JP3427090B2 - 新規ｄｎａ、ポリペプチドおよび組換えｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規ＤＮＡ、ポリペプ
チドおよび組換えＤＮＡに関する。さらに詳しくは、ｉ
ｎ ｖｉｖｏにおいてがん抑制作用を有するポリペプチ
ド、それをコードするＤＮＡならびに組換えＤＮＡに関
する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】がん
抑制は、古くは、あるがん細胞と正常細胞とが細胞融合
したときにしばしばそのがんの性質が消える現象として
とらえられていた。

【０００３】近年、レチノブラストーマ遺伝子（ＲＢ
１）、ｐ53遺伝子、Ｋ−ｒｅｖ−１遺伝子などのがん抑
制遺伝子が相次いで見出され、がん抑制が分子レベルで
論議されるようになった。しかし、生体内において発が
ん、がんの増殖および転移へと移行するには多段階の、
かつ複数の遺伝子変化が必要と考えられる。したがっ
て、現在知られているがん遺伝子およびがん抑制遺伝子
のみではそれらの機構をすべて説明することは困難であ
る。それらの機構を解明し、またまったく新しいがん抑
制剤を開発するためにも、新たながん抑制遺伝子の解明
が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１の
10番から 408番までのＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ、
配列番号１で示されるＤＮＡ配列の全部または一部であ
るＤＮＡ、配列番号１の10番から 408番までのＤＮＡ配
列を実質的に含んでいるＤＮＡであって、その配列中の
１個もしくは複数の塩基が、置換されおよび（または）
欠失しており、さらに（または）該配列中１個もしくは
複数の塩基が付加されているＤＮＡ、配列番号２で示さ
れるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、配列番号
２で示されるアミノ酸配列を実質的に含んでいるポリペ
プチドであって、その配列中の１個もしくは複数のアミ
ノ酸残基が、置換されおよび（または）欠失しており、
さらに（または）該配列中１個もしくは複数のアミノ酸
残基が付加されているポリペプチド、そのポリペプチド
をコードするＤＮＡならびにそれらを含む組換えＤＮＡ
に関する。

【０００５】

【実施例】本発明者は、以下に述べるような生体内時計
とプロテオグリカンとの関係の解明の研究において、新
規なＤＮＡ、およびそのがん抑制作用を見出し、本発明
を完成するに至った。

【０００６】ショウジョウバエの生体内時計の主要なレ
ギュレーターであるｐｅｒｉｏｄ遺伝子は、ヘパラン硫
酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードし、翻訳
領域にＡＣＮＧＧＮ（Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）からなるリピー
ト配列（ｐｅｒリピート）を持つ遺伝子である。このリ
ピート配列は、哺乳動物のコンドロイチン硫酸プロテオ
グリカンのＳｅｒ−ＧｌｙをコードするＤＮＡ配列と相
同性がある。マウスゲノムにおけるｐｅｒｉｏｄ遺伝子
と相同な遺伝子として、ｃｐ2.2 が知られている（H.N.
Shin et al，Nature，317,445-447,1985）。

【０００７】このｃｐ2.2 の配列をプローブとして、マ
ウス脾細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。適度なストリンジェンシー条件下、ハイブリダイズ
するクローンを選択し、常法によりＤＮＡ配列を決定し
て、読取り枠（ＯＲＦ）中にｐｅｒリピートを持つクロ
ーン（ｓｐ41）をえた。ここで、適度なストリンジェン
シー条件とは、50から60℃、１×ＳＳＣ、30分から50分
の条件で、好ましくは50から60℃、１×ＳＳＣ、0.1 ％
ＳＤＳ、40分の条件をいう。このｓｐ41のｃＤＮＡの塩
基配列を配列番号１に示す。哺乳動物において、ＯＲＦ
中にｐｅｒリピートを持つ例はこれまで知られていなか
った。

