CN114062328A - 一种基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的检测方法，对第一核酸链进行中间修饰，加入稀土配合物，获得第一核酸链和稀土配合物的偶联产物，然后加入与所述第一核酸链互补的第二核酸链，从而达到增强荧光的效果。该方法具有反应操作简单，条件绿色温和、反应时间短等优点。核酸与稀土配合物的偶联产物在核酸互补链存在的情况下，荧光最高可以增强至20倍以上，可用于生理条件对各种核酸、蛋白质及其他生物小分子的高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，还涉及荧光材料领域，特别涉及一种基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的检测方法。
背景技术
发光稀土配合物因具有发射光谱窄(半峰宽仅10nm左右)，荧光寿命长(10-2-10- 6s)以及发射波长可调且分布区域宽等优点，广泛应用于生物化学分析中。与荧光寿命在纳秒级的有机染料和荧光纳米材料相比，发光稀土配合物的荧光寿命可以达到毫秒级，因此，可以通过时间分辨或时间门控制检测来消除背景荧光和光散射，提高检测的信背比，最终实现待测物的高灵敏检测。
增强稀土配合物荧光主要基于以下四种方法：(1)通过调节与中心稀土离子配位的水分子来进行靶标分子的检测。在水溶液中，稀土配合物外围存在与稀土离子直接配位的水分子，荧光强度较低，当比水分子配位能力强的分子或离子取代水分子的配位后，可以有效增强配合物的荧光发射，从而实现分子或离子的检测；(2)调节“天线”配体与稀土离子之间的距离。当稀土离子与配体之间距离较远时，能量传递效果较差，荧光强度较低，加入能够拉近配体和稀土离子之间距离的待测物即可提高能量传递效果，增强发光强度。(3)调节“天线”配体的激发态。通过加入待测物来调节配体的激发态衰减过程来提高稀土配合物的荧光强度。(4)利用手性分子与稀土配合物结合后产生圆偏振荧光实现手性待测物的检测。
然而，这些方法往往需要针对待测物重新设计、合成结构复杂的配体，操作繁琐，反应条件严苛，反应时间长，结果的随机性较强，普适性较差，荧光强度提高的程度有限，极大地限制了稀土配合物的发展与应用。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了本发明涉及一种基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的检测方法，对第一核酸链进行中间修饰，加入稀土配合物，获得第一核酸链和稀土配合物的偶联产物，然后加入与所述第一核酸链互补的第二核酸链，从而达到增强荧光的效果。该方法具有反应操作简单，条件绿色温和、反应时间短等优点。核酸与稀土配合物的偶联产物在核酸互补链存在的情况下，荧光最高可以增强至20倍以上，可用于生理条件对各种核酸、蛋白质及其他生物小分子的高灵敏检测。
一种基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的检测方法，包括如下步骤：
(1)对第一核酸链进行中间修饰；
(2)加入稀土配合物，获得所述第一核酸链和所述稀土配合物的偶联产物；
(3)加入与所述第一核酸链互补的第二核酸链。
进一步的，所述步骤(1)中所述的修饰为氨基、羧基、叠氮、马来酰亚胺中的任一种修饰，如巯基和马来酰亚胺的连接，炔基和叠氮的偶联，异硫氰酸和氨基的偶联。只要所选用的修饰能够使第一核酸链与发光稀土配合物发生化学反应而偶联在一起均可适用。
进一步的，所述步骤(1)中所述的修饰的位置为核酸链5’端的第二位至3’端的第二位中的任意位置。在核酸链中间位置的修饰才能够起到荧光增强的效果。
进一步的，所述步骤(1)中所述的修饰的位置为核酸链5’端的第二位至3’端的第二位中的中部。在核酸链的中部修饰所产生的荧光增强效果优于接近末端的修饰所产生的荧光增强效果。
进一步的，所述步骤(1)中所述的第一核酸链的长度大于3个核苷酸。对序列结构没有要求。大于3个核苷酸才能够满足发光稀土配合物偶联在核酸链的非末端位置。
进一步的，所述步骤(2)中所述的稀土配合物为镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钇、钪的配合物中的任一种。
进一步的，所述步骤(2)中需要加入缓冲溶液。
进一步的，所述缓冲溶液为HEPES缓冲溶液。HEPES缓冲溶液的优选pH值为7.4。
进一步的，所述步骤(2)中需要进行分离步骤，所述分离步骤使用脱盐柱。
进一步的，所述步骤(3)中所述的第二核酸链的浓度大于10nM。互补的第二核酸链浓度过低不能产生荧光增强效果。继续增大第二核酸链的浓度不发生过饱和效果。
本发明还提供所述的方法在核酸、蛋白质、生物小分子标志物检测上的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.反应操作简单，为一步反应，在室温下反应，条件绿色温和。
