JPH05504479A

JPH05504479A - レチノイドレセプター組成物および方法

Info

Publication number: JPH05504479A
Application number: JP3504655A
Authority: JP
Inventors: マンゲルスドルフ，デイビッド　ジョン; エバンズ，ロナルド　マーク
Original assignee: ザ　ソーク　インスティテュート　フォア　バイオロジカル　スタディーズ
Priority date: 1990-02-09
Filing date: 1991-01-22
Publication date: 1993-07-15
Also published as: AU1155395A; EP0514488A1; US7501487B1; WO1991012258A1; EP0999271A2; EP0514488A4; AU680575B2; ATE196310T1; CA2075182A1; US5723329A; CA2075182C; DE69132411T2; ES2152920T3; DE69132411D1; EP0514488B1; EP0999271A3; AU7338391A; AU654270B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１１、リポータ−ベクターによりさらに形質転換され、該リポータ−ベクターが、（ａ）該細胞中で機能し得るプロモーター、（１））ホルモン応答エレメント、および（Ｃ）　リポータ−タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含有しており、該リポータ−タンパク質をコードするＤＮＡセグメントが、該ＤＮＡセグメントの転写のために該プロモーターに作動可能に連結されており、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために作動可能に連結されている、請求項８に記載の細胞。

１２、前記プロモーターがマウス乳癌ウィルスの５°−ＬＴＲプロモーターであり、前記ホルモン応答エレメントがＴＲＥＰまたはβ−ＲＡＲＥから選択され、さらに、前記リポータ−タンパク質が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼから選択される、請求項１１に記載の細胞。

１３、前記ＩＪホー９−ヘク９−が、δ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、　δ−ＴＫ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ−５Ｖ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ− ＬＵＣ，δ−ＴＫ−ＴＩｉＥｐ−ＬＵＣまたはδ−５Ｖ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣから選択される、請求項１２に記載の細胞。

１４、前記リポータ−ベクターが、ＡＤＨ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、　ＡＤＨ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣ，ＴＫ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴまたはＴＫ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣから選択される、請求項１２に記載の細胞。

１５、キイクシ１ウジヨウバエ５ｃｈｎｅｉｄｅｒ系２細胞である、請求項１４に記載の細胞。

１６、レセプターポリペプチドの転写活性化効果を制御する化合物の能力を試験する方法であって、該方法が、レセプターポリペプチドおよびリポータ−ベクターを含有する細胞を該化合物に接触させてリポータ−タンパク質の有無を調べるアッセイを行うことを包含しており、該レセプターポリペプチドが、（１）単数または複数種類のレチノイドの存在に対して応答性を有しており、これによって、関連する単数または複数個の遺伝子の転写を制御すること、および（２）９個のＣｙｓ残基を持つ約６６個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有しており、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）ｈＲＡＲ−αのＤＮＡ結合ドメインに対する約６５％未満のアミノ酸同一性と、（ｂ）ｈＴＲ−βのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性と、（ｃ）ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性とを有することを特徴としており、さらに、該リポータ−ベクターが、（ａ）該細胞中で機能し得るプロモーター、（ｂ）ホルモン応答エレメント、および（Ｃ）　リポータ−タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含有しており、該リポータ−タンパク質をコードするＤＮＡセグメントが、Ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａセグメントの転写のために該プロモーターに作動可能に連結されており、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために作動可能に連結されている、方法。

１７、前記接触が、さらに少なくともひとつのレチノイド橿の存在下で行われる、請求項１６に記載の方法。

１８、使用される前記細胞が、前記レセプターポリペプチドを発現させ得るベクターで共形質転換されたＣＶ−１細胞であり、該ベクターが、Ｒ５−ｈＲＸＲ− ａ、Ｒ３−ｍＲＸＲ−ａまたはＲＳ　−ｍ　ＲＸ　Ｒ−γから選択されるベクターであり、およびリポータ−ベクターが、δ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ− ＴＩ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ１　δ−５Ｖ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣ，δ−ＴＫ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣまたはδ−５Ｖ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣから選択される、請求項１６に記載の方法。

１９、使用される前記細胞が、前記レセプターポリペプチドを発現させ得るベクターで共形質転換されたキイクシヨウジヨウバエ５ｃｈｎｅｉｄｅｒ系２細胞であり、該ベクターが、Ａ５Ｃ−ｈＲＸＲ−α、Ａ５Ｃ−ｍＲＸＲ−ａまたはＡ５Ｃ−ｍＲＸＲ−７から選択されるベクターであり、およびリポータ−ベクターが、ＡＤＨ−Ｔｌ？Ｅｐ−ＣＡＴ、　ＡＤ［１−ＴＲＥｐ−ＬＵＣ，ＴＫ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴまたはＴＩ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣから選択される、請求項１６に記載の方法。

２０、標識された一本鎖核酸配列であって、少なくとも長さ２０個の連続する塩基を含有しており、該塩基が、（ｊ）配列番号１　［ｈＲＸＲ−αコに示されているＤＮＡの、２位から１８６１位までの塩基、または（ｉ　ｉ）配列番号２０ｍＲＸＲ−α］に示されているＤＮＡの、２０位から２０９５位までの塩基、または（ｆｉｔ）配列番号３［ｍＲＸＲ−７コに示されているＤＮＡの、１５位から１６５３位までの塩基、またはＨｖ）（ｉ）、（ｉ　ｉ）または（ｉｉｉ）に記載の配列の内の何れかひとつの相補体から選択される任意の２０個以上の連続する塩基と実質的に同一の配列を有する、標識された一本鎖核酸配列。

２１、３２ＰによりＩ識された、請求項２０に記載の核酸。

２２、レセプターポリペプチドを作製する方法であって、該ポリペプチドが、（１）単数または複数種類のレチノイドの存在に対して応答性を有しており、これによって、関連する単数または複数個の遺伝子の転写を制御すること、および（２）９個のＣｙｓ残基を持つ約６６個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有しており、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）ｈＲＡＲ−αのＤＮＡ結合ドメインに対する約６５％未満のアミノ酸同一性と、（ｂ）ｈＴＲ−βのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性と、（ｃ）ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性とを有することを特徴としており、発現ベクターを含有する細胞を培養することを包含し、該発現ベクターが、該細胞中で機能し得、これによって、該ポリペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａ配列を発現させる、レセプターポリペプチドを作製する方法。

２３、前ｇ己しセプターポリペプチドが、配列番号２　［ｈＲＸＲ−α］に示されている１位〜４６２位のアミノ酸、配列番号４　［ｍＲＸＲ−α］に示されている１位〜４６７位のアミノ酸、または配列番号６　［ｍＲＸＲ−γ］に示されている１位〜４６３位のアミノ酸の配列と実質的に同一の配列を有する、請求項２２に記載の方法。

２４、前記レセプターポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメインを含有しており、該ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２　［ｈＲＸＲ−α］に示されている１３５位〜２００位のアミノ酸、配列番号４　［ｍＲＸＲ−α］に示されている１４０位〜２０５位のアミノ酸、または配列番号６　［ｍＲＸＲ−γ］に示されている１３９位〜２０４位のアミノ酸の配列と実質的に同一の配列を有する、請求項２２に記載の方法。

２５、前記ＤＮＡ配列が、セグメントを含有しており、該セグメントが、配列番号１　［ｈＲＸＲ−α］に示されている７６位〜１４６４位のヌクレオチド、配列番号２　［ｍＲＸＲ−α］に示されている１８１位〜１５８１位のヌクレオチド、または配列番号３　［ｍＲＸＲ−γ］に示されている１２３位〜１５１４位のヌクレオチドの配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載の方法。

明細書レチノイドレセプター組成物および方法関連出願本出願は、１９９０年２月９日に出願された現在係属中の出願系４７８．０７１号の一部継続出願であり、この関連出願の全内容はこれにより本明細書中に援用される。

技術分野本発明は、新規なステロイドホルモン様レセプタータンパク質、ならびにこれを作製および使用する方法に関する。

特に、本発明は、転写を調節する効果を有するステロイドホルモン様レセプタータンパク質に関する。このようなタンパク質は、レチノイド酸（ｒｅｔｉｎｏｉｄ　ａｃｉｄ）および他のビタミンＡ代謝物の存在に対して応答性を有する。

発明の背景レチノイドは、レチノイド酸、レチノール（ビタミンＡ）、ならびに一連の天然および合成誘導体を含む化合物の群を含む。これらは共に、広範囲の種々のシステムにおける発生および分化に対して大きい効果を与える。初期の研究の中心は、上皮細胞の成長および分化に対するレチノイドの効果にあったが、レチノイドの作用が広範囲に渡ることは現在明らかにされている。近年の多くの研究では、ヒト前骨髄球性白血病細胞系ＨＬ６０を含む、種々の培養された新生細胞型に対するこれらの分子の効果が調査されている。このような細胞中では、レチノイド酸が顆粒球分化の有効な誘導物質であると思われる。Ｆ９胚性癌腫細胞中では、レチノイド酸は、後期マウス胚盤胞の特徴である壁側内胚葉の分化を誘導する。

レチノイド酸は、さらに、発生中のトリの肢および再生中の両性類の肢において時空軸を規定するに際し重要な役割を果たしていると思われる。

レチノイド酸は、数個のｃＤＮＡの転写を誘導することが明らかにされている。

これらのｃＤＮＡの遺伝子産物は分別スクリーニングによって単離されている。

この観察により、レチノイド酸が遺伝子発現の調節を介して作用するという仮説が支持される。このレチノイド酸の作用は、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンが標的遺伝子に影響を及ぼす場合と類似の態様で生じる。

レチノイド酸またはビタミンＡの他の代謝物に対して応答性を宵する遺伝子の転写に影響を及ぼす化合物を同定する能力は、例えば治療の用途において、非常に重要である。さらに、レチノイド酸、ビタミンＡまたはビタミンＡの代謝物の存在を調べるために溶液、体液などを監視するための有用なシステムは、様々な分析的生化学の応用、およびおそらくは医学的診断において重要であろう。

