JP3427090B2 - 新規dna、ポリペプチドおよび組換えdna - Google Patents
新規dna、ポリペプチドおよび組換えdnaInfo
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- JP3427090B2 JP3427090B2 JP06923193A JP6923193A JP3427090B2 JP 3427090 B2 JP3427090 B2 JP 3427090B2 JP 06923193 A JP06923193 A JP 06923193A JP 6923193 A JP6923193 A JP 6923193A JP 3427090 B2 JP3427090 B2 JP 3427090B2
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- Japan
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- dna
- seq
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、新規DNA、ポリペプ
チドおよび組換えDNAに関する。さらに詳しくは、i
n vivoにおいてがん抑制作用を有するポリペプチ
ド、それをコードするDNAならびに組換えDNAに関
する。
チドおよび組換えDNAに関する。さらに詳しくは、i
n vivoにおいてがん抑制作用を有するポリペプチ
ド、それをコードするDNAならびに組換えDNAに関
する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】がん
抑制は、古くは、あるがん細胞と正常細胞とが細胞融合
したときにしばしばそのがんの性質が消える現象として
とらえられていた。
抑制は、古くは、あるがん細胞と正常細胞とが細胞融合
したときにしばしばそのがんの性質が消える現象として
とらえられていた。
【0003】近年、レチノブラストーマ遺伝子(RB
1)、p53遺伝子、K−rev−1遺伝子などのがん抑
制遺伝子が相次いで見出され、がん抑制が分子レベルで
論議されるようになった。しかし、生体内において発が
ん、がんの増殖および転移へと移行するには多段階の、
かつ複数の遺伝子変化が必要と考えられる。したがっ
て、現在知られているがん遺伝子およびがん抑制遺伝子
のみではそれらの機構をすべて説明することは困難であ
る。それらの機構を解明し、またまったく新しいがん抑
制剤を開発するためにも、新たながん抑制遺伝子の解明
が望まれている。
1)、p53遺伝子、K−rev−1遺伝子などのがん抑
制遺伝子が相次いで見出され、がん抑制が分子レベルで
論議されるようになった。しかし、生体内において発が
ん、がんの増殖および転移へと移行するには多段階の、
かつ複数の遺伝子変化が必要と考えられる。したがっ
て、現在知られているがん遺伝子およびがん抑制遺伝子
のみではそれらの機構をすべて説明することは困難であ
る。それらの機構を解明し、またまったく新しいがん抑
制剤を開発するためにも、新たながん抑制遺伝子の解明
が望まれている。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号1の
10番から 408番までのDNA配列を含んでなるDNA、
配列番号1で示されるDNA配列の全部または一部であ
るDNA、配列番号1の10番から 408番までのDNA配
列を実質的に含んでいるDNAであって、その配列中の
1個もしくは複数の塩基が、置換されおよび(または)
欠失しており、さらに(または)該配列中1個もしくは
複数の塩基が付加されているDNA、配列番号2で示さ
れるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、配列番号
2で示されるアミノ酸配列を実質的に含んでいるポリペ
プチドであって、その配列中の1個もしくは複数のアミ
ノ酸残基が、置換されおよび(または)欠失しており、
さらに(または)該配列中1個もしくは複数のアミノ酸
残基が付加されているポリペプチド、そのポリペプチド
をコードするDNAならびにそれらを含む組換えDNA
に関する。
10番から 408番までのDNA配列を含んでなるDNA、
配列番号1で示されるDNA配列の全部または一部であ
るDNA、配列番号1の10番から 408番までのDNA配
列を実質的に含んでいるDNAであって、その配列中の
1個もしくは複数の塩基が、置換されおよび(または)
欠失しており、さらに(または)該配列中1個もしくは
複数の塩基が付加されているDNA、配列番号2で示さ
れるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、配列番号
2で示されるアミノ酸配列を実質的に含んでいるポリペ
プチドであって、その配列中の1個もしくは複数のアミ
ノ酸残基が、置換されおよび(または)欠失しており、
さらに(または)該配列中1個もしくは複数のアミノ酸
残基が付加されているポリペプチド、そのポリペプチド
をコードするDNAならびにそれらを含む組換えDNA
に関する。
【0005】
【実施例】本発明者は、以下に述べるような生体内時計
とプロテオグリカンとの関係の解明の研究において、新
規なDNA、およびそのがん抑制作用を見出し、本発明
を完成するに至った。
とプロテオグリカンとの関係の解明の研究において、新
規なDNA、およびそのがん抑制作用を見出し、本発明
を完成するに至った。
【0006】ショウジョウバエの生体内時計の主要なレ
ギュレーターであるperiod遺伝子は、ヘパラン硫
酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードし、翻訳
領域にACNGGN(Thr−Gly)からなるリピー
ト配列(perリピート)を持つ遺伝子である。このリ
ピート配列は、哺乳動物のコンドロイチン硫酸プロテオ
グリカンのSer−GlyをコードするDNA配列と相
同性がある。マウスゲノムにおけるperiod遺伝子
と相同な遺伝子として、cp2.2 が知られている(H.N.
Shin et al,Nature,317,445-447,1985)。
ギュレーターであるperiod遺伝子は、ヘパラン硫
酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードし、翻訳
領域にACNGGN(Thr−Gly)からなるリピー
ト配列(perリピート)を持つ遺伝子である。このリ
ピート配列は、哺乳動物のコンドロイチン硫酸プロテオ
グリカンのSer−GlyをコードするDNA配列と相
同性がある。マウスゲノムにおけるperiod遺伝子
と相同な遺伝子として、cp2.2 が知られている(H.N.
