JPH05505201A - 新規なランタナイドキレート結合オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 新規なランクナイドキレート結合オリゴヌクレオチド本主肌東１景 生物学的マクロ分子の非アイソトープ標識にランクナイドキレートの使用は、診 断の分野において多大の関心を集めている。この技術は、さもなければ真正信号 を圧倒する通常の螢光バックグラウンドに比較して長く持続するランタナイド元 素の螢光の利苗を享受する。三価ランタナイドイオンＥｕ”“、Ｔｂ”およびＳ ｍ””は、バンクグラウンド螢光のナノ秒崩壊時間に比較して、すべてミリ秒の オーダーの螢光崩壊時間を有する。適切な波長およびエネルギーレベルにおいて サンプルを照射することにより、バックグラウンドは既に崩壊した後であるが、 しかしランタナイド標本はなお発光している間の遅延時点において螢光を測定す ることができる。この技術は、時間分解もしくは時間ゲート分光法として知られ ている。この技術の原理の一般的評論については、米国特許第４，１５０，２９ ５号および第４．０５８．７３２号と、Ｉｍｍｕｎｏｆ　Ｉｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｋｎ ａｐｐ　ｅｔ　ａｌ、ｅｄｓ、（１９７８：Ｅｌｓｅｆｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈ ｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｔｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ）を参照。

ランタナイドイオンの螢光性は、−４にそれらがキレート剤によって捕獲される 時に増強される。これは、水溶液中イオンの水和が放出エスルギーを劇的に消す からである。キレート化はまた、イオンをそれらの検出すべき標的の近傍へ運ぶ ためにも必要である。

標的に対する結合特異性を有する抗体のようなタンパクへ、および特異性相補核 酸配列ヘハイブリダイズする核酸へキレート剤を共有結合することは既知である ０例えば、ＷＯ３９１０４３７５（Ｍｕｓｓｏ）は、弐ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ，Ｎ Ｈ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ，Ｓ　（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ等の末端基を有するリンカ−分子により 、ＥＤＴＡ。

ＤＴＰＡおよびｐ−フェニルＥＤＴＡのようなある種のそれらの類縁体によるＤ ＮＡプローブの標識を開示する。プローブはランタンイドイオンと錯化され、そ して感度を増大するためミセル中のベータジケトンを利用する。同様に、ＷＯ３ ８１０２７８４（Ｙｌ　１ｋｏｓｋｉ）は、修飾したＥＤＴＡおよびＤＴＰＡタ イプのキレート分子を有する多キレートＩｌ［ｍポリマープローブを開示する。

ＷＯ９０１００５５０（Ｋａｎｋａｒｅ）は、ランタナイドイオンに対しキレー ト剤として作用し、そして核酸プローブおよびタンパクの標識に用途がある新規 なターピリジン誘導体を開示する。

ＥＰＯ３２４３２３（Ｈｅｍｍｉ　Ｉａ）は、窒素、酸素、リンまたはイオウか ら選ばれた自由電子対を有するヘテロ原子を含む構造を有し、そしてパイ結合の 共役系へ自由電子対が非局在化されるように結合された、均質アッセイ系に有用 なキレートを開示する。ＷＯ９０１００６２３（Ｋｗｉａｔｏｋｏｗｓｋｉ）は 、多数ジカルボンｆ１！基の担体としてビピリジン構造を有するキレートを使用 する、多標識核酸プローブシステムを開示する。

種々のキレート剤の性質は、それらが結合される生物学的マクロ分子のタイプに 応して異なる。特に関心があるのは、大きいイオン結合能力ををするポリ（アリ ールピリジン）キレートである。２個のジ酸基を存する、モノ置換アミノトリア ジンリガンド分子は、抗体のようなタンパクへ結合した時希土類イオンを効率的 に結合するが、ブローブアフセイにおいて重大な制限がある。タンパク標識の環 境において、リガンドはイオン結合の助けとなる立体配座構造を与える多数の部 位において結合する。グルタミン酸の遊離カルボキシル基のような天然のカルボ キシル基もキレート化を促進する。しかしながら、線状分子のように行動する核 酸では、そのような立体配座相互作用は不可能である。このように、どのキレー ト構造が核酸ブローブア７セイにおいて特別の有効性を有するかは自明でもない し、予測できない。

オ遣ｍ 本発明は、しばしば大量の非均′ｉ！核酸の存在下、サンプル中に少量存在する 核酸を検出するためのハイブリダイゼーシッンアフセイに使用される、新規なラ ンクナイドキレート結合オリゴヌクレオチドに関する。それ故、本発明の一目的 は、極めて高レベルの希土類元素補獲効率を有し、そして高い発光レベルに対応 するオリゴヌクレオチドへ共有結合することができるキレートを得ることである 。

