈｅｍｕｓ）の凝血系を特異的に活性化するというＬｅｖｉｎ　＆Ｂａｎｇ　（１９５６年）の観察に基づき、いくつかの方法が報告されてきた。初期には、カブトガニ変形細胞溶解質（ＬＡＬ）がエンドトキシンと接触すると特異的なゲル化を引き起こすことを利用した試験法が開発された。さらに最近になって、上述の観察に基づく発色および蛍光法が開発され、少量のエンドトキシンを迅速に検出することが可能になっている（Ｅｌ、Ｃ，Ｈｅｍｋｅｒ：Ｅｌａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃＳｕｂｓｔｒａｔｅ、１９８３．　Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ。

Ｂｏｓｔｏｎ）。

先行技術Ａ、Ｅ、　Ｔｏｒａｎｏらはカブトガニ変形細胞溶解質からの酵素が哺乳動物血液凝固因子Ｘａに類似の特異性を示すことを明らかにした（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３４．４０７−４１７゜１９８４）。これはその天然の基質、プロトロンビン中の配列−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを認識する。

他の研究者たちはまた、エンドトキシンの分析に際し、カルボキシ末端Ｇｌｙ− Ａｒｇの配列が重要な役割を果たすことを明らかにしている。Ｔ、　Ｈａｒａｄａら（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐ−１ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　Ｃｒａｂ　（Ｌｉｍｕｌｉｄａｌ）、　Ｅ。

Ｃｏｈｅｎ　（ｅｄ）、＾ｔａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７９．２０９−２２０頁〕は２１３頁の表に使用される様々な基質を開示しているが、ｃｔｙ−Ａｒｇカルボキシ末端配列を有するもののみが、興味ある結果を与えることを示している。その２１２頁下から７〜１０行に、この著者らは［これらの結果は、カブトガニの凝血酵素が、Ｇｌｙ−Ａｒｇカルボキシ末端配列を有するペプチドｐＮＡに対して高い特異性を現すことを明瞭に示すＪと指摘している。

米国特許第４．１８８．２６４号および米国特許第４．５７６、７４５号もまた、エンドトキシンの定量に使用される基質中のカルボキシ末端配列としてＧｌｙ −Ａｒｇを与えるものである。

カルボキシ末端配列としてＡｒｇを有する他の基質についても検討されている。

米国特許第４．４０６．８３２号では、カルボキシ末端は一＾１ａ−Ａｒｇ−または−Ｃｙｓ−＾ｒｇ−とされ、この基質は標準の−ｃｉｙ−＾ｒｇ−に比し、同等またはわずかに優れた相対活性を示している。これらの反応における機構は複雑なので、どのようなペプチド配列が許容できる結果を生じるかを予知することは不可能である。

驚くべきことに、この領域の先行技術に反して、本発明者らは−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ −のカルボキシ末端を有する基質が既知の基質と比較して少なくとも２０％優れた相対活性を示すことを見出したのである。

エンドトキシンの定量用の基質中にグリコール酸（Ｇｌｙｃ）を使用することはこれまで開示されたことはないが、全く驚くべきことに−Ｇｌｙｃ−＾ｒｇ−を用いた場合も−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−を用いた場合と同様に良好な結果が得られ、これらはいずれも通常用いられている（ｄｙ−Ａｒｇよりも優れた効果を発揮することが明らかにされたのである。

発明の説明本発明における色素原合成ペプチドまたはペプチド同等物質は、エンドトキシンの定量に使用される方法において高い感度を示す。

この新規な基質は、次式Ｒ＋−Ａｔ−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｒ２またはその塩（式中、１？、＝Ｈまたは保護基Ａ、＝Ｈ，Ｉｌｅ、　ＬｅｕまたはＶａｌ＾２＝Ｇ１ｕ、＾ｓｐ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ＾３＝Ｇ１ｙまたはＧｌｙｃＡ４＝ＡｒｇまたはＬｙｓＲ２＝４−ニトロアニリンである。