2.对稀土配合物的荧光强度提高程度更高，可达20倍以上。
3.反应时间更短，加入互补链之后可立即观察到荧光增强效果。
4.经过对核酸序列的调节，可应用于核酸(DNA或RNA)、蛋白质、生物小分子等生物标志物的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的操作流程图。
图2为发明实施例1中所用的稀土配合物Lumi-4-Tb-NHS中的配体结构。
图3为3’端末端氨基修饰DNA与Lumi4-Tb-NHS偶联物(终浓度为5nM)的荧光强度与互补DNA链浓度的依赖关系。
图4为5’端末端氨基修饰DNA与Lumi4-Tb-NHS偶联物(终浓度为5nM)的荧光强度与互补DNA链浓度的依赖关系。
图5为在5’端第三位碱基处进行氨基修饰DNA与Lumi4-Tb-NHS偶联物(终浓度为5nM)的荧光强度与互补DNA链浓度的依赖关系。
图6为在5’端第七位碱基处进行氨基修饰DNA与Lumi4-Tb-NHS偶联物(终浓度为5nM)的荧光强度与互补DNA链浓度的依赖关系。
图7为在5’端第七位碱基处进行氨基修饰DNA与Lumi4-Tb-NHS偶联物(终浓度为5nM)的荧光强度与互补DNA链浓度的线性依赖关系。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明的方案中，对第一核酸链进行中间修饰后，借助修饰基团与发光稀土配合物上相应基团的反应可以将第一核酸链与发光稀土配合物偶联到一起，所述的修饰为氨基、羧基、叠氮、马来酰亚胺等中的任一种修饰，核酸链和发光稀土配合物之间的偶联如巯基和马来酰亚胺的连接，炔基和叠氮的偶联，异硫氰酸和氨基的偶联等。只要所选用的第一核酸链修饰能够使第一核酸链与发光稀土配合物发生化学反应而偶联在一起均可适用。所述的第一核酸链的长度需大于3个核苷酸，对序列结构没有要求。大于3个核苷酸才能够满足发光稀土配合物偶联在核酸链的非末端位置。而只有在中间位置才会出现荧光增强的效果。
所用的发光稀土配合物偶联到第一核酸链的中间序列后，第一核酸链的碱基和稀土元素的配位作用使得稀土配合物的荧光强度降低，加入互补的第二核酸链之后，碱基互补配对会减弱碱基和稀土元素的配位作用，所以稀土配合物的荧光得以恢复，能够达到偶联了第一核酸链的发光稀土配合物荧光强度的20倍。
以下实施例中的发光稀土配合物以Lumi-4-Tb-NHS为例，但是镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钇、钪均为稀土元素，它们的发光配合物都能够与核酸链偶联，因此本领域技术人员能够推及镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钇、钪元素的发光配合物均可适用以下的方案。
以下实施例中以DNA链为例，但是RNA链和有核酸适配体的蛋白质也可以与发光稀土配合物偶联，也能够进行单链中间的修饰，加入互补的第二核酸链后也能够产生荧光增强的效果，因此本领域技术人员能够推及RNA链和有核酸适配体的蛋白质也可适用以下的方案。
实施例1
本发明提出了一种基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的检测方法，分为以下3步，如图1的流程图所示：
(1)对第一核酸链进行中间修饰；
(2)加入稀土配合物，获得所述第一核酸链和所述稀土配合物的偶联产物；
(3)加入与所述第一核酸链互补的第二核酸链。
具体的操作步骤如下：
取10-40μL浓度为25-100μM的中间修饰的单链第一核酸链，加入2.5μL浓度8mM的发光稀土配合物，再加入5μL浓度为250mM，pH为7.0-9.0的HEPES缓冲溶液，室温下反应过夜，采用脱盐柱对产物进行分离，用浓度为10-25mM，pH＝7.0-7.4的HEPES缓冲溶液为洗脱液，收集偶联产物，之后加入浓度大于10nM互补的第二核酸链，即可以产生荧光增强的效果。该方法具有反应操作简单(一步反应)，条件绿色温和(室温，12h)等优点。核酸链与发光稀土配合物的偶联产物在核酸互补链存在的情况下，荧光最高可以增强至20倍以上，可用于生理条件对各种核酸及其相关物质的高灵敏检测。
本发明实施例中采用的DNA序列如下(5’端到3’端)：
3’端末端氨基修饰的DNA序列：AGTCCGTTACCTTGATT-C6NH2；
5’端末端氨基修饰的DNA序列：NH2C6-AGTCCGTTACCTTGATT；
5’端第七位碱基处进行氨基修饰的DNA序列：AGTCCG/iNH2C6dT/TACCTTGATT；
5’端第三位碱基处进行氨基修饰的DNA序列：AG/iNH2C6dT/CCGTTACCTTGATT；
氨基修饰DNA的互补序列：AATCAAGGTAACGGACT；
