JPH05505936A - 肝酵素による２―アリールプロピオン酸エステル化合物の加水分解による立体特異的分割 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 肝酵素による２−アリールプロピオン酸エステル化合物の加水分解による 立体特異的分割 本発明は、各種の動物からの肝酵素を使用することによって、キラルな２−アリ ールプロピオン酸化合物を製造することに関するものである。

多数の２−アリールプロピオン酸化合物、たとえばケトプロフェン、イブプロフ ェンおよびナプロキセンが非ステロイド系抗炎症剤として使用されている。これ らの２−アリールプロピオン酸化合物は２種のエナンチオマー形態、すなわちＲ −エナンチオマーおよびＳ−エナンチオマーを有する。生物学的活性が１種のみ のエナンチオマーに付随する場合が多いことは周知である。たとえば、イブプロ フェン、ナプロキセンなどのような非ステロイド系抗炎症剤の場合に、活性はＳ −エナンチオマーにある（Ｊ、Ｃａｌｄｗｅｌｌ、　Ａ、Ｊ、Ｈｕｔｔ、　Ｓ、 Ｆｏｕｒｎｅｌ−Ｇｉｇｌｅｕｘ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃａ ｌａｇｙ、　３　７．　１　０　５　−　１　１　４．　１９８８）。

２−アリールプロピオン酸化合物は、下記式Ｉの一般構造で示すことができる： 式中、ＹはＨであり、Ｘは芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族および置換へテロ 芳香族基であることかでき、これらの基はそれぞれ、別の基により置換されてい てもよい。

エステル化合物の場合には、Ｙはアルコール残基を表わす。

２−アリールプロピオン酸エステル化合物の立体特異的加水分解によって例示さ れているように、゛キラルな２一アリールブロビオン酸化合物の単離に、生化学 的方法が使用されている（１９８３年１２月１６日付で出願されたドイツ国特許 ＤＥ　３３４５６６０．１９８６年１２月１９日付で出願されたヨーロッパ特許 ０２２７０７８．１９８７年１月６日付で出願されたヨーロッパ特許０２３３６ ５６）。これらの方法は、立体特異的加水分解に微生物の完全細胞または単離酵 素のどちらかを使用する。高等動物からの酵素がこれらの化合物の立体特異的合 成に使用されたことは知られていない。

動物源、特に肝臓からの酵素によるエステル化合物の立体特異的加水分解は主と して、ブタ肝臓からのエステラーゼの使用に向けられていた（　”Ｅｎｚｙｍｅ ｓ　ｉｎ　ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　”　Ｊ、Ｂ、Ｊｏｎｅｓ：　Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４２．３３５１〜３４０３．１９８６およびそこに引用 されている参考刊行物）。

他の動物種の肝臓からの酵素は、限られた数の立体特異的加水分解の場合にのみ 使用されている。たとえば、ウマ肝臓エステラーゼを使用する二環状ラクトン化 合物の酵素による分割か最近報告されている（“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅｓｏｌ ｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｃｙｃｌｉｃ　Ｉａｃｔｏ口ｅＳ　ｂｙ　ｈｏｒｓｅ　 １ｉｖｅｒｅｓｔｅｒａｓｅｓ　”　、　Ｂ、Ｇｕｉｂｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄ ｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　。

本発明によれば、下記にあげる成る種の動物源に由来する肝酵素を使用して、２ −アリールプロピオン酸エステル化合物から加水分解によって、２−了り−ルブ ロピオン酸化合物を立体特異的に分割することができる。

本発明の詳細な説明 本明細書で使用するものとして、“ケトプロフェン“の用語は“２−（３−ベン ゾイルフェニル）プロピオン酸”を意味するものとし：　“イブプロフェン”の 用語は“２−（４−イソブチルフェニル）プロピオン酸“を意味するものとし； そしてナプロキセンの用語は“ｄ−２−（６−メドキシー２−ナフチル）プロピ オン酸”を意味するものとする。