ただし、Ａ４がＬｙｓの場合にはＡ３はＧｌｙであり、Ａ４がＡｒｇの場合にはＡ３はＧｌｙｃである）によって特徴づけることができる。

本発明はまた、ペプチド誘導体の製造方法を開示する。

本発明はまた、次式Ｒ，−Ａ、−Ａ２−Ａ３−Ａ　４−Ｒ２またはその塩（式中、Ｒ，＝Ｈまたは保護基＾ｒ＝Ｈ，Ｉｌｅ、　ＬｅｕまたはＶａｌＡ２＝Ｇ１ｕ、　ＡｓｐＳＳｅｒ、　ＴｈｒＡ、＝Ｇ１ｙまたはＧｌｙｃ＾４＝＾ｒｇまたはＬｙｓＲ２＝酵素的加水分解によって化合物Ｒ２−ＮＨ２を与える芳香族または異項環基１？、−ＮＨ３は、分裂したマーカーを直接または誘導体化後に測定することにより、エンドトキシンの定量を可能にする色素原性を有する既知の化合物（Ｈ，Ｃ，Ｈｅｍｋｅｒ　：前出）である。

ただし、Ａ、がＬｙｓの場合にはＡ３はＧｌｙであり、Ａ４がＡｒｇの場合にはＡ３はＧｌｙｃである）の誘導体を使用することによる、細菌エンドトキシンの定量方法を開示する。

細菌エンドトキシンの定量のためのこれらの誘導体の使用も開示される。

Ｒ２−Ｎ１１１２で表される化合物の例には、ｐ−ニトロアニリン、３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリン、３−スルホ−４−ニトロアニリン、３−アルコキシ−４−ニトロアニリン、３−カルボキシ−４−ニトロアニリン、４−メチルオキシ−ナフチルアミン、４−（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル）アミノアニリン、５−アミノ−イソフタル酸ジメチルエステル、５−アミノ−８−ニトロキノリン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、４−アミノジフェニルアミンを挙げることができる。本発明はまた細菌エンドトキシンの定量のためのこれらの誘導体の使用も開示する。

新規なペプチドまたはペプチド同族誘導体は、カルボキシ末端としてＧｌｙと組み合わせる場合はＬｙｓを、Ｇｌｙｃと組み合わせる場合はＡｒｇを含有する。

Ｇｌｙ−Ｌｙｓの組み合わせはカブトガニ変形細胞溶解賀に使用する基質としてはこれまで不適当と考えられていたものであり、Ｇｌｙｃ　−Ａｒｇの組み合わせは細菌エンドトキシンの定量方法におけるこの種類の基質としてはこれまで全く使用されたことがないものである。

合成の説明ペプチド化学（Ｍ、　Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　１９６４）において用いられる慣用のカップリング技術および慣用の保護基（Ｚ、　Ｂｏｃ等）、例えばマーカーを提供するＣ末端アミノ酸へのアミノ酸の逐次付加、またはＮ末端ペプチドフラグメント自体の合成、ついでマーカーを提供するＣ末端アミノ酸へのそのカップリングが使用された。

本発明による様々な基質の合成については以下の実施例にさらに詳述するが、それによって限定されるものではない。

中間体および最終生成物の精製は、沈殿、結晶化またはゲル濾過クロマトグラフィーによって行われた。精製された最終生成物は凍結乾燥した。ＴＬＣ分析には、予め構築したシリカゲルＦ２５４のガラスプレートを使用した。

クロマトグラフィー終結後、プレートを紫外線（２５０ｎＩＩｌ）で検査し、ついでニンヒドリンおよび塩素／ジカルボキシジン試薬で発色させた。示したＲｆ値は単一クロマトグラフィーの結果である。

ＴＬＣに用いられた溶媒系は次表に従って指示した。

盟　溶媒系　容量比Ａｎ−ブタノール：＾ｃＯＨ：水　３：２：ｌＰａ６　り００ホルム：　ＭｅＯＨ：ＡｃＯ■＝水　３４：４：９：２Ｐ１　りｏｏホルム：　ＭｅＯＦｉ　９　：　１Ｐａ　クロｏホルム：　ＭｅＯＨ：＾ｃＯＨ１７：２：２ＨＰＬＣ分析は、１ｌｅｒｃｋ　Ｒ，Ｐカラム（Ｂｉｂａｒ　Ｌｉｃｈｒａｃａｒｔ）上、溶出液として５％トリエチルアミノホスフェ−ｒ中生成物の光学活性は５０％ＡｃＯＨ中濃度０．４〜１．０９　／　１００ｍ１．２５℃において５８９ｎｍで測定した。下記の略号についてその意味を示す（［ＰＡＣの規定がある場合はそれに従った）。

＾ｒｇ＝アルギニン　Ｖａｌ＝バリンＧ１ｙ＝グリシン　Ｇ１ｕ＝グルタミン酸１１ｅ＝イソロイシン　Ａｓｐ＝アスパラギン酸Ｌｅｕ＝　Ｏイシン　５ｅｒ＝セリンＴｈｒ＝スレオニン基質中のすべてのアミノ酸は、特に指示のない限りＬ−立体配置である。