このことは、ヌクレオチド塩基の無差別多キレート標識は結合特異性を妨害する ため特に重要である。

本発明の他の目的は、どんな核酸配列へも普遍的に結合できるキレートを提供す ることである０本発明のキレートは、別の部分的に相補な核酸ストランドへハイ ブリダイズするのに通した少な（とも４個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド 尾部を有する。ハイブリダイズ化に際し、このオリゴヌクレオチド尾部ヘハイブ リダイズされたものに対して相補的な新しいストランドは、この尾部をプライマ ーとして使用して試験管内酵素触媒ポリメラゼーシタンによって合成することが できる。代りに、最初非相補ストランドとオリゴヌクレオチドを橋かけ配列ヘハ イブリダイズし、次に連結することによって非相補ストランドをキレート化オリ ゴヌクレオチドへ組入れることができる０代りに、該オリゴヌクレオチドおよび プローブ配列は、ＲＮＡリガーゼで：末鎖末端連結することができる。

本発明によれば、希土類キレート結合オリゴヌクレオチドは、１番目のトリアジ ン炭素がｐ−アミノフエ不トキシ、Ｐ−イソチオンアノフェネトキシおよびｐ− チオニルクロロフエネトキシよりなる群から選ばれた官能化アリールアルキル基 へ共有結合し、そして２番目および３番目のトリアジン炭素が（アリール−ジカ ルボキシルピリジン）アルキル基へ共有結合している１個または複数の２−アル コキシ−４，６−ジ（Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラアルキル）アミノトリアジ ンを含む希土類キレート部分を有し、結合基はアミドおよびチオ尿素よりなる群 から選ばれ、そしてオリゴヌクレオチドは前記結合基によって希土類キレートへ 結合した少なくとも４個の連続した非誘導体化デオキシー、またはりポヌクレオ チドを含んでいる。

本発明の他の局面において、このキレート結合オリゴヌクレオチドは、オリゴヌ クレオチドが標的核酸配列ヘハイブリダイズされ、ハイブリダイズされた核酸が 分離され、そして信号手段によって発生した信号を測定することによってハイブ リダイゼーションの程度が検出される、相補核酸を検出するためのアッセイに使 用することができる。このアッセイの改良は、２−アルコキシ−４，６−ジアミ ツトリアジン基へ共有結合した置換子り−ルビリジンジ酸単位の四量体を育する テトラ（アリールピリジン）リガンドを含む希土類キレートへ共有結合している 、サンプル標的配列へ相補のヌクレオチド配列を有する少なくとも１２個の連続 した非誘導体化ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドプローブよりなる。

任意の所望の配列のキレート結合プローブは、２−アルコキン−４，６−ジアミ ツトリアジン蟇へ共有結合した置換アリールピリジンジ酸単位の四量体を有する テトラ（アリールピリジン）を含む希土類キレートを３”または５“末端におい て組込んだ少なくとも４個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌ クレオチドに対して相補の少なくとも４個のヌクレオチドの末端配列を有するブ ローブヘハイプリダイズし、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをもってポ リメラーゼ触媒延長反応をブライミングし、延長反応を実施し、二本鎖のストラ ンドを分離し、そしてキレート標識核酸プローブを単離することによって容易に 構成することができる。

多分相補ストランドは酵素消化によって除去することができる。

その代りに、任意の所望配列のキレート標識プローブは、２−アルコキシ−４， ６−ジアミツトリアジンへ共有結合した！換アリールピリジン酸単位の四量体を 有するテトラ（アリールとリジン）リガンドを含む希土類キレート部分を３“ま たは５“末端に組込んだ少なくとも４個の連続した非誘導体化ヌクレオチドのオ リゴヌクレオチドに対し相補であり、また反対の５′−３”極性のプローブ配列 の末端に対しても相補である橋かけ配列を用意し、この橋かけ配列を前記オリゴ ヌクレオチドおよびプローブ配列ヘハイブリダイズし、そしてプローブ配列をオ リゴヌクレオチドへ連結することを含む方法で構成することができる。

本発明の他の具体例において、３′または５゛末端において、２−アルコキシ− ４，６−ジアミツトリアジン基へ共有結合した置換アリールピリジンジ酸単位の 四量体を有するテトラ（アリールピリジン）リガンドを含む希土類キレートを組 込んだ少なくとも４個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを収容する第１の容 器と、そしてポリメラーゼおよびリガーゼよりなる群から選ばれた酵素を収容す る第２の容器よりなる、希土類キレート結合オリゴヌクレオチドを組込んだ任意 配列のキレート標識核酸プローブを調製するためのキットが提供される。

