JPH05501416A - エンドトキシンの毒性作用の治療のためのラクトフェリンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エンドトキシンの毒性作用の治療のためのラクトフェリンの使用 この発明は、エンドトキシンの毒性作用の予防的処置ならびに治療的処置のため の薬剤としてのラクトフェリンの使用に関係する。

ラクトフェリンは、平均分子量７７．０００ダルトンの糖蛋白質である。これは 、２分子の鉄と可逆的に結合することができる。それはまた、鉄の代わりに綱、 マグネシウム、亜鉛、マンガンまたはコバルトのような、２価または３価の金属 イオンとも結合することができる。

ラクトフェリンは、１９６０年に初めて、牛乳から分離された。ヒト乳汁のラク トフェリン含量は、約１■／ｄＱである。

ラクトフェリンは、また血液、好中性顆粒球、涙液、胃液または腸管分泌物中で も見い出されている。血中に見い出されるラクトフェリン濃度は、４０〜２００ μｇ／ａである。

主に好中性顆粒球の顆粒によって放出される血中のラクトフェリンは、特に感染 症や炎症性経過の期間中において、細胞内皮系の細胞への鉄輸送のいくつかの局 面に寄与する［Ｖａｎ　５ｎｉｃｋ　ＪＬ、　Ｍａｓｓｏｎ　Ｌ、　Ｈｅｒｅｍ ａｎｓ　ＪＦ、ｒ急性炎症の低鉄血症におけるラクトフェリンの関与Ｊ　Ｊ　Ｅ ｘｐ　Ｍｅｄ　１９７４；１４０：　１０６８−１０８４］。動物実験では、顆 粒球からの急速なラクトフェリンの放出のために、エンドトキシンないしは細菌 の投与とほぼ同時に血漿ラクトフェリン値が上昇するのが見られた。このために 、血漿ラクトフェリン濃度の上昇は、エンドトキシン血症や敗血症についての早 期１見であるとみなされる（Ｇｕｔｔｅｂｅｒｇ　ＴＪ、、　Ｒｏｋｋｅ　Ｏ， 、Ｊｏｓｒｇｅｎｓｅｎ　Ｔ、：　ＡｎｄｓｒｓｅｎＯ，、：　ｒ豚における敗 血症およびエンドトキシン血症の指標としてのラクトフェリンＪ　５ｃａｎｄ　 Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ　（１９８８）、　２０：６５９−６６６）。

もう１つのラクトフェリンの本質的な機能は、特に新生児期においては、腸管に おける鉄吸収の調節である［Ｂｒｏｃｋ　ＪＨ。

「ヒト乳汁中のラクトフェリン：新生児における鉄吸収および腸感染症に対する 保護におけるその役割Ｊ　Ａｒｃｈ　ＤｉｓＣｈｉｌｄ　（１９８０）　５５： 　４１７−４２２１というのは、ヒト乳汁中ラクトフェリンは、結合している鉄 を、腸粘膜に対して放出することができるからである。

しかし、ラクトフェリンの最も重要な生物学的機能は、その静菌作用に由来する ［Ａｒｎｏｌｄ　ＲＲ，Ｂｒａｖｅｒ　Ｍ、　Ｇａｕｔｈｉｅｒ　ＪＪ。

「ヒト・ラクトフェリンの殺菌活性Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍ− ｕｎｉｔｙ　（１９８０）　２８：　８９３−８９８；　Ａｒｎｏｌｄ　ＲＲ， Ｒｕ５ｓｅｌ　ＪＥ、　Ｃｈａｍｐ−ｉｏｎ　ＶＪ、　Ｇａｕｔｈｉｅｒ　ＪＪ 、ｒヒト・ラクトフェリンの殺菌活性：物理的条件と標的生物の代謝状態の影響 Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ　（１９８０）　３２：　６ ５５−６６０；　Ｇｕｔｔｅｂｅｒｇ　Ｔ、Ｊ、、Ｒｏｋｋｅ　Ｏ，。

Ａｎｄｅｒｓｅｎ　Ｏ，、Ｊｏｅｒｇｅｎｓｅｎ　Ｔ、；　ｒ敗血症およびエン ドトキシン血症における循環鉄の早期低下とラクトフェリンの急激な増加：早期 防御機序Ｊ　５ｃａｎｄ　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ、　（１９８９）　２］ 、ニア０９−７１５］。その静菌作用のために、ヒト乳汁中ラクトフェリンは、 それが腸感染症から新生児を保護する防御機序として１重要な役割を果たす。こ の静菌作用は、ラクトフェリンの高い鉄結合能から生じる。鉄は、細菌にとって 必須の増殖因子である。鉄とラクトフェリンの結合は、細菌を取り巻く遊離鉄濃 度を、細菌の増殖を助成するレベル以下に保つ。これが、細菌の増殖の阻止をも たらす、鉄含量が高ければ高いほど、ラクトフェリンの静菌作用は小さくなる。

鉄フリーのラクトフェリン　アポフオーム　は、苗土症およびエンドトキシン血 症の初期と同程度の早期に放出されるので、Ｇｕｔｔｅ−ｂｅｒｇらは、鉄フリ ーラクトフェリンはその静菌作用に鑑みて、員１１漿に対する早期防御機序であ ろうと仮定した［Ｇｕｔｔｅ−ｂｅｒｇ　Ｔｊ、、　Ｒｏｋｋｅ　Ｏ，、Ａｎｄ ｅｒｓｅｎ　Ｏ，、Ｊｏｅｒｇｅｎｓｅｎ　Ｔ、；　ｒ敗血症とエンドトキシン 血症における循環鉄の早期低下とラクトフェリンの急激な増加：早期防御機序Ｊ 　５ｃａｎｄ　Ｊ、　ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ、　（１９８９）　２１：　７０９− ７１５］　、上述の公表文献は、顆粒球から放出されるラクトフェリンの厳ユ沃 ニアポフォームが、細菌に対する防御機序としてのその機能に加えて、エンドト キシンに対する防御機序の役割を演じるという証拠を含んではいない。

ラクトフェリンは、また、顆粒球造成において何らかの機能を果たすらしいが、 関与する機序は、未だ十分には理解されていない。マクロファージからのコロニ ー促進因子（Ｃ５Ｆ）の放出が、ラクトフェリンによって阻止され得るというこ とが、観察されている。この因子は、顆粒球造成に必須である。ＣＳＦ放出阻止 は、ラクトフェリンの鉄負荷に依存する［Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ　ＨＥ　ｅｔ　ａ ｌ、ｒコロニー促進活性産生の顆粒球誘発性阻害物質としてのラクトフェリンの 同定Ｊ　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ１９７８；　１４８：　１０５２−１０６８］。

エンドトキシンは、グラム陰性菌の細胞壁の構成成分であり、細菌の崩壊によっ てのみ放出される。それは、ｌＸｌ０＠ダルトンまでの分子量を有する高分子で 、主として糖化合物と脂肪酸から成る。それはまた、細菌の細胞壁からの複合蛋 白質残基も含有する。エンドトキシン分子は、構造的ならびに免疫生物学的に異 なる３つのサブ領域から成る：サブ領域１．各々が最大５個の中性糖から作られ ているいくつかの反復性のオリゴ糖類ユニットから成る〇−特異鎖、存在するオ リゴ糖類の数は、細菌の株に依存する；例えば我々の実験に用いられたＳ、　ａ ｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉのエンドトキシンは、この領域に８個のオリゴ糖類を有 する。