遊離のアミノ酸またはペプチドはＮ−末端アミノ基におけるトにより、またカルボキシ末端基における一ＯＨによって指示する。アミノ基は左側に、カルボキシ基は右側に常に表示する。

略　号Ａｃ＝アセチルＡｃ０Ｈ＝酢酸ＡＭＣ＝　７−アミノ−４−メチルクマリンＢｏｃ＝　ｔ−ブトキシカルボニルＢｚ＝ベンゾイルＢｚｌ　＝ベンジルＤＣＣＩ＝ジシクロへキシルカルボジイミドＤＣＵ＝ジシフロヘキシル尿素ＤＮＡＰ＝ジメチルアミノピリジンＤＩＩＦ　＝ジメチルホルムアミドＥｔＯＡｃ＝酢酸エチルＥｔＯＨ＝エタノールＥｔ、Ｎ＝　）リエチルアミンＧ１ｙｃ＝グリコール酸ＨＯＢＴ＝　１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＨＰＬＣ＝高速液体りロマトグラフィーＭｅＯＨ＝メタノール０Ｎｐ＝ニトロフエニルエステルＯ３ｕ÷ヒドロキシスクシンイミドｐＮＡ＝ｐ−ニトロアニリンＴＦＡ＝　トリフルオロ酢酸Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル実施例１ α−＾ｃ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　・ＨＣＩ、分子量＝６４４、１５Ｉａ）　ｅ　−Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　−ＴＦＡ、分子量＝　５１４．５２５真ｌのメチレンクロリドに溶解した１０ミリモルのα−Ｂｏｃ−ｔ　−Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡに９寵ｌのＴＦＡを加えた。この溶液を室温で３０分間撹拌し、ｔ− ブチルメチルエーテル−石油エーテルの２＝１混合物で沈殿させた。

収率：９５％ＴＬＣ：　ｌ！ｆｌ）、　６０　（＾）ｌｂ）　ａ　−Ｂｏｃ−ｒ　−０−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ，分子量＝３９４、４１モルＮａＨＣＯ３溶４２００　ｍ　ｌに溶解したＣ１．１モルのＨ−Ｇｕｙ− 〇■にジオキサン２００菖Ｊ中０．１モルのα−Ｂｏｃ−７−０−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−０−Ｓｕの溶液を加えた。混合物を一夜室温で撹拌した。翌日、溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状の残留物を１００ｚＪの水に溶解し、ジエチルエーテルで洗浄した。水相をにｌｌｌ５Ｏ４溶液でｐＨ２とし、ＥｔＯＡｃで抽出した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、ＥｔＯＡｃ溶液を蒸発させ、標記物質をジエチルエーテル−石油エーテル混合物（１：　１）で沈殿させた。

収率：８５％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．５　（Ｐａ）ｌｃ）　Ｈ−ｒ　−０−ＢｚＬ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ−ＴＦＡ、分子量＝４０８、４１０ミリモルのα−Ｂｏｃ−７−０−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１ｂ）を２０ｍ１のメチレンクロリドに溶解し、これに９冨ｌのＴＦＡを加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、真空中で蒸発させて油状物とし、ジエチルエーテルで沈殿させた。

収率：９０％丁ＬＣ：　Ｒｆ＝　０．４４　（Ａ）ｌｄ）　ａ−Ｂｏｃ−１１ｅ−７−○−Ｂｚｌ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−ＯＨ，分子量；５０７．６１モルＮａＨＣＯ３溶１＆２５Ｏｘｌ中に溶解した０、１モルのＨ−７−０−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ・ＴＦＡにジオキサン２５（ｈｌｌａ、１モルのα −Ｂｏｃ−１１ｅ−０−Ｓｕの溶液を加えた。混合物を室温で一夜撹拌した。翌日、溶液を真空中で蒸発させ、残留物を水１０Ｊ＋＋１に溶解し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。水相をＫＨＳＯ４ＨＳＯ４溶液上ｐＨ３ｔＯＡｃテ抽出した。Ｎａ２５Ｏ４ｔ’乾燥後、ＥｔＯＡｃ溶液を蒸発させ、標記物質を石油エーテルで沈殿させた。