ましい亘　の−　な−゛　一 本発明の核酸結合キレートがそれへ属する希土類キレート分子の一般的クラスは 、ＰＣＣ出出１１ＷＯ８９１０４８２６（Ｈａ　Ｉｅ）および米国特許第４，７ ６１，４８１号（Ｈａｔｅ）に開示されている。さらに詳しくは、末端標識核酸 ブロ−ブアンセイにおいて異常な有効性を有するキレートは、以下の構造の２− アルコキシ−４゜６−ジ（Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラアルキル）アミノトリ アジンを含む。

式中、Ｒはｐ−アミノフェネトキシ、Ｐ−インチオシアノフェネトキシ、および ｐ−チオニルクロロフェネトキシからなる群から選ばれた官能化されたアリール アルキル基であり、Ｒ゛は（アリールジカルボキシルピリジル）アルキル基であ り、ｎはトリアジン環の数である。このキレートは、２−アルコキシ−４，６− ジアミツトリアジン基へ共有結合した置換アリールピリジンジ酸単位の四量体を 含むテトラ（アリールピリジン）リガンドと別に定義される。

好ましい置換アリールピリジンジ酸単位は、（２，４−ジアルコキシ−５−（２ ，６−ジ酸ピリジル）フェニル）アルキル基であり、もっと好ましい置換アリー ルピリジンジ酸単位は、（２，４−ジメトキシ−５−（２，６−ジカルボキシル ピリジン）フェニル）プロピル基である。アミノトリアジン基への置換アワール ビリジンジ酸単位の共有結合は、スルホンアミドまたは類似の基を介して好都合 に得られる。

本発明のキレートの合成においては、アリールジ力ルボシルピリジンジアルコキ シフェニル化合物がクロロスルホン化によって官能化されたアリルジカルボキシ ルピリジンジアルコキシフェニル誘導体に変換され、次に官能化されたトリアジ ンとの反応によってニトロフエネトキシテトラ（ジアルコキシフェニルジカルボ キシルピリジン）トリアジンを得る。これら反応および操作のすべては文献に既 知である。

このようにして合成された好ましいキレートは、２−〔ｐ−アミノフエネトキシ ）−４，６−ジ（Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ″−テトラ〔３−プロピル（２，４ −ジメトキシ−５−（２，６−ジカルボキシピリジル）スルホンアミド）〕）ア ミノトリアジンである。この化合物を以後「テトラキス」と呼ぶ。この化合物お よびそれに構造上関連ある化合物は、合成の容易さ、高効率の希土類元素捕獲を 示すこと、低い消失および核酸分子へカップリング容易性の利益を有する。

キレートの核酸へのカップリングのための典型的な戦略は第１図に示されており 、そこではアミノ−テトラキスがチオホスゲンで活性化され、ＤＮＡとインキュ ベートされ、そして反応生成物を逆相ｆ（Ｐ　Ｌ　ＣおよびＧ−２００セフアデ ンクスを通すゲル濾過によって精製される。中間体インチオシアネートは精製さ れないが、しかし核酸へのカンブリング前に乾固されることが重要である。ＤＮ Ａもリン酸基へ直結した１個以上のアミノ基を含むように３′または５゜末端に おいて官能化される。代りに、核酸塩基へ結合したアミノ基（いわゆるＲｕｔｈ ＠Ｉのような）もキレートイソチオシアネートへ結合するために使用し得る。（ Ｒｕｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ。

Ｐｈａｒｍ、、２０：４５，１９８１を見よ、）イソチオシアネートカップリン グの代替法はチオニルクロライド誘導体化である。このためキレートと核酸の間 の連結基はアミドかチオ尿素でよい。キレートをオリゴヌクレオチドプローブへ 結合するのに利用し得る他の連結技術は、Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｉｎｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ、、２５：２７７２　Ｃｌ９８６）、ＥｖａｎｇｅＪ　ｊｓｔａ　ｅｔ 　ａｌ、、ｃｌｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２１＋１７３（１９８８）および米国 特許第４，８０８．５４１号に記載されている。