分子クローニング研究によって、ステロイドホルモン、レチノイドホルモンおよび甲状腺ホルモンのためのレセプターが全て構造上関連していることが実証可能となった。これらのレセプターは、調節タンパク質のスーパーファミリーを含む。調節タンパク質は、ホルモン刺激に応答してシス作用エレメントに直接結合することにより特異的な遺伝子発現を調節することができる（Ｅｖａｎｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０．８８９　（１９８８）；ＧｒｅｅｎおよびＣｈａｍｂｏｎ、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｇｅｎｅｔ、　４．３０９　（１９８８））　ｏ変異レセプターとの構造上の比較およびこれらの機能の研究によって、これらの分子が別個の機能ドメインにより構成されていることが確認された。機能ドメインとして最も顕著なものには、典型的には６６〜６８個のアミノ酸（２個の亜鉛フィンガーを含む）により構成されるＤＮＡ結合ドメイン、および、約２５０個のアミノ酸により構成された関連するカルボキシ末端伸張部があり、このカルボキシ末端伸張部は、リガンド結合ドメインを含有する（前出のＥｖａｎｓにより概説）。

低い緊縮条件でハイブリダイゼーシヨンを行って、ホルモンレセプターの構造的特徴を有する遺伝子産物を単離し、その後にこれを描写してリストを増やしてい（ことが可能となった。

最近、ＲＡＲ−α（レチノイド酸レセプター−α）と称されるレチノイド酸依存転写因子が確認された。これに続いて、他の２個のＲＡＲ関連遺伝子が単離された。したがって、現在少なくとも３個の異なるＲＡＲのサブタイプ（α、βおよびγ）がマウスおよびヒト中に存在することが知られている。

これらのレチノイド酸レセプター（ＲＡＲ）は、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンレセプターのスーパーファミリーと相同であり、しかも、類似のリガンド依存機構によって特異的な遺伝子発現を調節することが明らかにされている（　Ｕｍｅｓｏｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３３５．　２６２　（１９８ｇ））　ｏ　これらのＲＡＲサブタイプは、発生中および成熟した生体において異なるパターンで発現される。

本発明の理解および実施に有用な他の情報は、同一出願人の、同時係属中である、１９８７年１０月２０日出願の米国特許出願策１０８．４７１号、１９８８年１１月３０日出願の第２７６、５３６号、１９８９年３月１７日出願の第３２５．２４０号、１９８９年６月２２日出願の第３７０．４０７号、および１９８９年１１月１６８出願の第４３８．７５７号に見られる。これら全ての出願は、これによってその全体が本明細書中に援用される。

発明の要旨本発明者らは、動物細胞がレチノイド酸およびレチナールなどのレチノイドに接触した時に、活性化されて細胞中の特定の遺伝子の転写を調節する新規なレセプターを発見した。

これらの新規なレセプターは、−次タンパク質配列および種々のレチノイドに対する応答性の双方に関して、既知のレチノイド酸レセプターとは大きく異なる。

これらの新規なレセプターは、遺伝子的に異なる遺伝子座に位置する数個のイソ型を有する。これらのイソ型は、レチノイド酸レセプターに類似のシスエレメントを介してトランス活性化を行い得るが、有効性のランクおよびレチノイドに対する用量依存性は異なる。本発明の新規なレセプターをノーザン分析することによって、各イン型が成人組織中で独特の発現パターンを呈すること、および、胚中で時間的、空間的に発現されることが分かる。結合実験によって、新規なレセプタータンパク質が［３Ｈ］レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）に対して低い親和性を有することが実証される。これらの結果をトランス活性化研究の結果と共に考慮すると、新規なレセプターのためのリガンドは、レチノイン酸の単数（もしくは複数）種類の代謝物または単数（もしくは複数）種類の構造的アナログであることが示唆される。本発明は、新規なレセプターをコードするＤＮＡ、レセプターを発現するための発現ベクター、そのような発現ベクターで形質転換された細胞、ならびにそのような発現ベクターおよびリポータ−ベクターで共形質転換された細胞を提供する。このリポータ−ベクターは、レセプターによる転写の関節を監視するためのものである。本発明は、さらに、レセプターを直接または間接的に活性化し得る化合物のためのスクリーニングにおいてそのような共形質転換された細胞を使用する方法を提供する。

本発明は、さらに、他のレチノイドレセプターをコードするＤＮＡを同定するための一末鎖核酸プローブを提供する。

本発明は、さらに、本発明のレセプターを作製する方法を提供する。これは、適切な宿主生物中でレセプターをコードするＤＮＡを発現させることによって行われる。

本発明のレセプターが存在する動物細胞は、レチノイドの存在を調べるための液体のアッセイに使用され得る。本発明の動物細胞は、治療に有効と思われる化合物をスクリーニングするためにも使用され得る。このスクリーニングは、これらの化合物の結合能力および／または本発明のレセプターによるトランス活性化（即ちトランス作用転写活性化）を促進する能力に関して行われる。

以下にさらに詳しく記載するように、本発明のレセプターは、遺伝子の転写を調節する。これは、レセプターがホルモン応答エレメントに結合した時に生じる。

ホルモン応答エレメントは、このような遺伝子のためのプロモーターに対して作動可能に位置しており、このことによって、そのような調節が生じる。本発明の実施で使用を意図するホルモン応答エレメントとしては、ＴＲＥｐ−β−レチノイン酸応答エレメント、およびエストロゲン応答エレメント、ならびに、非常に関連のあるエレメント、例えば１９８９年１１月１６日出願の出願箪４３８．７５７号および１９８９年３月１７日出願の出願第３２５．２４０号に開示されたエレメントがある。

図面の簡単な説明図１は、マウスＲＸＲ−ａ　（ｍＲＸＲα）　のＤＮＡ結合ドメイン（ｒＤＮＡＪ）およびリガンド結合ドメイン（ｒＲＸＪ）を、ヒトレチノイン酸レセプター −α（ｈ　ＲＡＲα）、ヒトエストロゲンレセプター（ｈＥＲ）、ヒト甲状腺ホルモンレセプター−β（ｈＴＲβ）およびヒトグルフフルチコイドレセブタ−（ｈＧＲ）の対応する各ドメインと比較して、アミノ酸同一性（即ち相同性）の程度を示している。

図２は、ヒトＲＸＲ−α（ｈＲＡＲα）のＤ　Ｎ　Ａ結合ドメイン（ｒＤＮＡＪ）およびリガンド結合ドメイン（「Ｌ　Ｉ　ＧＡＮＤＪ）を、ヒトレチノイン酸レセプター−β（ｈＲＡＲβ）、ヒトレチノイン酸レセプター−７（ｈＲＡＲγ ）、ｈＴＲβおよびｈＲＸＲαの対応する各ドメインと比較して、アミノ酸同一性（即ち相同性）の程度を示している。

図３は、ｍＲＸＲαのＤＮＡ結合ドメイン（ｒＤＮＡＪ　）およびリガンド結合ドメイン（ｒＲＸＪ）を、マウスＲＸＲ−β（ｍＲＸＲβ）、マウスＲＸＲ−７（ｍＲＸＲ７）およびｈＲＸＲαの対応する各ドメインと比較して、アミノ酸同一性（即ち相同性）の程度を示している。

図４は、レセプター発現ベクターであるＡ５Ｃ−ＲＸＲ−αで共形質転換され、かつ種々の濃度のレチノイン酸を含有する培地中に存在する牛イロシ１ウジｌウバエ５ｃｈｎｅｆｄｅｒ系２　細胞中のリポータ−ベクター（ＡＤＨ−ＴＲＥ　ｐ−ＣＡＴ）からのＣＡＴ産生を示す。

図５は、異なるビタミンＡ代謝物を含有する培養中の哺乳動物細胞中のｈＲＸＲ −αとｈＲＡＲ−αの転写活性化作用の差を示す。

図６は、図５と同様に、レチノイン酸または異なる合成レチノイドを含有する培養中の哺乳動物細胞中のｈＲＸＲ−αとｈＲＡＲ−αの転写活性化作用の差を示す。

図７は、ｈＲＸＲ−αとｈＲＡＲ−αの、これらのレセプターが生じる培養液中の哺乳動物細胞中のレチノイン酸に対する投与量応答効果の差を示す。図８は、マウスＲＸＲ−α（ｍＲＸＲα）、？ウスＲＸＲ−β（ｍＲＸＲβ）およびマウスＲＸＲ−７（ｍＲＸ　Ｒγ）間の、このようなレセプターを発現する培養液中の哺乳動物細胞中のレチノイド酸（ＲＡ）に対する投与量応答効果の差を示す。

図９は、ｍＲＸＲα、ｍＲＸＲβおよびｍＲＸＲ７間の、このようなレセプターを発現する培養液中の哺乳動物細胞中の３．４−ジデヒドロレチノイン酸（ｄｄＲＡ）に対する投与量応答効果の差を示す。

発明の詳細な説明本発明は、新規なポリペプチドに関し、その特徴は以下の通りである。

（１）単数（または複数）種類のレチノイドの存在に対して応答性を有しており、これによって、関連する単数（または複数）の遺伝子の転写を調節すること；（２）９個のＣｙｓ残基を有する約６６個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有しており、このＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）ｈＲＡＲ−αのＤＮＡ結合ドメインに対する約６５％未満のアミノ酸同一性、（ｂ）ｈＴＲ−βのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性、および（ｃ）ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性を有すること；ならびに（３）配列番号７に記載の配列を含有しないこと。

本発明の新規なポリペプチドレセプターは、さらに、種々の特徴を有し得る。例えば、これらのレセプターが存在しない場合ならびに／またはレチノイン酸およびレチナールが存在しない場合の転写速度と比較して、構築物中の標的遺伝子の転写速度を増加させることである。この構築物は、これらのレセプターによる転写活性化のためにホルモン応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含有する。上記標的遺伝子の転写は、培養中の動物細胞中で測定される。その培地は、約５　Ｘ　１０−７Ｍを越える濃度のレチノイド酸またはレチナールを含有する。