収率：９２％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．６　（Ｐａ）ｌｅ）　α−Ｂｏｃ−１１ｅ−７−０−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ε−Ｚ−Ｌｙｓ　−ｐＮＡ、分子量＝　８９（１，０２５露ｌのＤＭＦに溶解した３ミリモルのε−Ｚ　−Ｌｙｓ　−ｐＮＡ　−ＴＦＡ　（ｌａ）を冷却しながら（−１０’ Ｃ）　Ｅｔ３Ｎで中和した。この溶液に３ミリモルのα−Ｂｏｃ　−１１ｅ−γ −０−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ｌｄ）　、３ミリモルのＨＯＢＴおよび３．２ミリモルのＤＣＣＩを加えた。混合物を冷却しながら１時間ついで室温で一夜撹拌した。生成したＤＣＵを濾去し、溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状物をＥｔＯＡｃに溶解し、２％ＮａＨＣＯｓ、２％ＫＨ８ｏ４ツいテ水で洗浄した。

Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、ＥｔＯＡｃ相を蒸発させ、標記物質をジエチルエーテルで沈殿させた。

収率：６１％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．６７　（ＰＬ）Ｉｆ）　ａ−＾ｃ−１１ｅ−７−０−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ε−Ｚ　−Ｌｙｓ　−ｐＮＡ、分子量＝　８３１．９６菖ｌのメチレンクロリド中１２ミリモルのα−Ｂｏｃ　−１１ｅ−ｙ　−０−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ε−Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（１ｅ）に３．ＢｚｌのＴＦＡを加えた。混合物を室温で３０分間攪拌し、ジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した物質を１０ｗ１のＤｎＦに溶解し、冷却しながら（−１０℃）１６０μｌのＥｔ３Ｎで中和した。１４０μｌの無水酢酸を加え、混合物を冷却しながら１時間、室温で２時間撹拌した。溶液を真空中で油状物に蒸発させ、標記物質を水で沈殿させた。

収率：８６％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．４５　（ＰＬ）１）　α−Ａｃ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ−ＥｔｃＩ！、分子量＝６４４．１５メチレンクロリド１０ｍ１中１ミリモルのα−Ａｃ−１１ｅ−γ−〇−Ｂｚｌ− Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（１ｆ）の冷（−１０℃）懸濁液に１０１７のトリフルオロメタンスルホン酸を加えた。混合物を室温で５０分間撹拌し、ジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した基質を５ｅｐｈａｄｅｘ＠　ＱＡＥ −２５クロライド型カラム上溶出液として５０％ＥｔＯＨを用いてイオン交換に付し、Ｍｅｒｃｋ　ＬｏｂａｒＯ充填カラム（Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ■ＲＰ−８ −Ｂ）上洛出液として５０％ＭｅＯＨ（２ｘｉ／分）を用いて精製した。精製された生成物は凍結乾燥した。

収率：４２％丁ＬＣ：　Ｒｆ＝　０．２　（Ｐａｇ）ＨＰＬＣ：純度９８％［α］％’＝−６３．１’　（ｃ　＝０．５％）実施例２ α−＾ｃ−１１ｅ−Ｓｅ’ｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ−ＨＣｌ、分子量＝６０２、１１２ａ）　ａ　−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ｅ　−Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮ＾２分子量＝　５５７．６２５ｍ１のＤＭＦに溶解した５ミリモルのε−Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ・ＴＦＡ　（実施例１ａの記載と同様にして製造）を冷却しながら（−１０℃）　Ｅｔ、Ｎで中和した。この溶液に５ミリモルのａ　−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，５ミリモルのＨＯＢＴおよび５ミリモルのＤＣＣＩを添加した。混合物を冷却しながら１時間、ついで室温で一夜撹拌した。生成したＤＣＵを濾去し、溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状物をＥｔＯＡｃに溶解し、２％ＮａＨＣＯｓ、２％ＫＩＩＩＳＯ４および水で洗浄した。

Ｎａ、ＳＯ２で乾燥後、ＥｔＯＡｃ相を真空中で蒸発させ、標記物質をジエチルエーテルで沈殿させた。油状物が得られ、真空中で固化した。

収率ニア３％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．５５　（ＰＩ）２ｂ）　ａ−Ｂｏｃ−０−Ｂｚｌ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−ｅ　−Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ。

分子量＝　７３４．２２ＴｏＪのメチレンクロリドに溶解した５ミリモルのα−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ｅ　 −Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（２ａ）　ｌこＴＦＡ　１０ｍ１を加えた。