キレート結合プローブを使用するアンセイの感度を増強するため、核酸プローブ 配列の３′または５“末端に対し多数のキレート分子を分枝または直鎖構造とし て結合することが望ましい。第２図はこれらの戦略を概略的に図示する。第２ａ 図においては枝分れしたアミノ結合構造がｙ回繰り返し、末端午レートは最初の 枝分れ構造からＸ個の塩基で隔てられて位買している。第２ｂ図においては、多 標識はプローブの３゛または５″末端において交番する塩基上のアミノ誘導体化 ウラシルを介してカンブリングすることによって実施される。理論的には複数の トリアジン結合分子を結合できるけれどれ、Ｘの値は一般に４以下であり、ｙの 値は８以下である。この結合数以上ではある程度のプローブハイブリダイゼーシ ョンに対する立体障害またはハイブリダイゼーションの妨害が予想されるが、こ れらのパラメータはプローブおよび標的配列の大きさおよび塩基組成によっても 影響されるであろう。キレート分子のオリゴヌクレオチドへのカップリングに際 し、少なくとも４個の誘導体化しないヌクレオチドの尾部はプローブのキレート 結合部位の３゛または５゛を保存することが重要である。ハイブリダイゼーショ ンによる相補配列の認識は一般に少なくとも４個の塩基を必要とする。もしｎが キレート結合オリゴヌクレオチドのキレート部分中のトリアジンの数であれば、 デオキシ−またはりボヌクレオチドであれ、該オリゴヌクレオチドは少なくとも ４＋−ｎ個のヌクレオチドを含まなければならない、好ましくは尾部の４個のヌ クレオチドは、相補配列への最大結合を得るため連続して非誘導体化でなければ ならない。オリゴヌクレオチドプローブを構成するヌクレオチドの上限は理論的 にはキロ塩基のオーダーである。しかしながら機能的には、標的配列に対し実質 上相補の最低」２個の塩基を持ったプローブは、もしＧＣ含量が比較的高く、そ して標的配列が高度に保存されていれば、アンセイにおいて適切なハイブリダイ ゼーション識別のために十分である。

約４個のヌクレオチドの最短尾部を持ったキレート結合オリゴヌクレオチドをプ ローブとして使用することを一般に意図せず、むしろＲＮＡリガーゼを使用する 二本鎖末端連結によって尾部へ縦木すべき任意の与えられた配列のプローブの構 築において道具として使用する。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ。

２ｅｄ、、１９８９を見よ、）代りに、縦木はオリゴヌクレオチドの末端とプロ ーブをつなぐ二本鎖領域中の一本領切片に対するＴ４ＤＮＡリガーゼの作用によ って実行することができる。この方法によれば、尾部配列に対し相補であり、そ して反対の５′−３°極性のプローブ配列の末端に対しても相補である橋かけ配 列が提供される。この橋かけ配列は、オリゴヌクレオチド尾部およびプローブ配 列へ慣用のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズされる。

オリゴヌクレオチド尾部とプローブの間の二本鎖末端切目をシールするためリガ ーゼが添加され、連続的に共有結合した分子が形成される。

代りに、最低４個しかし好ましくは少なくとも１２個のヌクレオチドのキレート 結合尾部オリゴヌクレオチドは、末端配列が相互に相補である尾部ヌクレオチド に対して相補であるプローブ配列ヘハイブリダイズされる。オリゴヌクレオチド 尾部は、鋳型としてプローブ配列に沿ってポリメラーゼ触媒延長反応をプライム するために使用される。ストランドは次に分離することができ、そしてキレート 結合ストランドは容易に単離することができ、または相補鎖は酵素的に消化する ことができる。ポリメラーゼ延長反応のための操作およびストランド分離および 酵素消化のための戦略は慣用である。

例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｎｏｔｅｂｏｏｋ。

２ｅｄ、Ｎｅｗ　￥ｏｒｋ：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９およびＬａｎｇ’ｅｒ　ｅｔａｌ、、ＰＮ ＡＳ、７８：６６３３　（１９８１）を見よ。

オリゴヌクレオチド尾部は、制限エンドヌクレアーゼの活性によってつくられた 粘着末端の一対の一本鎖対向ストランド切目間のヌクレオチドの配列としても選 択することができる。このため、本発明のキレート結合オリゴヌクレオチドは、 任意ソースからの制限エンドヌクレアーゼ消化断片へ直接結合することができる 。以下はそのような制限酵素およびそれらの対応する認識配列である。Ｍｂ。

Ｉ　（ＧＡＧＣＴＣ）、Ｔａｒ　（ＴＣＧＡ）、Ｈｉｎｄ　Ｉ　ＩＩ　（ＡＡＧ ＣＴＴ）、Ｅｃ　ｏＲＩ　（ＧＡＡＴＴＣ）、および５ａｃｌ（ＧＡＧＣＴＣ） 本発明のキレート結合オリゴヌクレオチドプローブは、二本鎖核酸を検出するこ とができる任意の液相または固相系アッセイシステムに使用することができる。

ｖＦに有利なのはサンドイタチ型アッセイ、好ましくはビーズ系サンドイツチア ンセイである。基本的なサンドインチアッセイ方法は、Ｒａｎｋｉ　ｅｔ　ａｌ 、、（Ｇｅｎｅ、２１ニア７（１９８３）、Ｖｉｒｔａｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、ＣＩｉｎｏＭｉｃｒＣｌｌｎｏ、、２０：１０８３　（１９８４）、および Ｄａｈｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　 Ｐｒｏｂｆｅｓ、１：１５９（１９８７）に記載されている。核酸プローブへ結 合した希土類キレートの時間分解螢光を利用するビーズ系サンドイツチアンセイ は、ＷＯ３９１０４３７５（Ｍｕｓｓｏ）に詳細に記載されている。やはり本発 明の実施において有利なのは、Ｂｒｅｓｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ。