ｍよ、他のものに混じって、ｎ−アセチルグルコサミン、ブドウ糖、ガラクロー ス、７単糖または２−ケト−３−デスオキシオフトン酸から成る核オリゴ糖類類 。

ｍ、いくつか−およそ７個−の長鎖脂肪酸がアミドまたはエステルとして結合し ているリン酸化Ｄ−ｄルコサミン２糖類から成る脂質Ａ（分子量２，０００ダル トン）、毒性蛋白質の担体が脂質Ａであり、そのために、毒性作用がこの領域の いくつかの脂肪酸残基に由来する。

エンドトキシン分子の大きさと、その電荷の特徴が、その毒性に影響を及ぼすこ となしにエンドトキシン構造中の３つのサブ領域の基あるいは側鎖と様々な化合 物または蛋白質との複合を可能にする。普通は、脂質Ａに結合した蛋白質、いわ ゆる脂質Ａ関連蛋白質がある。たいていの場合に、エンドトキシンからのこの蛋 白質成分の分離は、毒性作用に何の変化もひき起こさない。しかし、多くのエン ドトキシンへの蛋白質の結合は、それらの毒性の顕著な増加を生じ得ることが見 い出された（Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ　Ｅ、　ＴＨ，ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　 ｒ細菌のエンドトキシン：化学構造、生物学的活性ならびに敗血症における役割 Ｊ　５ｃａｎｄ　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ、　５ｕｐｐ１．３１：　８−２ １；　ｐ。

１７）。

健常者には、腸から血中へのエンドトキシンの生理学的転移もある。門脈血から のエンドトキシンの排泄は、主として肝臓で起こると思われる１ｍ器を損傷から 保護するために。

健常者の血漿は、腸から持続的に運ばれるエンドトキシンを不活化することがで きるが１機序はまだ説明されていない。

腸の透過性障害が、腸から血流中へのエンドトキシンの転移増加をもたらすかも しれない、そのような障害は、例えば、ショックや炎症性腸疾患のために、ある いは、サイクロスポリンＡによる免疫制御療法下で、続いて微小循環の障害をひ き起こす。血中への腸からのエンドトキシンの転移増加も、腸でのエンドトキシ ン放出増加をもたらす経腸抗生物質療法に続いて認められる（Ｎｉｔｓｃｈｅ　 Ｄ、　５ｔｅｈｌｅ　Ｍ、　Ｈａｍｅｌｍａｎｎ　Ｈ。

「腸性エンドトキシン血症に対するサイクロスポリンによる免疫制御の影響：動 物実験による研究Ｊ　Ｌａｎｇａｎｂｅｃｋｓ　Ａｒｃｈ−ｉｖ　ｆＬｉｒ　Ｃ ｈｉｒｕｒｇｉａ、　１９９０．５ｕｐｐ１．）　、大量のエンドトキシンの放 出と、それ故の数置病巣から血流中へのエンドトキシンの転移の増加も、腹膜炎 のような広範なダラム陰性菌性感染症の場合に起こり得る。そのような大量のエ ンドトキシンの流入は、これらのエンドトキシンを十分にすみやかに不活化させ る血漿の能力を消耗し、生物学的に活性なエンドトキシンの血漿レベルをより高 くし、最終的に臨床的エンドトキシン血漿を生じる。一方でエンドトキシンは、 毒性メゾイエイタ−の放出をひき起こす：他方では、それはまた細胞のエネルギ ー代謝を障害し、細胞の崩壊と、−エンドトキシンの量がより高い場合、および ／または、エンドトキシン血症の期間がもっと長い場合には一臓器不全も生じる 。このために。

腸または数置病巣から血中へのエンドトキシン転移を増加させる可能性のある疾 患全て、あるいは、肝臓によるエンドトキシンの生理的排泄の障害を巻き込む疾 患の全てが、血中エンドトキシン活性を低下させることができる付加治療処置を 必要とする。

エンドトキシン血症の治療における重要な付加治療処置は。

生理的状態の下でも持続する腸からのエンドトキシンの流入の軽減である。

エンドトキシンを吸収することができる物質の経口投与が、腸から血中へのエン ドトキシンの流入を減らすための治療処置として提案されている［Ｄｉｔｔｅｒ 　Ｂ、　Ｕｒｂａｓｃｈｅｋ　Ｒ，Ｕｒｂａｓｃ−ｈａｋＢ、ｒ様々な吸収剤の ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　（イン・ビトロ）でのエンドトキシン結合能およびマウスで の経口誘発エンドトキシン血症防御能Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　 １９８３；　８４：　１５４７−１５５２］。

これらの物質を使用する上で巻き込まれる主要な問題は、それらは腸においてエ ンドトキシンと結合することには成功するが、それらの毒性を不活化させること はなく、従って、エンドトキシンは、周囲の環境の化学的変化の結果として、も う一度放出されるかもしれない、ということである。

臨床試験によって証明されたように、モノクローナル脂質Ａ抗体を投与すること によって血漿エンドトキシン活性を低下させることが可能である［Ｚｉｅｇｌｅ ｒ　ＥＪ　ａｔ　ａｌ；　ｒ　ＨＡ−ＩＡヒトモノクローナル抗エンドトキシン 抗体によるグラム陰性菌血症および敗血症シミツクの治療Ｊ　Ｎ　Ｅｎｇ　Ｊ　 Ｍａｄ、　１９９１：４２９−４３６］　、血漿エンドトキシン活性は、多価免 疫グロブリン製剤を投与することによっても、ある程度まで低下させられる。と いうのは、それらはいくぶんかの脂質Ａ抗体を含有すると予想され得るからであ る。しかし、モノクローナル脂質Ａ抗体を含有する製剤を除いて、今日利用可能 な治療法の全てが、血中に入るエンドトキシンのいくぶんかの割合でしか不活化 しないという欠点を持っている。このため、それらは、より大量のエンドトキシ ンが血流に入る場合には、無効となる。

大量のエンドトキシンを急速に中和する能力によって、エンドトキシンの毒性作 用を管理する方法として適する治療薬を供与することが、この発明の目的である 。それは、また、腸で放出されたエンドトキシンを、まだ腸管内にあるうちに不 活化することによって、腸管から血流中への生理的流入を減少させることも可能 なはずである。このためには、この薬剤を経口的にないしは胃管から投与するこ とが可能でなければならない。

この発明は、それ故に、金属イオンと結合しているラクトフェリンの使用につい て規定する。そのようなラクトフェリンは、非経口的ないしは経腸的のどちらで も投与され得る。

用いられるラクトフェリンは、鉄か別の金属イオンのどちらかと結合していなけ ればならない、ラクトフェリンとＩｇＧだけ、ないしは、ＩｇＧ、ＩｇＭおよび ＩｇＡの３つ全ての組み合わされたもののいずれかを含有する免疫グロブリンと の併用は、非常に効果的であることが証明されている。ラクトフェリンを血漿誘 導体中に見い出される蛋白質と結合させるために、血漿誘導体中での非経口投与 用ラクトフェリンを強化することも可能である。非経口投与に用いられるラクト フェリンは、ヒト・ラクトフェリンと等価でなければならない、動物からのラク トフェリンは、経腸投与に用いられ得る。

