JPH05503008A - 直接フィブリノーゲンアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトロンビンを試薬として使用し、血漿中のフィブリノーゲンの濃度を測 定するための方法に係る。

トロンビンを使用してフィブリノーゲン濃度を測定する先行方法には、血漿トロ ンビン反応が起るのに要する時間（血液凝固時間）の測定に基づくクラウス法と ＡＣＬ３フィブリノーゲンアブセイが挙げられる。クラウス法は、ＡＲＴＨＵＲ Ｒ，ＴｂｏｍｐｓｏａＢｅ＋ｌｉ＋＋＋ａａｎｇ　ｄｅ＋　Ｆｉｂｒｉｎｏｇｍ ＋、＾ｃｔｚ　［１ｔｅｉｔｊｏ１，１７：２３７（１９５７）に記載されてい る。ＡＣＬａ法は、Ｅ、　Ｒｏ＋＋ｉ、　Ｐ、　Ｍｏｎｄｏｎｉｃｏ、　ＡＬｏ ｍｚｂｉ＋ｄｉ、　Ｌ、　Ｐｒｅｄｚ著、１ｌｅｔｈｏｄ　ｌｏｔ　ｔｈｅ　Ｄ ！ｔｅ＋ｍ１ｎａｔｉｏｎ　ｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ（Ｃ１ｏ１ｔ１ｂｌｅ） Ｆｉｂ＋ｉｎｏｇｏｎ　ｂ７　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｆｓｍｉ１７　ｏＩＡＣＬ　Ｃ ｏｌｇａｌｏｍｅｔｅｒ＋、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ＋　Ｒｅ＋ｅ１ｒｃｈ　５２： ４５３〜４６９（１９８８）に記載されている。これらの方法は血液凝固時間又 は光学的透過率の変化のような関連パラメーターの測定と所定時間に機器及び試 薬の条件を補正するため校正用血漿の多重稀釈に依っている。校正用血漿（即ち 、既知のフィブリノーゲン濃度を有する血漿）を使用して条件が保証される場合 はいつでも繰返して「標準線」又は「検量線」を作製しなければならない。未知 試料のフィブリノーゲン濃度の定量には、凝固時間のような関連量を測定し、継 いで標準曲線から濃度を「読み取る」。この方り＼１ 法は相当な計算を伴うことマあって、長たらしくて時間がかかＩることがしばし ばある。

これらの先行方法のもう１つの欠点は、測定される関連量がしばしば機器に左右 され、同様に反応にも左官されることである。たとえば、関連パラメータを測定 するため使用する器具が散乱し又は透過された光を検出する電気光学系を用いる 場合、測定により得られる数値は、光センサーにより計測される信号レベルに依 存し、それは今度は反応器に入射する光量と同様に光センサーと連係して使用さ れる電気的ゲインにも依存する。

これらの量の数値は時間の経過とともに不変のままではないし、径路ごとに、又 は機器ごとに一定してもいない。

発明の概要 従って、本発明の目的は、先行方法より更に能率的で有効な、血液試料中のフィ ブリノーゲンの濃度の測定方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、フィブリノーゲン濃度を定量する基礎となっている 、光の透過率の変化を測定する場合の機器による変動及び径路による変動の影響 を打ち消すことである。

標準曲線を繰り返し確定する必要をなくするやり方で測定量を使用することもや はり本発明の目的である。

本発明は血漿試料中のフィブリノーゲンの濃度を測定する方法を提供する。本発 明方法では、フィブリノーゲンを含有する血漿の試料を容器に供給する。トロン ビンを試料に添加して、試料と混合し反応混合物を形成する。当初の光透過率を 反応混合物について測定する。トロンビンとフィブリノーゲンを反応混合物中で 互いに反応させる。最終の光透過率を反応混合物について測定する。測定は後記 のようにして操作を行い、フィブリノーゲンの濃度をあらかじめ確定した標準曲 線により決定する。

標準曲線を機器、試薬又は試料の変化により変化しないようなやり方で作図する ことが本発明の態様である。従って、一度確定した場合、繰り返してそれを再作 図することは不必要である。

好ましい実施１様の説明 本発明方法は、本出願の譲受人にＷａ！させた「多重チャネル光モニター系」と 称するＳｖｏ　ｐ　ｅ　らの同時出願された同時係属米国特許出願番号０７／４ ４３．９５２号（その開示を引用により本書に含める）に開示されているような 光モニター系との併用、又は本譲受人の型式Ｃｏａｇ−＾−１１ｘｌｅ　ＸＣ若 しくは型式Ｃｏｉｇ−Ａ−Ｍａｔｅ　ＸＭのような市販の止血機器との併用によ り使用するのが好ましい。