Shin et al,Nature,317,445-447,1985)。
【0007】このcp2.2 の配列をプローブとして、マ
ウス脾細胞cDNAライブラリーをスクリーニングし
た。適度なストリンジェンシー条件下、ハイブリダイズ
するクローンを選択し、常法によりDNA配列を決定し
て、読取り枠(ORF)中にperリピートを持つクロ
ーン(sp41)をえた。ここで、適度なストリンジェン
シー条件とは、50から60℃、1×SSC、30分から50分
の条件で、好ましくは50から60℃、1×SSC、0.1 %
SDS、40分の条件をいう。このsp41のcDNAの塩
基配列を配列番号1に示す。哺乳動物において、ORF
中にperリピートを持つ例はこれまで知られていなか
った。
ウス脾細胞cDNAライブラリーをスクリーニングし
た。適度なストリンジェンシー条件下、ハイブリダイズ
するクローンを選択し、常法によりDNA配列を決定し
て、読取り枠(ORF)中にperリピートを持つクロ
ーン(sp41)をえた。ここで、適度なストリンジェン
シー条件とは、50から60℃、1×SSC、30分から50分
の条件で、好ましくは50から60℃、1×SSC、0.1 %
SDS、40分の条件をいう。このsp41のcDNAの塩
基配列を配列番号1に示す。哺乳動物において、ORF
中にperリピートを持つ例はこれまで知られていなか
った。
【0008】配列番号1の塩基配列を有するDNAのコ
ードする 133アミノ酸からなるポリペプチド(SP41)
の配列を、配列番号2に示す。ホモロジー検索の結果、
このポリペプチドは、既知のポリペプチドとの相同性を
有していないことがわかった。アミノ酸レベルの解析で
はperiod遺伝子産物との有意の相同性も認められ
なかった。
ードする 133アミノ酸からなるポリペプチド(SP41)
の配列を、配列番号2に示す。ホモロジー検索の結果、
このポリペプチドは、既知のポリペプチドとの相同性を
有していないことがわかった。アミノ酸レベルの解析で
はperiod遺伝子産物との有意の相同性も認められ
なかった。
【0009】えられたクローンsp41のcDNAにコー
ドされるポリペプチドSP41に対応するmRNAが正常
マウス脾細胞由来poly(A)+ RNAに存在するこ
とをRT−PCR法にて確認した。さらに、プライマー
伸長法により、このcDNAが、断片でなく全長のSP
41をコードしていることを確認した。また、無細胞翻訳
系において、このmRNAが実際に予期したとおりのタ
ンパクに翻訳されることを確認した。
ドされるポリペプチドSP41に対応するmRNAが正常
マウス脾細胞由来poly(A)+ RNAに存在するこ
とをRT−PCR法にて確認した。さらに、プライマー
伸長法により、このcDNAが、断片でなく全長のSP
41をコードしていることを確認した。また、無細胞翻訳
系において、このmRNAが実際に予期したとおりのタ
ンパクに翻訳されることを確認した。
【0010】つぎに、sp41の有する機能を調べるた
め、このcDNAを哺乳動物発現ベクターに組換え、ヒ
ト血管内皮細胞由来tHUE−2細胞株を形質転換し
て、SP41発現安定形質転換体をえた。この形質転換体
のin vitroでの増殖速度および軟寒天培地での
コロニー形成率を、それぞれtHUE−2と比較した
が、有意な差は認められなかった。しかし、検鏡によ
り、tHUE−2に比べ著しい細胞移動速度の減少およ
び形態の変化が認められた。この現象に影響を及ぼして
いる細胞接着因子を探るため、細胞外マトリックスのm
RNAレベルを調べた。tHUE−2に比べ、形質転換
体では、フィブロネクチン(FN)のmRNAレベルが
顕著に増加していた。形質転換体の免疫染色により、実
際にFNが発現していることを確認した。
め、このcDNAを哺乳動物発現ベクターに組換え、ヒ
ト血管内皮細胞由来tHUE−2細胞株を形質転換し
て、SP41発現安定形質転換体をえた。この形質転換体
のin vitroでの増殖速度および軟寒天培地での
コロニー形成率を、それぞれtHUE−2と比較した
が、有意な差は認められなかった。しかし、検鏡によ
り、tHUE−2に比べ著しい細胞移動速度の減少およ
び形態の変化が認められた。この現象に影響を及ぼして
いる細胞接着因子を探るため、細胞外マトリックスのm
RNAレベルを調べた。tHUE−2に比べ、形質転換
体では、フィブロネクチン(FN)のmRNAレベルが
顕著に増加していた。形質転換体の免疫染色により、実
際にFNが発現していることを確認した。
【0011】さらに、前記形質転換体をヌードマウスに
接種した。tHUE−2はヌードマウスに接種したばあ
いに腫瘍形成能を有するが、この形質転換体では、腫瘍
形成能が著しく減少していることがわかった。
接種した。tHUE−2はヌードマウスに接種したばあ
いに腫瘍形成能を有するが、この形質転換体では、腫瘍
形成能が著しく減少していることがわかった。
【0012】以上の結果から、sp41は、従来より知ら
れているがん抑制遺伝子とは異なる作用機序、すなわち
宿主側のなんらかの因子との相互作用により腫瘍形成能
を抑制する、新しいタイプのがん抑制遺伝子であること
がわかった。
れているがん抑制遺伝子とは異なる作用機序、すなわち
宿主側のなんらかの因子との相互作用により腫瘍形成能
を抑制する、新しいタイプのがん抑制遺伝子であること
がわかった。
【0013】また、配列番号1の配列のうちORF、す
なわち10番から408 番までの配列を実質的に含むDNA
とは、前記sp41のcDNAと同様の機能を有するもの
である。同様に、配列番号2のアミノ酸配列を実質的に
含むポリペプチドとは、SP41と同様の機能を有するも
のである。
なわち10番から408 番までの配列を実質的に含むDNA
とは、前記sp41のcDNAと同様の機能を有するもの
である。同様に、配列番号2のアミノ酸配列を実質的に
含むポリペプチドとは、SP41と同様の機能を有するも
のである。
【0014】つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるも
のではない。
しく説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるも
のではない。
【0015】実施例1
1)クローニング方法
まず、前記cp2.2 の配列から23merのオリゴヌクレ
オチド(配列番号3)を常法により合成し、これをプロ
ーブとしてマウス肝ゲノムのシャロン28ファージライブ
ラリー(名古屋大学理学部 高橋直樹博士より供与をう