以下の実験が、ラクトフェリンと免疫グロブリンの併用のみならず、ラクトフェ リン単独によるエンドトキシンの不活化を調べるために実施された：金属イオン の影響が、鉄と亜鉛を用いて調べられた。鉄フリーアポフオームでのヒトとつシ のラクトフェリンと、鉄または亜鉛と結合しているラクトフェリンが、ｉｎ　ｖ ｉｔｒｏとｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、免疫グロブリンとの併用のみならず単独で も、エンドトキシンの生物学的活性を低下させる能力を決定するために、試験さ れた。

的］遺μＬ夫隨 Ａ）生　学　に　ぼす　の　・ 免疫グロブリンと併用されたヒト・ラクトフェリンとウシ・ラクトフェリンが、 漸増されたエンドトキシンとともに、３７℃で６０分間インキュベーションされ た。インキュベーションに続いて、色素生成物質を用いるリムラス試験の変法に より、上澄液中の生物学的エンドトキシン活性の定量的測定が実施された（Ｎｊ 、ｔｓｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｎ：　Ｖａｔｓｏｎ　Ｓｌ、　Ｌｅｖｉｎ　Ｊ 。

Ｎｏｖｉｔｓｋｙ　ＴＪ　（ｅｄｓ、）　ｒリムラス・アメーバ株細胞溶解質試 験による細菌エンドトキシンの検出Ｊ　ｐｐ、　４１７−４２９　（１９８７） ）　。

このリムラス試験の変法の検出の下限は、ＩＥＵ／ｄＱ　［ＩＥＵ／ａ＝　１０ ０μｇ／ｄＱ　Ｅｃ　−５１テあルウリムラス試験によッテ測定されたエンドト キシン活性は、エンドトキシンの生物学的活性に相当する（Ｎｊ、ｔｓｃｈｅ　 Ｄ、　Ｆｌａｄ　ＨＤ　ａｎｄ　Ｂｌｕｍ　Ｂ、ｒリムラス試験によるエンドト キシンの測定と、エンドトキシンの生物学的活性、相関関係は存在するか？」− 投稿準備中）。

実験に用いられたヒトおよびウシ・ラクトフェリンは、はとんど鉄フリーだった （Ｌｃｆ、　−０）　、　ＭｅｇｒａｗとＢｏｕｄａによって記述された鉄分析 法（Ｍｅｇｒａｗ　ＲＥ、　Ｈｒｉｔｚ　ＡＭ、　Ｂａｂｓｏｎ　ＡＬａｎｄ　 Ｃａｒｒｏｌｌ　ＪＪ　（１９７３）　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、６：　２ ６６；　Ｂｏｕｄａ　Ｊ（１９６８）　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　Ａｃｔａ　２ １：　１５９）は、検出の最下限（０゜３μｇ　／　ａ　）に至るまで、アポラ クトフェリン（Ｌｃｆ、　−０）の５％溶液中での鉄の含有を何も示さなかった 。このアポラクトフェリン（Ｌｃｆ、　−０）中では、原子吸光分析法によって は、亜鉛は全く検出されなかった。

普通の生理食塩水に溶解した後、アポラクトフェリンは。

最初に濾過によって滅菌された。次に、様々な量の塩化第一鉄（ＦｅＣ１，）が 、様々な鉄含有量のラクトフェリン溶液を得るために、それに添加された。

実験では、ラクトフェリン１ｇ当たり鉄２８μｇの鉄含量のラクトフェリン（Ｌ ｃｆ、−Ｆｅ（Ａ））　、同じく２９６μｇの鉄含量のラクトフェリン（Ｌｃｆ 、−Ｆｅ（Ｂ））　、同じ＜１，０５８μｇの鉄含量のラクトフェリン（Ｌｃｆ 、−Ｆａ（Ｃ））の各々の溶液が用いられた。

アポラクトフェリンのさらなる試料は、アポラクトフェリ２１ｇ当たり５９０μ ｇの亜鉛含量を有するアポラクトフェリン溶液（Ｌｃｆ、−Ｚｎ）を得るために 、アポラクトフェリン（Ｌｃｆ、　−０）に亜鉛ＺｎＣ１，を添加することによ って作られた。

以下の免疫グロブリン製剤が用いられたニアＳＩｇＧ（Ｉｎｔｒａｇｌｏｂｉｎ ｌｌ、　Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｉｎ”）　、　１２％　ＩｇＭ強化７ＳＩ　ｇ　Ｇ 　（Ｉ　ｇ　Ｇ　／　Ａ／　Ｍ＝Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ”）　。

以下の菌株からのエンドトキシンが用いられた：Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ａｂｏ ｒｔｕｓ　ｅｑｕｉ　（ＮＯＶＯＰＹＲＥＸＡＬ”）　、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｔｙｐｅ　７．　Ｅ、ｃｏｌｉ　 ０１１３：　ＨＩＯ：　ＫＯからのＦＤＡエンドトキシン標準品。

“　ヒの　−％″の 不活化されたエンドトキシンの量の％は、初めのエンドトキシン濃度と、蛋白質 とのインキュベーション後に測定されたエンドトキシン活性との差異から計算さ れた。調べられたエンドトキシン濃度の全範囲（１０ＥＵ／ｄｉ！−１，０００ ＥＵ／ｄｌｌ）についての、各蛋白質濃度に関する“不活化の平均％”は、異な るエンドトキシン濃度についてこの方法で測定された値に基づいて計算された。

エンドトキシン　化　の測 エンドトキシンの不活化についてのラクトフェリンおよび、ラクトフェリンと免 疫グロブリンとの併用の能力を定量するために、′不活化能“が測定された。測 定精度を改善するために、このパラメータは、等量では測定されず、むしろ、１ ０ＥＵ／ｄｌｌ　および１００　ＥＵ／ｄＱという過剰のエンドトキシン濃度で 測定された。

このパラメータは、蛋白質製剤とのインキュベーション（６０分、３７℃）後の 上澄液中での遊離エンドトキシンの濃度が１０ないし１００　ＥＵ／ｄＱ　に達 するように、各蛋白質試料に添加されなければならないエンドトキシンの量（Ｅ Ｕ／ｄａ）に基づいて計算された。このエンドトキシン濃度は、添加されたエン ドトキシンの量と、インキュベーション後の上澄液中で測定されるエンドトキシ ン濃度との関係に基づいて、各試料（ラクトフェリン、免疫グロブリンおよびラ クトフェリンと免疫グロブリンの併用）について計算された。この関係は、エン ドトキシンを、その濃度を漸増させながら（１０ＥＵ／准、２５　Ｅυ／ａ、５ ０　Ｅｌｌ／ｄＱ、１００　ＥＵ＃Ｑ、２００　ＥＵ／ｄｕ。

３００　ＥＵ／ｄｌｌ、５００　ＥＵ／ｄｌｌ、７５０　ＥＵ／ｄｌｌ、および １，０００　ＥＵ／ａ）、様々な蛋白質試料とともに６０分間インキュベーショ ンした一連の測定によって決定された。反応液中のラクトフェリンの濃度は３１ ２　、５ｍｇ／ｄＱだった。