これに代わるものとして、本発明のポリペプチドレセプターは、さらに、連続ヌクレオチド配列によりコードされるという特徴を有し得る。この連続ヌクレオチド配列は、配列番号２　［ｈＲＸＲαコに示す１位〜４６２位のアミノ酸、配列番号４［ｍＲＸＲαコに示す１位〜４６７位のアミノ酸または配列番号６　［ｍＲＸＲγコに示す１位〜４６３位のアミノ酸の配列と実質的に同一のアミノ酸配列をフードする。

さらにこれに代わるものとして、本発明のポリペプチドレセプターは、他の連続ヌクレオチド配列によりコードされるという特徴を有し得る。この連続ヌクレオチド配列は、配列番号２　［ｈＲＸＲαのＤＮＡ結合結合ドメイン水す１３５位〜２００位のアミノ酸、配列番号４　［ｍＲｘＲαのＤＮＡ結合結合ドメイン水す１４０位〜２０５位のアミノ酸または配列番号６　［ｍＲＸＲγのＤＮＡ結合結合ドメイン水す１３９位〜２０４位のアミノ酸の配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。

さらにこれに代わるものとして、本発明のポリペプチドレセプターは、さらに他の連続ヌクレオチド配列によりコードされるという特徴を有し得る。この連続ヌクレオチド配列は、配列番号１　［ｈＲＸＲα］に示す７６位〜１４６４位のヌクレオチド、配列番号ａ　［ｍＲＸＲα］に示す１８１位〜１５８１位のヌクレオチドまたは配列番号３　［ｍＲＸＲγ］に示す１２３位〜１５１４位のヌクレオチドと実質的に同一である。

本明細書中に使用されているように、用語「レチノイド」とは、ビタミンＡ活性合成アナログおよびこれらの種々の代謝物を有する天然の化合物を言う。レチノイドは、頭部と末端とが互いに連結された４個のイソプレノイド単位により構成される化合物のクラスである。多くのレチノイドが、例えばＴｈｅ　Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓと題する２巻の論文（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ。

１９８４）において５ｐｏｒｎ、　ＲｏｂｅｒｔｓおよびＧｏｏｄ＋＊ａｎにより記載されているように、確認されている。これに関しては、さらに詳しく説明する。レチノイドの例としては、レチノール、レチニルアセテート、レチニルへキサデカノエート、α−レチニル、４．１４−レトロレチノール、デオキシレチノール、アンヒドロレチノール、３．４−ジデヒドロレチノール、１５．１５− ジメチルレチノール、レチニルメチルエーテル、レチニルフォスフェート、マンノシルレチニルフォスフェート、レチノールチオアセテート、レチナール（レチナルデヒド）、３．４−ジデヒドロレチナール、レチニリデンアセチルアセトン、レチニリデンー１．３−シクロペンタンジオン、レチナールオキシム、レチナルデヒドアセチルヒドラゾン、レチノイン酸、４−ヒドロキシレチノイン酸、４ −オキソレチノイン酸、５．６−ジヒドロレチノイン酸、５．６−ニポキシレチノイン酸、５．８−エボキシレチメイン酸、レチノイン酸の開環Ｃ２１１アナログ（即ち、（オール一旦−３，７，１１，１５−テトラメチル−２，４，６，８，１０，２，１４−へキサデカへブタエン酸）、７．８−ジデヒドロレチノイン酸、７．８−ジヒドロレチノイン酸、”ＣＩＳ酸″（旦、旦）−３−メチル−５ −（２，６，６−ドリメチルー２−シクロヘキセン−１−イル）−２，４−ペンタンジオル酸、”ＣＩ７酸″（（Ｌ旦、旦）−５−メチル−７−（２，６，ａ− トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−２，４，６−ヘパトリエン酸）、Ｃ２２酸”（１４゛−アポ−β、φ−カロチン酸）、レチノイン酸エステル（例えば、メチルエステル、エチルエステルなど）、レチノイン酸エチルアミド、レチノイン酸２−ヒドロキシエチルアミド、メチルレチノン、″Ｃ１８″ケトン ″（岨、Ｈ４）−６−メチル−８−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−３，５，７−オクタトリエン−２−オン）などがある。

さらに、本発明によれば、上記のように新規なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が提供される。

さらに本発明によれば、培養中の動物細胞中で機能し、これによって、上記ポリペプチドを作製するＤＮＡ構築物が提供される。

本発明のさらに池の実施態様によれば、（上記のように）ＤＮＡ構築物で形質転換された培養中の動物細胞が提供される。これらのＤＮＡ構築物は、上記細胞中で機能し、これによって、レセプターポリペプチドを作製する。このレセプターポリペプチドの作製は、上述のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントの発現によって行われる。

本発明の実施で使用を意図する動物細胞の中には、リポータ−ベクターでさらに形質転換されるものがある。このリポータ−ベクターは、（ａ）細胞中で機能し得るプロモーター、（ｂ）ホルモン応答エレメント、および（Ｃ）　リポータ−タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを有する。

このリポータ−タンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、上記プロモーターに作動可能に連結されており、これによって、上Ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａセグメントの転写が行われる。

上記ホルモン応答エレメントは、上記プロモーターに、その活性化のために作動可能に連結されている。

本発明によれば、さらに、上記のレセプターポリペプチドの転写活性化特性を制御する化合物の能力を試験する方法が提供される。この方法は、リポータ−ベクターおよびレセプターポリペプチドを含有する細胞を上記化合物に接触させて、リポータ−タンパク質の有無を調べるアッセイを行うことを包含する。このリポータ−ベクターおよびレセプターポリペプチドは、上記のようなものである。

本発明のさらに他の実施態様によれば、本発明のレセプターに関連するレセプターをフードする遺伝子を同定するために使用され得る種々のプローブが提供される。これに関しては、以下の実施例ＶおよびｖＩで特に記載する。特に、本発明は、標識された一本鎖核酸を提供する。この核酸は、以下のものから選択された任意の２０個以上の連続する塩基と実質的に同一の配列を有する少なくとも２０個の連続する塩基の配列を含む。

（ｉ）配列番号１　［ｈＲＸＲ−α］に示すＤＮＡの、２位から１８６１位までの塩基、または（ｉ　ｉ）配列番号２　［ｍＲＸＲ−ａコに示すＤＮＡの、２０位から２０９５位までの塩基、または（ｔｉｔ）配列番号３［ｍＲＸＲ−７コに示すＤＮＡの、１５位から１６５３位までの塩基、または（ｆｖ）　（ｆ）、（ｉ　ｉ）または（ｉ　１　ｌ）による配列の内の何れかひとつの相補体。

本明細書に使用されているように、用語「標識された一本鎖核酸配列」とは、他の改変されていない配列中から容易に検出され得る、ある種のものを付加して「標識された」配列を提供することによって改変された一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を言う。標識の例としては、放射性標識（例えば、３２ｐ、３５３）、酵素標：ａ（例えば、ビオチン）などがある。

本発明の実施で使用を意図する好ましいプローブは、上記の配列から選択される少なくとも約１ｏｏ個の連続する塩基を有する。特に好ましいプローブは、約１９８個から数百側の範囲のヌクレオチドを有する。なぜならば、配列が長くなるほど、選択範囲が広くなるからである。

本発明はまた、上記のレセプターポリペプチドを作製する方法を包含する。この方法は、発現ベクターで形質転換される適切な宿主細胞を培養することを包含する。この発現ベクターは、上記細胞中で機能し得、これによって、レセプターポリペプチドをフードするＤＮＡを発現させる。本発明の実施で使用を意図する適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞などがある。大腸菌が現在好ましい細菌の橿である。本発明の方法に使用され得る多くの発現ベクターは、何れも当業者に公知のものである。これらの発現ベクターには、原核発現ベクターｐＮＨ８Ａ、　ｐ＋ＪＨ１６ＡおよびｐＮＨ１８Ａがあり、これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　ＵＳＡより入手可能である。

本発明に関するさらに詳しい情報は、以下の非限定的実施例オよび寄託の説明にあるように提供される。

実施例実施例！ｈＲＡＲ−αをフードするＤＮＡのＤＮＡ結合ドメインを含むＫｐｎｌ／５ａｃｌ制限フラグメント（５０３ｂｐ）　［Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０．６２４　（１９８７）；同一出願人の１９８８年１１月３０日出願の米国特許出願！２７６．５３６号；および欧州特許出願系０３２５８４９号を参照のこと：これらは全て本明細書中に援用されるコをニックトランスレー／−Ｊンして、λ−ｇｔｌｌヒト肝臓ｃヒトＮＡライブラリー（にｙａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｔ　２４．５５５　（１９８５））を低い緊縮条件でスクリーニングするために使用した。ハイブリダイゼーション混合物は、３５％のホルムアミド、ＩＸのデンハート溶液、５Ｘｔ７）　５ＳＰＥ　（Ｉｘ）ＳＳＰＥｌｔ、０．１５　ＭノＮａＣ１，１０ｍＭ（ＤＮａ２ＨＰＯ４およびｌｄ　ＥＤＴＡ”、８る）　、０．１％ノＳＤＳ、　１０％のデキストラン硫酸、１゜Ｏｍｇ／ＩＩｔの変性サケ精子ＤＮＡおよび１０’ｃｐｍの［３２Ｐコにより標識されたプローブを含有していた。２重ニトロセルロースフィルターを、４２℃で１６時間ハイブリダイズして、２ｘのＳＳＣ＜１ｘのＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣ１および０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである）および０．１％のＳＤＳで２５℃にて１５分間１旦洗浄し、そして、２ＸのＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中で３０分間５５℃にて２回洗浄した。これらのフィルターに、増感板を用いて、−７０’Ｃで３日間オートラジオグラフィーを行った。

陽性のクローンを単離し、これをｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｓｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｅｏｎｓｉｎ、　ＵＳＡ）にサブクローニングし、制限マツプし、そして、種々のサイズの制限フラグメントにしてＭ１３＋５ｐ１８およびＭ１３ｓ＋ｐ１９のシーフェンシングベクターに再度サブクローニングした。ＤＮＡ配列を、ジデオキシ法により、５ｅｑｕｅｎａｓｅ”　シークエンシングキノト（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅ＋５ｆｃａｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、０ｈｉｏ、　ＵＳＡ）を用いて決定し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐプログラム（Ｄａｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１２．３８７　（１９８４））により分析した。固有のレセプター様配列を同定し、λ−ＨＬ３−１と称することとした。