【０００８】配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡのコ
ードする 133アミノ酸からなるポリペプチド（ＳＰ41）
の配列を、配列番号２に示す。ホモロジー検索の結果、
このポリペプチドは、既知のポリペプチドとの相同性を
有していないことがわかった。アミノ酸レベルの解析で
はｐｅｒｉｏｄ遺伝子産物との有意の相同性も認められ
なかった。

【０００９】えられたクローンｓｐ41のｃＤＮＡにコー
ドされるポリペプチドＳＰ41に対応するｍＲＮＡが正常
マウス脾細胞由来ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡに存在するこ
とをＲＴ−ＰＣＲ法にて確認した。さらに、プライマー
伸長法により、このｃＤＮＡが、断片でなく全長のＳＰ
41をコードしていることを確認した。また、無細胞翻訳
系において、このｍＲＮＡが実際に予期したとおりのタ
ンパクに翻訳されることを確認した。

【００１０】つぎに、ｓｐ41の有する機能を調べるた
め、このｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターに組換え、ヒ
ト血管内皮細胞由来ｔＨＵＥ−２細胞株を形質転換し
て、ＳＰ41発現安定形質転換体をえた。この形質転換体
のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖速度および軟寒天培地での
コロニー形成率を、それぞれｔＨＵＥ−２と比較した
が、有意な差は認められなかった。しかし、検鏡によ
り、ｔＨＵＥ−２に比べ著しい細胞移動速度の減少およ
び形態の変化が認められた。この現象に影響を及ぼして
いる細胞接着因子を探るため、細胞外マトリックスのｍ
ＲＮＡレベルを調べた。ｔＨＵＥ−２に比べ、形質転換
体では、フィブロネクチン（ＦＮ）のｍＲＮＡレベルが
顕著に増加していた。形質転換体の免疫染色により、実
際にＦＮが発現していることを確認した。

【００１１】さらに、前記形質転換体をヌードマウスに
接種した。ｔＨＵＥ−２はヌードマウスに接種したばあ
いに腫瘍形成能を有するが、この形質転換体では、腫瘍
形成能が著しく減少していることがわかった。

【００１２】以上の結果から、ｓｐ41は、従来より知ら
れているがん抑制遺伝子とは異なる作用機序、すなわち
宿主側のなんらかの因子との相互作用により腫瘍形成能
を抑制する、新しいタイプのがん抑制遺伝子であること
がわかった。

【００１３】また、配列番号１の配列のうちＯＲＦ、す
なわち10番から408 番までの配列を実質的に含むＤＮＡ
とは、前記ｓｐ41のｃＤＮＡと同様の機能を有するもの
である。同様に、配列番号２のアミノ酸配列を実質的に
含むポリペプチドとは、ＳＰ41と同様の機能を有するも
のである。

【００１４】つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるも
のではない。

【００１５】実施例１ １）クローニング方法 まず、前記ｃｐ2.2 の配列から23ｍｅｒのオリゴヌクレ
オチド（配列番号３）を常法により合成し、これをプロ
ーブとしてマウス肝ゲノムのシャロン28ファージライブ
ラリー（名古屋大学理学部 高橋直樹博士より供与をう
けた）を公知の方法でスクリーニングし、このオリゴヌ
クレオチドにハイブリダイズするｃｐ2.2 相当のクロー
ンを単離した。この単離されたクローンのＤＮＡはその
制限酵素地図から既報のｃｐ2.2 と同一であることを確
認した。

【００１６】つぎに、Ｂａｌｂ／ｃマウス（マウス：学
名Mus musculus）の脾臓ｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。具体的にはマウス脾臓細胞をグアニジンチオシアネ
ート溶液中で溶かし、ＣｓＣｌ溶液に重層し、超遠心分
離にて全ＲＮＡを沈澱として回収し、通常のフェノール
／クロロホルム、エタノール処理により精製した。オリ
ゴｄＴセルロースクロマトグラフィーによりｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ ＲＮＡを単離し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを
複製し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩとＲＮａｓｅＨと
共にインキュベーションすることにより二本鎖にし、そ
の末端にＥｃｏＲＩリンカーを連結した。このｃＤＮＡ
をλｇｔ10のＥｃｏＲＩサイトに挿入して(T. U. Hyunh
et al, DNA Cloning Techniques, ed. D. Glover(IRL
Press, Oxford), Vol. 1, 49-78, 1985)、λ in vitro
パッケージングキット（商品名、アマシャム・ジャパン
株式会社製）を用いてパッケージングし、ファージライ
ブラリーを作製した。