ラクトフェリンと免疫グロブリンの併用によって実施された測定は、各蛋白質成 分の濃度が３１２騰ｇ／ａであることを明らかにした。一定条件下で各蛋白質試 料［＋ｓｇ／ｄＱ］によって不活化され得る平均エンドトキシン濃度は、この方 法によって測定されたエンドトキシンの量から一定の過剰エンドトキシン量（１ ０ＥＵ／ａないし１００　ＥＵ／ｄＱ）を差し引いた量である。１００ｍｇ／４ の蛋白質濃度に関して、このエンドトキシンの量が各ラクトフェリン試料ないし はラクトフェリンと免疫グロブリンとの併用のＬ三片ｌ　化　（ＥＵ／　１００ ｍｇ）　’のゲージである。

エンドトキシンが鉄フリー・アポラクトフェリン−〇旦ム：−肚とインキュベー ションされると、３５．４−４１．２％のエンドトキシン活性の玉曳久王が記録 され、エンドトキシンのタイプと濃度に依存する。

エンドトキシンがラクトフェリン１ｇ当たり２８μｇの鉄含量を有するラクトフ ェリン−Ｃ匹エトニジα人υ−とインキュベーションされると、６２−６７．７ ％のエンドトキシン活性の平均低下が記録され、エンドトキシンのタイプに依存 する。

エンドトキシンがラクトフェリン１ｇ当たり２９６μｇの鉄含量を有するラクト フェリン−Ω、ｃｆ、−Ｆ＋α旦υ−とインキュベーションされると、７９．１ −８６．４％のエンドトキシン活性の玉曳墓上が記録され、エンドトキシンのタ イプに依存する。

エンドトキシンがラクトフェリン１ｇ当たり１，０５８μｇの鉄含量を有するラ クトフェリン−Ｑ６工と二五α旦υ−とインキュベーションされると、８９．２ −９６．７％のエンドトキシン活性の王ｍ王が記録され、エンドトキシンのタイ プに依存する。

エンドトキシンがアポラクトフェリン１ｇ当たり５９０μｇの亜鉛含量を有する アポラクトフェリン溶液−Ω６エ、　−ＺｔΩ−とインキュベーションされると 、８５．２−９２．７％のエンドトキシン活性の玉曳監玉が記録され、エンドト キシンのタイプに依存する。

ａ　）　１０　ＥＵ／　ｄＱ　の゛　エンドトキシンを基礎とする玉１似腹は： １　、　）　Ｌｃｆ、　−０：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては５ ．８Ｅυ／１００■、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては５．２　ＥＵ／１００［、Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては４．７Ｅυ／１００＊。

Ｉｌ、　）　ｄ　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては４８．９　Ｅ Ｕ／１００ｘ、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては５７．８　ＥＵ／１００ｍ、Ｐｓｅｕｄ ｏｍ−ｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては１７．５　Ｅυ／１００．。

ＩＩｌ、）　９　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては６２．１　Ｅ Ｕ／１０ｋ、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては７２．３　ＥＵ／１００＋ｓｇ、　Ｐｓｅ ｕｄｏｉｔ−ｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては６７．７　ＥＵ／１０ ０＊。

ＩＶ、）　Ｌｃｆ、−Ｆｅ　Ｃ：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては ９７．Ｉ　ＥＵ／１００＋ｓｇ、　Ｅ、ｃｏｌｉに対しては１２６．４　Ｅｌ／ １００ｇ、Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては１５２ ．７　ＥＵ／Ｌｏｏｗ＠。

Ｖ、）　Ｌｃｆ、　−Ｚｎ　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては８ ５．６　ＥＵ／１００Ｑ、　Ｅ、ｃｏｌｉに対しては１０９．６　Ｅｌ／１００ ｍ１＋、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては１２６．８　 ＥＵ／１００ｑ。

Ｉ　、）　Ｌｃｆ、　−０：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては２０ ．３　ＥＵ／１００■、　Ｅ、ｃｏｌｉに対しては１８，８　ＥＵ／１００＋１ ｇ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては３２．７　ＥＵ／ １００＊。

Ｉｌ、）　Ｌｃｆ、　−Ｆｅ　Ａ　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対し ては１６７．９　ＥＵ／１００ｇ、　Ｅ、ｃｏｌｉに対しては３０９　ＥＵ／１ ００＋ｉｇ、　Ｐｓｅｕｄｏ＋＊ｏ−ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては １５５．４　ＥＵ／　１００ｍｇ。

ＩＩｌ、）　Ｌｃｆ、−Ｆｅ　Ｂ　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉ　しこ 対して番１２３３　ＥＵ／１００■、　Ｅ、ｃｏｌｉに対しては４９３．２　Ｅ ＩＪ／１００ｍｇ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ−ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して は３９２．４　ＥＵ／１００■。

■ｖ、）　Ｌｃｆ、−Ｆｅ　Ｃ：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては ３７６．５　ＥＵ／１００ｍｇ、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては５９８Ｅυ／　１００ ＠ｇ、Ｐｓｅｕｄｏｒｒｒｏ−ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては６２７ 　ＥＵ／１００■。

Ｖ、）　Ｌｃｆ、−Ｚｎ　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては３１ ２．６　ＥＵ／１１００ｎ１．Ｅ、ｃｏｌｉに対しては５２７　ＥＵ／１００＋ ＋＋ｇ、Ｐｓｅｕｄｏｒｎｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては５５８．８ 　ＥＵ／１００ｍｇ。

２、乏り」≦７Ｚ隻−＞　ｋ、　’７ヨ辷」−口ｌ上ラクトフェリンと７５　ｒ ｇＧとの併用は、エンドトキシンの不活化を増進する。７ＳＩｇＧ単独（３１２ ■／ｄｌｌ）とエンドトキシンとのインキュベーションにより、エンドトキシン 活性を２１．５−３３．７％低下させる。　２００　Ｅ［Ｉ／准以下の濃度のエ ンドトキシンを、ラクトフェリン（３１２■／ａ）と７Ｓ　Ｉ　ｇＧ　（３１２ ■／ｄＱ）との組み合わせとともにインキュベーションすると、鉄フリー・アポ ラクトフェリン１匡ムｉを用いる場合には、エンドトキシン活性は５８．７−６ ４．１％低下する。より高いエンドトキシン濃度に対しては、この併用は、エン ドトキシン活性を４４．３−５１．８％しか低下させない。ラクトフェリン１ｇ 当たりＦｅ”　２８μｇの鉄含量を有するラクトフェリン−Ω匹エピニジα人ロ ーを代わりに用いると、７２−７８．４％のエンドトキシン活性の低下が記録さ れ、用いられるエンドトキシンのタイプと濃度に依存する。

ラクトフェリン１ｇ当たり９５０μｇの鉄含量を有するラクトフェリン−Ωｆ」 よ＜−が７５　ＩｇＧとの併用で用いられると、エンドトキシン活性は８７．３ −９２．２％低下し、エンドトキシンのタイプと濃度に依存する。