混合物を室温で３０分間撹拌し、物質をジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した物質を２５震１のＤＭＦに溶解し、冷却しながら（−１０℃）　Ｅｔ３Ｎで中和した。この溶液に５ミリモルのａ−Ｂｏｃ−○−Ｂｚｌ　−Ｓｅｒ　−０Ｈ１５ミリモルのＨＯＢＴおよび５．１ミリモルのＤＣＣＩを加えた。混合物を冷却しながら１時間、ついで室温で一夜撹拌した。生成したＣＣＵを濾去し、溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状物を）：ｔＯＡｃに溶解し、２％ＮａＨＣＯ３，２％ＫＨＳＯ，および水で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、ＥｔＯＡｃ相を蒸発させ、標記物質をジエチルエーテルで沈殿させた。油状物が得られ、真空中で固化した。

収率、８６％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．６２　（ＰＬ）２ｃ）　ａ−Ｂｏｃ−１１ｅ−〇−ＢｚＬ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−ｅ　−Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、分子量＝　８４８．０２０諺ｌのメチレンクロリドに溶解した２ミリモルのα−Ｂｏｃ−０−Ｂｚｌ− ３ｅｒ−Ｇｌｙ−ε−Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（２ｂ）にＴＦＡｌｏｍｌを加えた。

混合物を室温で３０分間撹拌し、生成した物質をジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した物質を２５冨ｌのＤＭＦに溶解し、冷却しながら（−１０℃）　Ｅｔ、Ｎで中和した。この溶液に２ミリモルのα−Ｂｏｃ　−１１ｅ　−ＯＮｐを加えた。混合物を冷却しながら１時間、室温で４８時間撹拌した。・溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状物をＥｔＯＡｃに溶解し、２％ＮａＨＣＯ３，２％ＫＨ３Ｏ，および水で洗浄した。Ｎａ２ｓＯ４で乾燥後、ＥｔＯＡｃ相を蒸発させ、標記物質をジエチルエーテルで沈殿させた。

収率ニア２％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．６２　（ＰＬ）２ｄ）　ａ−Ａｃ−１１ｅ−０−Ｂｚｌ −Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ｅ　−Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、分子量＝　７８９．９１０１Ｎのメチレンクロリドに溶解した１ミリモルのα−Ｂｏｃ−１１ｅ−０− Ｂｚｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ε−Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（２ｃ）にＴＦＡ５ｔ／を加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、生成した物質をジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した物質をＤＭＦ　ＩＱｍｊ＋に溶解し、冷却しながら（−１０ °Ｃ）８０μ／のＥｔ３Ｎで中和した。７０μ！の無水酢酸を加え、混合物を冷却しながら１時間ついで室温で２時間撹拌した。溶液を真空中で蒸発させて油状物とし、エーテルで標記物質を沈殿させた。

収率：８５％ＴＬＣ：　Ｒｆ−０，５５（ＰＩ）２）　ａ−Ａｃ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ−ＢＣｌ、分子量＝６０２、１１１０１１ノのメチレンクロリド中の１ミリモルのα−Ａｃ−１１ｅ−０−Ｂｚｌ −Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ε−Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　（２ｄ）の懸濁液に１（ｂｉ’のトリフルオロメタンスルホン酸を加えた。

混合物を室温で５０分間撹拌し、ジエチルエーテルで沈殿させた。生成物を実施例１の場合と同様の方法でイオン交換し、精製した。

収率：３５％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．２　（Ｐａｓ）ＨＰＬＣ：純度９７％〔α漕＝５０．１’　（ｃ　＝０．５％）実施例３ α−＾ｃ−１１ｅ−丁ｈｒ　−Ｇｌｙ　−Ｌｙｓ　−ｐＮＡ　−ＦｉＣｌ、分子量＝６１６、１３３ａ）　ａ　−Ｂｏｃ−０−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ　−ε−Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡ。

分子量＝　７４８．２メチレンクロリド２０ｍ１に溶解した５ミリモルのα−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ｅ　− Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（２ａ）にＴＦＡ　１０ｇＩＶを加えた。

混合物を室温で３０分間撹拌し、生成した物質をジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した物質を２５１／のＤＭＦに溶解し、冷却しながら（−１０℃）　Ｅｔ３Ｎで中和した。この溶液に５ミリモルのａ−Ｂｏａ−０−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ−０ ■、５ミリモルのＨＯＢＴおよび５．１ミリモルのＤＣＣＩを加えた。混合物を冷却しながら１時間、ついで室温で一夜撹拌した。生成したＤＣＵを濾去し、溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状物をＥｔＯＡｃに溶解し、２％Ｎａ１ｌｌＣ０３，２％ＫＨ５Ｏａおよび水で洗浄した。Ｎａ２５Ｏ，で乾燥後、ＥｔＯＡｃ相を蒸発させ、標記物質をジエチルエーテルで沈殿させると油状物が得られた。油状物は真空中で固化した。