λ−ＨＬ３−１をハイブリダイゼーンコンブローブとして使用し、これによって、λ−ｇｔｌＯヒト腎臓ｃヒト　Ｎ　Ａライブラリー（Ａｒｒ　ｉｚａら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３７．２６８　（１９８７））を再度スクリーニングした。この λ−ｇｔｌｏヒト腎＠　ヒトＤ　Ｎ　Ａライブラリーは数個のクローンを産生じた。その内の最長のクローンの配列決定を行い、λ−ＸＲ３−１と称することとした。λ−ＸＲ３−１からＥｃｏＲＩ−フラグメントとして得られたＤＮＡ配列は、配列番号１　［ｈＲＸＲａコに示す配列を宵する。

マウス全胚ライブラリーを上記の全長のｈＲＸＲ−αクローンで同様にスクリーニングすることによって、ヒトＲＸＲ−αレセプターの異なるイソ豐をコードする配列がさらに得られた。さらに、マウスのこの相同体（マウスＲＸＲ−α）もまたこのようにして同定された。

したがって、交尾後（ｐ、ｃ、）　１４．５０のマウス胚からｍＲＮＡを単離し、これをｃＤＮＡに翻訳し、ＥｃｏＲ１／Ｎｏｔｌリンカ−と結合し、そして、クローニングベクターλ−Ｚ　Ａ　Ｐ　（Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ）の固有のＥｃｏＲ１部位に挿入した。得られたライブラリーを、３２ｐ標識の全長のｈＲＸＲ −αをプローブとして用いて、緊縮条件を低くしてスクリーニングした。

得られたクローンのＤＮＡ配列を、配列番号３　［ｍＲＸＲα］および配列番号５　［ｍＲＸＲγ］として記載する。

実施例！！ｍＲＸＲ−α、ｈＲＡＲ−α（ヒトレチノイン酸レセプター−α）、ｈＥＲ（ヒトエストロゲンレセプター）、ｈＴＲ−β（ヒト甲状腺ホルモンレセプター−β ）およびｈＧＲ（ヒトグルココルチコイドレセプター）のアミノ酸配列を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐプログラム″Ｂｅ５ｔｆｉｔ”　（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、前出）を用いて整列させた。ｍＲＸＲ−αと他のレセプターとの非常に類似した領域、即ち、６６〜６８個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを、アミノ酸同一性パーセントとして図１に模式的に示す。

同様に、ヒトＲＡＲ−α（ｈＲＡＲα）、ヒトＲＡＲ−β（ｈＲＡＲβ）、ヒトＲＡＲ−γ　（ｈＲＡＲγ）、ヒトＴＲ−β（ｈＴＲβ）およびヒトＲＸＲ−ａ　（ｈＲＸＲａ）（７）７　ミ／酸配列を整列させた。図１で示したように、ｈＲＡＲ−αと他のレセプターとの非常に類似した領域をアミノ酸同一性パーセントとして図２に模式的に提示する。

さらに他のレセプターの比較を図３に示す。したがって、マウスＲＸＲ−ａ　（ｍＲＸＲａ）　、マウスＲＸＲ−β（ｍＲＸＲβ）、マウスＲＸＲ−７（ｍＲＸＲγ）およびヒトＲＸＲ−α（ｈＲＸＲａ）のアミノ酸配列を整列させて、アミノ酸同一性パーセントを図３に模式的に示す。

ｍＲＸＲ−αおよびｈＲＸＲ−αの双方のＤＮＡ結合ドメインは、他のレセプター（ｈＲＡＲ−αおよびｆｉＴＲ−βなど）と比較して、かなりよく保存されているが、リガンド結合ドメインの保存程度は低い（図１および図３参照）。レセプターのレチノイン酸レセプターサブファミリーとｈＲＸＲ−αとを比較すると、ｈＲＸＲ−αが既知の何れかのレチノイドレセプターに関連することを示唆するような証拠は得られない（図２）。

実施例ＩＩ＋キイロシコウジＪウバエ５ｃｈｎｅｉｄｅｒ系２（ｒｓ２Ｊ）細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｅ履ｂｒｙｏ１．　Ｅｘｐ、　Ｍｏｒｐｈｏｌ、　２７．３５３　（１９７２））は容易に入手可能であり、これを、３５ＩＩ１１２の各培養ディツシュに付き２　ｘ　１０６個の割合で植えて、５ｅｈｎｅｉｄｅｒ培地（ＧＩＢＣＯ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＵＳＡ）中で維持した。この５ｃｈｎｅｉｄｅｒ培地には、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１２％の熱不活性化ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　５ａｎｔａ　Ａｎａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）が補足されていた。これらの細胞を、リン酸カルシウム沈澱法（Ｋｒａｓｎｏｗら、Ｃａ１１５７、１０３１　（１９８９））により、各ディツシュに付き１０μｇのプラスミドＤ　Ｎ　Ａを用いて一時的に共トランスフェクトした。各ディツシュに付き１０μｇのプラスミドＤＮＡとは、即ち、各ディツシュに付き４．５μｇのレセプター発現ベクターまたは対照の構築物（ｈ　ＲＸ　Ｒ−αを産生しない）；各ディツシュに付き０．５μｇのリポータ−プラスミドまたは対照のリポータ−プラスミド；各ディツシュに付き０゜５μｇのリファレンスプラスミド；および４．５μｇの不活性プラスミドＤＮＡである。

レセプター発現ベクターＡ５Ｃ−ＲＸＲ−α（各ディツシュに付き４５μｇ）では、レセプターｈＲＸＲ−αは、ンゴウジ１ウバエのアクチン５Ｃプロモーター（Ａ　５　Ｃ；　Ｔｈｕｍ＋ｇｅｌら、ｑｅｎｅ　７４：　４４５　（１９８ｇ））の制御下で８２細胞中に構成的に発現される。このプロモーターによって、 λ−ＸＲ３−１のＥｃｏＲ１部位結合挿入物の転写が推進される。対照のベクターＡ５Ｃ−ＲＸＲ，，ｖ　（これもまた４、５μｇ／ｍｌ）では、λ−ＸＲ３− １からのＥｃｏＲ１部位結合挿入物が、逆向きの配回（即ち、ノンコーディングまたはナンセンスコーディング）で挿入される。

Ａ５Ｃ−ＲＸＲ−αの作製の際には、最初に、Ａ５Ｃの固有のＢａｍ旧部位において、５−ＧＡＴＣＣＧＡＴＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＡ。

の配列のリンカ−を挿入し、次に、リンカ−のＥｃｏＲ１部位（上記下線部）において、λ−ＸＲ３−１のＥｃｏＲ１部位結合挿入物を挿入した（実施例■膠原）。

リポータ−プラスミドＡＤＨ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ　（各ディツシュに付き０．５ μｇ）は、パリンドロームの甲状腺ホルモン応答ニレメンｈＴＲＥｐを含有している。このＴＲＥｐは、５°−ＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴ［（Ｇｌａｓｓら、Ｃｅ１ｌ　５４．　３１３　（１９８８）：　ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＥＶａｎｉ９、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８６．３４９４　（１９８９）］の配列を有しており、バックグラウンドとしてのｐＤ３３−ＡＤＨ−ＣＡＴ　（Ｋｒａｓｎｏｗら、Ｃｅ１ｌ　５７．１０３１　（１９８９））のく転写開始部位に対して）−３３位に挿入される。

ｐＤ３３−ＡＤＨ−ＣＡＴは、キイロショウジョウバエのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の遠位のプロモーターを持つプラスミドである。この遺伝子は、転写のために機能できるように、ｍｍ　（大ｉ［１ｉ）のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｒｃＡＴＪ　）遺伝子、即ち１標タンパク質であるＣＡＴの遺伝子に連結されている。ＡＤＥ［−ＴＲＥｐ−ＣＡＴの作製の際には、５°−ＣＴＡＧＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣ− ５’の配列を有するすりゴヌクレオチドを、ｐＤ３３−ＡＤＨ−ＣＡＴの一３３位のＸｂａ１部位に挿入する。ｐＤ３３−ＡＤ）Ｉ−ＣＡＴは、ＴＲＥｐを持たない場合には、対照のリポータ−（即ちバックグラウンドの）プラスミドとして機能した。

アクチン５Ｃプロモーターにより推進されるβ−ガラクトシダーゼをコードするリファレンスプラスミドもまた、ｐＧＥＭＤＮＡ（各ディツシュに付き４．５μ ｇ＞　（Ｐｒｏ＋＊ｅｇａ、　Ｍａｄｉｓ。

ｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）と共にトランスフェクト（各ディツシュに付き０５ μｇ）され、これによって、Ｄ　Ｎ　Ａの最終１度が各ディツシュに付き１０μ ｇとされた。リファレンスプラスミドは、Ｂａｍ旧部位結合β−ガラクトシダーゼをコードするセグメントをＡ５Ｃの固有のＢａｇ旧部位に挿入することによって、作製された。リファレンスプラスミドの目的は、トランスフェクション効率の結果を基準化することであった。

トランスフェクションから２４時間後に、種々のレチノイドを培養中に加えた。

レチノイドをジメチル−スルホキシドおよび／またはエタノール中に溶解し、得られた溶液を０．１％Ｖ／Ｖの培養培地に加えた。培養培地中のレチノイドの初期濃度は１０−’Ｍであった。但し、図４に示すデータの基礎となる実験は例外であり、この実験は、種々のレチノイン酸濃度で行われた。