【００１７】このライブラリーを前述のｃｐ2.2 のＥｃ
ｏＲＩ−ＨｉｎｄIII の2.5 Ｋｂのフラグメントをプロ
ーブとしてスクリーニングし、適度なストリンジェンシ
ー条件（50℃〜60℃、１×ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳ，40ｍ
ｉｎ）により洗浄し、ハイブリダイズした５つの独立し
たｃＤＮＡクローンを常法により単離した。これらをｐ
ＵＣ18のＥｃｏＲＩサイトにサブクローン化し、kilo-S
equence 用Deletion kit（商品名、宝酒造株式会社製）
を用いたのちに、サンガー法(F. Sangar et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5469, 1977)によって
ＤＮＡ配列を決定した。これを配列番号１に示す。さら
に、プライマー伸長法(T. Kataoka et al., J. Biol. C
hem., 257, 277-285, 1982) により、配列番号１の10番
目のＡより143 ｂｐ上流に転写開始点があることを決定
した。これらの５つのｃＤＮＡクローンのうち、ｓｐ41
と名づけた１つのクローンのみがＯＲＦ中にｐｅｒリピ
ートをもっており（配列番号１の73番から243 番）、13
3 アミノ酸からなる未知のタンパク質をコードしてい
た。このクローンをｐＵＣベクターに組換えたｐＵＣＳ
Ｐ41をＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ101 株に導入したものを、平
成５年３月３日に工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託した（受託番号 FERM P-13498 ）。

【００１８】さらにウサギの網状赤血球を用いる公知の
試験管内翻訳系にてｓｐ41がコードしているポリペプチ
ドがＤＮＡ配列から予期したとおりの約16Ｋｄの分子量
を有していることが確認された。具体的には、ブルース
クリプトIIＳＫ（＋）（商品名、STRATAGENE社製）のＥ
ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII クローニングサイトにクローン
化したｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグメン
ト（約0.4 ＫｂのＯＲＦ部分）およびＨｉｎｄIII クロ
ーニングサイトにＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIIIのフラグ
メント（約1.6 Ｋｂの３´側非翻訳領域）をｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使って、センスＲＮ
Ａを合成し、タンパク質合成のテンプレートとして用い
た。ＯＲＦを含むＲＮＡからは、約16Ｋｄのタンパク質
が合成されたが、３´非翻訳領域およびテンプレートが
ないばあいには何も合成されなかった。図１にそれぞれ
のテンプレートを用いて試験管内翻訳させたものについ
てＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を示す。ａは前記の
３´側非翻訳領域、ｂは前記のＯＲＦ部分をテンプレー
トとしたばあい、なおｃはテンプレートなしのばあいを
示す。図２には、配列番号１のＤＮＡの制限地図を示
す。

【００１９】以上より、ｓｐ41のｃＤＮＡは断片でなく
全長のタンパクをコードしていることがわかった。

【００２０】２）ｓｐ41のｃＤＮＡのｔＨＵＥ−２での
発現 ｓｐ41のＥｃｏＲＩ2.8 Ｋｂフラグメントを哺乳動物高
発現用プラスミドベクターｐＳＲαｇｐｔ(M. Kondo et
al., Biochimica et Biophysica Acta, 1134,242-246,
1992）のＥｃｏＲＩサイトに挿入した。このｐＳＲα
ｇｐｔ−ｓｐ41の模式図を図３に示す。ｐＳＲαｇｐｔ
は、ｐｃＤＬ−ＳＲα296 (Y. Tanabe et al., Mol. Ce
ll. Biol., 8, 466-472, 1988)のＳａｌＩサイトにｐＳ
Ｖ２ｇｐｔ(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 20
9, 1422-1427, 1980; R. C. Mulligan and P. Berg, Pr
o. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072-2076) のＥｃｏｇ
ｐｔフラグメント（ＥｃｏＲＩ−ＰｖｕII 2.5Ｋｂ）を
挿入することにより修飾したものである。このベクター
は、ＳＶ40の初期プロモーターとHuman T-cell leukemi
a virus type 1のＬＴＲのＲ−Ｕ５配列の一部を融合し
たプロモーターと、ＳＶ40の複製起点をもち、マーカー
遺伝子としてＥｃｏｇｐｔが付加されている。