本発明方法に適する大体の試薬／血漿濃度は、前記クラウスフィブリノーゲン法 により知られている。トロンピノ濃度は約１００　ＮＩＨ単位（高いトロンビン 濃度）であるのが好ましく、血漿試料はＱ　ｖｔｌｎのベロナール緩衝液（パル ビタールナトリウム）を用いて１．１０の比（低い血漿濃度）に希釈するのが好 ましい。

本発明では、反応の開始前の光透過率と反応の終結時の光透過率の間の全変化に ついて、フィブリノーゲンの形成を光学的に追跡する。本方法に従って、試薬を 血漿に添加して、試料−試薬を完全に混合をさせた後、最初の透過率信号（Ｔ、 ）を記録する。血漿が充分形成した後、最後の透過率信号（Ｔ［）を後記のよう に処理する。

関連パラメーターδ又はＤは、初期値に任意のオフセットを加えたのに対して読 み取りの差を正規化することにより最初と最後の透過率測定値から次式により計 算する。

Ｄはδの正規化した数値であり、 Ｔ　は凝血の発生前の透過光の数値であり、Ｔ、は凝血の形成後の透過光の数値 であり、Ｓ　は機器設計の部分として課せられていることがあり得るディジタル オフセットであり、 Ｋは便宜上選択される任意定数である。

先行方法では、Ｄは差（Ｔ、−Ｔ、）のみで定義したことに注目すべきである。

前記式中の分母は透過率の初期値に対するＤの正規化を表わす。

未知明試料のフィブリノーゲンの濃度を測定する次のステ・ツブは、標準曲線の 使用によりＤの前記測定値を濃度と対比することである。これは量 口ここに、Ｄ　は既知フィブリノーゲン濃度の校正用血漿にっいてあらかじめ測 定したδであるコを先ず算定することにより行う。Ｄ　の計測は試験条件の変化 が保証されるに応じて比較的希に行われる。次のステップは、Ｒとフィブリノー ゲン濃度の間の関係を記載するあらかじめ決定した相関式を使用して、試料のフ ィブリノーゲン濃度を決定することである。Ｒとフィブリノーゲン濃度と関係づ ける相関式は指示された試薬と校正用血漿が異っても箸しく変ることがないこと が見出されている。

従って、それはコンピュータソフトウェアの一部として永久保存することができ て、定期的再計算を必要としない。

相関式は好ましくは次のように導く。即ち、既知フィブリノーゲン濃度の種々の 標準血漿を調製してδ値Ｄ　をそれぞれの標準血漿に対して決定する。次に、各 標準血漿について値Ｒ５を次式に基づいて計算する Ｒ　は標準血漿に対するＲ値であり、 Ｄ　は標準血漿に対する測定δ値であって、Ｄ　は校正用血漿に対してあらかじ め決定されたδである。

次いで種々の血漿についてＲ対ｌｏｇ（Ｃ／Ｃ）をプロツトすることによって相 関式を導く。ここで、Ｃは標準血漿のフィブリノーゲン濃度であり、Ｃは校正用 血漿のフィブリノーゲン濃度である。

本発明の前記説明は種々の修正、変更及び応用を行うことがヒ でき、付属の請求の範囲の均等の意味と範囲内で理解されることを意図している ものと理解されたい。

特許庁長官　深　沢　亘　殿　平成４年６月１日１．特許出願の表示　ＰＣＴ／ ＵＳ　９０１０６９８８３、特許出願人 住　所　オランダ国、６８００・エル・ニス・アーネム、ベー・オー・ボックス ・１８６、フエルベルウエヒφ７６ 名　称　アクゾ・エヌ・ヴ工− ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル６、添附書類の 目録 （１）補正書の翻訳文　１通 請求の範囲 １、　血漿試料中のフィブリノーゲンの濃度を光学的に測定する方法であって、 容器にフィブリノーゲンを含有する血漿の試料を供給すること、 その試料にトロンビンを添加すること、トロンビンと試料を混合して、反応混合 物を形成すること、反応混合物について最初の光透過率を測定すること、反応混 合物中でトロンビンとフィブリノーゲンを互いに反応させること、 反応混合物について最後の光透過率を測定すること、最後の透過率測定を最初の 透過率測定と比較して、本明細書中以下δ値と称する、全体の光透過率の変化を 計算すること、及び 該δ値に基づいてフィブリノーゲンの濃度を決定すること、から成る前記測定方 法。