それらのエステルから加水分解によって立体特異的に分割することができる２− アリールプロピオン酸は前記式Ｉて示される式によって表わすことかできる。こ の群の化合物の中には、ケトプロフェン、イブプロフェンおよびナプロキセンが 含まれる。従って、この式においてＸはアリール基、置換アリール基、ヘテロア リール基および置換へテロアリール基であることができる。このアリール基は、 アリール基のいずれでもよく、たとえばフェニル、ナフチルであることができ； へテロアリール基はヘテロアリール基のいずれてもよく、たとえばピリジル、イ ンドリルなとであることかできる。これらのアリール基またはへテロアリール基 上の置換基は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、アロイル、ヘテ ロアロイル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ハロゲン、 シアノ、ヒドロキシ、ハロアルキル、ハロアリール、ヒドロキシアルキル、ヒド ロキシアリール基であることかできる。この式において、Ｙは直鎖状および分枝 鎖状アルキルおよびそのハロ（ＣＩ、Ｂｒおよび■）およびヒドロキシ置換アル キル基を包含するＣｌ−Ｃｌ０アルキル基であることができ、その条件は、当該 エステル基か酵素によって加水分解できることにある。好ましくは、２−アリー ルプロピオン酸のエステルはケトプロフェン、イブプロフェンおよびナプロキセ ンのＣ１〜Ｃ４アルキルエステルである。アルキルの例はメチル、エチル、プロ ピル、ｎ−ブチルであることができ：ハロアルキルの例は２−クロロエチルであ ることができ：そしてヒドロキシアルキルの例は２−ヒドロキシエチル、２，３ −ジヒドロキンプロピルであることができる。

２−アリールプロピオン酸化合物は１個のキラル中心を有しており、光学活性で ある。この酸化合物を医薬品として有効に使用するためには、この化合物の分割 が必要である。本発明の酵素はこの酸化合物をそのデキストロ旋光形態およびレ ボ旋光形態に分割する能力を有する。

分割の程度は、動物源に依存して、各種酵素間で変わる。

酵素の分割効率はＥＥ（エナンチオマー過剰）数によって示すことかできる。

酵素は粗製形態で、溶剤処理した形態であるいは精製形態で使用することかでき る。酵素処理に使用できる溶剤には、エタノールなどのアルコール類、ヘキサン 、イソオクタンなどの炭化水素類、およびアセトンなどのケトンが包含され、ア セトンが好ましい。精製酵素はまた、公知の従来技術を使用するクローニングに よって再生させることもできる。本発明の実施において、肝臓アセトン粉末の使 用は効果的であることが見い出された。

この肝臓アセトン粉末は種々の程度の活性を示す。加水分解の立体特異性は、こ の肝臓アセトン粉末の起源および基質に依存する。肝臓アセトン粉末の構成成分 を分離することによって、活性および立体特異性の両方を高めることができる。

全部の場合に、未反応エステルは、好ましい量の反対のエナンチオマー（肝臓ア セトン粉末による加水分解で生成される所望の酸の配位の反対の配位）を含存す る。この未反応エステルは標準的方法、たとえば化学的加水分解によって変換さ せ、上記肝臓アセトン粉末の加水分解によって生成されるものとは反対のエナン チオマーを好ましい量で含有する酸を得ることかできる。この肝臓アセトン粉末 はまた、標準的方法により、たとえば存機溶媒中でエステル合成を行なうことに よって、この反応を反対方向に進行させて、２−アリールプロピオン酸のエステ ルの立体特異的合成に使用することもできる。別法として、成る種のアルキル基 または置換アルキル基を育するエステルを、異なるアルキル基を有する別のエス テルに立体特異的に変換することもできる。

その最も広い態様において、本発明はウサギ、ウマ、ヒツジ、ハト、ヤギ、アザ ラシ、マウス、ニワトリ、イヌ、ラット、ネコ、仔ウシ、ウシの肝臓から得られ た酵素およびその混合物を使用する加水分解によって、エステルから酸を製造す るために、成る種の動物の肝酵素を使用することを包含する。本発明の２−アリ ールプロピオン酸エステル化合物の加水分解において、実質的に無効であること が見い出された酵素には、レモン　シャーク、サケ、ニジマス、カメおよびモル モットの肝臓から得られた酵素が含まれる。

上記群の基準は、２−アリールプロピオン酸エステル化合物の加水分解における 酵素の効率にもとづいており、この効率は生成した酸のもとのエステルの重量に 基づくパーセンテージにより決定され、５％を越える量であり、効率か下がる順 に列挙されている。