ａ’　）　１０　ＥＵ／　ｄＱの過剰エンドトキシンを基礎とするＥＬ±丘は： １、）７Ｓ　ＩｇＧの単独使用：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては １．８　ＥＵ／１００■、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては０，９　ＥＵ／１００ａ＋ｇ 、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては１，３　ＥＵ／１ ００ｗ。

Ｉｌ、　）　Ｌｃｆ、　−０と７　Ｓ　Ｉ　ｇ　Ｇ　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ 　ａｑｕｉに対しては９．Ｉ　ＥＵ／Ｌｏｏ■、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては１２． ６　ＥＵ／　Ｌｏｏ■。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては１０．４　ＥＵ／１ ００ｑ。

ＩＩＬ）　Ｌｃｆ、　−Ｆｅ　Ａ　と７　Ｓ　Ｉ　ｇ　Ｇ　：　Ｓ、　ａｂｏｒ ｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては５７．６　ＥＵ／１００■、Ｅ、ｃｏｌｉに対して は６５．７　ＥＵ／１００■、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｓｒｕｇｉｎｏｓａ に対しては３６．２　ＥＵ／１００ＩＶ、）　Ｌｃｆ、　−Ｆｓ　Ｂ　と７　Ｓ 　Ｉ　ｇ　Ｇ　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては７７．４　ＥＵ ／１００■、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては８６．４　ＥＵ／１００■、Ｐｓｅｕｄｏ ｒｉｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては８２．７　ＥＵ／１００ｂ　） 　Ｉｏｏ　ＥＵ／ｄｌｌの過剰エンドトキシンを基礎とする王五上莞−は： １、）ＴＳ　ＩｇＧの単独使用：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　５ｑｕｉに対しては １９，３　ＥＵ／１００■、　Ｅ、ｃｏｌｉに対しては９．４　ＥＵ／１００■ 。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては１６．７　Ｅυ／１ ００９゜Ｉｌ、）　Ｌｃｆ、　−０と７　Ｓ　Ｉ　ｇ　Ｇ　：　Ｓ、　ａｂｏｒ ｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては４７．６　ＥＵ／１００ｑ、Ｅ、ｃｏｌｉに対して は５１．９２０７１００ｍｇ。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては５７．３２０７１０ ０ｍｇ。

ＩＩｌ、）　し江ｔニジ伏幻−と７　Ｓ　Ｉ　ｇ　Ｇ　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕ ｓ　ｅｑｕｉに対しては２０２　ＥＵ／１００＋ａｇ、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては ３５９　ＥＵ／１００■、Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに 対しては２８２．５　ＥＵ／１００ｎＨ０ＩＶ−）し４１．ム工幻−と７　Ｓ　 Ｉ　ｇ　Ｇ　：　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては２８９．７　ＥＵ ／１００＋ａｇ、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては５４５．２　ＥＵ／１００ｑ、　Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対しては４４７．Ｉ　Ｅｌｌ／１ ２％　ＩｇＭを強化されたＩｇＧ試料へのラクトフェリンの添加は、不活化能を さらに増進させる。エンドトキシン活性は、Ｉ　ｇＧ／Ａ／Ｍ　（１２％　Ｉ　 ｇＭ）　（３１２ｇ／ｄｌｌ）の単独使用によって、約４５−４８％低下する。

エンドトキシンがＩ　ｇＧ／Ａ／Ｍ　（１２％　ＩｇＭ）（３１２■／ｄｌｌ） およびラクトフェリン（同じ＜３１２■／ｄｌｌ）と−緒にインキュベーション されると、ラクトフェリン１ｇ当たり２８μｇの鉄含量を有するラクトフェリン −Ｃｆｔと１均１人υ−が用いられた場合、エンドトキシン活性は、７５．９− ８１．２％低下し、エンドトキシンのタイプに依存する。

ラクトフェリン１ｇ当たり２９６μｇの鉄を含有するラクトフェリンＡ崩り二ｆ ｆｌ旺りとＩ　ｇＧ／Ａ／Ｍが併用されると、エンドトキシン活性は９１．８− ９５．４％低下し、エンドトキシンのタイプと濃度に依存する。

ａ　）　１０　ＥＵ／　ａ　の過剰エンドトキシンを基礎とする玉孟止血は： Ｉ　、）　Ｉ　ｇ　Ｇ／Ａ／Ｍ　（１２％　ＩｇＭ）の単独使用：Ｓ。

ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては５．Ｉ　２０７１００ｍｇ、　Ｅ、ｃｏｌ ｉに対しては３．８２０７１００ｍｇ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉ ｎｏｓａに対しては５，７　ＥＵ／１０ｋ。

Ｉｌ、）　し４エニヱ１θユとＩ　ｇ　Ｇ／Ａ／Ｍ　：　Ｓ、ａｂｏｒｔｕｓ　 ｅｑｕｉ　に対しては６ｇ、６２０７１００ｍｇ、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては７４ ．４２０７１００ｍｇ、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対 しては５１．２　ＥＵ／１００■。

ＩＩｌ、）　Ｌｃｆ、　ニヱＸと工ｇ　Ｇ　／　Ａ　／　Ｍ　：　Ｓ、ａｂｏｒ ｔｕｓ　ｅｑｕｉ　に対しては８７．４　ＥＵ／１００■、Ｅ、ｃｏｌｉに対し ては９７．８　ＥＵ／１００ｑ、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏ ｓａに対しては９６．７　ＥＵ／１００■。

ｂ　）　１００　ＥＵ／ｄＱの過剰エンドトキシンを基礎とする王皿±丘は： １、）Ｉ　ｇＧ／Ａ／Ｍ　（１２％　ＩｇＭ）の単独使用：Ｓ。

ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉに対しては４８．９　ＥＵ／１００■、Ｅ、ｃｏｌｉ に対しては３５．７　ＥＵ／１００＋ｇ、Ｐｓｓｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇ ｉｎｏｓａに対しては６７．７　ＥＵ／１００■。

Ｉｌ、）　しＪエニヱ１０Ｊと工ｇ　Ｇ　／　Ａ　／　Ｍ　：　Ｓ、ａｂｏｒｔ ｕｓ　ｅｑｕｉ　に対しては２６８．４　ＥＵ／１００■、Ｅ、ｃｏｌｉに対し ては４１９．１ＥＵ／１００■、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓ ａに対しては３４９．５ＥＵ／１．００■。

ＩＩｌ、）　ＬＳＩ艷、二：ｊ−９ｘＪ１Σと　Ｉ　ｇ　Ｇ　／　Ａ　／　Ｍ　 ：　Ｓ、ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉ　しこ対しては３８３．７　ＥＵ／１００■ 、Ｅ、ｃｏｌｉに対しては６２９．４ＥＵ／　１００■、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　４こ対して（ま５８６．７ＥＬＩ／１００■。

単球からのＩＬ　１とＩＬ６の放出が、試験化合物によるエンドトキシンの不活 化の程度の付加）（ラメータとして用し１られた。エンドトキシンがラクトフェ リンと、なしＮ　Ｌ、　ｉｔラクトフェリンと免疫グロブリンの組み合わせとと もしこ、インキュベーションされた。上澄液が次いで単球とともにインキュベー ションされ、単球によって放出されるインターロイキン１とインターロイキン６ の濃度が、上澄液で測定された。ラフ１−ツエリン１ｇ当たりの鉄含量が２８μ ｇのラクトフェリン萱立と、２９６μｇのラクトフエリンユ匡ムニシα隻ローと が用いられた。