２　：２４３　（１９８３）および０ｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＮＡＲ９１６：１ １８１　（１９８８）に記載されている、固定化標的を測定するトンドブロット のような固相系アッセイである。

サンプル中に含まれる相補核酸配列を検出するための好ましいアンセイ操作は、 希土類キレートへ結合したプローブとサンプルとを、サンプル内に含まれる相補 標的配列ヘハイブリダイズするのに有利な条件下でハイブリダイズし、ハイブリ ダイズした核酸を分離し、そしてキレート結合プローブへ結合したキレート化希 土類金属イオンによって発生する信号を測定することによりハイブリダイゼーシ ョンの程度を検出することを含む。これは、信号手段を含んでいるプローブをサ ンプル中に含まれる標的核酸配列ヘハイブリダイズし、ハイブリダイズした核酸 を分離し、そして信号手段によって発生する信号を測定することによりハイブリ ダイゼーションの程度を検出することができる、ここでも適用し得る一般的アッ セイ操作の特定具体例である。

本発明のアッセイは、オリゴヌクレオチドプローブが、２−アルコキン−２，６ −ジアミツトリアジン基へ共有結合した！換アリールビリジンジ酸単位の四量体 を含むテトラ（アリールピリジン）リガンドを含む希土類キレート部分へ共有結 合した先行技術を上層る改良を含んでいる。これは、下記構造の分子（以後ＴＲ ｌ５と呼ぶ）へ連結した同しプローブ配列の対応する密接に関連した類縁体が、 核酸を結合した単一の対応するジメトキ！換アリールピリジンジカルボキシル酸 化合物（以後ＰＰＴＡと呼ぶ）と同様に、Ｔ　ｂ　””の存在下極めて貧弱な信 号を示す点で、高度に有意義であり、そして完全に予測されなかった。

、二のことは、Ｅ　ｕ　””およびＴ　ｂ　””原子の三面配位接触表面に鑑み 、最適な予想される信号はＴＲｌ５構造であるため特に驚くべきことである。

本発明の他の局面においては、３゛または５°末端において上に記載したタイプ の希土類キレートを組込んだ少なくとも４個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチ ドを収容している第１の容器と、そして鎖延長のためのポリメラーゼ、または橋 かけ配列もしくはその二本鎖末端連結に対しＲＮＡリガーゼを使用する核酸断片 の隣接部をシールするためのＤＮＡリガーゼのような酵素を含んでいる第２の容 器よりなるキントが提供される。そのような容器成分の′１ｇ液は好ましくは密 封され、所望の使用まで凍結される０本発明の追加の利益は以下の実施例から理 解されるであろう。

実施例Ｉ ＰＰＴＡ標ｍＤＮＡが米国特許第４．７６１．４８１号（Ｈａｌｅ　ｅｔ　ａｌ 、）に記載の操作に従って調製された。　Ｈ３Ｏｆｆ　Ｃ２の５０μ２が１．５ ＩＩｉエツベンドルフスナツプキヤフブハイアルに入れられ、そして０．０°Ｃ の水浴中に配！された。この溶液へ５分間を要して１回約１，０■づつ５回にＰ ＰＴＡ５．０ｍｇが添加された。溶液をＰＰＴＡ添加の間連続してかきまぜ、温 度はＯ２０°Ｃに保った。溶液は溶液を２００ｕｌの水へ非常にゆっくり加える 前に、約１５分間攪拌された。生成する淡黄色固体を遠心によって除去し、冷水 で２回洗った。このＰＰＴＡチオニルクロライドを０゜２Ｍホウ酸ナトリウム、 ｐＨ９，５，１００μβ中に溶解した。この溶液へ、５′末端において６−アミ ンへキシルリン酸で官能化した、配列ＴＴＴＴＴ、ＡＡＣＧＧＧ　ＴＡＣＴＴＡ 　ＴＡＣＡＣＡ　ＡＣＴ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＧＴＧを有する３５個塩基オリゴマ ーを加えた。この３５個塩基オリゴマーは、ＡｐｐｌｉｏｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ　Ｉｎｃ、社の合成装置を使用して調製された０反応混合物は室温で６時間撹 拌した０反応混合物をＧ、−２００セフアデツクスのカラムに注ぎ、水で溶出し た。最初のピークを集め、そして凍結乾燥した。得られた白色粉末をＵＶ走査に よって評価し、２６０および３１６ｎｍにそれぞれ最大吸収を示した。未標識Ｄ ＮＡは２６０　ｎｍにおいてだけ吸収した。１４％変性ＰＡＧＥゲルは、出発Ｄ ＮＡより僅かに遅く移動するバンドを示し、そしてテルビウム染色に対し陽性で あった。