本发明实施例中所用的稀土配合物Lumi-4-Tb-NHS中的配体结构如图2所示，稀土元素包裹在左侧的“笼子”中间，右上角延伸出的部分即为与核酸链偶联的部位。
实施例2Lumi4-Tb-NHS与核酸的偶联与纯化
Lumi4-Tb-NHS是一种发光稀土配合物，购买于Lumiphore公司(货号BCK20-E01)，准确量取2.5μL浓度为8mM的Lumi4-Tb-NHS的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，加入5μL浓度为10mg/mL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液(EDC溶液)，再依次加入40μL浓度为100μM的氨基修饰的单链DNA和5μL浓度为250mM、pH＝7.4的HEPES缓冲溶液中，混合均匀后于室温下反应过夜。采用PD-10脱盐柱进行分离，洗脱液为浓度为25mM pH＝7.4的HEPES缓冲溶液。每5滴收集一管，测定溶液于260nm处的吸光度，并根据DNA的摩尔吸光系数计算浓度，通过测定相同浓度下的所收集的样品的荧光强度(激发滤光片为340nm，发射滤光片为545nm，收集100-600μs内的荧光强度)，取荧光强度接近的、较先洗脱出的几组组分，即DNA与稀土配合物的偶联产物(Lumi4-Tb-DNA)，DNA是氨基修饰的，Lumi4-Tb-NHS的配体结构含有羧基活化之后的物质，两者混合就可以发生氨基和羧基的偶联，形成酰胺键。
实施例3核酸链修饰的不同位置对Lumi4-Tb-DNA荧光增强的研究
用pH＝7.4浓度为25mM含150mM氯化钠的HEPES缓冲溶液稀释所得Lumi4-Tb-DNA，并加入不同量的互补DNA链，Lumi4-Tb-DNA偶联物的终浓度为5nM，互补DNA链的终浓度分别为0、10nM、20nM、50nM，每个样品重复三次，加入互补链之后可立即观察到荧光增强效果，用Vector多功能酶标仪测定其荧光强度。在DNA不同位置上修饰氨基，使其与Lumi4-Tb-NHS偶联，得到的荧光增强效果也不同。图3和图4显示，横坐标为互补DNA的浓度，纵坐标为荧光强度，在DNA末端，无论是3’端还是5’端修饰氨基使其与Lumi4-Tb-NHS偶联，所得产物在互补DNA存在下，无荧光增强现象。而在其中间部位进行氨基修饰(第3个碱基或第7个碱基)后再与Lumi4-Tb-NHS偶联，所得产物在互补DNA存在下，荧光有明显的增强，如图5和图6所示，横坐标为互补DNA的浓度，纵坐标为荧光强度，加入互补链后的发光稀土配合物的荧光强度最高增强倍数可以达到20倍以上，说明只有在中间位置修饰的核酸链才能够产生荧光增强的效果。图6的荧光增强倍数约为20倍，而图5中荧光增强倍数为约12倍，说明在5’端第7个碱基处进行氨基修饰的效果比在第3个碱基处进行氨基修饰对荧光增强的效果更好。在实施例1的具体序列信息中可见5’端第7个碱基处更加靠近DNA链的中间，而5’端第3个碱基处靠近DNA链的末端，靠近DNA链的末端时稀土配合物有一侧的碱基较少，数量较少的碱基和稀土元素产生的配位作用配位较弱，而靠近DNA链的中间进行的修饰两侧都有数量较多的碱基，加入互补的第二核酸链之后，碱基互补配对作用强，会减弱碱基和稀土元素的配位作用，所以在5’端第7个碱基处进行氨基修饰的效果比在第3个碱基处进行氨基修饰对荧光增强的效果更好。
实施例4互补核酸链的不同浓度对Lumi4-Tb-DNA荧光增强的研究
用pH＝7.4浓度为25mM含150mM氯化钠的HEPES缓冲溶液稀释所得Lumi4-Tb-DNA，并加入不同量的互补DNA链，Lumi4-Tb-DNA偶联物的终浓度为5nM，互补DNA链的终浓度分别为0、10nM、20nM、50nM，每个样品重复三次，加入互补链之后可立即观察到荧光增强效果，用Vector多功能酶标仪测定其荧光强度。图5和图6显示当互补DNA浓度为10nM时就能够产生很强的荧光增强效果，之后再继续增加互补链的浓度，就不再产生进一步的荧光增强。
实施例5Lumi4-Tb-DNA在核酸检测中的应用
将在5’端第7个碱基上修饰氨基的DNA与Lumi4-Tb-NHS偶联产物用pH＝7.4浓度为25mM含150mM氯化钠的HEPES缓冲溶液稀释，加入不同浓度的互补DNA链(0、0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、5nM)，利用Vector多功能酶标仪测定其在100-600μs范围内的荧光强度，获得如图7的线性标准曲线，可见曲线上的数据点呈线性分布，横坐标为互补DNA链的浓度，纵坐标为酶标仪测定的荧光强度，由图7可以看出，随着互补链的浓度升高，荧光增强。该线性标准曲线可以用来测定目标核酸链的浓度，对目标核酸链的荧光强度进行测定，根据荧光强度的结果对应到相应的线性标准曲线中即可获得目标核酸链的浓度。同时，根据10次空白样本的标准偏差的三倍除以曲线斜率计算出该体系的检出限为31.56pM，检出限是检测应用的一个重要指标，能体现应用的好坏，说明本发明的方法在核酸检测中非常有效。