２、トロンビンが約ＩＱＱＮ　Ｉ　Ｈ単位の濃度であって、血漿試料をバルビタ ールナリトウムを用いて約１：１０の比に希釈する、請求の範囲第１項の方法。

３、δ値が式 りはδの正規化した値であり、 Ｔ　は試料の最初の光透過率であり、 Ｔ１は試料の最後の光透過率であり、 Ｓｏは前記方法を行うために使用する装置に応じて変るオフセットであって、 Ｋはあらかじめ決定した決定である。コにより計算される、請求の範囲第１項の 方法。

４、　フィブリノーゲン濃度を決定する前記ステップ力、更ニ、試料のフィブリ ノーゲン濃度を値Ｒ口ここに、Ｒ１４式から計算され、式中、 Ｄは試料血漿のδ値であって、 Ｄ　は校正用血漿のδ値である。］から決定し得る相関式を導くステップ、及び 血漿試料のフィブリノーゲン濃度を、誘導された相関式に基づいて決定するステ 、ツブから成る、請求の範囲第３項の方法。

５、相関式を、 種々の既知濃度の多数の標準血漿についてδ値を測定すること、 既知濃度の校正用血漿についてδ値を測定すること、及び多数の標準血漿につい てＲ対１ｏｇ（Ｃ／Ｃｃ）［ここＬ に 式中 Ｒは標準血漿に対するＲ値であり、 Ｄ　は標準血漿に対する測定δ値であり、Ｄ　は校正用血漿に対する測定δ値で あり、Ｃは標準血漿のフィブリノーゲンの濃度であって、Ｃは校正用血漿中のフ ィブリノーゲンの濃度である。］をプロットすることによって導（、請求の範囲 第４項の方法。

国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．血漿試料中のフィブリノーゲンの濃度を光学的に測定する方法であって、 容器にフィブリノーゲンを含有する血奬の試料を供給すること、 その試料にトロンビンを添加すること、トロンビンと試料を混合して、反応混合 物を形成すること、反応混合物について最初の光学的透過率を測定すること、反 応混合物中でトロンビンとフィブリノーゲンを互いに反応させること、 反応混合物について最後の光学的透過率を測定すること、最後の透過率測定を最 初の透過率測定と比較してδ値を計算すること、及び 該δ値に基づいてフィブリノーゲンの濃度を決定すること、から成る前記測定方 法。
2. ２．トロンビンが約１００ＮＩＨ単位の濃度であって、血漿試料をバルビタール ナリトウムを用いて約１：１０の比に希釈する、請求の範囲第１項の方法。
3. ３．δ値が式 Ｄ＝Ｔｉ−Ｔｆ／Ｔｉ＋Ｓｏ×Ｋ ［ここに、 Ｄはδの正規化した値であり、 Ｔｉは試料の最初の光学的透過率であり、Ｔｆは試料の最後の光学的透過率であ り、Ｓｏは前記方法を行うために使用する装置に応じて変るオフセットであって 、 Ｋはあらかじめ決定した定数である。］により計算される、請求の範囲第１項の 方法。
4. ４．フィブリノーゲン濃度を決定する前記ステップが、更に、試料のフィブリノ ーゲン濃度を値Ｒ［ここに、Ｒは式Ｒ＝ｌｏｇ（Ｄ／Ｄｃ） から計算され、式中、 Ｄは試料血漿のδ値であって、 Ｄｃは校正用血漿のδ値である。］から決定し得る相開式を導くステップ、及び 血漿試料のフィブリノーゲン濃度を、誘導された相関式に基づいて決定するステ ップから成る、請求の範囲第１項の方法。
5. ５．相関式を、 種々の既知濃度の多数の標準血漿についてδ値を測定すること、 既知濃度の校正用血漿についてδ値を測定すること、及び多数の標準血漿につい てＲｓ対ｌｏｇ（Ｃｓ／Ｃｃ）［ここに Ｒｓ＝ｌｏｇ（Ｄｓ／Ｄｃ） 式中 Ｒｓは標準血漿に対するＲ値であり、 Ｄｓは標準血漿に対する測定δ値であり、Ｄｃは校正用血漿に対する測定δ値で あり、Ｃｓは標準血漿のフィブリノーゲンの濃度であって、Ｃｃは校正用血漿中 のフィブリノーゲンの濃度である。］をプロットすることによって導く、請求の 範囲第４項の方法。