実施例２ 官能化された７ミ／−ＴＲＩ　Ｓは、水１００ｔＩｆ中にＬｉ０Ｈ（１０■）で アミノ−ＴＲＩＳ　７．ＯＷｇを溶解することによって調製された。この溶液へ 、０．５Ｍ炭酸ナトリウム１００　ｔｔ　Ｅおよび水２００μｌを加えた。クロ ロホルム２００μ！中５μＰのチオホスゲンを約７５μｉづつでキレート溶液へ 加え、各添加間約１分湯巻きした。溶液を間歇的にかきまぜながら約１０分開放 １した。次に溶液を減圧下乾燥し、クリーム色の固体を得た。これはさらに精製 することなく使用した。

ＴＲｌ５　ＤＮＡは上のＴＲｌ５イソチオシアネートを水に再溶解して調製した 。５′末端において６−アミノへキシルリン酸で官能化した、実施例１で規定し た３５個塩基オリゴヌクレオチド５７ナノモルを０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐ Ｈ９，５中に溶解した。

キレート溶液およびオリゴマー溶液を合併し、攪拌下１２時間反応させた０反応 混合物は、１）５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテートおよびアセトニトリ ルの勾配を使用する逆相ＨＰＬＣと、２）水を溶出液とするＧ−２００ゲル濾過 の二段階プロセスによって精製した。精製した標識オリゴマーは１４％変性ＰＡ ＧＥゲルによって特徴化された。

実施例３ テトラキス−ＤＮＡを実施例２に述べたＴＲＩ　５−ＤＮＡの製造のための操作 を正確に同し操作を使用して調製した。スペクトル分光およびＰＡＧＥ分析は、 キレート化ＤＮＡ複合体の生成の確認を与えた。

実施例４ ＰＰＴＡ、すなわち４−　（２，４−ジメトキシフェニル）−２゜６−ジ（Ｎ、 Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラカルボキシエチル）メチルアミノピリジン−ＤＮＡ、 ＴＲｌ５−ＤＮＡおよびテトラキス−ＤＮＡキレート結合核酸の比較を以下のビ ーズ系サンドイツチハイブリダイゼーンコンブロトコールを使用して實施した。

Ｄｅｌｔａｒプレート（Ｐａｎｄｅｘ２２−０１０−２）のウェル中において、 実施例１で述べたプローブ配列に対して相補的な標的配列を結合したポリスチレ ンビーズ懸濁液（５ｗｇ　／　ａｆ　）を、１０ｘＳＳＣｃｉ、５Ｍ塩化ナトリ ウム、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭＭ０ＰＳ（３−（ｎ−モルホ リノ）プロパンスルホンＭ）よりなる２５μ２２×ハイブリダイゼーシロン溶液 とインキュベートした。

検出標識オリゴヌクレオチドの１００フェムトモルを加え、そして５０゛Ｃで１ 時間インキュベートした。

ビーズを吸引により媒体から分離し、そしてｏ、ｘｘｓｓｃｉｌ衝液（０，０１ ５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）の添加によって数回 洗浄した。ｌＸ５ｓｃ、０．２Ｍ塩化マグネシウムの再！！Ａ濁溶液を加え、続 いてＴｂ””　ＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラ酢ＭＩ）溶液を加えた。サ ンプルは、ＭｃＣａｒｔｈｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、３８：８ ４８（１９６６）およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃｈｅｍ、Ｒｅｖ、８２：５４ １　（１９８２）に規定されている励起および発光波長において螢光時間分解機 器において読取った。

結果は、ＰＰＴＡ、ＴＲｌ５および特許請求したテトラキス化合物の比較のため 、以下の表ＩＡに与えた。１番目のカラムは、実施例１の配列のその相補的標的 とのビーズ系サンドイッチ／Ｓイブリダイゼーシッン反応におけるキレート結合 プローブの値を示す、２番目のカラム中の対照値は、標的配列を除いたプローブ のビーズへの結合値であり、３番目のカラムの値はＳ二Ｎ比、すなわち信号対ノ イズ比である。

このデータから、テトラキス化合物は密接に関連したＴＲＩＳ化合物に比較して 、信号（フォトン）において杓ｌＯ倍増加を示すことが明らかである。対照的に 、テトラキスとＴＲｌ５構造の差は、ＴＲｌ５キレートは希土類イオンによって 提供される分子相互作用表面の全部を保合することが期待されるにもかかわらず 無視し得る。