【００２１】ＳＰ41の発現にはｔＨＵＥ−２を用いた。
この細胞はＥＣＶ304 (K. Takahashi et al., In Vitro
Cell Dev. Biol., 25, 265-274, 1990)を低血清条件下
で培養することにより形質転換した(M. Kobayashi et a
l., Human Cell, 4, 296-305, 1991) ヒト血管内皮細胞
を無血清のＡＳＦ301 （極東製薬工業株式会社製）で培
養できるように育種したものである。対数増殖期のｔＨ
ＵＥ−２を、0.02％トリプシンで剥離して集め、１×10
⁷ 個／mlとなるようにＰＢＳ中に再懸濁してｐＳＲαｇ
ｐｔ−ｓｐ41ＤＮＡ５μｇを加えたのちに、氷上で10分
間冷やし、エレクトリックセルボーラーＥＣＢ−1001
（商品名、理工化学研究所製）の２Ｋｖ／cmの電気パル
スを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトし
た細胞はＡＳＦ301 に播種し直し48時間後に、キサンチ
ン250 μｇ／ml、ヒポキサンチン13.6μｇ／ml、グリシ
ン10μｇ／ml、チミジン11.8μｇ／ml、アミノプテリン
２μｇ／ml、ミコフェノール酸2.5 μｇ／mlを含む選択
培地に替えて、８−12週後には、トランスフェクトされ
てＥｃｏｇｐｔ遺伝子がゲノムに組込まれた細胞のみが
増殖しコロニーを形成する。充分に成長したコロニーを
常法によりトリプシンで剥離し、実際にｓｐ41を発現し
ていることをノーザンブロット法(P. S. Thomas, Pro.
Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-5205)により確認でき
た。組換えＤＮＡでトランスフェクトしたｔＨＵＥ−２
のｍＲＮＡをｓｐ41ｃＤＮＡのＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片
約370 bpをプローブとしたノーザンブロットの結果を図
４に示す。１はクローン25-12 、２はクローン2.5-11、
３は2.5-13、４はクローン2.5-9、５はベクターのみを
トランスフェクトしたクローンＡ、６はクローン2.5-2
D、とそれぞれ名づけた形質転換体、７はベクターのみ
をトランスフェクトしたクローン、８は野生株を示す。
クローン25-12 、2.5-11、2.5-9 、2.5-2DがＳＰ41を発
現していることがわかる。3.7 ｋｂは2.8 ｋｂのｓｐ41
のＲＮＡとベクター由来のＲＮＡが含まれる。

【００２２】３）ＳＰ41の機能 Ｉｎ ｖｉｔｒｏウーンドアッセイ(wound assey) (F.
G. Giancotti and E.Ruoslahti, Cell, 60, 849-859, 1
990) により、ベクターのみでトランスフェクトした細
胞株とＳＰ41発現株（クローン2.5-11）の細胞移動特性
を調べた。すなわち、サブコンフレント(subconflent)
に単層培養された細胞を１mm幅でかきとり洗浄したあ
と、マノメーター（オリンパス社製）を用いて細胞の移
動を測定すると、図５に示すとおりＳＰ41発現細胞株の
移動度は、対照細胞株に比較して減少していた。これ
は、ｓｐ41ｃＤＮＡの発現がｔＨＵＥ−２の移動能力を
抑制していることを示している。