けた)を公知の方法でスクリーニングし、このオリゴヌ
クレオチドにハイブリダイズするcp2.2 相当のクロー
ンを単離した。この単離されたクローンのDNAはその
制限酵素地図から既報のcp2.2 と同一であることを確
認した。
オチド(配列番号3)を常法により合成し、これをプロ
ーブとしてマウス肝ゲノムのシャロン28ファージライブ
ラリー(名古屋大学理学部 高橋直樹博士より供与をう
けた)を公知の方法でスクリーニングし、このオリゴヌ
クレオチドにハイブリダイズするcp2.2 相当のクロー
ンを単離した。この単離されたクローンのDNAはその
制限酵素地図から既報のcp2.2 と同一であることを確
認した。
【0016】つぎに、Balb/cマウス(マウス:学
名Mus musculus)の脾臓cDNAライブラリーを作製し
た。具体的にはマウス脾臓細胞をグアニジンチオシアネ
ート溶液中で溶かし、CsCl溶液に重層し、超遠心分
離にて全RNAを沈澱として回収し、通常のフェノール
/クロロホルム、エタノール処理により精製した。オリ
ゴdTセルロースクロマトグラフィーによりpoly
(A)+ RNAを単離し、逆転写酵素によりcDNAを
複製し、大腸菌DNAポリメラーゼIとRNaseHと
共にインキュベーションすることにより二本鎖にし、そ
の末端にEcoRIリンカーを連結した。このcDNA
をλgt10のEcoRIサイトに挿入して(T. U. Hyunh
et al, DNA Cloning Techniques, ed. D. Glover(IRL
Press, Oxford), Vol. 1, 49-78, 1985)、λ in vitro
パッケージングキット(商品名、アマシャム・ジャパン
株式会社製)を用いてパッケージングし、ファージライ
ブラリーを作製した。
名Mus musculus)の脾臓cDNAライブラリーを作製し
た。具体的にはマウス脾臓細胞をグアニジンチオシアネ
ート溶液中で溶かし、CsCl溶液に重層し、超遠心分
離にて全RNAを沈澱として回収し、通常のフェノール
/クロロホルム、エタノール処理により精製した。オリ
ゴdTセルロースクロマトグラフィーによりpoly
(A)+ RNAを単離し、逆転写酵素によりcDNAを
複製し、大腸菌DNAポリメラーゼIとRNaseHと
共にインキュベーションすることにより二本鎖にし、そ
の末端にEcoRIリンカーを連結した。このcDNA
をλgt10のEcoRIサイトに挿入して(T. U. Hyunh
et al, DNA Cloning Techniques, ed. D. Glover(IRL
Press, Oxford), Vol. 1, 49-78, 1985)、λ in vitro
パッケージングキット(商品名、アマシャム・ジャパン
株式会社製)を用いてパッケージングし、ファージライ
ブラリーを作製した。
【0017】このライブラリーを前述のcp2.2 のEc
oRI−HindIII の2.5 Kbのフラグメントをプロ
ーブとしてスクリーニングし、適度なストリンジェンシ
ー条件(50℃〜60℃、1×SSC、0.1 %SDS,40m
in)により洗浄し、ハイブリダイズした5つの独立し
たcDNAクローンを常法により単離した。これらをp
UC18のEcoRIサイトにサブクローン化し、kilo-S
equence 用Deletion kit(商品名、宝酒造株式会社製)
を用いたのちに、サンガー法(F. Sangar et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5469, 1977)によって
DNA配列を決定した。これを配列番号1に示す。さら
に、プライマー伸長法(T. Kataoka et al., J. Biol. C
hem., 257, 277-285, 1982) により、配列番号1の10番
目のAより143 bp上流に転写開始点があることを決定
した。これらの5つのcDNAクローンのうち、sp41
と名づけた1つのクローンのみがORF中にperリピ
ートをもっており(配列番号1の73番から243 番)、13
3 アミノ酸からなる未知のタンパク質をコードしてい
た。このクローンをpUCベクターに組換えたpUCS
P41をE.coli HB101 株に導入したものを、平
成5年3月3日に工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託した(受託番号 FERM P-13498 )。
oRI−HindIII の2.5 Kbのフラグメントをプロ
ーブとしてスクリーニングし、適度なストリンジェンシ
ー条件(50℃〜60℃、1×SSC、0.1 %SDS,40m
in)により洗浄し、ハイブリダイズした5つの独立し
たcDNAクローンを常法により単離した。これらをp
UC18のEcoRIサイトにサブクローン化し、kilo-S
equence 用Deletion kit(商品名、宝酒造株式会社製)
を用いたのちに、サンガー法(F. Sangar et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5469, 1977)によって
DNA配列を決定した。これを配列番号1に示す。さら
に、プライマー伸長法(T. Kataoka et al., J. Biol. C
hem., 257, 277-285, 1982) により、配列番号1の10番
目のAより143 bp上流に転写開始点があることを決定
した。これらの5つのcDNAクローンのうち、sp41
と名づけた1つのクローンのみがORF中にperリピ
ートをもっており(配列番号1の73番から243 番)、13
3 アミノ酸からなる未知のタンパク質をコードしてい
た。このクローンをpUCベクターに組換えたpUCS
P41をE.coli HB101 株に導入したものを、平
成5年3月3日に工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託した(受託番号 FERM P-13498 )。
【0018】さらにウサギの網状赤血球を用いる公知の
試験管内翻訳系にてsp41がコードしているポリペプチ
ドがDNA配列から予期したとおりの約16Kdの分子量
を有していることが確認された。具体的には、ブルース
クリプトIISK(+)(商品名、STRATAGENE社製)のE
coRI−HindIII クローニングサイトにクローン
化したcDNAのEcoRI−HindIII フラグメン
ト(約0.4 KbのORF部分)およびHindIII クロ