以下の免疫グロブリンが用いられた８１２％　ＩｇＭ強化７　Ｓ　Ｉ　ｇＧ　（ Ｉ　ｇＧ／Ａ／Ｍ＝Ｐａｎｔａｇｌｏｂｉｎ”）　。

以下の菌株からのエンドトキシンが用いられた：　Ｓａｌ＋５ｏｎｅ−１１ａ　 ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉ　（ＮＯＶＯＰＹＲＥＸＡＬ”）とＥ、ｃｏｌｉ　０ １１３：　ＨＩＯ：　ＫＯ。

からのエンドトキシン標準品ＥＣ−５゜ラクトフェリン、免疫グロブリンおよび 免疫グロブ１ノンと組み合わされたラクトフェリンが、エンドトキシンとともに ３７℃で６０分間インキュベーションされた。試料中の蛋白質の濃度は、各々６ ２５■／ｄｉ！、　３１２■／ｄＩ２，１５６■／ｄｆｌであった。インキュベ ーションは、５０から１，５００　ＥＵ／ｄｉｌのエンドトキシン濃度で実施さ れた。

蛋白質とのインキュベーションに続いて、各エンドトキシン溶液が、健常者から の単核細胞とともにインキュベーションされた（３７℃、１６時間）。次に、放 出されたメゾイエイタ−ＩＬＬとＩＬ６の濃度が、測定された。ＩＬ　１は、繊 維芽細胞増殖試験（Ｌｏｐｐｎｏｗ、　Ｈ，；　Ｆｌａｄ、　Ｈ，−Ｄ、；　Ｕ ｌｍｅｒ、　Ａ。

−Ｊ、　ａｔ　ａｌ、ｒヒト皮膚線維芽細胞によるインターロイキン１の検出Ｊ 　Ｉ＋＋ｎｕｎｂｉｏ１．、１９８９．１７９．２８３−２９１）によって、Ｅ Ｌ４−６．１胸腺腫細胞系列を用いて測定された。ＩＬ６の濃度も、ＩＬ６−依 存性マウスハイブリドーマ（７ＴＤ１）を用いる増殖試験によって測定された（ Ｖａｎ　Ｄａｍｎｓ　Ｊ、　ＣａｙｐｈａｓＳ、　ａｔ　ａｌ、　（１９８７） 　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、　１６８：　５４３−５５０；　ＶａｎＯ ｅｒｓ　ＭＨＪ、　Ｖａｎ　ｄｓｒ　Ｈｅｙｄｅｎ　Ａ、　ａｎｄ　Ａａｒｄｅ ｎ　Ｌａ、　（１９８ｇ）　Ｃｌ１ｎ。

ｅｘｐ、Ｉ＋ｓｍｕｎｏ１．　７１：　３１４−４１９）　。

エンドトキシンとラクトフェリンとのインキュベーションは、単核細胞からのメ ゾイエイタ−のエンドトキシン誘発性放出の急激な低下をひき起こした。この効 果は、ラクトフェリンの鉄含量に依存するーそれは、鉄負荷を増すことによって 増進され得る。ラクトフェリンと免疫グロブリンとの併用は、メゾイエイタ−の 放出に及ぼす抑制効果をさらに強め、従って、ラクトフェリンのより高い鉄含量 もラクトフェリンと免疫グロブリンとの併用の抑制効果を増進する。

ａ）ｚノドトキシン５００　ＥＵ／ａ　をＬｃｆ、　−Ｆｅ　Ａ　とインキュベ ーションした場合、ＩＬ　１の平均放出は、Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓｅｑｕｉで３ ８７　Ｕ／ｍＱ　、　Ｅ、ｃｏｌｉで２２９Ｕ／＋ｓＱであった。工Ｌ　６の放 出は、　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉで１，２６９　Ｕ／＊Ｑ　、　Ｅ、ｃ ｏ−１１で１．９７１　Ｕ／ｍＱであった。

ｂ）エンドトキシン（ｓｏｏ　ＥＵ／ｄＱ）とＬｃｆ　、　−Ｆｅ　（Ｂ）との インキュベーション後、ＩＬ　ｌの平均放出は、Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓｅｑｕｉ で１４５　Ｕ／ｍＡ　、　Ｅ、ｃｏｌｉで１３６Ｕ／ｍ１２であった。工Ｌ　６ の平均放出は、Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉで７６５　Ｕ／ｍｕ　、　Ｅ、 ｃｏ−１ｉで８３１　Ｕ／ｍｕであった。

Ｉｌ、ラクトフェリンとＩ　Ｇ／Ａ／Ｍ　（１２％　工　Ｍ）Ａ）ｘノドトキシ ン５００　ＥＵ／ｄＱ　トＩ　ｇＧ／Ａ／Ｍ　（１２％ＩｇＭ）単独とのインキ ュベーションでのＩＬ　１の平均放出は、Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉで９ ８６　Ｕ／＋ｍＱ　、　Ｅ、ｃｏｌｉで９１２Ｕ／ｍＱであった。ＩＬ６の放出 は、　Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉで１，８０２　Ｕ　／　ｍ　Ｑ　、　Ｅ 、ｃｏｌｉで３，３８７　Ｕ／ｍｕであった。

Ｂ）１２％　ＩｇＭ強化７Ｓ　ＩｇＧ　（ＩｇＧ／Ａ／Ｍ）へのラクトフェリン の添加は、総免疫グロブリン濃度３１２■％。

ラクトフェリン濃度も３１２■％においては、５００　ＥＵ＃Ｑのエンドトキシ ンとのインキュベーション後に、以下の結果をもたらした。： ａ）用いられたラクトフェリンがＬｃｆ、二力収ｕであった場合には、ＩＬ　１ の平均放出は、Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉで２５１Ｕ／　ｍ　Ｑ　、　Ｅ 、ｃｏｌｉで１６７Ｕ／ｉｎであった。ＩＬ６の放出は、Ｓ、ａｂｏｒｔｕｓ　 ｅｑｕｉ　で　９２０　Ｕ／ｍＲ、Ｅ、ｃｏｌｉ　で　１，２６８　Ｕ／ｍＱで あった。

ｂ）レボ渣二」連工り−とＩ　ｇＧ／Ａ／Ｍ　（１２％）との併用は、Ｓ、　ａ ｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉで６９　Ｕ／ｍＱ、Ｅ、ｃｏｌｉで４７Ｕ／ｍＡの平均 ＩＬ　１放出を生じた。これらの条件下での平均ＩＬ６放出は、Ｓ、　ａｂｏｒ ｔｕｓ　ｅｑｕｉで４０７Ｕ／ｍｕ、Ｅ、ｃｏｌｉで５１８Ｕ／−ｇであった。