のとして表わされる。ウシは、そのＥＥによって示される、その分割効率にもと づいて、包含される。好ましくは上記したように１０％以上の加水分解にもとづ いて、酵素はウサギ、ウマ、ヒツジ、ハト、ヤギ、アザラシの肝臓およびその混 合物から得ることができ、最も好ましい酵素はウサギおよびウマの肝臓に由来す るものである。

本発明において有効な酵素は、５％以上のエナンチオマー過剰（Ｅ　Ｅ）および 効率低下度にもとずく、２−アリールプロピオン酸エステルの立体特異的分割に 係るその能力にもとづいて、イヌ、仔ウシ、ウシ、ハト、ネコ、ウマ、ヤギ、ウ サギ、ヒツジ、ニワトリ、ラットの肝臓からの酵素およびその混合物を包含する 。好ましくは、１０％以上のＥＥ値にもとづき、イヌ、仔ウシ、ウシ、ハト、ネ コ、ウマ、ヤギの肝臓からの酵素およびその混合物。

１０％以上の酸パーセンテージおよび１０％以上のＥＥにもとづき、総合的に好 適な酵素はイヌ、ハト、ウマ、ヤギの肝臓に由来するものおよびその混合物であ る。

イヌ肝酵素は８．０％の酸生成パーセントを示すと同時に、７４％のＥＥを有す ることから、総合的に最適なものに含まれる。

総合的に最適の酵素はイヌの肝臓に由来する酵素である。

これらのあげられている多くのものは、その肝酵素アセトン粉末の使用にもとづ いている。粗製および精製酵素の使用は程度の違いかあることかある。この差は 慣用の試験を用いて、当業者によって容易に測定することかできる。粗製酵素は 精製酵素よりも効力か低いという一般的概念が本発明にもあてはまる。

酵素は遊離の形態で、または慣用の手段による不動化形態で使用することができ る。

本発明で使用するために、酵素を不動化するのに適する方法は当技術で知られて いる。たとえば、米国特許４゜４３６．８１３を参照することができ、この特許 には、ポリアジリジン　プレポリマー（すなわち、ポリカップ［Ｐｏ１ｙｃｕｐ ］　）　、カルボキシメチル　セルロース、ポリメチレン　イソシアネートおよ びポリウレタン　ヒドロゲル　プレポリマーなどのプレポリマー材料を使用して 、酵素または酵素含存細胞を不動化することが記載されている。これらの材料を いずれも、米国特許Ｎｏ、４．４３６．８１３に記載の方法で、本発明における 目的に使用することができる。酵素の不動化にはまた、米国特許Ｎｏ、４．６５ ０，７５５に記載の硬化性多官能性アジリジン　プレポリマーも存用である。

本発明の酵素による分割は、反応が行なわれ、かつまた酵素を不活性化しない温 度範囲のいずれにおいても行なうことができる。高温（すなわち、〉５０°Ｃ） は酵素の不活性化を導く。１０°Ｃ程度の低温も使用できるか、反応速度は相当 に遅くなる。効果的な温度は使用される反応剤および酵素に幾分、依存して変わ る。約２５°Ｃ〜約５０°Ｃ１好ましくは約り０℃〜約４０℃の温度範囲で＜　 ｐＨ範囲である。酵素はそれぞれ、それ自体の特定の有効ｐＨ範囲を存するか、 一般に、約５〜約８．５、好ましくは約６．５〜７．５の範囲内のｐＨが、本明 細書に記載の酵素に係り効果的である。

分割に使用される反応時間は所望の程度の反応を達成するのに要する時間である 。反応時間は酵素の量、種類および純度、ならびに基質に依存して変わり、例と して、約０．５時間〜数日間の反応時間範囲があげられる。