【００２３】さらに、対照細胞株（ｔＨＵＥ−２野生
株、ベクター導入細胞株）、ｓｐ41発現細胞株における
フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１、Ｄｅｃｏｒｉｎ、β
−ＡｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現量をそれぞれヒトフィブロ
ネクチンｃＤＮＡのＸｂａＩ−ＮｓｉＩの1.4 ｋｂフラ
グメント、ヒトＴＧＦ−β１ｃＤＮＡのＸｂａＩ−Ｘｂ
ａＩの1.3 ｋｂフラグメント、ヒトデコリンｃＤＮＡの
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII の0.95ｋｂフラグメント、ヒ
トβ−アクチンｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩの2.
1 ｋｂフラグメントをプローブとしてノーザンブロット
法で調べると、ＴＧＦ−β１、Ｄｅｃｏｒｉｎ、β−Ａ
ｃｔｉｎは、二者間で差がみられないが、フィブロネク
チンｍＲＮＡの発現量がＳＰ41発現細胞株で顕著に増加
していた。ヒトフィブロネクチンｃＤＮＡおよびヒトＴ
ＧＦ−β１ｃＤＮＡを用いたばあいのノーザンブロット
の結果を、それぞれ図６、図７に示す。いずれも１、
２、３はそれぞれ発現株25-12 、2.5-11、2.5-2Dを、４
はベクターのみでトランスフェクトしたクローンＢを、
５は野生株を示す。

【００２４】実際に、フィブロネクチンタンパク質が増
加していることを、免疫染色により確認した。ヒトフィ
ブロネクチンに対するモノクローナル抗体（ラホヤ癌研
究財団のE. Ruoslahti博士より供与された）を用いて細
胞を染色すると、ＳＰ41発現細胞に強い染色像が見られ
た。ｓｐ41ｃＤＮＡの発現によりフィブロネクチン遺伝
子の劇的な転写増加がおこり、細胞外マトリクスに大量
のフィブロネクチンが沈着したものと考えられる。

【００２５】対照細胞株（ｔＨＵＥ−２野生株、ベクタ
ー単独導入株）とＳＰ41発現株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの
細胞増殖性を、10％ＦＢＳ添加ダルベッコ改変イーグル
培地（Ｄ´ＭＥＭ）および軟寒天培地((I. MacPherson
and L. Montagnier,Virology, 23, 291-294, 1984)の方
法による）中で調べたが、有意差は見られなかった。そ
れぞれの結果を図８および図９に示す。

【００２６】ヌードマウスにおける対照細胞株（ｔＨＵ
Ｅ−２野生株、ベクター単独野生株、ｓｐ41導入ＳＰ41
非発現株）とＳＰ41発現株との腫瘍形成能を調べるため
に６週齢のメスのヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の皮下に
１×10⁷ 個／マウスずつ移植した(F. G. Giancotti and
E. Ruoslahti, Cell 60, 849-859, 1990 参照）。ｉｎ
ｖｉｖｏでは、対照細胞株が２ないし３ヵ月以内に巨
大な腫瘍を形成する一方、ＳＰ41発現細胞株のばあい
は、腫瘍形成が顕著に抑制されていた。図10に結果のグ
ラフを示す。

【００２７】

【発明の効果】本発明の新規ＤＮＡ、ポリペプチドおよ
び組換えＤＮＡにより、従来より知られているがん抑制
遺伝子とは異なる作用機序、すなわち宿主側のなんらか
の因子との相互作用により腫瘍形成能を抑制する、新し
いタイプのがん抑制遺伝子が明らかになった。これによ
り、まったく新しいタイプの腫瘍抑制剤の開発も可能と
なる。