このデータは、希土類イオンの直接捕獲についての表ＩＢの結果と良く相関して いる。

（以下余白） 表ＩＡ サンドイッチハイブリダイゼーシヲン（標的を含む）５０フ工ムトモル標的を使 用 １１Ｌ−−整一ユー　Ｓ：Ｎ テトラキス　４０４６８　１６５４　２４：ｌＴＲｌ５　４９２０　１６９０　 ３：ＩＰＰＴＡ　１１１４　９７５　１：１ 表ＩＢ ■１藩１ キレート標識プローブ１０フェムトモル−里−一−−肱一庄一　Ｓ：Ｎ　ヨコ テトラキス　８２４０　５５　１５０１　８２０ＴｔＳ　９５２　５５　Ｉ７： １　９０表２は、このアッセイの感度レベルはＩ　Ｘ　１０−”のオーダーであ り、そしてアクリジニウムエステルおよびルミノールエン、Ａンサーのためのケ ミルミネッセンス技術に良く匹敵することを示す。

表２ ＭＵＢＰ”　螢光計　８Ｘ１０−！ｏ　ｌＸｌ０−”イソルミノール　ルミノメ ータ−Ｉ　Ｘ　１０−”　Ｉ　Ｘ　１０−”アクリジニウム　ルミノメータ−２ Ｘ１０−”　２Ｘ１０−”エステル ルミノール＋　ルミノメータ−６ＸｌＯ−”　６Ｘ１０−”エンハンサ− Ｔｂ″１／テトラキス　時間分解螢光計　ｌＸｌ０−”　５Ｘ１０−”Ｄ−ルシ フェリン−ルミノメータ−６Ｘ１０−”　ｌＸｌ０−”０−リン酸 表３は、ダブルキレート（ｙ＝２であるコンカテネート）は、上に与えたのと類 似の枠組のアッセイにおいて、単一複合体に比較して付加的に増強された信号を 発生することを示す。データは、０゜ｌｆｍ（１０−”モル）範囲の検出が多数 Ｎ識により可能であることを示す。

表　３ −・　゛キレート 土ヱニ上１度　−一車一二−−−一炙一歎−−２ｆｍ　２６１４　５６７６ １　ｆｍ　１４８６　３０７６ ０．５ｆｍ　５９６　１５３８ 単一標識ブローブ８８−３００および多数標識プローブ２１２０キレートからの データ 直接蒲獲アンセイにより得られたデータ多数キレートは、プローブ配列あたり約 ２個のキレートを存する。

キレートの数はスペクトル分光分析によって決定した。

−へ 要　約　書 核酸ハイブリダイゼーションアッセイに有用であり、そして任意配列のキレ−） ！１ｆｆｉプローブを調製するための希土類キレート結合オリゴヌクレオチドが 開示される。使用した特定のクラスのキレートは、他の構造的に関連したキレー ト化合物に比較し、時間分解螢光分光法において高レベルの信号の放出に相関す る、異常に高い希土類元素捕獲効率を発揮する。