収率：５１％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．６５　（ＰＬ）３ｂ）　ａ　−Ｂｏｃ−１１ｅ−０−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ｅ　−Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮ＾１分子量＝　８６２．０２（ｈｌのメチレンクロリドに溶解した２ミリモルのα−Ｂｏｃ、−０−Ｂｚｌ −Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ｔ　−Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（３ａ）にＴＦＡ１１）＋’ｌを加えた。混合物を室温で３ａ分間撹拌し、生成した物質をジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した物質をＤＭＦ　２５＊ｌに溶解し、冷却しながら（−１０℃ ）　Ｅｔ、Ｎで中和した。この溶液に２ミリモルのα−Ｂｏｃ　−１１ｅ　−ＯＮｐを加えた。混合物を冷却しながら１時間、室温で４８時間撹拌した。溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状物をＥｔＯＡＣに溶解し、２％ＮａＨＣＯ３，２％ＫＨＳＯ４および水で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、ＥｔＯＡＣ相を蒸発させ、標記物質をジエチルエーテルで沈殿させた。

収率：５０％丁ＬＣ：　Ｒｆ＝　０．７　（ＰＩ）３ｃ）　ａ−Ａｃ−ｆｌｅ−０−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ｅ−Ｚ　−Ｌｙｓ− ｐＮＡ、分子量＝　８０３．９１０ｍ１のメチレンクロリドに溶解した１ミリモルのα−Ｂｏｃ−１１ｅ−○− Ｂｚｌ　−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ｅ　−Ｚ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（３ｂ）に５ミリの丁ＦＡを加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、生成した物質をジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した物質をＤＭＦ　１（ｌｔｊ’に溶解し、冷却しながら（−１０℃）８０μｌのＥｔ３Ｎで中和した。７０ｔｔｌの無水酢酸を加え、混合物を冷却しながら（−１０℃）１時間、室温で２時間撹拌した。

溶液を真空中で蒸発させて油状物とし、標記物質を水中で沈殿させた。

収率：８６％ＴＬＣ：　Ｒｆ　＝　０．５５　（ＰＬ）３）　Ａｃ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ −Ｌｙｓ−ｐＮＡ−ＨＣＩ、分子量＝６１６、１３１ｒｈｌのメチレンクロリド中１ミリモルのα−＾ｃ−ｒｌｅ−Ｏ−Ｂｚｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ε−Ｚ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（３ｃ）の懸濁液を冷却しく一１０℃）　、１０ｍＡ’のトリフルオロメタンスルホン酸を加えた。混合物を室温で５０分間撹拌し、ジエチルエーテルで沈殿させた。生成物は実施例１の場合と同様にしてイオン交換し、精製した。

収率：３６％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．２１　（Ｐａｎ）ＨＰＬＣ：純度９７％〔α磨＝　−５３，２°（ｃ＝０．３％）実施例４ α−＾ｃ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙｃ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＣＩ、分子量＝６７３、１８４ａ）　Ｇｌｙｃ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＣｊ！、分子量＝　３８８．８３０ｍ１のＤＭＦに溶解した５ミリモルのＡｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＢｒを冷却しながら（− １０℃）　Ｅｔ、Ｎで中和した。この溶液に５ミリモルのゲルコール酸、５ミリモルのＨＯＢＴおよび５．１ミリモルのＤＣＣＩを加えた。混合物を冷却しながら１時間、ついで室温で７２時間撹拌した。生成したＣＣＵを濾去し、溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状物を５ｅｐｈａｄｅｘ＠ＱＡＥ−２５クロライド型カラム上、溶出液として９ｃ％ＥｔＯＨを用いて精製した。

収率ニア４％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．３５　（Ａ）４ｂ）　ａ−Ｂｏｃ−７−○−Ｂｚｌ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙｃ　−Ａｒｇ　−ｐＮＡ・ＨＣｌ、分子量＝　７０８．２３０ｍ１のＤＭＦに溶解した５ミリモルのＧｌｙｃ　−Ａｒｇ　−ｐＮＡ・Ｈｅ４（４ａ）を−１ｃ℃に冷却し、これら５ミリモルのα−Ｂｏａ−７−Ｏ−−ＢＺＩ−ＧＩＬＩ−ＯＨ１５ミリ−！−ル（７）ＨＯＢＴＳ’　０．５　ミ！ＪモルのＤ　Ｍ　Ａ　Ｐおよび５．１ミリモルのＤＣ（Ｊを加えた。混合物を冷却しながら１時間、ついで室温で４８時間撹拌した。