対照試験では、培地中の０．１％Ｖ／Ｖのエタノールを、レチノイド溶液の代わりに用いた。

培養物を、レチノイド添加後に暗所で３６時間維持し、そして回収した。レチノイドに関連する実験の他の全ての部分は、弱い光の下で行われた。

細胞溶解物を遠心した。β−ガラクトシダーゼを調べるために、上清のアッセイを、ＨｅｒｂｏｍｅｌらのＣｅ１ｌ　３９．６５３−６６２　（１９８４）に従って行い、そして、ｕｎ　ｉ　ｔ　ｓ／ｍ　ｌ単位のβ−ガラクトシダーゼ活性を算出した。上清のＣＡＴアッセイ用分析物（β−ガラクトシダーゼ活性に基準化されている）を７５ユニット一時間（「ユニット」とは、β−ガラクトシダーゼ活性のユニットを言う）インキュベートした。これは、ＧｏｒｍａｎらのＭｏ１．　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏｌ、　２．１０４４　（１９８２）に記載のように行われ、通常３０分に付き１５０ユニツトである。

ＡＤＨ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴの代わりに対照のリポータ−を用いた何れの実験においても、ＣＡＴ発現のｈＲＸＲ−α依存活性化は見られなかった。同様に、Ａ５Ｃ−ｈＲＸＲの代わりに対照のプラスミドであるＡ　５　Ｃ−ｈ　ＲＸ　Ｒ，、、を使用した試験でも活性化は本質的に観察されなかった。

レチノイドで処理した細胞中のＣＡＴ活性の誘導を、処理していない（即ちエタノールのみで処理した）細胞中での誘導と比較した。誘導は、レチノイン酸（ＲＡ）　、レチナール（ＲＡＬ）、レチノールアセテート（ＲＡＣ）　、レチノール（ＲＯＨ）およびレチノールパルミテート（ＲＰ）存在下で測定された。リポータ−ベクター（ＡＤＨ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ）からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の産生を、半イロノ曹つジコウバエ５ｃｈｎｅｉｄｅｒ系２細胞中で測定した。これらの細胞は、ｈＲＸＲ−α発現ベクターであるＡ５Ｃ−ＲＸＲ−αで共形質転換され、そして、レチノイン酸（ＲＡ）、レチナール（ＲＡＬ）、　レチノールアセテート（ＲＡＣ）、レチノール（ＲＯＨ）またはレチノールパルミテート（ＲＰ）を１０−６Ｍの濃度で加えた培地に接触するようにされたものである。観察された相対的誘導は、ＲＡ＞ＲＡＬ＞ＲＡＣ＞ＲＯＨ＞ＲＨであった。

図４には、上記の段落に記載したようにＣＡＴ活性の「誘導倍率」の結果が示されている。即ち、多（の異なる濃度のレチノイン酸を用いることによって、細胞の培地中のレチノイン酸に対する（昆虫細胞中のＴＲＥｐでのトランス活性化における）ｈＲＸＲ−αの「投与量応答効果」が示されている。

実施例＋７本実施例では、実施例ＩＩ＋で記載のものと類似の実験を説明しつつ、ｈＲＡＲ −αおよびｈＲＸＲ−αの特性が非常に異なること、特に、プロモーターからの転写のトランス活性化に関して異なるということを明らかにする。

哺乳動物レセプター発現ベクターであるＲＳ−ｈＲＡＲ−αからは、ラウス肉腫ウィルスのプロウィルスＤＮＡの５′−ＬＴＲプロモーターの制御下でｈＲＡＲ −αが産生される。この哺乳動物レセプター発現ベクターであるＲ３−ｈＲＡＲ −αは、ＧｉｇｕｅｒｅらのＮａｔｕｒｅ　３３０．６２４　（１９８７）；同一出願人の１９８８年１１月３０日出願の米国特許出願！２７６、５３６号；および欧州特許出願系０３２５８４９号に記載されており、これらは全てこれによって本明細書中に援用される。

レセプター発現ベクターであるＲ９−ｈＲＸＲ−αは、Ｒ３−ｈＲＡＲ−ｆｆの場合と同様に、λ−Ｘ　Ｒ３−１の、ＥｃｏＲ１部位が結合したｈＲＸＲ−αをコードするセグメントをプラスミドｐＲ３中に挿入することによって、構築される（Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｃｅ１ｆ　４６．６４５　（１９８６））。

対照プラスミドであるｐＲ３ｎｓは、レセプターをコードする配列の代わりに挿入されたナンセンスコーディング配列を有するｐＲ３である。

リポータープラスミトテあるδ−ＭＴＶ−Ｔ［１Ｅｐ−ＣＡＴは、ＴＲＥｐｌＭＣＡＴとしても知られており、これもまた記載されている（ＵＩＩｌｅｓｏｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６．　２６２　（１９８８）、前出のＴｈｏＩｌｐｓｏｎおよびＥｖａｎｓ　、さらにＵ＋＊ｅｓｏｎｏおよびＥｖａｎｓ、　Ｃｅ１ｌ　５７．　１１３９　（１９８９）も参照のこと）。対照のリポータ−は、δ− ＭＴＶ−ＣＡＴと称されており、これは、実質的にはＴＲＥｐを除去したδ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴである。これを６−！＃ＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ＋；Ｄ代わリニ用イタとコロ、何れかのレチノイドまたはレチノイドアナログを持つレセプターの何れにおいてもＣＡＴ活性は見られなかった。

リファレンスプラスミドであるＲＳ−β−ガラクトシダーゼもまた、既知のものである。このＲ３−β−ガラクトシダーゼは、Ｒ５−ｈＲＡＲ−ａおよびＲＳ− ｈＲＸＲ−αと実質的ニ同一であるが、レセプターをフードするセグメントの代わりにβ−ガラクト／ダーゼをコードするセグメントを有する。

ＣＶ−を細胞の培養、共トランスフェクション（リポータ−プラスミド、レセプター発現プラスミドもしくは対照プラスミド、リファレンスプラスミドおよび不活性プラスミドＤＮＡを用いる）、およびＣＡＴアッセイは、全て、ＵｍｅｓｏｎｏらのＮａｔｕｒｅ　３３６．２５２　（１９８８）に記載のように行われた。共トランスフェク／−ＪンおよびＣＡＴアッセイは、実施例ＩＩ＋に記載のものと類似の方法で実施された。実施例ＩＩ＋の実験と同様に、弱い光が使用された。

リポータープラスミ）’　（６−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ）、リファレンスプラスミド、対照プラスミド（即ちレセプターを発現しないもの）、およびレセプタープラスミド（Ｒ３−ｈＲＡＲ−αまたはＲＳ　−ｈ　ＲＸ　Ｒ−α）を用いて共形質転換されたＣＶ−１細胞を、ＲＡ、ＲＡＬ％ＲＡＣＳＲＯＨＳＲ，Ｐ　（これらは天然のビタミンＡ代謝物である）、またはレチノイドを含まないエタノールに接触させたところ、図５に示す結果が得られた。

この図には、ＣＶ−１系のサル腎臓細胞中のリポータ−プラスミドからのＣＡＴ産生が示されており、これらの細胞は、ｈＲＸＲ−α産生発現ベクターであるＲ３−ｈＲＸＲ−αまたはｈＲＡＲ−α産生発現ベクターであるＲ３−ｈＲＡＲで共形質転換されたものである。実験は、ＲＡ、ＲＡＬ、ＲＡＣ％Ｒ○ＨまたはＲＰを濃度１０−６Ｍとなるように添加した培地中で実施された。「−」の上に位置するバーは、細胞がレチノイドに接触しない（即ちレチノイドを含まないエタノールに接触する）場合のＣＡＴ産生レベルを示す。斜線を施したバーは、レセプターが発現されることのない対照の発現ベクターをレセプター発現ベクターの代わりに用いた場合のＣＡＴ産生レベルを示す。斜線のないバーは、レセプター産生発現ベクターを用いた場合のＣＡＴ産生レベルを示す。いずれの場合にも、レチノイドをエタノール溶液として、培地中の溶液の体積が０．１％（Ｖ／Ｖ）となるように加えた。レチノイドを含まないエタノールは０．１％Ｖ／Ｖとなるように加えられた。これらの結果を、実験で観察された最大反応、即ちＲＡに対するｈＲＸＲ−αのパーセンテージとしてグラフに示した。

図６では、上記の段落で記載したように実施した実験の結果が提供されているが、ただし、これらの実験では、ＲＡＬ。

ＲＡＣ，ＲＯＨおよびＲＰの代わりに合成レチノイドを初期濃１ｆｆｉｌｏ−’ Ｍで使用した。この合成レチノイドは、４−（５，６，７，８−テトラヒドロ− ５，５，８，８−テトラメチル−４−ヨード−２−アントラセニル−安慝香酸く ”Ｒ１”）、エチル−Ｐ−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフチル）−１−プロヘニル］−安息香ａｌ　（”　Ｒ２′″）　、エチル−オール　トランス−９−〈４−メトキン−２，３，６−）ジメチル）−３，７−シメチルー２．４．５．８−７ナテトラノエート（”Ｒ３”）およびエチル−オール　トランス−９−（４−メトキン−２，３，６−トリメチル）−３，７−シメチルー２．４．５゜８−ノナテトラエン酸（ ”Ｒ４”）である。この図では、Ｃｖ−１細胞中ノＩＪポータープラスミド（δ −ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ）からのＣＡＴ産生が示されており、各ＣＶ−１細胞は、ｈＲＸＲ−α産生発現ベクターであるＲ３−ｈＲＸＲ−αまたは構成性ｈＲＡＲ−α産生発現ベクターであるＲ３−ｈＲＡＲで共形質転換されている。実験は、ＲＡ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４を濃度１０−８Ｍとなるように加えた培地中で実施される。「−」の上に位置するバーは、細胞がレチノイドに接触しない場合のＣＡＴ産生レベルを示す。斜線を施したバーは、レセプターが発現されることのない対照の発現ベクターをレセプター発現ベクターの代わりに用いた場合のＣＡＴ産生レベルを示す。斜線のないバーは、レセプター産生発現ベクターを用いた場合のＣＡＴ産生レベルを示す。