ーニングサイトにHindIII −HindIIIのフラグ
メント(約1.6 Kbの3´側非翻訳領域)をin vi
troでT7RNAポリメラーゼを使って、センスRN
Aを合成し、タンパク質合成のテンプレートとして用い
た。ORFを含むRNAからは、約16Kdのタンパク質
が合成されたが、3´非翻訳領域およびテンプレートが
ないばあいには何も合成されなかった。図1にそれぞれ
のテンプレートを用いて試験管内翻訳させたものについ
てSDS−PAGEを行なった結果を示す。aは前記の
3´側非翻訳領域、bは前記のORF部分をテンプレー
トとしたばあい、なおcはテンプレートなしのばあいを
示す。図2には、配列番号1のDNAの制限地図を示
す。
試験管内翻訳系にてsp41がコードしているポリペプチ
ドがDNA配列から予期したとおりの約16Kdの分子量
を有していることが確認された。具体的には、ブルース
クリプトIISK(+)(商品名、STRATAGENE社製)のE
coRI−HindIII クローニングサイトにクローン
化したcDNAのEcoRI−HindIII フラグメン
ト(約0.4 KbのORF部分)およびHindIII クロ
ーニングサイトにHindIII −HindIIIのフラグ
メント(約1.6 Kbの3´側非翻訳領域)をin vi
troでT7RNAポリメラーゼを使って、センスRN
Aを合成し、タンパク質合成のテンプレートとして用い
た。ORFを含むRNAからは、約16Kdのタンパク質
が合成されたが、3´非翻訳領域およびテンプレートが
ないばあいには何も合成されなかった。図1にそれぞれ
のテンプレートを用いて試験管内翻訳させたものについ
てSDS−PAGEを行なった結果を示す。aは前記の
3´側非翻訳領域、bは前記のORF部分をテンプレー
トとしたばあい、なおcはテンプレートなしのばあいを
示す。図2には、配列番号1のDNAの制限地図を示
す。
【0019】以上より、sp41のcDNAは断片でなく
全長のタンパクをコードしていることがわかった。
全長のタンパクをコードしていることがわかった。
【0020】2)sp41のcDNAのtHUE−2での
発現 sp41のEcoRI2.8 Kbフラグメントを哺乳動物高
発現用プラスミドベクターpSRαgpt(M. Kondo et
al., Biochimica et Biophysica Acta, 1134,242-246,
1992)のEcoRIサイトに挿入した。このpSRα
gpt−sp41の模式図を図3に示す。pSRαgpt
は、pcDL−SRα296 (Y. Tanabe et al., Mol. Ce
ll. Biol., 8, 466-472, 1988)のSalIサイトにpS
V2gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 20
9, 1422-1427, 1980; R. C. Mulligan and P. Berg, Pr
o. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072-2076) のEcog
ptフラグメント(EcoRI−PvuII 2.5Kb)を
挿入することにより修飾したものである。このベクター
は、SV40の初期プロモーターとHuman T-cell leukemi
a virus type 1のLTRのR−U5配列の一部を融合し
たプロモーターと、SV40の複製起点をもち、マーカー
遺伝子としてEcogptが付加されている。
発現 sp41のEcoRI2.8 Kbフラグメントを哺乳動物高
発現用プラスミドベクターpSRαgpt(M. Kondo et
al., Biochimica et Biophysica Acta, 1134,242-246,
1992)のEcoRIサイトに挿入した。このpSRα
gpt−sp41の模式図を図3に示す。pSRαgpt
は、pcDL−SRα296 (Y. Tanabe et al., Mol. Ce
ll. Biol., 8, 466-472, 1988)のSalIサイトにpS
V2gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 20
9, 1422-1427, 1980; R. C. Mulligan and P. Berg, Pr
o. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072-2076) のEcog
ptフラグメント(EcoRI−PvuII 2.5Kb)を
挿入することにより修飾したものである。このベクター
は、SV40の初期プロモーターとHuman T-cell leukemi
a virus type 1のLTRのR−U5配列の一部を融合し
たプロモーターと、SV40の複製起点をもち、マーカー
遺伝子としてEcogptが付加されている。
【0021】SP41の発現にはtHUE−2を用いた。
この細胞はECV304 (K. Takahashi et al., In Vitro
Cell Dev. Biol., 25, 265-274, 1990)を低血清条件下
で培養することにより形質転換した(M. Kobayashi et a
l., Human Cell, 4, 296-305, 1991) ヒト血管内皮細胞
を無血清のASF301 (極東製薬工業株式会社製)で培
養できるように育種したものである。対数増殖期のtH
UE−2を、0.02%トリプシンで剥離して集め、1×10
7 個/mlとなるようにPBS中に再懸濁してpSRαg
pt−sp41DNA5μgを加えたのちに、氷上で10分
間冷やし、エレクトリックセルボーラーECB−1001
(商品名、理工化学研究所製)の2Kv/cmの電気パル
スを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトし
た細胞はASF301 に播種し直し48時間後に、キサンチ
ン250 μg/ml、ヒポキサンチン13.6μg/ml、グリシ
ン10μg/ml、チミジン11.8μg/ml、アミノプテリン
2μg/ml、ミコフェノール酸2.5 μg/mlを含む選択
培地に替えて、8−12週後には、トランスフェクトされ
てEcogpt遺伝子がゲノムに組込まれた細胞のみが
増殖しコロニーを形成する。充分に成長したコロニーを
常法によりトリプシンで剥離し、実際にsp41を発現し
ていることをノーザンブロット法(P. S. Thomas, Pro.
Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-5205)により確認でき
た。組換えDNAでトランスフェクトしたtHUE−2
のmRNAをsp41cDNAのXbaI−PstI断片
約370 bpをプローブとしたノーザンブロットの結果を図
4に示す。1はクローン25-12 、2はクローン2.5-11、
3は2.5-13、4はクローン2.5-9、5はベクターのみを
トランスフェクトしたクローンA、6はクローン2.5-2
D、とそれぞれ名づけた形質転換体、7はベクターのみ
をトランスフェクトしたクローン、8は野生株を示す。
クローン25-12 、2.5-11、2.5-9 、2.5-2DがSP41を発
現していることがわかる。3.7 kbは2.8 kbのsp41
のRNAとベクター由来のRNAが含まれる。
この細胞はECV304 (K. Takahashi et al., In Vitro
Cell Dev. Biol., 25, 265-274, 1990)を低血清条件下
で培養することにより形質転換した(M. Kobayashi et a
l., Human Cell, 4, 296-305, 1991) ヒト血管内皮細胞
を無血清のASF301 (極東製薬工業株式会社製)で培
養できるように育種したものである。対数増殖期のtH
UE−2を、0.02%トリプシンで剥離して集め、1×10
7 個/mlとなるようにPBS中に再懸濁してpSRαg
pt−sp41DNA5μgを加えたのちに、氷上で10分
間冷やし、エレクトリックセルボーラーECB−1001
(商品名、理工化学研究所製)の2Kv/cmの電気パル
スを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトし
た細胞はASF301 に播種し直し48時間後に、キサンチ
ン250 μg/ml、ヒポキサンチン13.6μg/ml、グリシ
ン10μg/ml、チミジン11.8μg/ml、アミノプテリン
2μg/ml、ミコフェノール酸2.5 μg/mlを含む選択
培地に替えて、8−12週後には、トランスフェクトされ
てEcogpt遺伝子がゲノムに組込まれた細胞のみが
増殖しコロニーを形成する。充分に成長したコロニーを
常法によりトリプシンで剥離し、実際にsp41を発現し
ていることをノーザンブロット法(P. S. Thomas, Pro.
Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-5205)により確認でき
た。組換えDNAでトランスフェクトしたtHUE−2
のmRNAをsp41cDNAのXbaI−PstI断片
約370 bpをプローブとしたノーザンブロットの結果を図
4に示す。1はクローン25-12 、2はクローン2.5-11、
3は2.5-13、4はクローン2.5-9、5はベクターのみを
トランスフェクトしたクローンA、6はクローン2.5-2
D、とそれぞれ名づけた形質転換体、7はベクターのみ
をトランスフェクトしたクローン、8は野生株を示す。
クローン25-12 、2.5-11、2.5-9 、2.5-2DがSP41を発
現していることがわかる。3.7 kbは2.8 kbのsp41
のRNAとベクター由来のRNAが含まれる。
【0022】3)SP41の機能
In vitroウーンドアッセイ(wound assey) (F.
G. Giancotti and E.Ruoslahti, Cell, 60, 849-859, 1
990) により、ベクターのみでトランスフェクトした細
胞株とSP41発現株(クローン2.5-11)の細胞移動特性
を調べた。すなわち、サブコンフレント(subconflent)
に単層培養された細胞を1mm幅でかきとり洗浄したあ
と、マノメーター(オリンパス社製)を用いて細胞の移
動を測定すると、図5に示すとおりSP41発現細胞株の
移動度は、対照細胞株に比較して減少していた。これ
は、sp41cDNAの発現がtHUE−2の移動能力を
抑制していることを示している。
G. Giancotti and E.Ruoslahti, Cell, 60, 849-859, 1
990) により、ベクターのみでトランスフェクトした細
胞株とSP41発現株(クローン2.5-11)の細胞移動特性
を調べた。すなわち、サブコンフレント(subconflent)
に単層培養された細胞を1mm幅でかきとり洗浄したあ
と、マノメーター(オリンパス社製)を用いて細胞の移
動を測定すると、図5に示すとおりSP41発現細胞株の
移動度は、対照細胞株に比較して減少していた。これ
は、sp41cDNAの発現がtHUE−2の移動能力を
抑制していることを示している。
【0023】さらに、対照細胞株(tHUE−2野生
株、ベクター導入細胞株)、sp41発現細胞株における
フィブロネクチン、TGF−β1、Decorin、β
−ActinのmRNA発現量をそれぞれヒトフィブロ
ネクチンcDNAのXbaI−NsiIの1.4 kbフラ
グメント、ヒトTGF−β1cDNAのXbaI−Xb
aIの1.3 kbフラグメント、ヒトデコリンcDNAの
EcoRI−HindIII の0.95kbフラグメント、ヒ
トβ−アクチンcDNAのBamHI−BamHIの2.
1 kbフラグメントをプローブとしてノーザンブロット
法で調べると、TGF−β1、Decorin、β−A
ctinは、二者間で差がみられないが、フィブロネク
チンmRNAの発現量がSP41発現細胞株で顕著に増加
していた。ヒトフィブロネクチンcDNAおよびヒトT
GF−β1cDNAを用いたばあいのノーザンブロット
の結果を、それぞれ図6、図7に示す。いずれも1、
2、3はそれぞれ発現株25-12 、2.5-11、2.5-2Dを、4
はベクターのみでトランスフェクトしたクローンBを、
5は野生株を示す。
株、ベクター導入細胞株)、sp41発現細胞株における
フィブロネクチン、TGF−β1、Decorin、β
−ActinのmRNA発現量をそれぞれヒトフィブロ
ネクチンcDNAのXbaI−NsiIの1.4 kbフラ
グメント、ヒトTGF−β1cDNAのXbaI−Xb
aIの1.3 kbフラグメント、ヒトデコリンcDNAの
EcoRI−HindIII の0.95kbフラグメント、ヒ
トβ−アクチンcDNAのBamHI−BamHIの2.