【００２８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：2851 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起 源 生物名：Mus musculus 株名：Ｂａｌｂ／ｃ 配列の特徴73．．243 per リピート 配 列 TGAGCATTG ATG TTG ACA TAC AAA GGA ATG AAC TGC GGC CCA CTC ACT 48 Met Leu Thr Tyr Lys Gly Met Asn Cys Gly Pro Leu Thr 1 5 10 GGC AGG AGG ATT TTC TGG TAT TAT TCA ACC CAG AGT ACA GCA CAG CAC 96 Gly Arg Arg Ile Phe Trp Tyr Tyr Ser Thr Gln Ser Thr Ala Gln His 15 20 25 AGC ACA GCA CAG CAC AGC ACA GCT CAG CAC AGC ACA GCA CAA CAC AAC 144 Ser Thr Ala Gln His Ser Thr Ala Gln His Ser Thr Ala Gln His Asn 30 35 40 45 ACA GCA CAC CAC AGC ACA CCA CAG CAC AGC ACA GCC CAG CAC ACC ACA 192 Thr Ala His His Ser Thr Pro Gln His Ser Thr Ala Gln His Thr Thr 50 55 60 GCA CAC CAC AGC ACA CCA CAG CAC ACC ACA GCA CAC TAC AGC ACC GGC 240 Ala His His Ser Thr Pro Gln His Thr Thr Ala His Tyr Ser Thr Gly 65 70 75 TTT ACT AAT GGC AGA TTA ATT GGA TCT GGG TTT CTG AAT GTG GGT CAG 288 Phe Thr Asn Gly Arg Leu Ile Gly Ser Gly Phe Leu Asn Val Gly Gln 80 85 90 TTT GGG TTG GAA GTG ATT TTA TTA GCA AGA AAC CTC TCT AAA ACC CCA 336 Phe Gly Leu Glu Val Ile Leu Leu Ala Arg Asn Leu Ser Lys Thr Pro 95 100 105 CCC CAC TCC CTA CCC CTC GCC CTC CTT GAA ACG CTA GGC CAC ACG CTT 384 Pro His Ser Leu Pro Leu Ala Leu Leu Glu Thr Leu Gly His Thr Leu 110 115 120 125 TCC TCT GTG GCT CAG GGC ACT CTC TAGAAGCTTC TGAGGAGCAA 428 Ser Ser Val Ala Gln Gly Thr Leu 130 133 TGTGTTTTCT CTGCTAGATT TCACGGGCAG CCGTGCTGGG ACTTGGTAAA GTTGGGACTT 488 GGTAAAGTTA TGTTTGGAGT TCACGGAATT TCTCAGCGTG CTGAAAGTTA AATTCCAGGA 548 CAGAAGGGAA CCAGCACTGG GCTCAGACCC TGGGGCCAGA GTCCTTGTCT TAGCCCAGCT 608 TCTATAACTT GCCATGTGAC CTTGGGCAAG TATTGGCATC ATGTTTTAAC TCATGGAAAA 668 CTTTTTTTTT TAAAAGGAAG AAGGGCTACC TGGGATTGTT TTCCATCCAT CCATGGGTTT 728 ACCTGTCTGT CTGTCTGTCT GTCTGTCTGT CTGTCTGTCT ATCATTTCAC AGACACTTAG 788 AGACTATGTT TTCTAGACTT TGCTTACAAA GTAGAGGATA AATTAACGGG TAGAACCTCC 848 AAGTCTGGAG AGAGCCAGGA TTTTCTCTTC ACATAGTTTC TGAGTACCCT TAAGAACCTA 908 TTTAATTGGG TCCTGGTCTT CCTCTGTGAC ATGTACTACA ATTTTATAGA CTTCACTTAG 968 ATTCTGATGT CCCTTTAAAA AGCATTTTTT TTTAAAAAAA AAGCATTAAA TGCCTTATTA 1028 AATTTTTCTG AGGATGTTCA GTCCTCAGGG