図７には、種々の濃度のレチノイン酸を用いて本実施例で記載したように実施した実験の結果が提示されている。この図では、ＣＶ−１細胞中のリポータ−プラスミド（δ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ）からのＣＡＴ産生が示されており、各ＣＶ−１細胞は、レセプター産生発現ベクターであるＲ　Ｓ　−ＲＸ　Ｒ−αまたはＲＳ　−ＲＡ　Ｒ−αで共形質転換されている。実験は、ＲＡを種々の濃度で加えた培地中で行われた。この図において、結果は、ＲＡに接触した細胞および（ＲＡを含まないエタノールのみに接触した）対照の細胞において観察された誘導倍率が示されている。

図８には、種々の濃度のレチノイン酸を、ｍＲＸＲ−α、ｍＲＸＲ−βおよびｍＲＸＲ−γをコードする発現ベクターと共に用いて上記のようにして実施した実験の結果が提示されている。

図９には、種々の濃度の３．４−ジデヒドロレチ／　イア酸（ｄｄＲＡ）を、ｍＲＸＲ−ａ、ｍＲＸＲ−βおよびｍＲＸＲ−７をコードする発現ベクターと共に用いて上記のようにして実施した実験の結果が提示されている。

実施例■ ｈＲＸＲ−α遺伝子発現の分布を決定するために、種々の成体ラット組織から単離されたポリＡ″ＲＮＡをサイズ分画し、ナイロンフィルターに移して、ｈＲＸＲ−αのｃ　ＤＮＡとハイブリダイズした。

したがって、分析した成体雄ラットの各組織に対して、全てのＲＮＡをこの組織から調製しく　Ｃｈｏｍｅｚｙｎｓｋｉおよび５ａｃｅｈｉのＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１６２．１５６　（１９８７）参照）、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーによってポリＡ゛を選択した。

１０μｇのポリＡ　”　ＲＮ　Ａを、１％アガロースホルムアルデヒドゲル電気泳動により分離して、Ｎｙｔｒａｎフィルター（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｅｌｌ）　（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌらの５ｃｉｅｎｃｅ　２３５．１２１４　（１９８７）参照）に移し、そして、ｈＲＸＲ−αをコードするλ−ＸＲ３− １のＥｃｏＲＩ挿入物に緊縮条件下でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシ１ンは、５０％のホルムアミド、５Ｘのデンハート溶液、５Ｘ（７）ＳＳＰＥ、　０．１％ノＳＤＳ、　１００ｍｇ／ｍｌノｆヶ精子ＤＮＡ、２００ｍｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ、および［３２ｐ］標識プローブを含有する緩衝液中で４２℃にて行われた。次いで、フィルターを、２ｘのＳＳＣおよび０．１％ノＳＤＳを用いて、２２℃で２回、そして５０℃で２回洗浄した。オートラジオグラフィーを、増感板を用いて、−７０℃で２４時間行った。ＲＮＡラダーサイズマーカーは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＵＳＡ）からのものである。

ラット中のＲＸＲ−αのｒｎＲＮＡの分布は、レチノイド酸レセプターの分布とは異なる発現パターンを呈する（Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０．　６２４　（１９ｇ？）；Ｚｅｌｅｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９．　７１４　（１９８９）：　Ｂｅｎｂｒｏｏｋ、Ｎａ−ｔ＊ｒｅ　３３３．６６９　（１９８８））。ラットＲＸＲ−ａのメノセーノは、約４．８ｋｂｐ（キロベースベア）の単独橿であると思われる。この種は、多くの組織中に発現される。ただし、肝臓、筋肉、肺および腎臓中に最も多く発現され、これより幾分少ないが、副腎、心臓、腸および、弾臓中にも多く発現される。

実施例ｖ１甲状腺ホルモンおよびレチノイン酸レセプター遺伝子の分子クローニング分析によって、これらの各レセプターが、数個のレセプターのイソ型をコードする別個の遺伝子サブファミリーに属することがわかる。ＲＸＲに関してもこのことが言えるかどうかを確認するために、一連のサザンブロ’ｙ　）分析を行った。制限エンドヌクレアーゼにより消化されたヒトＤＮＡを、λ−Ｘ　Ｒ３−１由来の標ｍＤＮＡフラグメントと高い緊縮条件でハイブリダイズしたところ、単独の遺伝子座が一致する同じ数のバンドが各消化において得られた。しかし、ハイブリダイゼーション条件が緩和されると、各酵素消化の産物中に他の多くのバンドが観察された。このハイブリダイゼーションパターンを注意深く観察することにより、このパターンが、ｈＲＡＲ−αに関して記載された類似の分析（Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０．６２４　（１９ｇ？＞）とは関係ないことが実証された。これらの観察によって、ヒトゲノム中にｈＲＸＲ−α遺伝子に関連する少なくとも１個の他の遺伝子座が存在していることが分かる。さらに、哺乳動物、トリ、酵母およびシボウジコラバエの種を示すゲノムＤＮＡグープロットが得られた。これまでのところ、ＲＸＲ遺伝子ファミリーは酵母以外の試験された全ての種に存在すると思われる。酵母がステロイドレセプタースーパーファミリーの何れかのメンバーを含有することは現在明らかにはされていない。

ヒトＤＮＡの分析のために、２個のヒト胎盤ゲノムＤＮＡサザンプロノトを、同一のＤＮＡ試料に対応して調製した。

各プロットを、約１２００ｂｐノ１．ｔ−ＸＲ３−１の［３２Ｐ］　Ｊ−ｍｙラグメントと、高い緊縮条件または低い緊縮条件でハイブリダイズした。このフラグメントは、前記のＤＮＡおよびリガンド結合ドメインのコーディング部分（配列番号１の４５９位〜１６３１位のヌクレオチド）を含有していた。

ズープロットを得るために、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびキイロシコウジｌウバエからのゲノムＤＮＡを、約３３０ｂｐの、λ−ＸＲ３−１の［］２Ｆ］−Ｉｇ識フラグメントに、低い緊縮条件でハイブリダイズした。このフラグメントは、ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号ｌの４５９位〜７７６位のヌクレオチド）を含有していた。サイズの異なるバンド（サイズ決定のための旧ｎｄｌｌｌにより消化されたえＤＮＡと比較して）を、種々の種において発見した。酵母、マウスおよびウサギを除く全ての種（キイロシコウジヲウバエに関しては両方を含む）のプロ。

トが、１個を越えるバンドを有していると思われた。

ヒトＤＮＡの分析のために、胎盤ＤＮＡをＢａ＋＊ＨＩ、Ｂｇｌ目、ＥｅｏＲＩ、　Ｈｉｎｄｌｌｌ、　ＰｓｔｌおよびＰｖｕ　Ｉ　［で制限し、０．８％の７ガロースゲル中で分離しく各レーンに１０μｇ）、ニトロセルロース（前出のＭｃＤｏｎｎｅｌｌらを参照のこと）に移し、以下に記載のようにハイブリダイズした。

ズープロットを得るために、キイロシヲウジ１ウバエ以外の数個の種からの、ＥｃｏＲＩにより消化されたＤ　Ｎ　Ａ　（Ｃ１ｏｎｔｅａｈ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ）を、サザンブｏ　’ｙト分析に使用した。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌにより消化されたキイロシコウジコウハエのＤＮＡもまた含まれていた。

各プロットを、実施例Ｉに記載の低い緊縮条件の緩衝液中で、もしくは同一の緩衝液にホルムアミドを５０％まで加えて改変した緩衝液中において高い緊縮条件で、４２℃にてハイブリダイズした。各低い緊縮条件のプロットを、室温で２回、そして２ｘのＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中で５０℃にて２回洗浄した。

高い緊縮条件のプロ、トを、室温で２回、２ｘのｓｓｃおよび０．１％のＳＤＳ中で洗浄し、そして６５℃にて２回、０．５Ｘのｓｓｃおよび０．１％のＳＤＳ中で洗浄した。

実施例ｖ１１ノーザン分析を、マウスＲＸＲイソ型α、βおよびγについて実施した。これは、成体組織および発生中の胚におけるこれらのレセプターの組織分布を決定するためである。

したがって、ｍＲＮＡ（１０μｇ）を、種々の成体ラット組織、および交尾後（ｐ、　ｃ、　）第１０．５２１目から第１８．５日巨までの全マウス胚から単離した。これらの試料に対して、ｍＲＸＲα、ｍＲＸＲβまたはｍＲＸＲγに特異的な領域由来の、”Ｐ−ｍ識ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブを用いて、ノーザン分析を実施した。

成体組織では、種々のＲＸＲイソ型が、特異的でありかつ重なり合った分布パターンで発現されることが認められる。

胚では、種々のイソ型が、特異的で一時的なパターンと思われるもので高度に発現される。

本発明は、その好ましい実施態様について特に詳しく説明されてきたが、本発明の精神および範囲内で変更および改変が行われ得ることは理解されるであろう。

寄託１９９０年１月３１日に、複製可能なファージスフリブ）ＳＫ二本末鎖Ｎ　Ａ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ）の試料を、その固有のＥｃｏＲ１部位に、図１に示す配列を有する１８６０ベースペアーのＥｃｏＲ１部位結合ＤＮＡを挿入した状態で、寄託した。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいて、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖ４１１ｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＵＳＡ　（−ＡＴＣＣ −）において行われた。この寄託物に割り当てられた受託番号は、ＡＴＣＣ４０７４１Ｆある。寄託されたＤＮＡは、ｐｓＫ　（ｈＲＸＲ−ａ）と称される。

ファージスクリプトＳＫ二本鎖ＤＮＡは、改変されたＭ１３ｍｐ１ｇバクテリオファージＤＮＡ　（二本鎖）である。ｐｓＫ（ｈＲＸＲ−α）などの、ファージスクリプトＳＫ二本鎖ＤＮＡの誘導体は、Ｍｌ：１ａｐＨｌおよびその誘導体の場合と間様にしてクローニングし得る。