国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．希土類キレート結合オリゴヌクレオチドにして、構造式：▲数式、化学式、 表等があります▼ （式中、Ｒはｐ−アミノフェネトキシ、ｐ−イソチオシアノフェネトキシおよび ｐ−チオニルクロロフェネトキシよりなる群から選ばれた官能化されたアリール アルキル基であり、Ｒ′は（アリール−ジカルボキシルビリジル）アルキル基で あり、ｎはトリアジン環の数である。）の２−アルコキシ−４，６−ジ（Ｎ，Ｎ ，Ｎ′，Ｎ′−テトラアルキル）アミノトリアジン１個または複数よりなる螢光 性希土類キレート部分と、アミドおよびチオ尿素よりなる群から選ばれた連結基 と、前記連結基を介して前記希土類キレート部分へ共有結合した、少なくとも４ プラスｎ個のデオキーまたはりボタクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチド を含んでいる希土類キレート結合オリゴヌクレオチド。
2. ２．前記（アリール−ジカルボキシルビリジル）アルキル基は、（２，６−ジカ ルボキシル−４−アリールビリジル）アルキル基である請求項１の希土類キレー ト結合オリゴヌクレオチド。
3. ３．各自２−アルコキシ−４，６−アミノトリアジン基へ共有結合した置換アリ ールビリジンジ酸単位の四量体を含んでいるテトラ（アリールビリジン）リガン ドと、少なくとも４個の連続した非誘導体化ヌクレオチドを有するオリゴヌクレ オチドと、そして前記オリゴヌクレオチドを前記２−アルコキシ−４，６−ジア ミノトリアジン基の各自へ結合する連結基を含んでいる希土類キレート結合オリ ゴヌクレオチド。
4. ４．信号手段を含んでいるプローブをサンプル中に含まれている標的核酸配列へ ハイブリダイズし、ハイブリダイズした核酸を分離し、そして前記信号手段が発 生する信号を測定することによりハイブリダイゼーションの程度を検出すること を含む相補的核酸配列を検出するためのアッセイ方法において、サンプル中に含 まれる核酸に対して相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１２個の連続 した非誘導体化ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにして、２−アルコキシ−４ ，６ジアミノトリアジン基へ共有結合した置換アリールビリジン酸単位の四量体 を含んでいるテトラ（アリールビリジン）リガンドを含む希土類キレート部分へ 共有結合している前記オリゴヌクレオチドを使用することよりなる改良。
5. ５．信号手段を含んでいるプローブをサンプル中に含まれている標的核酸配列へ ハイブリダイズし、ハイブリダイズした核酸を分離し、そして前記信号手段が発 生する信号を測定することによりハイブリダイゼーションの程度を検出すること を含む相補的核酸配列を検出するためのアッセイ方法であって、サンプル中に含 まれる標的核酸に対して相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１２個の 連続した非誘導体化ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブにして、２−ア ルコキシ−４，６−ジアミノトリアジン基へ共有結合した置換アリールビリジン ジ酸単位の四量体を含むテトラ（アリールビリジン）リガンドを含む希土類キレ ート部分へ共有結合している前記オリゴヌクレオチドプローブをインキュベート し、サンプルからハイブリダイズされた前記オリゴヌクレオチドプローブおよび 標的核酸を分離し、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブおよび標 的核酸のキレート化を実現するため希土類元素の存在下インキュベートし、最初 希土類元素を励起波長の放射線にて励起し、次に時間分解螢光分光法によって螢 光発光を測定することによりキレート化の程度を測定することよりなるアッセイ 方法。
6. ６．２−アルコキシ−４，６−ジアミノトリアジン基へ共有結合した置換アリー ルビリジンジ酸単位の四量体を有するテトラ（アリールビリジン）リガンドを含 む希土類キレート部分を３′または５′末端において組込んでいる少なくとも１ ２個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを、プローブに対し相補的でありかつ 前記オリゴヌクレオチドに対し相補的な末端配列を有する配列へハイブリダイズ し、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド配列をもってポリメラーゼ触媒延長 反応をプライミングし、前記延長反応を実施し、そのようにして形成した二本鎖 のストランドを分離し、そしてキレート標識核酸プローブを車離することよりな る方法によって形成した、希土類キレート結合オリゴヌクレオチドを含んでいる 任意配列のキレート標識核酸プローブ。
7. ７．各自２−アルコキシ−４，６−ジアミノトリアジン基へ共有結合した置換ア リールビリジンジ酸単位の四量体を有する１個または複数のテトラ（アリールビ リジン）リガンドを含んでいる希土類キレート部分を３′または５′末端に組込 んだ少なくとも４個の連続した非誘導体化ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに 対して相補的であり、かつ反対の５′−３′極性のプローブ配列の末端に対して も相補的である橋かけ配列を用意し、前記橋かけ配列を前記オリゴヌクレオチド およびプローブ配列へハイブリダイズし、そしてプローブ配列をオリゴヌクレオ チドへ連結することよりなる方法によって形成した、希土類キレート結合オリゴ ヌクレオチドを含んでいる任意配列のキレート標識核酸プローブ。
8. ８．任意の所望のプローブ配列を、各自２−アルコキシ−４，６−ジアミノトリ アジン基へ共有結合した置換アリールビリジン酸単位の四量体を有する１個また は複数のテトラ（アリールビリジン）リガンドを含んでいる希土類キレート部分 へ結合した少なくとも４個の連続した非誘導体化ヌクレオチドのオリゴヌクレオ チド尾部へ、ＲＮＡリガーゼによって連結することよりなる方法によって形成し た、希土類キレート結合オリゴヌクレオチドを含んでいる任意配列のキレート標 識核酸プローブ。
9. ９．前記オリゴヌクレオチドは、制限エドヌクレアーゼの活性によってつくられ た一対の一本鎖対向ストランド切片間に前記ヌクレオチド配列を有する請求項７ または８のキレート標議プローブ。
10. １０．各自２−アルコキシ−４，６−ジアミノトリアジン基へ共有結合した置換 アリールビリジン酸単位の四量体を有する１個または複数のテトラ（アリールビ リジン）リガンドを含んでいる希土類キレート部分を３′または５′末端に組込 んだ少なくとも４個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを収容している第１の 容器と、そしてポリメラーゼおよびリガーゼよりなる群から選ばれた酵素を収容 している第２の容器よりなる、希土類キレート結合オリゴヌクレオチドを組込ん だ任意配列のキレート標識核酸プローブを調製するためのキット。