1 kbフラグメントをプローブとしてノーザンブロット
法で調べると、TGF−β1、Decorin、β−A
ctinは、二者間で差がみられないが、フィブロネク
チンmRNAの発現量がSP41発現細胞株で顕著に増加
していた。ヒトフィブロネクチンcDNAおよびヒトT
GF−β1cDNAを用いたばあいのノーザンブロット
の結果を、それぞれ図6、図7に示す。いずれも1、
2、3はそれぞれ発現株25-12 、2.5-11、2.5-2Dを、4
はベクターのみでトランスフェクトしたクローンBを、
5は野生株を示す。
【0024】実際に、フィブロネクチンタンパク質が増
加していることを、免疫染色により確認した。ヒトフィ
ブロネクチンに対するモノクローナル抗体(ラホヤ癌研
究財団のE. Ruoslahti博士より供与された)を用いて細
胞を染色すると、SP41発現細胞に強い染色像が見られ
た。sp41cDNAの発現によりフィブロネクチン遺伝
子の劇的な転写増加がおこり、細胞外マトリクスに大量
のフィブロネクチンが沈着したものと考えられる。
加していることを、免疫染色により確認した。ヒトフィ
ブロネクチンに対するモノクローナル抗体(ラホヤ癌研
究財団のE. Ruoslahti博士より供与された)を用いて細
胞を染色すると、SP41発現細胞に強い染色像が見られ
た。sp41cDNAの発現によりフィブロネクチン遺伝
子の劇的な転写増加がおこり、細胞外マトリクスに大量
のフィブロネクチンが沈着したものと考えられる。
【0025】対照細胞株(tHUE−2野生株、ベクタ
ー単独導入株)とSP41発現株のin vitroでの
細胞増殖性を、10%FBS添加ダルベッコ改変イーグル
培地(D´MEM)および軟寒天培地((I. MacPherson
and L. Montagnier,Virology, 23, 291-294, 1984)の方
法による)中で調べたが、有意差は見られなかった。そ
れぞれの結果を図8および図9に示す。
ー単独導入株)とSP41発現株のin vitroでの
細胞増殖性を、10%FBS添加ダルベッコ改変イーグル
培地(D´MEM)および軟寒天培地((I. MacPherson
and L. Montagnier,Virology, 23, 291-294, 1984)の方
法による)中で調べたが、有意差は見られなかった。そ
れぞれの結果を図8および図9に示す。
【0026】ヌードマウスにおける対照細胞株(tHU
E−2野生株、ベクター単独野生株、sp41導入SP41
非発現株)とSP41発現株との腫瘍形成能を調べるため
に6週齢のメスのヌードマウス(nu/nu)の皮下に
1×107 個/マウスずつ移植した(F. G. Giancotti and
E. Ruoslahti, Cell 60, 849-859, 1990 参照)。in
vivoでは、対照細胞株が2ないし3ヵ月以内に巨
大な腫瘍を形成する一方、SP41発現細胞株のばあい
は、腫瘍形成が顕著に抑制されていた。図10に結果のグ
ラフを示す。
E−2野生株、ベクター単独野生株、sp41導入SP41
非発現株)とSP41発現株との腫瘍形成能を調べるため
に6週齢のメスのヌードマウス(nu/nu)の皮下に
1×107 個/マウスずつ移植した(F. G. Giancotti and
E. Ruoslahti, Cell 60, 849-859, 1990 参照)。in
vivoでは、対照細胞株が2ないし3ヵ月以内に巨
大な腫瘍を形成する一方、SP41発現細胞株のばあい
は、腫瘍形成が顕著に抑制されていた。図10に結果のグ
ラフを示す。
【0027】
【発明の効果】本発明の新規DNA、ポリペプチドおよ
び組換えDNAにより、従来より知られているがん抑制
遺伝子とは異なる作用機序、すなわち宿主側のなんらか
の因子との相互作用により腫瘍形成能を抑制する、新し
いタイプのがん抑制遺伝子が明らかになった。これによ
り、まったく新しいタイプの腫瘍抑制剤の開発も可能と
なる。
び組換えDNAにより、従来より知られているがん抑制
遺伝子とは異なる作用機序、すなわち宿主側のなんらか
の因子との相互作用により腫瘍形成能を抑制する、新し
いタイプのがん抑制遺伝子が明らかになった。これによ
り、まったく新しいタイプの腫瘍抑制剤の開発も可能と
なる。
【0028】
配列番号:1
配列の長さ:2851
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
起 源
生物名:Mus musculus
株名:Balb/c
配列の特徴73..243
per リピート
配 列
TGAGCATTG ATG TTG ACA TAC AAA GGA ATG AAC TGC GGC CCA CTC ACT 48
Met Leu Thr Tyr Lys Gly Met Asn Cys Gly Pro Leu Thr
1 5 10
GGC AGG AGG ATT TTC TGG TAT TAT TCA ACC CAG AGT ACA GCA CAG CAC 96
Gly Arg Arg Ile Phe Trp Tyr Tyr Ser Thr Gln Ser Thr Ala Gln His
15 20 25
AGC ACA GCA CAG CAC AGC ACA GCT CAG CAC AGC ACA GCA CAA CAC AAC 144
Ser Thr Ala Gln His Ser Thr Ala Gln His Ser Thr Ala Gln His Asn
30 35 40 45
ACA GCA CAC CAC AGC ACA CCA CAG CAC AGC ACA GCC CAG CAC ACC ACA 192
Thr Ala His His Ser Thr Pro Gln His Ser Thr Ala Gln His Thr Thr
50 55 60
GCA CAC CAC AGC ACA CCA CAG CAC ACC ACA GCA CAC TAC AGC ACC GGC 240
Ala His His Ser Thr Pro Gln His Thr Thr Ala His Tyr Ser Thr Gly
65 70 75
TTT ACT AAT GGC AGA TTA ATT GGA TCT GGG TTT CTG AAT GTG GGT CAG 288
Phe Thr Asn Gly Arg Leu Ile Gly Ser Gly Phe Leu Asn Val Gly Gln
80 85 90
TTT GGG TTG GAA GTG ATT TTA TTA GCA AGA AAC CTC TCT AAA ACC CCA 336
Phe Gly Leu Glu Val Ile Leu Leu Ala Arg Asn Leu Ser Lys Thr Pro
95 100 105
CCC CAC TCC CTA CCC CTC GCC CTC CTT GAA ACG CTA GGC CAC ACG CTT 384
Pro His Ser Leu Pro Leu Ala Leu Leu Glu Thr Leu Gly His Thr Leu
110 115 120 125
TCC TCT GTG GCT CAG GGC ACT CTC TAGAAGCTTC TGAGGAGCAA 428
Ser Ser Val Ala Gln Gly Thr Leu