ｐＳＫ　（ｈＲＸＲ−α）の試料は、遅くとも本出願またはその継続出願に対する米国特許が最初に発行される日に、３７　ＣＦＲ１，８０１以下の規定によるもの以外には制限なくＡＴＣＣから公的に入手可能となるであろう。これ以外の場合には、ブダペスト条約およびこれに基づいて公布された規定に従って、試料はＡＴＣＣから入手可能となるであろう。この場合に、試料を入手できるのは、出願即ちその出願の優先権主張が提出されるかまたはそのような何れかの出願に対する特許が認可されるあらゆる国または国際機関の法律および規定に基づいて試料を受け取る権利を法的に有する全ての人である。

配列の概要配列番号１は、本明細書に開示され、ヒトＲＸＲ−α［ｈＲＸＲα］と称する新規なレセプターをコードするＥｅｏＲＩ一部位結合ＤＮＡセグメントのコーディング配列である。

配列番号２は、本明細書においてｈＲＸＲαと称する新規なレセプターのアミノ酸配列である。

配列番号３は、本明細書中に開示され、マウスＲＸＲ−α［ｍＲＸＲα］と称する新規なレセプターのヌクレオチド（およびアミノ酸）配列である。

配列番号４は、本明細書においてｍＲＸＲαと称する新規なレセプターのアミノ酸配列である。

配列番号５は、本明細書中に開示され、マウスＲＸＲ−γ［ｍ　ＲＸ　Ｒγ］と称する新規なレセプターのヌクレオチド（およびアミノ酸）配列である。

配列番号６は、本明細書においてｍＲＸＲγと称する新規なレセプターのアミノ酸配列である。

配列番号７は、ＨａｍａｄａらによりＰＮＡＳ　８５：　８２９８−８２９３　（１９ｇ９）において開示されたレセプターのヌクレオチド配列である。

このレセプターは、本明細書においてｍＲＸＲβと称するしセブターに類似している。

（鳳Ｔ：衆自う配列番号１・ｌＪｅ　Ｃ’ＴＣＡｃｅＴｅａ　ｅｆｆｌ　ＡＴα繊＝３０　Ｇｌｎ　Ｌａａ　Ｈｅｒ−Ｐｍ　Ｍｅｔ　Ａａｎ　Ｐｒ。′Ｔ″′″″″′″″Ａ″ｃｇａｙｅａａｃ　！Ｗう　、。ｖ“−′″′榊“（ｕ　ＡＱ　Ｉｎ　Ｌ”＋０５ＴＧＣね一−ｕコ；ＣｃＣＣＴＴＴＴＣＴ丁ＴＣｍＩＣ；ＱＣＴＴ↑Ａ丁ｅｃａ τｃｃＴＧＩＴＴＴＴＩ−Ａｊ＾＾ＴτｅＩ＋シロ６配列番号２：Ｌｅｕ　Ｎｆ　Ｐｒｏ　１ａｔ　Ｌｅｕ　Ｓｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｔｙ　ＩＩｓζｌｙ　ｆｏｒ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　Ｃ１ｎ　Ｌｅｕ　ＸｉｓユＯＸＳ　尋　４５ＳｅｒＰｒｏＩｔｍ＄４−・丁）ＩＦＬｅｕＳｙ＄ｃ「ＰｎｒＩ１ｍＡ寡ｎ１ｉｌｙｂｔＧｌｙＰｒｓＰｒｖｓｏ　ｓｓ　關１５　Ｍｌ＊　ｔａｒ　Ｖｓｌ　ＩＩｓ　ｓａｔ　ｓｅｒ　ｐｒｅ　ｓａｔ　ｓｔｙ　ｐｒｖ　＋＋ｌｓ　ｔａｒ　ｋｅ　ｓｗ　ｖａｔ　Ｐ窒■ ４５　７０　７５　ｇｌＬｓｕ　Ａｓｎ　Ｃ１ｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＬＹＩ　Ｖａｌ　ｌ１ｒｏ　Ａｌａ　ＩＩｓ　Ｐｐｍ　Ｍａｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｈ　Ｎｅｔ　Ａ１■ ２５　ｕｓ　τ江　１ごｔｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙ　ｍｉｓ　Ｈｅ　ｅＷ＾Ｉｓ　Ｉ　＋ａ　ｅｙｓ　Ｇｌｙ　ＡＨムＱ　細］ｃＧｌｙ１３０　１！５　１４０コＯＬｙｓｍｉｓＴｙｒＳｌｙＶａ（ＹｙｒｋｒＣｙｓ！１ｕａｔｙｅ’ｎＬｍＧＩＹＰｈ偕ＰｈｅＬＴＩｍＣ１ｎ　Ｌｙｓ　Ｃ’ＹＩ　Ｌｍ　Ａｌｍ　ｌ＋１ｅｔ　Ｇｌｙ　１ｌｌｅｔ　ＬＷ　Ｍ＠　Ｇ−Ａｌｍ　Ｖａｌ　ＧＬｒ＋　ＧＬｕ　Ｇｌ■ ４ｏ　嘔　洩　あＡｒｇ　（ｉｎ　Ａｒｇ　ａｔｙ　ＬＹＩ　ｋｘｏ　Ａｒｃ　Ａｓｎ　ＧＩＬＩ　ＡＭ　ＣＬｕ　Ｖａｌ　ｌ：ｌｕ　ｊａｒτ？＋ｒｋｒｚｔａ　２１５　２２０４５　ｓ＃Ｐａｒｍ　ｈＩｃｒｕ　ａｓｐ　ｓｅｔ　ＩＭＩ　ｖａｔ　ａｌｕ　Ａｑ　ｌτｅ　Ｌｇｕ　ｌ：ｌｕ　Ａｉｍ　Ｇｌｕ　Ｌｓｖ２２５　２３０　Ｚｎ　２４０＋ＬｓｌｌＬＱＬ：ＩｎＬａｕＰｈ＃ＴｈｒＩｊＪＶｌｌｌＤＩＩＪＴｌ’ＰＡｌｌｌＬＷ＾「１夏ｌ１ＩＰ？＠Ｉｔｇ５５　２７５　２６０　ｚａｓＰ！１＠Ｍｙαｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｖ　Ｌｅｖ＾詩＾Ｈｅｌｎ　Ｖａｌ　ＩＩｓ　Ｌｗ　Ｌｓａ　Ｍ１＾１＠　５ｌｙ２９０　２？５　Ｘｉ力６０　Ｔｒｖ　Ａｊ／Ｉｃ１ｕ　ＬＭ　ｋＷ　ｌｉｅ＾１ｏｓｅｒリ−１ｗ　ｌ１ｌｓ　ＡｒＩ　Ｓｅｒ　ＩＩｓ＾ｌａ　Ｖｓ１３０５　！＋Ｑ　ゴ＋Ｓ　Ｘ２ｒＪＬｊｌｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ｌｅｔ＾１Ｍ中＾ｔ　Ｇｌｎ　ｋｔ　Ａｍ　ＬＭ　Ｔｈｒ　ａ＋ｕ　Ｌａｕ　ｃｌｙ７０　ｘｓｓ　詞４　又５ＣｙｓＬｅ＆ＩＡｒＩＡｌｅ＋１ｅＶａ４Ｌｅｕ〜ＡｓｎＰｒｏ＾ｕｓＳｏｒＬｙｓＣ１ｙＬｍｋｒｍ　：＋７５　シにＡｓ１ｌＰｒａＡｌｅＧｌｕＶａｔＧｌｕＡＬａＬａｓｔ＾ＱＦｕＬｙａＶａｔＴＹ＋−＾１ｍ＄ｅｒＬｍＷ３９０３９５４００Ｃ１ｕ　Ａｌ＃　７ｙｒ　ｌ：’ｙｌ　Ｌｎ　Ｎｉｌ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　ｔ、ｒｎ　Ｐ＋”ｅ　ｃｔｙ＾ＰＩ　％ｅ　Ａ１■ ５　可　ＣＩＯ４１５Ｌｙｓ　Ｌｒｕ　Ｌｓｕ　Ｌｅｕ　Ａｔ窒Ｌａｕ　Ｐｒｅ＾（ａ　ＬｅｕＡｑ　ｋｒ口ａ　Ｃ１ｙ　Ｌａｕ　ＬＷ　ｅ）ｙ４２０　４２５　４ｕ配列番号３：配列番号４：ＩＱＳａｒＬ〜”督“Ｐｒａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ喚Ｐ″Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌ″″Ｉｙ″″′！５　４０　４５４０Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｍ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｌ′Ｃ’ｎ　ＬＷＪ　Ａｌｍ　ｋｔ　Ｇｌｙ　ｓｅｔ　ＬＷＡＰＩ　Ｃ１ｕ嘔　２ｏｏ２０５ＩＩｓ　Ｃ１ｑ　Ｇｌｎ＾１−ムＩａ　Ａｓｐ　ＬＷ　Ｇ（ｎ　Ｌ＆〜Ｔｈｒ　Ｌｊ＆ｌ　Ｖａｔ　Ｃ１ｕ　Ｔｒｌ＞　ＡＬａ＾ｒ１１Ｖ＠ｌＬｅ＋ａ丁ｈｅＧｌｕＬｍＶａｌＳｕｒＬｙｓＭｅｔＡｒ１呻ｋｔＧｌｒ＋１ｌｌｅｔＡｓｐ７０　３５５　誓　扇５ｕｒＬｙｓｌｉｌｙＬｓｕｂｅＡｓｎＰｒｏＡｌａＣ１ｕＶａＬＣ１ｕ＾１ｍＬｅａＡｒｇＦｕＬＷＭ５　３９０　’５９５　４０ＧＶｓｌＴｙｒＡｌａＳｅｔＬｅｕＣ１ｕＡｌａ＋ｙｒＣＭＬＭＩＩｓＬｙｇ丁ｙｒＰｒｖＣ１ｕＩＩｎＰｒｏ　Ｃ１ｙ　Ａｒｃ　ＰＰＩＩ１　Ａ１１ｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ＾ｒｇ　Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌａｕ＾Ｎ　ｔａｒｃｎ　４２５　４ｇ。