生成したＤＣＵを濾去し、溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状物をＥｔＯＡＣに溶解し、２％ＮａＨＣＯｓ、２％ＫＨＳＯ４および水で洗浄した。Ｎａ２５Ｏ＜で乾燥後、ＥｔＯＡｃを蒸発させ、標記物質をジエチルエーテルで沈殿させた。

収出：６６％丁ＬＣ：　Ｒｆ＝　０．３５　（Ｐａｎ）４ｃ）　ａ−Ｂｏｃ−ｒｌｅ−７−０ −Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙｃ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣＩ、分子量＝　８２１．３２０ｍ１のメチレンクロリドに溶解した２ミリモルのα−Ｂｏｃ−７−○−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙｃ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　−ＨＣＡ　（４ｂ）に１ｃｔｌのＴＦＡを加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、生成物をジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した物質を２５Ｉ／のＤＭＦに溶解し、冷却しながら（−１０℃）　Ｅｔ３Ｎで中和した。この溶液に２ミリモルのα−Ｂｏｃ　−１１ｅ　−ＯＮｐヲ加えた。混合物を冷却しながら１時間、ついで室温で４８時間撹拌した。溶液を真空中で蒸発させ、得られた油状物をＥｔＯＡｃに溶解し、２％ＮａＦｉＣＯｓ、２％にＨｓｏ４および水で洗浄した。、、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、ＥｔＯＡＣ相を蒸発させ、標記物質をジエチルエーテルで沈殿させた。

収率：６９％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．４３　（Ｐａａ）４ｄ）　ａ−Ａｃ−１１ｅ−７−〇−Ｂｚｌ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙｃ　−Ａｒｇ　−ｐＮＡ・ＨＣＬ１分子量＝　７６３．３１０翼ｌのメチレンクロリドに溶解した１ミリモルのα−Ｂｏｃ−１１ｅ− ７−○−Ｂｚｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙｃ−＾ｒｇ　−ｐＮＡ　・ＦｉＣｌ（４ｃ）に５ミリのＴＦＡを加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、生成した物質をジエチルエーテルで沈殿させた。乾燥した物質を１ＯｔｌのＩＩＭＦに溶解し、冷却しながら（−１０°Ｃ）１３０２１のＥｔ３Ｎで中和した。１２０μｊの無水酢酸を加え、混合物を冷却しながら１時間、室温で２時間撹拌する。溶液を真空中で蒸発させて油状物を得、標記物質を水で沈殿させる。

収率：９４％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．３４　（Ｐａａ）４）　ａ−Ａｃ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙｃ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−１１１ｃ１．分子量＝　６７３．１８メチレンクロリド１０ｘｌ中の１ミリモルのα−Ａｃ−１１ｅ−γ−０−Ｂｚｌ −Ｇｌｕ−Ｇｌｙｃ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＣＩ（４ｄ）の懸濁液を冷却しく一１０℃）　、１０ｚ１のトリフルオロメタンスルホン酸を加えた。混合物を室温で５０分間撹拌し、ジエチルエーテルで沈殿させた。この物質を実施例１の場合と同様にしてイオン交換し、精製した。

収率：３１％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝　０．４５　（Ａ）ＨＰＬＣ：純度９８％〔α漕＝　−６０，６°（ｃ＝０．４％）一段色素原ＬＡＬ　（カブトガニ変形細胞溶解質：Ｈ，Ｃ。

Ｈｅｍｋｅｒ、前出）テストを用いた色素原基質の比較０．１〜１．２ＥＵ／ｍｌの範囲の標準曲線を作成するため、−連のエンドトキシン含有溶液について、様々な色素原基質を用い、以下に述べるように検定を実施した。得られた標準曲線の傾斜を比較した。基質Ｓ−２４２３についての傾斜を１００％とした。

ｐＨ７，９のトリス緩衝液中、ＬＡＬ（５０％凝血濃度）および色素原基質（４，４ｍＭ）の混合物からなる試薬（１００μＩりを等容量のサンプルに加えた。

これによって起こる反応（ＬＡＬの活性化、ついで色素原基質の加水分解）は３７℃で進行させた。１５分後に４００ｐｌの酢酸を加えて反応を停止させ、吸収を４０５ｎｅで測定した。