实施例6本发明的基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的检测方法对目标核酸进行识别的应用
对目标核酸的浓度进行测定的具体步骤可分为以下几步：
(1)对第一核酸链进行中间修饰；
(2)加入稀土配合物，获得所述第一核酸链和所述稀土配合物的偶联产物；
(3)加入与所述第一核酸链互补的不同浓度的第二核酸链；
(4)测定加入不同浓度的第二核酸链的发光稀土配合物的荧光强度，以第二核酸链的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。
(5)对目标核酸链的荧光强度进行测定，根据荧光强度的结果对应到相应的线性标准曲线中即可获得目标核酸链的浓度。
实施例7本发明的基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的检测方法对目标蛋白质进行识别的应用
对有核酸适配体的蛋白质的浓度进行测定的具体步骤可分为以下几步：
(1)蛋白质先与其适配的第一核酸链结合，结合后蛋白质与第一核酸链作为一个整体进行下面的步骤；
(1)对第一核酸链进行中间修饰；
(2)加入稀土配合物，获得所述第一核酸链和所述稀土配合物的偶联产物；
(3)加入与所述第一核酸链互补的不同浓度的第二核酸链；
(4)测定加入不同浓度的第二核酸链的发光稀土配合物的荧光强度，以第二核酸链的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。
(5)对目标蛋白质的荧光强度进行测定，根据荧光强度的结果对应到相应的线性标准曲线中即可获得目标蛋白质的浓度。
可以按照本发明的核酸杂交的方法对目标核酸进行识别。同理，将对蛋白质、小分子等生物标志物的检测转化成对核酸的检测即可，故本发明的方法可用于生理条件对各种核酸、蛋白质及其他生物小分子的高灵敏检测。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.反应操作简单，为一步反应，在室温下反应，条件绿色温和。
2.对稀土配合物的荧光强度提高程度更高，可达20倍以上。
3.反应时间更短，加入互补链之后可立即观察到荧光增强效果。
4.经过对核酸序列的调节，可应用于核酸(DNA或RNA)、蛋白质、生物小分子等生物标志物的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种基于核酸杂交增强稀土配合物荧光的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对第一核酸链进行中间修饰；
(2)加入稀土配合物，获得所述第一核酸链和所述稀土配合物的偶联产物；
(3)加入与所述第一核酸链互补的第二核酸链。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的修饰为氨基、叠氮、羧基、马来酰亚胺中的任一种修饰。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的修饰的位置为核酸链5’端的第二位至3’端的第二位中的任意位置。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的修饰的位置为核酸链5’端的第二位至3’端的第二位中的中部。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的第一核酸链的长度大于3个核苷酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述的稀土配合物为镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钇、钪的配合物中的任一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中需要加入缓冲溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为HEPES缓冲溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中需要进行分离步骤，所述分离步骤使用脱盐柱。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述的第二核酸链的浓度大于10nM。
11.权利要求1-10任一项所述的方法在核酸、蛋白质、生物小分子标志物检测上的应用。
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