インキュベーション反応は水性溶液中で、または混合水性溶液／有機溶剤系中で 、行なうことかできる。混合水性溶液／ｆ機溶剤系の効果は、反応剤、酵素およ び有機溶剤に依存する。有機溶剤は炭化水素類、芳香族炭化水素類、エーテル類 、アルコール類およびその他の極性および非極性有機溶剤などの供給源から誘導 することかできる。使用できる溶剤はＯ〜９９容量％の水混和性有機溶剤か含ま れる。水不混和性溶剤は水とともに使用でき、２相溶剤系を形成することができ 、この２泪溶剤系は、約Ｏ〜約５０容量％の水性成分および相当する約１００％ 〜約５０％の水不混和性有機溶剤からなることができる。

水混和性打機溶剤としては、Ｃ，−Ｃ，アルコールおよび１−メトキシ−２−プ ロパツールなとのアルコール類、エチレン　グリコール、プロピレン　グリコー ルなとのグリコール類、エチレン　グリコールのジメチルエーテル、プロピレン 　グリコールのジメチル　エーテル、ジエチレン　グリコールのジメチル　エー テル、テトラエチレン　グリコールのジメチル　エーテルなどのグリコール　エ ーテル類、ならびにグリセロールなどのトリオール類；テトラヒドロフランおよ びジオキサンなどの環状オキシド類、アセトンなどのケトン類およびアセトニト リル、ジメチルホルムアミド、ピリジンなどの窒素含存化合物およびその混合物 をあげることができる。

水不混和性有機溶剤の例としては、ヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカン 、ヘキサデカン、ケロセン、石油エーテル、トルエンおよびキシレンなどの炭化 水素類：塩化メチレンおよびクロロホルムなどの塩素化炭化水素：酢酸エチルに ようなエステル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、ブチルエーテル、 イソブチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ジフェニルエ ーテルなとのエーテル類：および２−エチル−１−ヘキサノール、１−オクタノ ール、２−オクタノールなどのアルコール類、およびその混合物をあげることが できる。

分割された酸化合物は、塩析、沈殿、抽出を含む慣用の手段によって、水性反応 溶液から分離することをできる。未分割のエステルは分離し、ラセミ化し、次い て別の分割に再循環することかできる。

本発明において使用される肝臓アセトン粉末は市販源から入手することができ、 Ｓｉｇｍａ社、米国から入手した。

２−アリールプロピオン酸エステル化合物は慣用の方法で製造した。このエステ ル化合物は構造式■で示され、この式において、Ｘは前記のとおりの基を表わし 、モしてＹは種々のアルキル基および置換アルキル基を表わす。

加水分解反応は２〜８のｐＨ範囲を有する水性溶媒中において、０〜６０°Ｃの 範囲の種々の温度で行なった。エステル化合物は反応溶媒中に直接に加えるか、 あるいは少量の有機溶剤中に溶解して加えた。この方法には、肝臓アセトン粉末 をそのまま、あるいは肝臓アセトン粉末の中の加水分解性酵素を使用することが できる。さらにまた、酵素は不動化することができ、そしてまた再使用すること ができる。

下記の例により本発明を説明する。

例１ ケトプロフェン　メチル　エステル５０ｍｇのエタノール０．２ｍｌ中の溶液を 、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）５ｍｌ中の各種動物源（表１に 記載）からの肝臓アセトン粉末のそれぞれｌｏｍｇに加えた。室温で２４時間振 りまぜた後に、この反応混合物を６（Ｎ）ＨＣＩにより　ｐＨ２，０に酸性にし 、次いで酢酸エチル１０ｍ１により抽出した。この酢酸エチル抽出液の一部分を 、Ｐａｒｔｉｓｉ１５　０ＤＳ−３ＲＡＣカラム（９，４ｍｍｘ　１００　ｍｍ 、　Ｗｈａｔｍａｎ　）において、メタノールと１０ｍＭリン酸二水素アンモニ ウムとの混合物（９：　１）を用いるＨＰＬＣによって分析し、２５４　ｎｍで ＵＶによって追跡し、この反応で生成された酸のパーセンテージを測定した。こ の結果を表■にまとめて示す。