表１には基質によるＬＡＬの活性化の結果を加水分解されたｐＮＡの濃度によって測定して示す。基質Ｓ−２４２３（Ａｃ　−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −ｐＮＡ　−ＨＣＪ）を標準とする。

表１基質濃度２．２ｍＭ（反応溶液中）における一段法一エンドトキンンに対する基質のスクリーニングＳｏ＝　２．２ｍＭＳ−２４２３＾ｃ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ４ｃＪ　１００Ｓ −２８３４＾ｃ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ４ＣＡ’　１２６Ｓ −２８５４Ａｃ−ＩＬｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ−ＨＣＪ　１３１Ｓ −２８６０Ａｃ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙｃ−＾ｒｇ−ｐＮＡ−ＨＣｊ！　１４２この表から基質中にカルボキン末端配列として−Ｇ１ｙ−ＬｙｓまたはＧｌｙｃ　−Ａｒｇを用いた場合には、カルボキン末端配列としてＧｌｙ−Ａｒｇを有する既知の基質を用いた場合に比較して、驚くべきことに活性は著しく上昇することが明らかである。

要　約　書本発明は、式Ｒ５−＾ビＡ２−Ａ３−Ａ４−Ｒ，またはその塩（式中、１？、＝Ｈまたは保護基Ａ、＝Ｈ，Ｉｌｅ、’ＬｅｕまたはＶａＬ＾２＝ＧＩＬＩＳＡｓｐＳＳｅｒ、　Ｔｈｒ＾３＝Ｇ１ｙまたはＧｌｙｃＡ４＝ＡｒｇまたはＬｙｓただし、Ａ４がＬｙｓの場合にはＡ３はＧｌｙであり、Ａ４力（Ａｒｇの場合にはＡ３はＧｌｙｃである）によって表される新規なペプチド誘導体重こ関する。

本発明はまた、上記ペプチド誘導体の製造方法、本発明のペプチド誘導体を使用することによる細菌エンドトキシンの定量方法、および細菌エンドトキシンの定量のためのこれらの誘導体の使用に関する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年６月１１日

Claims

【特許請求の範囲】

１．式Ｒ１−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｒ２またはその塩（式中、Ｒ１＝Ｈまたは保護基Ａ１＝Ｈ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌＡ２＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＴｈｒＡ３＝ＧｌｙまたはＧｌｙｃＡ４＝ＡｒｇまたはＬｙｓＲ２＝４−ニトロアニリンである。ただし、Ａ４がＬｙｓの場合にはＡ３はＧｌｙであり、Ａ４がＡｒｇの場合にはＡ３はＧｌｙｃである）によって表されるペプチド誘導体。
２．Ａ１はＩｌｅである請求項１記載のペプチド誘導体。
３．【配列があります】または【配列があります】から選ばれる請求項１記載のペプチド誘導体。
４．マーカーを提供するＣ末端アミノ酸にアミノ酸を段階的に付加させることにより合成を行う請求項１〜３記載のペプチド誘導体の製造方法。
５．Ｎ末端ペプチドフラグメント自体を合成し、ついでそれをマーカーを提供するＣ末端アミノ酸にカップリングさせることにより合成を行う請求項１〜３記載のペプチド誘導体の製造方法。
６．式Ｒ１−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｒ２またはその塩（式中、Ｒ１＝Ｈまたは保護基Ａ１＝Ｈ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌＡ２＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＴｈｒＡ３＝ＧｌｙまたはＧｌｙｃＡ４＝ＡｒｇまたはＬｙｓＲ２＝酸素的加水分解によって、定量的測定が可能な化合物Ｒ２−ＮＨ２を与える芳香族または異項環基である。ただし、Ａ４がＬｙｓの場合にはＡ３はＧｌｙであり、Ａ４がＡｒｇの場合にはＡ３はＧｌｙｃである）によって表されるペプチド誘導体を使用する細菌エンドトキシンの定量方法。
７．Ａ１はＩｌｅである請求項６記載のペプチド誘導体を使用する細菌エンドトキシンの定量方法。
８．【配列があります】または【配列があります】から選ばれる請求項６記載のペプチド誘導体を使用する細菌エンドトキシンの定量方法。
９．Ｒ２−ＮＨ２は色素原基である請求項６記載のペプチド誘導体を使用する細菌エンドトキシンの定量方法。
１０．細菌エンドトキシンの定量のための請求項１〜３記載のペプチド誘導体の使用。