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本発明は、新規なレセプターをコードするＤＮＡ、レセプターを発現するための発現ベクター、そのような発現ベクターで形質転換された細胞、ならびに、そのような発現ベクターおよびリポータ−ベクターで共形質転換された細胞を提供する。このリポータ−ベクターは、レセプターによる転写の調節を監視するためのものである。本発明は、さらに、レセプターを直接または間接的に活性化し得る化合物のためのスクリーニングにおいてそのような共形質転換された細胞を使用する方法を提供する。本発明はまた、本明細書に開示されている新規なレセプターと同一のクラスの他のレチノイドレセプターをコードするＤＮＡを同定するための核酸プローブを提供する。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮＡ配列であって、該ポリペプチドが、（１）単数または複数種類のレチノイドの存在に対して応答性を有しており、これによって、関連する単数または複数個の遺伝子の転写を制御すること、（２）９個のＣｙｓ残基を持つ約６６個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有しており、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）ｈＲＡＲ−αのＤＮＡ結合ドメインに対する約６５％未満のアミノ酸同一性と、（ｂ）ｈＴＲ−βのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性と、（ｃ）ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性とを有すること、および、（３）配列番号７に記載の配列を含まないことを特徴とする、ＤＮＡ配列。２．前記ポリペプチドが連続配列によりコードされ、該連続配列が、配列番号２［ｈＲＸＲ−α］に示されている１位〜４６２位のアミノ酸、配列番号４［ｍＲＸＲ−α］に示されている１位〜４６７位のアミノ酸、または配列番号６［ｍＲＸＲ−γ］に示されている１位〜４６３位のアミノ酸の配列と実質的に同一の配列をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ配列。３．前記ポリペプチドが連続配列によりコードされ、該連続配列が、配列番号２［ｈＲＸＲ−α］に示されている１３５位〜２００位のアミノ酸、配列番号４［ｍＲＸＲ−α］に示されている１４０位〜２０５位のアミノ酸、または配列番号６［ｍＲＸＲ−γ］に示されている１３９位〜２０４位のアミノ酸の配列と実質的に同一の配列をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ配列。４．連続ヌクレオチド配列を有するセグメントを含有しており、該ヌクレオチド配列が、配列番号１［ｈＲＸＲ−α］に示されている７６位〜１４６４位のヌクレオチド、配列番号２［ｍＲＸＲ−α］に示されている１８１位〜１５８１位のヌクレオチド、または配列番号３［ｍＲＸＲ−γ］に示されている１２３位〜１５１４位のヌクレオチドの配列と実質的に同一である、請求項１に記載のＤＮＡ配列。５．ｐＳＫ（ｈＲＸＲ−α）、ｐＳＫ（ｍＲＸＲ−α）またはｐＳＫ（ｍＲＸＲ −γ）である、請求項４に記載のＤＮＡ配列。６．実質的に純粋なＤＮＡ構築物であって、（ｉ）請求項１に記載のＤＮＡ配列と、該ＤＮＡ配列が作動可能に連結されている、（ｉｉ）培養中の動物細胞中における該ＤＮＡ配列の転写および前記ポリペプチドの発現のために作動可能な単数または複数の制御エレメントとを含有する、ＤＮＡ構築物。７．ＡｓＣ−ｈＲＸＲ−α、ＡｓＣ−ｍＲＸＲ−α、ＡｓＣ−ｍＲＸＲ−γ、ＲＳ−ｈＲＸＲ−α、ＲＳ−ｍＲＸＲ−αまたはＲＳ−ｍＲＸＲ−γから選択される、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。８．培養中の動物細胞であって、請求項６に記載のＤＮＡ構築物で形質転換された動物細胞。９．前記細胞が昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項８に記載の細胞。１０．前記ＤＮＡ構築物が、Ａ５Ｃ−ｈＲＸＲ−α、Ａ５Ｃ−ｍＲＸＲ−α、Ａ５Ｃ−ｍＲＸＲ−γ、ＲＳ−ｈＲＸＲ−α、ＲＳ−ｍＲＸＲ−αまたはＲＳ−ｍＲＸＲ−γから選択される、請求項９に記載の細胞。１１．リポーターベクターによりさらに形質転換され、該リポーターベクターが、（ａ）該細胞中で機能し得るプロモーター、（ｂ）ホルモン応答エレメント、および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含有しており、該リポータータンパク質をコードするＤＮＡセグメントが、該ＤＮＡセグメントの転写のために該プロモーターに作動可能に連結されており、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために作動可能に連結されている、請求項８に記載の細胞。１２．前記プロモーターがマウス乳癌ウィルスの５′−ＬＴＲプロモーターであり、前記ホルモン応答エレメントがＴＲＥｐまたはβ−ＲＡＲＥから選択され、さらに、前記リポータータンパク質が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼから選択される、請求項１１に記載の細胞。１３．前記リポーターベクターか、δ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ−ＴＫ− ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ−ＳＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣ、δ−ＴＫ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣまたはδ−ＳＶ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣから選択される、請求項１２に記載の細胞。１４．前記リポーターベクターが、ＡＤＨ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、ＡＤＨ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣ、ＴＫ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴまたはＴＫ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣから選択される、請求項１２に記載の細胞。１５．キイロショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ系２細胞である、請求項１４に記載の細胞。１６．レセプターポリペプチドの転写活性化効果を制御する化合物の能力を試験する方法であって、該方法が、レセプターポリペプチドおよびリポーターベクターを含有する細胞を該化合物に接触させてリポータータンパク質の有無を調べるアッセイを行うことを包含しており、該レセプターポリペプチドが、（１）単数または複数種類のレチノイドの存在に対して応答性を有しており、これによって、関連する単数または複数個の遺伝子の転写を制御すること、および（２）９個のＣｙｓ残基を持つ約６６個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有しており、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）ｈＲＡＲ−αのＤＮＡ結合ドメインに対する約６５％未満のアミノ酸同一性と、（ｂ）ｈＴＲ−βのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性と、（ｃ）ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性とを有することを特徴としており、さらに、該リポーターベクターが、（ａ）該細胞中で機能し得るプロモーター、（ｂ）ホルモン応答エレメント、および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含有しており、該リポータータンパク質をコードするＤＮＡセグメントが、該ＤＮＡセグメントの転写のために該プロモーターに作動可能に連結されており、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために作動可能に連結されている、方法。１７．前記接触が、さらに少なくともひとつのレチノイド種の存在下で行われる、請求項１６に記載の方法。１８．使用される前記細胞が、前記レセプターポリペプチドを発現させ得るベクターで共形質転換されたＣＶ−１細胞であり、該ベクターが、ＲＳ−ｈＲＸＲ− α、ＲＳ−ｍＲＸＲ−αまたはＲＳ−ｍＲＸＲ−γから選択されるベクターであり、およびリポーターベクターが、δ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ−ＴＫ− ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ−ＳＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、δ−ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣ、δ−ＴＫ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣまたはδ−ＳＶ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣから選択される、請求項１６に記載の方法。１９．使用される前記細胞が、前記レセプターポリペプチドを発現させ得るベクターで共形質転換されたキイロショウジョウバエＳｏｈｎｅｉｄｅｒ系２細胞であり、該ベクターが、Ａ５Ｃ−ｈＲＸＲ−α、Ａ５Ｃ−ｍＲＸＲ−αまたはＡ５Ｃ−ｍＲＸＲ−γから選択されるベクターであり、およびリポーターベクターが、ＡＤＨ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ、ＡＤＨ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣ、ＴＫ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴまたはＴＫ−ＴＲＥｐ−ＬＵＣから選択される、請求項１６に記載の方法。２０．標識された一本鎖核酸配列であって、少なくとも長さ２０個の連続する塩基を含有しており、該塩基が、（ｉ）配列番号１［ｈＲＸＲ−α］に示されているＤＮＡの、２位から１８６１位までの塩基、または（ｉｉ）配列番号２［ｍＲＸＲ−α］に示されているＤＮＡの、２０位から２０９５位までの塩基、または（ｉｉｉ）配列番号３［ｍＲＸＲ−γ］に示されているＤＮＡの、１５位から１６５３位までの塩基、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載の配列の内の何れかひとつの相補体から選択される任意の２０個以上の連続する塩基と実質的に同一の配列を有する、標識された一本鎖核酸配列。２１．３２Ｐにより標識された、請求項２０に記載の核酸。２２．レセプターポリペプチドを作製する方法であって、該ポリペプチドが、（１）単数または複数種類のレチノイドの存在に対して応答性を有しており、これによって、関連する単数または複数個の遺伝子の転写を制御すること、および（２）９個のＣｙｓ残基を持つ約６６個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有しており、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）ｈＲＡＲ−αのＤＮＡ結合ドメインに対する約６５％未満のアミノ酸同一性と、（ｂ）ｈＴＲ−βのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性と、（ｃ）ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインに対する約５５％未満のアミノ酸同一性とを有することを特徴としており、発現ベクターを含有する細胞を培養することを包含し、該発現ベクターが、該細胞中で機能し得、これによって、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させる、レセプターポリペプチドを作製する方法。２３．前記レセプターポリペプチドが、配列番号２［ｈＲＸＲ−α］に示されている１位〜４６２位のアミノ酸、配列番号４［ｍＲＸＲ−α］に示されている１位〜４６７位のアミノ酸、または配列番号６［ｍＲＸＲ−γ］に示されている１位〜４６３位のアミノ酸の配列と実質的に同一の配列を有する、請求項２２に記載の方法。２４．前記レセプターポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメインを含有しており、該ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２［ｈＲＸＲ−α］に示されている１３５位〜２００位のアミノ酸、配列番号４［ｍＲＸＲ−α］に示されている１４０位〜２０５位のアミノ酸、または配列番号６［ｍＲＸＲ−γ］に示されている１３９位〜２０４位のアミノ酸の配列と実質的に同一の配列を有する、請求項２２に記載の方法。２５．前記ＤＮＡ配列が、セグメントを含有しており、該セグメントが、配列番号１［ｈＲＸＲ−α］に示されている７６位〜１４６４位のヌクレオチド、配列番号２［ｍＲＸＲ−α］に示されている１８１位〜１５８１位のヌクレオチド、または配列番号３［ｍＲＸＲ−γ］に示されている１２３位〜１５１４位のヌクレオチドの配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載の方法。