130 133
TGTGTTTTCT CTGCTAGATT TCACGGGCAG CCGTGCTGGG ACTTGGTAAA GTTGGGACTT 488
GGTAAAGTTA TGTTTGGAGT TCACGGAATT TCTCAGCGTG CTGAAAGTTA AATTCCAGGA 548
CAGAAGGGAA CCAGCACTGG GCTCAGACCC TGGGGCCAGA GTCCTTGTCT TAGCCCAGCT 608
TCTATAACTT GCCATGTGAC CTTGGGCAAG TATTGGCATC ATGTTTTAAC TCATGGAAAA 668
CTTTTTTTTT TAAAAGGAAG AAGGGCTACC TGGGATTGTT TTCCATCCAT CCATGGGTTT 728
ACCTGTCTGT CTGTCTGTCT GTCTGTCTGT CTGTCTGTCT ATCATTTCAC AGACACTTAG 788
AGACTATGTT TTCTAGACTT TGCTTACAAA GTAGAGGATA AATTAACGGG TAGAACCTCC 848
AAGTCTGGAG AGAGCCAGGA TTTTCTCTTC ACATAGTTTC TGAGTACCCT TAAGAACCTA 908
TTTAATTGGG TCCTGGTCTT CCTCTGTGAC ATGTACTACA ATTTTATAGA CTTCACTTAG 968
ATTCTGATGT CCCTTTAAAA AGCATTTTTT TTTAAAAAAA AAGCATTAAA TGCCTTATTA 1028
AATTTTTCTG AGGATGTTCA GTCCTCAGGG ACTGTCCATC TTGTGTGGAA ACCTGCTCGC 1088
TCAGCAGCTC TACTTCAGTG TAACCACTGT GCAAATAAAA GGCTTCCTGC CTCCAGTCTG 1148
TCTACCCTTC TTTTTTGTTT CCTGTAAATA CCTACCCAGG GGCTCTTACT CTAGAACTTA 1208
GTTAACGAAT GATGGCCCAC CAACAAGATA ATTACCCAGA ATCCCTTTTG AATCATCTAG 1268
GCTGCTGGAA ATGGGTTGGC AGTGGCTCTC TGGGGAGCAA AGGTTCTCAG CCGTGGGGGA 1328
GGGCGGAGTT GGGGGAGGGC ATAAGAGTCA GGGAAAGGAC CTCTCAGAAG GACATCAGAA 1388
TTTAAACTGC TTAGAGCACA GACACTAAAC TGCTGCTAGA TGTTGGCCTC CAGAGGCCTG 1448
GGAATGGCTG CTCTGGACCT CAGCCTGTTT GGAGGAACAC TAGGAGTGCT GATAGCAATC 1508
CTTTGTCCTC GTCATGGTCC ATCATAGTCC TAGTCCTTCA CCCACTGTAT CTTCACATTC 1568
CCTGCCTGCA GCTCTCCTCC CTNNCCCCTC CCCCTNCCCC CTCCCCCCAT CTTGGCTGAG 1628
TATTTTTGCA TCCTCACCCT TTCCATTCCC ACCCCACCTC GCTCCTCTTC ACTCCATGCC 1688
CCATAGCCCT CTCTCTACCT TGGGCCTGTT TCTATACAAA CAGGTGTGCA AGACAAGGAT 1748
ATATTCCTAA TTTCTGGATG AGGAGGTGGA GACAGCATTA CCAGTCACGG TCCAGGCATG 1808
GGTAACATCC AGTTATCCTT GAGTTCAGTT CCTTGGTTTA GACAGGGAAA CCTAGAACTG 1868
TCTGTCTCTC AGGAGTCCAG AATGGGGCCA TCTTCAAGCT CAGGGGGATA GAAGGTGAGG 1928
TGGGCACTGT GAAGAGCCAT TTATTTCTAG ATTAGAAGAC AAGTGTGTTG ATGACACAGG 1988
TTTGTTTGCC CCCCTGCTTG CTCAAGTCAA AGAAGCTTCC AGAAGAATAT GAACAGCTGC 2048
CAATATGTAG AGATTCTGGG GAGATATTTA AGACAGTAGA TGAGGGCTTA TATATACTCC 2108
TTCATGGTGA GTATGCTGGT TATGGTATAA GCCTTGACTT CAGAAGTTTT CTTTCTGATG 2168
ATTAACACTT TCTGATGATT CGTCACCAAG TTGAGGTTCC CAGAACAGCA GGACAAAGGG 2228
TCCTAGTGAT GCTTCCTATA TGGGAGAAGT CTGTTTGCAA ATTTCTCATT GAAGGCTCCA 2288
AATTGAGGAT ACGAGAAGCA AGATGAGTGT GGCATTGCTC CTCAATGTAG AAGCTCCGTT 2348
CCTTTATTCA TGGGGAGCGT GGCCCCAGGC GATACACACA AGAGCAGGCA GAGGTTCTGT 2408
CTCTACTTAC TCAAGGGCTT CCTTGACAGA GAGCTTTCTG TGTTTGCAGT TGGCTCCTGA 2468
GGAGACTGTC GAACCTTAGA AGCAGCTAAG GATCTTACTG AGAGCCCTGG GGTCCTGTTG 2528
TGGGGTAGAA GGTTTAGTAG GAGTGCTGGG TTGGTATTAG ATAGTAGCAT AGACCAGCCA 2588
AACCTGTGGG GCTAGGAAGG AGGCCAGTCT TGTACTAACA TCTTCTGTAT GAAGTAGAAA 2648
AATTGTTCAA CATCTTCTTT CTTTAAAGCC CGAGAAACTC AGGAAATAAC ACTGGTGACA 2708
GGTGTCAGAA ACCTGGTCTG AAAGTGGAAA GGAGAGGCTA AGGTGGGATG ATCATAAGTT 2768
TGAAGCTAGC CTAGGGCACA TAACAAGTCT CAGAGGCCAA CCTGAGCTAC AAAGCAAGCT 2828
TTGTCATAAA AAAAAAAAAA AAA 2851
【0029】配列番号:2
配列の長さ:133
配列の型:アミノ酸
トポロジー:不明
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル配列:Yes
配 列
Met Leu Thr Tyr Lys Gly Met Asn Cys Gly Pro Leu Thr Gly Arg Arg
1 5 10 15
Ile Phe Trp Tyr Tyr Ser Thr Gln Ser Thr Ala Gln His Ser Thr Ala
20 25 30
Gln His Ser Thr Ala Gln His Ser Thr Ala Gln His Asn Thr Ala His
35 40 45