ＩＩｌ、アルブミン エンドトキシン５００　ＥＵ／ｄｌｌ　と標準品としてのアルブミンとのインキ ュベーション後は、ＩＬｌの平均放出は、Ｓ。

ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉからのエンドトキシンで２，９７５　Ｕ／ｍΩ、Ｅ。

ｃｏｌｉで２．６７６　Ｕ　／　ｗ＊　Ｑであった。ＩＬ　６の放出は、Ｓ、　 ａｂ−ｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉで３，０１８　Ｕ／ｍＡ、Ｅ、ｃｏｌｉで６，２３ ３　Ｕ／ｍＱで健常者からのヒト血漿が１＝１０に希釈され、加熱［８０℃］に よって不活化された。ラクトフェリンが次に、２５０■／ｄｉ！血漿ラクトフ工 リン濃度を得るように添加された。同量のアルブミンが対照血漿試料に添加され た。次に、エンドトキシンが、血漿試料中テ１，０００　ＥＵ＃Ｑ　ト３００　 ＥＵ＃Ｑ　ノニントドキシン活性を得るために、血漿／ラクトフェリンおよび血 漿／アルブミン混合物に添加され、それから３７°Ｃで６０分間インキュベーシ ョンされた。これに続いて、試料中のエンドトキシン活性が測定された。

血漿エンドトキシン活性は、アルブミンだけを含む試料に比へて、ラクトフェリ ンを添加した試料中では有意に低下するように見えた。

ａ）血漿へのＬｃｆ、−Ｆｅ１ｍの添加は、１，０００　Ｅｌ／ｄｉエンドトキ シンでは　６２．１％±　４．８％（ｎ　＝１８）　、　３００　ＥＩＪ／ｄｉ 　エンドトキシンでは６７．４％±　５．４％（ｎ＝１６）のエンドトキシン活 性低下を生じさせた。

ｂ）血漿へのにム：士区吋の添加は、１，０００　ＥＵ／准エンドトキシンでは 　７８．５％　±　６．９％（ｎ　＝１８）　、　３００　ＥＵ／ｄｆｆｉエン ドトキシンでは８４．１％±　５．１％（ｎ＝２０）のエンドトキシン活性低下 を生じさせた。

糀見座ｉ見至１貞： １、鉄のような３価の金属イオン、あるいは、例えば亜鉛のような２価の金属イ オンと結合しているラクトフェリンは。

エンドトキシンの生物学的活性を低下させることが可能であり、そのために、効 果のレベルは、用いられたラクトフェリン濃度に依存する。

２、ラクトフェリンがエンドトキシンの毒性作用を減少させる程度は、ラクトフ ェリンと結合している鉄の量とともに増大する。用いられたラクトフェリンの鉄 含量は、ラクトフェリ２１ｇ当たり少なくとも０．１μｇでなければならないが 、１ｇ当たり１００μｇ以上が望ましい。

３、ラクトフェリンを他の血漿蛋白質、特に、ＩｇＧとＩｇＭ分画からの免疫グ ロブリンと併用することによって起こるエンドトキシンの生物学的活性の低下は 、これらの蛋白質が互いに別に用いられる場合よりも有意に大きい。ラクトフェ リンと免疫グロブリンとの併用は、両蛋白質のエンドトキシン不活化作用を可能 にする相乗効果を有する。

４、この相乗作用は、ラクトフェリン／免疫グロブリン併用のエンドトキシン不 活化能の有意な増加を特徴とする。これによって、治療上明らかなエンドトキシ ンの不活化は、細菌に鉄を与え過ぎることなしに達成される。

５、鉄フリー・ラクトフェリンと免疫グロブリンとを併用して、エンドトキシン 活性の低下を達成することも可能であるが、ラグトフェリン１ｇ当たり少なくと も０．１μｇの鉄含量を有するラクトフェリンと免疫グロブリンとの併用が、よ り有利であることが証明されている。しかし、ラクトフェリ２１ｇ当たり１００ μｇ以上の鉄含量が好ましい。

６、エンドトキシンの生物学的活性を低下させる能力のために、ラクトフェリン は、エンドトキシンの排泄が低下している症例や、腸管や数置病巣から血流中へ のエンド１−キシンの通過の増加を巻き込む病的経過の全タイプにおいて、エン ドトキシンの毒性作用の治療に適する。

７、ラクトフェリンは、胃腸管へ直接投与することもできるので、それは腸管か ら血流中へのエンドトキシンの通過の治療に特に十分適する。この目的のために は、それは単独物質として、あるいは、特に経腸栄養補給用に用いられるような 、他の物質と併用して、経口的に、ないしは管を用いて、投与され得る。

８、より大きいその不活化能のために、ラクトフェリンと免疫グロブリンとの併 用は、より長期に亘る腸管や数置病巣から血中へのより大量のエンドトキシンの 通過をひき起こす病的経過の全てについて、エンドトキシンの毒性作用の治療に 適する治療薬である。従って、ラクトフェリンやラクトフェリンと免疫グロブリ ンとの併用療法は、何が原因であろうとも、エンドトキシン血症の臨床経過に好 ましい影響を及ぼすと予想されるだろう。

９、ラクトフェリンは、顆粒球造成のために重要なコロニー促進因子（Ｃ３Ｆ） のマクロファージからの放出の阻止をもたらすかもしれないので、必要とされる ようなＣＳＦは、組み換え型と自然形のいずれでも、ラクトフェリンのｉ、ｖ、 投与に含有されなければならない。

１０、鉄の代わりに、亜鉛、銅、コバルト、マンガンあるいはマグネシウムのイ オンのような他の金属イオンと結合しているラクトフェリンも、エンドトキシン の毒性作用を治療するために用いられるかもしれない。

本　［の様々な　か、以下の　によってさらに記゛＼される：肛 以下の実験は、血漿中のエンドトキシンの不活化に関するラクトフェリンの鉄負 荷の有意性の客観的尺度を得るために実施ぎわた：健常者からのヒト血漿が０． ９％Ｎ　ａ　Ｃ１で１：１０に希釈され、次に加熱（９０℃、５分間）によって 不活化された。様々な量の鉄と複合されたラクトフェリンが、次に、血漿へ添加 された。これらの反応試料中のラクトフェリン濃度は、３００■／ｄＱであった 。ラクトフェリンの鉄負荷は、様々な量のＦｅＣｌ３を添加することによって調 整され、ラクトフェリン封蓋のモル比を２２：１，１：１．１：２．５訃よび１ ：３．９とされた。

ラクトフェリンの添加後、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａａｒｕｇｉｎｏｓａから のエンドトキシンも様々な濃度で血漿試料に添加され、反応試料中のエンドトキ シン濃度を５０．１００，２００．３００．５００，７５０．１　、０００、お よび１，５００　ＥＵ／ａトされた。試料は、エンドトキシンの添加後直ちに、 ３７℃で６０分間インキュベーションされた０次に、試料中の残余エンドトキシ ン活性が測定された。それから、１０　ＥＵ／ｄＱの過剰エンドトキシンに対す る様々なラクトフェリン溶液の不活化能が、得られた値に基づいて計算された。

一不活化能を計算するために用いられる方法の詳細は。

”ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験″の節に詳細に記述されている。−ラクトフェリンの１ ００■／ｄ１　についての不活化能は、ラクトフェリン対鉄のモル比の関数とし て計算された二計算は。