ACTGTCCATC TTGTGTGGAA ACCTGCTCGC 1088 TCAGCAGCTC TACTTCAGTG TAACCACTGT GCAAATAAAA GGCTTCCTGC CTCCAGTCTG 1148 TCTACCCTTC TTTTTTGTTT CCTGTAAATA CCTACCCAGG GGCTCTTACT CTAGAACTTA 1208 GTTAACGAAT GATGGCCCAC CAACAAGATA ATTACCCAGA ATCCCTTTTG AATCATCTAG 1268 GCTGCTGGAA ATGGGTTGGC AGTGGCTCTC TGGGGAGCAA AGGTTCTCAG CCGTGGGGGA 1328 GGGCGGAGTT GGGGGAGGGC ATAAGAGTCA GGGAAAGGAC CTCTCAGAAG GACATCAGAA 1388 TTTAAACTGC TTAGAGCACA GACACTAAAC TGCTGCTAGA TGTTGGCCTC CAGAGGCCTG 1448 GGAATGGCTG CTCTGGACCT CAGCCTGTTT GGAGGAACAC TAGGAGTGCT GATAGCAATC 1508 CTTTGTCCTC GTCATGGTCC ATCATAGTCC TAGTCCTTCA CCCACTGTAT CTTCACATTC 1568 CCTGCCTGCA GCTCTCCTCC CTNNCCCCTC CCCCTNCCCC CTCCCCCCAT CTTGGCTGAG 1628 TATTTTTGCA TCCTCACCCT TTCCATTCCC ACCCCACCTC GCTCCTCTTC ACTCCATGCC 1688 CCATAGCCCT CTCTCTACCT TGGGCCTGTT TCTATACAAA CAGGTGTGCA AGACAAGGAT 1748 ATATTCCTAA TTTCTGGATG AGGAGGTGGA GACAGCATTA CCAGTCACGG TCCAGGCATG 1808 GGTAACATCC AGTTATCCTT GAGTTCAGTT CCTTGGTTTA GACAGGGAAA CCTAGAACTG 1868 TCTGTCTCTC AGGAGTCCAG AATGGGGCCA TCTTCAAGCT CAGGGGGATA GAAGGTGAGG 1928 TGGGCACTGT GAAGAGCCAT TTATTTCTAG ATTAGAAGAC AAGTGTGTTG ATGACACAGG 1988 TTTGTTTGCC CCCCTGCTTG CTCAAGTCAA AGAAGCTTCC AGAAGAATAT GAACAGCTGC 2048 CAATATGTAG AGATTCTGGG GAGATATTTA AGACAGTAGA TGAGGGCTTA TATATACTCC 2108 TTCATGGTGA GTATGCTGGT TATGGTATAA GCCTTGACTT CAGAAGTTTT CTTTCTGATG 2168 ATTAACACTT TCTGATGATT CGTCACCAAG TTGAGGTTCC CAGAACAGCA GGACAAAGGG 2228 TCCTAGTGAT GCTTCCTATA TGGGAGAAGT CTGTTTGCAA ATTTCTCATT GAAGGCTCCA 2288 AATTGAGGAT ACGAGAAGCA AGATGAGTGT GGCATTGCTC CTCAATGTAG AAGCTCCGTT 2348 CCTTTATTCA TGGGGAGCGT GGCCCCAGGC GATACACACA AGAGCAGGCA GAGGTTCTGT 2408 CTCTACTTAC TCAAGGGCTT CCTTGACAGA GAGCTTTCTG TGTTTGCAGT TGGCTCCTGA 2468 GGAGACTGTC GAACCTTAGA AGCAGCTAAG GATCTTACTG AGAGCCCTGG GGTCCTGTTG 2528 TGGGGTAGAA GGTTTAGTAG GAGTGCTGGG TTGGTATTAG ATAGTAGCAT AGACCAGCCA 2588 AACCTGTGGG GCTAGGAAGG AGGCCAGTCT TGTACTAACA TCTTCTGTAT GAAGTAGAAA 2648 AATTGTTCAA CATCTTCTTT CTTTAAAGCC CGAGAAACTC AGGAAATAAC ACTGGTGACA 2708 GGTGTCAGAA ACCTGGTCTG AAAGTGGAAA GGAGAGGCTA AGGTGGGATG ATCATAAGTT 2768 TGAAGCTAGC CTAGGGCACA TAACAAGTCT CAGAGGCCAA CCTGAGCTAC AAAGCAAGCT 2828 TTGTCATAAA AAAAAAAAAA AAA 2851