His Ser Thr Pro Gln His Ser Thr Ala Gln His Thr Thr Ala His His
50 55 60
Ser Thr Pro Gln His Thr Thr Ala His Tyr Ser Thr Gly Phe Thr Asn
65 70 75 80
Gly Arg Leu Ile Gly Ser Gly Phe Leu Asn Val Gly Gln Phe Gly Leu
85 90 95
Glu Val Ile Leu Leu Ala Arg Asn Leu Ser Lys Thr Pro Pro His Ser
100 105 110
Leu Pro Leu Ala Leu Leu Glu Thr Leu Gly His Thr Leu Ser Ser Val
115 120 125
Ala Gln Gly Thr Leu
130 133
【0030】配列番号:3
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配 列
CCTGAGCTGT ATGAACAAGG ATC 23
C
【図1】それぞれのテンプレートを用いて試験管内翻訳
させたものについてSDS−PAGEを行なった結果を
示すスケッチである。
させたものについてSDS−PAGEを行なった結果を
示すスケッチである。
【図2】配列番号1のDNAの制限地図である。
【図3】pSRαgpt−sp41の模式図である。
【図4】組換えDNAでトランスフェクトしたtHUE
−2のmRNAをsp41cDNAのXbaI−PstI
断片約370 bpをプローブとしたノーザンブロットの結果
を示すスケッチである。
−2のmRNAをsp41cDNAのXbaI−PstI
断片約370 bpをプローブとしたノーザンブロットの結果
を示すスケッチである。
【図5】SP41発現株の細胞移動度のグラフである。
【図6】SP41発現株の、ヒトフィブロネクチンcDN
Aをプローブとしたノーザンブロットの結果を示すスケ
ッチである。
Aをプローブとしたノーザンブロットの結果を示すスケ
ッチである。
【図7】SP41発現株の、ヒトTGF−β1cDNAを
プローブとしたノーザンブロットの結果を示すスケッチ
である。
プローブとしたノーザンブロットの結果を示すスケッチ
である。
【図8】SP41発現株の10%FBS添加ダルベッコ改変
イーグル培地(D´MEM)中での細胞増殖性を示すグ
ラフである。
イーグル培地(D´MEM)中での細胞増殖性を示すグ
ラフである。
【図9】SP41発現株の軟寒天培地中での細胞増殖性を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図10】SP41発現株のヌードマウス皮下での腫瘍形
成能を示すグラフである。
成能を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI
C12N 5/10 C12N 5/00 A
(72)発明者 橋本 將男
大阪府大阪市生野区巽西一丁目8番1号
清和寮
(56)参考文献 Nature,1985,Vol.317,
No.6036,p.445−448
血液・腫よう科,1990,Vol.21,
No.1,p.54−61
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N 15/09
C12N 15/12
C07K 14/47
SwissProt/PIR/GeneS
eq
GenBank/EMBL/DDBJ/G
eneSeq
BIOSIS/WPI(DIALOG)
PubMed
Claims (11)
- 【請求項1】 配列番号2で示されるアミノ酸配列を含
んでなるポリペプチド。 - 【請求項2】 配列番号2で示されるアミノ酸配列にお
いて、1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、及
び/または付加されているアミノ配列を含む、腫瘍形成
能抑制活性を有するポリペプチド。 - 【請求項3】 配列番号1で示されるDNA配列を含ん
でなるDNA。 - 【請求項4】 配列番号1の10番から408番までの
DNA配列を含んでなるDNA。 - 【請求項5】 請求項1または2記載のポリペプチドを
コードするDNA配列を含んでなるDNA。 - 【請求項6】 少なくとも配列番号1の73番から24
3番までのDNA配列を含んでなるDNA。 - 【請求項7】 請求項3または4記載のDNAにおい
て、1若しくは数個の塩基が欠失、置換、及び/または
付加されている、腫瘍形成能抑制活性を有するDNA。 - 【請求項8】 ストリンジェントな条件のもとで、請求
項3〜6のいずれか1項記載のDNAにハイブリダイズ
することができる腫瘍形成能抑制活性を有するDNA。 - 【請求項9】 請求項3〜8のいずれか1項記載のDN
Aを含む組換えDNA。 - 【請求項10】 請求項3〜8のいずれか1項記載のD
NA、または請求項8記載の組換えDNAで形質転換さ
れた形質転換体。 - 【請求項11】 請求項3〜8のいずれか1項記載のD
NAに相補的なRNA。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP06923193A JP3427090B2 (ja) | 1993-03-03 | 1993-03-03 | 新規dna、ポリペプチドおよび組換えdna |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP06923193A JP3427090B2 (ja) | 1993-03-03 | 1993-03-03 | 新規dna、ポリペプチドおよび組換えdna |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06253848A JPH06253848A (ja) | 1994-09-13 |
JP3427090B2 true JP3427090B2 (ja) | 2003-07-14 |
Family
ID=13396758
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP06923193A Expired - Lifetime JP3427090B2 (ja) | 1993-03-03 | 1993-03-03 | 新規dna、ポリペプチドおよび組換えdna |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3427090B2 (ja) |
-
1993
- 1993-03-03 JP JP06923193A patent/JP3427090B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Nature,1985,Vol.317,No.6036,p.445−448 |
血液・腫よう科,1990,Vol.21,No.1,p.54−61 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH06253848A (ja) | 1994-09-13 |
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