Ｒ−酸とＳ−酸とのパーセンテージを測定するためにして、Ｒ（＋）−１−フェ ニルエチルアミンを用いて生成された酸をアミド誘導体に変換した。酢酸エチル 抽出液（５ｍｌ）を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、次いで０°Ｃに冷却 した。この冷い溶液に、Ｎ−メチル　モルホリン０．２ｍｌを加え、次いでイソ ブチルクロロホルメー１−０．２ｍｌを加えた。０゛Ｃで１０分間おだやかに振 りまぜた後に、Ｒ（＋）−１−フェニルエチルアミン０．２［＋１１を加え、振 りまぜを０°Ｃで５分間、次いで室温でさらに５分間続けた。この反応混合物を 水（５ｍｌ）、１　（Ｎ）　ＨＣＩ　（５ｍｌ）および水（５ｍｌ）により順次 洗浄し、酢酸エチル溶液中にアミド誘導体を得た。このアミド誘導体の酢酸エチ ル溶液を次いで、同一カラムにおいて、同一溶剤混合物であるか異なる組成、す なわち６：４比の混合物を用いるＨＰＬＣによって分析し、そしてまた加水分解 によって生成されたＲ−酸とＳ−酸とのパーセンテージを測定するために、ＵＶ により追跡した。この結果を表Ｉにまとめて示す。エナンチオマー過剰（Ｅ　Ｅ ）は、Ｒ−酸バーセントとＳ−酸パーセントとの間の差をパーセントで示すもの と定義される。多い方のエナンチオマーか表■のカッコ内に示されている。

表■ 肝臓アセトン　酸のＥＥペパ ーヌ　８．　０　８７．　ｌ　１２．　９　７４．　２（Ｒ）仔ウシ　５．　７ 　７１．　６　２８．　４　４３．　２（Ｒ）ウシ　４．　３　７１．　２　２ ８．　８　４２．　４（Ｒ）ハト　１８．　０　６６、　７　３３．　３　３３ ．　４（Ｒ）ネコ　７．　２　６４．　１　３５．　９　２８．　２（Ｒ）ウマ 　２４．　１　６２．　７　３７．　３　２５．　４（Ｒ）ヤギ　１５．　５　 ４２．．３　５７．　７　１５．　４　（Ｓ）ウサギ　５４．９　４６．１　５ ３．　９　７．　８（Ｓ）ヒツジ　１８．　ｌ　４６．　５　５３．　５　７． 　０（Ｓ）ニワトリ　８．１　５２．７　４７．３　５．４（Ｒ）ラット　７． ５　５２．７　４７．３　５．４（Ｒ）アザウシ　１４．　３　４８．　９　５ １．　１　２．　２（Ｓ）マウス　９．４　４９．０　５１．０　２．０（Ｒ） 肺魚　３．２　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ ’７＋４”　３．ＯＮＤ　ＮＤ　ＮＤ ウナギ”　１．１　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ ブタ　０．９　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ モルモット　０．８　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤニジマス　０．７　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ レモン　シャーク　０．１３　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤサケ　０．６　ＮＤ　ＮＤ　Ｎ Ｄ カメ　０．６　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ ＊　アングイラ　アングイラ（Ａｎｇｕｉｌｌａ　ａｎｇｕｉｌｌａ）＊＊　エ レクトロホロウス　エレクトリクス（Ｉｌｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｏｕｓ　ｅｌｅ ｃｔｒｉｃｕｓ）ＮＤ　酸のパーセンテージが小さすぎるので、測定しながった 。

例２ 種々の鎖長を有する各種アルキル基を有するケトプロフェンの数種のエステル（ ０，２ミリモル）を、例１に記載の方法によって、ウシ、仔ウシおよびイヌから の肝臓アセトン粉末を用いて加水分解した。これらの反応混合物を例１に記載の 方法と同一の方法によって分析した。