【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：133 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Yes 配 列 Met Leu Thr Tyr Lys Gly Met Asn Cys Gly Pro Leu Thr Gly Arg Arg 1 5 10 15 Ile Phe Trp Tyr Tyr Ser Thr Gln Ser Thr Ala Gln His Ser Thr Ala 20 25 30 Gln His Ser Thr Ala Gln His Ser Thr Ala Gln His Asn Thr Ala His 35 40 45 His Ser Thr Pro Gln His Ser Thr Ala Gln His Thr Thr Ala His His 50 55 60 Ser Thr Pro Gln His Thr Thr Ala His Tyr Ser Thr Gly Phe Thr Asn 65 70 75 80 Gly Arg Leu Ile Gly Ser Gly Phe Leu Asn Val Gly Gln Phe Gly Leu 85 90 95 Glu Val Ile Leu Leu Ala Arg Asn Leu Ser Lys Thr Pro Pro His Ser 100 105 110 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Glu Thr Leu Gly His Thr Leu Ser Ser Val 115 120 125 Ala Gln Gly Thr Leu 130 133

【００３０】配列番号：３ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配 列 CCTGAGCTGT ATGAACAAGG ATC 23

Ｃ

【図面の簡単な説明】

【図１】それぞれのテンプレートを用いて試験管内翻訳
させたものについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を
示すスケッチである。

【図２】配列番号１のＤＮＡの制限地図である。

【図３】ｐＳＲαｇｐｔ−ｓｐ41の模式図である。

【図４】組換えＤＮＡでトランスフェクトしたｔＨＵＥ
−２のｍＲＮＡをｓｐ41ｃＤＮＡのＸｂａＩ−ＰｓｔＩ
断片約370 bpをプローブとしたノーザンブロットの結果
を示すスケッチである。

【図５】ＳＰ41発現株の細胞移動度のグラフである。

【図６】ＳＰ41発現株の、ヒトフィブロネクチンｃＤＮ
Ａをプローブとしたノーザンブロットの結果を示すスケ
ッチである。

【図７】ＳＰ41発現株の、ヒトＴＧＦ−β１ｃＤＮＡを
プローブとしたノーザンブロットの結果を示すスケッチ
である。

【図８】ＳＰ41発現株の10％ＦＢＳ添加ダルベッコ改変
イーグル培地（Ｄ´ＭＥＭ）中での細胞増殖性を示すグ
ラフである。

【図９】ＳＰ41発現株の軟寒天培地中での細胞増殖性を
示すグラフである。

【図１０】ＳＰ41発現株のヌードマウス皮下での腫瘍形
成能を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 橋本 將男 大阪府大阪市生野区巽西一丁目８番１号 清和寮 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，1985，Ｖｏｌ．317, Ｎｏ．6036，ｐ．445−448 血液・腫よう科，1990，Ｖｏｌ．21, Ｎｏ．１，ｐ．54−61 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 15/12 C07K 14/47 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２で示されるアミノ酸配列を含
   んでなるポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号２で示されるアミノ酸配列にお
   いて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、及
   び／または付加されているアミノ配列を含む、腫瘍形成
   能抑制活性を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号１で示されるＤＮＡ配列を含ん
   でなるＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号１の１０番から４０８番までの
   ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１または２記載のポリペプチドを
   コードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ。
6. 【請求項６】 少なくとも配列番号１の７３番から２４
   ３番までのＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項３または４記載のＤＮＡにおい
   て、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、及び／または
   付加されている、腫瘍形成能抑制活性を有するＤＮＡ。
8. 【請求項８】 ストリンジェントな条件のもとで、請求
   項３〜６のいずれか１項記載のＤＮＡにハイブリダイズ
   することができる腫瘍形成能抑制活性を有するＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項３〜８のいずれか１項記載のＤＮ
   Ａを含む組換えＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 請求項３〜８のいずれか１項記載のＤ
    ＮＡ、または請求項８記載の組換えＤＮＡで形質転換さ
    れた形質転換体。
11. 【請求項１１】 請求項３〜８のいずれか１項記載のＤ
    ＮＡに相補的なＲＮＡ。