得られた結果を表【【にまとめて示す。

表＋１ 肝臓 ラン　Ｃ−１４，４７３，６２６，４４７，２Ｃ−２５，５７０，３２９，７４ ０，６Ｃ−３３，４７０，７２９，３４１，４Ｃ−４４，７６６，７３３，３３ ３，４Ｃ−６３，３７２，７２７，３４５，４仔ウシ　Ｃ−１７，３７２，８２ ７，２４５，６Ｃ−２６，４６９，６３０，４３９，２Ｃ−３５，０６９，１３ ０，９３８，２Ｃ−４５，８６５，６３４，４３８，２Ｃ−６５，４７１，０２ ９，０４２，０Ｃ−８２，９６２，１３７，９２４，２イヌ　Ｃ−１６，２８８ ，３１１，７７６，６Ｃ−２１１，９８２，５１７，５６５，０Ｃ−３６，１８ ４，１１５，９６８，２Ｃ−４３，９８４，４１５，６６８，８Ｃ−６３，９６ ７，９３２，１３５，８Ｃ−８２，０７０，７２９，３４１，４浄書（内容に変 更なし） 要　約　書 肝酵素、特にイヌ、ハト、ウマおよびヤギなどの特定の動物に由来する肝臓アセ トン粉末を使用する加水分解によって、ケトプロフェン、イブプロフェンおよび ナプロキセンなどの２−了り−ルブロピオン酸化合物をそれらのエステルから立 体特異的に分割することができる。

手続補正書（賎） １−事件の表示 ２、発明の名称 ロース　−　ブーラン　インコーポレイテッド４−代理人 ６−補正により増加する請求項の数 ７−補正の対象 明細書、請求の範囲及び要約書画訳文 ８−　補正の内容　別祇のとおり 明細書、請求の範囲及び要約書画訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．２−アリールプロピオン酸エステル化合物を加水分解する方法であって、ウ サギ、ウマ、ヒツジ、ハト、ヤギ、アザラシ、マウス、ニワトリ、イヌ、ラット 、ネコ、仔ウシからなる群から選ばれる動物由来の肝酵素またはその混合物を、 上記エステル化合物と接触させることからなる方法。 ２．上記エステルがＣ１〜Ｃ６アルキル基である、請求項１の方法。 ３．上記２−アリールプロピオン酸がケトプロフエンである、請求項１の方法。 ４．上記２−アリールプロピオン酸がイブプロフェンである、請求項１の方法。 ５．上記２−アリールプロピオン酸がナプロキセンである、請求項１の方法。 ６．２−アリールプロピオン酸エステル化合物を立体特異的に加水分解する方法 であって、イヌ、仔ウシ、ウシ、ハト、ネコ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ニ ワトリ、ラットからなる群から選ばれる動物由来の肝酵素またはその混合物を上 記エステル化合物と接触させることからなる方法。 ７．上記立体選択的加水分解から生成する２−アリールプロピオン酸がＲ−ケト プロフエンである、請求項６の方法。 ８．上記立体選択的加水分解から生成する２−アリールプロピオン酸がＳ−ケト プロフエンである、請求項６の方法。 ９．上記立体選択的加水分解から生成する２−アリールプロピオン酸がＲ−イブ プロフェンである、請求項６の方法。 １０．上記立体選択的加水分解から生成する２−アリールプロピオン酸がＳ−イ ブプロフェンである、請求項６の方法。 １１．上記立体選択的加水分解から生成する２−アリールプロピオン酸がＳ−ナ プロキセンである、請求項６の方法。 １２．上記立体選択的加水分解から生成する２−アリールプロピオン酸がＲ−ナ プロキセンである、請求項６の方法。 １３．上記肝酵素が、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ハト、ヤギ、アザラシからなる群 から選ばれる動物由来のもの、あるいはその混合物である、請求項１の方法。 １４．上記肝酵素が、イヌ、ハト、ウマ、ヤギからなる群から選ばれる動物由来 のものあるいはその混合物である、請求項１の方法。 １５．上記肝酵素が、イヌ、仔ウシ、ウシ、ハト、ネコ、ウマ、ヤギからなる群 から選ばれる動物由来のもの、あるいはその混合物である、請求項６の方法。 １６．上記肝酵素がイヌの肝臓に由来するものである、請求項６の方法。 １７．上記肝酵素が粗製酵素、溶剤処理した肝酵素および精製肝酵素からなる群 から選ばれる、請求項１の方法。 １８．上記肝酵素が溶剤処理した肝酵素あり、そしてこの溶剤がアセトンである 、請求項１６の方法。 ２０．上記肝酵素を不動化される、請求項１に記載の方法。 ２１．上記肝酵素をイオン交換樹脂上に吸着させ、次いでこのように吸着された 酵素をポリアジリジンプレポリマーと接触させることによって、この酵素を不動 化する、請求項２０に記載の方法。