１０　ＥＵ＃Ｑ　の過剰エンドトキシンで達成するように行なわれた二以下の値 が得られた： ａ）２２：１　：　ラクトフェリン１００ｍｇ当たり　１７．２　ＥＵｂ）１： １　：　ラクトフェリン１００■当たり　６８．２　ＥＵｃ）１：２．５　：　 ラクトフェリン１００■当たり１７９．４　ＥＵｄ）１：３．９　：　ラクトフ ェリン１００■当たり４０５．７　ＥＵ不不活能能、ラクトフェリンの鉄の割合 を増すことによって、増大され得る。例えば、ラクトフェリン試料中のラクトフ ェリン対鉄のモル比を２２＝１から１：３．９になるように鉄の値を増すと、不 活化能は２３．５という係数で高まる。

１：３．９のモル比では、ラクトフェリン分子の大多数が各々、鉄２分子と結合 していると予想される。

五主 上昇する血漿エンドトキシン活性値が、び漫性腹膜炎の女性患者で測定された０ 反応試料中の免疫グロブリン濃度を３１２■／ａとして、この患者からの血漿試 料をＩｇＭ強化免疫グロブリン試料とインキュベーション（３７℃、３０分間） することによって、１６．５％のエンドトキシン活性低下が達せられた。同じ血 漿が３１２■／ｄの濃度でラクトフェリン（粘ムニ力」柱）とインキュベーショ ンされると、エンドトキシンの４１％が不活化された。この患者の血漿中でのエ ンドトキシン不活化のレベルは、それぞれ３１２■／ａの濃度で、レコ旦ユ」及 ぷり−と免疫グロブリンとを併用することによって、６４％まで高められた。

患者の血漿へ相当する濃度で、より高い鉄含量を有するラクトフェリンＬｃｆユ ニ」）遵Ω−の同量を添加すると、エンドトキシンの６３％を不活化した。この ラクトフェリンＬｃｆ、　−ム頂狂をＩｇＭ強化免疫グロブリン試料（エエ旦Ｚ 人Ｚ及）と併用すると、患者血漿中のより一層多くのエンドトキシンの不活化を 起こした一８７％。鉄を含有するラクトフェリンによるエンドトキシン活性の効 果的な低下、および鉄を含有するラクトフェリンを免疫グロブリンと併用するこ とによる、この効果の促進は、ヒト・ラクトフェリンを静脈内に適用することに よる、どの原因のエンドトキシン血症でも治療する方法を与える。

コロニー促進因子（Ｃ５Ｆ）の放出は、ラクトフェリンによって阻害されるかも しれないので、付加Ｃ８Ｆが−ｊ、Ｖ＊ラクトフェリン適用と一緒に、必要とさ れるだけ代用されなければならない。

盤且（図１） 抗生物質によるグラム陰性菌感染症の治療において発生する状態をまねるために 、血中でのエンドトキシン増加が、最初に腹腔内に細菌を接種し、次に殺菌性抗 生物質を静脈内投与し、これによって急速な細菌崩壊をひき起こすことにより、 動物実験において誘発された。血液採取カテーテルが、麻辞されたウィスターラ ット（２５０−３００ｇ）の右頚静脈へ挿入された。３つの異なる菌種の一定数 が、次に、その動物の腹腔内へ接種された（Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｋｌｅｂｓｉｅ ｌｌａ　５ｐｅｃｉｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ 、それぞれ体重１ｋｇ当たりＯ＋７５Ｘ１０ｓＣＦＵの濃度で）、細菌が腹腔内 へ接種されてから３０分後に、研究中の試料（ラクトフェリン、ラクトフェリン と免疫グロブリン）が、２５０■／ｋｇｂ、ｗ、の投与量で。

潅流器によって静脈カテーテルを通してｉ、ｖ、投与された。

対照群の動物は、相当する投与量のアルブミンｉ、ｖ、を受けた。エンドトキシ ン血症を誘発するために、殺菌性抗生物質（ＩＭＩＰＥＮＥＭ　＝　Ｚｉｅｎａ ♂）が、細菌接種から１時間後にｉ、ｖ。

投与された。血中のエンドトキシン活性と細菌数を調べるための血液検体が、細 菌接種前と、その後３０分間隔で５時間に亘り採取された。以下の試料がｉ、ｖ 、投与された：１２％ＩｇＭ強化７　Ｓ　Ｉ　ｇＧ　（Ｉ　ｇＧ／Ａ／Ｍ＝Ｐｅ ｎｔａｇｌｏｂｌｎ　）　；Ｆｅ”２８μｇ／ｇの鉄含量のラクトフェリン（し 江トー１仔υ−）と、Ｆｅ”　２９６μｇ／ｇの鉄含量のラクトフェリン（Ｌｃ ｆ、　−ム頂狂）　；ラクトフェリンとＩｇＭ（１２％）強化免疫グロブリン（ ＩｇＧ／Ａ／Ｍ）併用。

蟇果土（図１） ａ）アルブミンを投与した場合、血漿エンドトキシン活性は、抗生物質投与後に かなり増大した。　１９２　ＥＵ／ｄｉｌの平均エンドトキシン活性が抗生物質 投与後１時間という早期に達せられた。４時間後、平均血漿エンドトキシン活性 は、　２１０　ＥＵ／ｄに達していた。

ｂ）ＩｇＭ（１２％）強化７５　Ｉ　ｇＧ　（Ｉ　ｇＧ／Ａ／Ｍ）のｉ、ｖ、投 与は、血漿エンドトキシン活性の低下をもたらした。血漿エンドトキシン活性は 、アルブミン対照群に比較して、抗生物質投与の１時間後に４６％、４時間後に ５３％であった。

Ｃ）ラクトフェリン（ｋＬ二力別［）がｉ、ｖ、投与された場合、血漿エンドト キシン活性の初期増加−抗生物質投与１時間後−は、アルブミン対照群に比較し て約５８．５％低下した。抗生物質投与の４時間後には、し４工＝ｍυ一群の動 物でのエンドトキシン活性は、アルブミン対照群よりもまだ４４％低かった。

ｄ）ラクトフェリン（い工亘：均伏恒−）が１．ｖ、投与された場合、血漿中の エンドトキシン活性の初期増加−抗生物質投与の１時間後−は、アルブミン対照 群に比較して約７５．３％低下した。抗生物質投与の４時間後には、Ｌｃｆ−− ｄ−を投与された群でエンドトキシン活性は、アルブミン群よりもまだ約６０． ５％低かった。

ｅ）ラクトフェリン（鮎」と＝Ｗ恒−）が１２％ＩｇＭ強化免疫グロブリンとと もにｉ、ｖ、投与された場合、血漿エンドトキシン活性の初期増加−抗生物質投 与の１時間後−は、アルブミン対照群に比較して約７３％低下した。抗生物質投 与の４時間後には、この併用投与群でのエンドトキシン活性は、アルブミン群よ りも約８５％低かった。

ラクトフェリンと免疫グロブリンとの併用によって得られる、不活化能の促進は 、エンドトキシンが長期間に亘って血流中へ入り続ける症例においてさえも、身 体への鉄の過負荷なしに、血漿エンドトキシン活性の激烈な増大をコントロール することを可能にする。鉄負荷ラクトフェリン（■ｆ、−Ｆｅ−Ｏυ−）だけの 適用は、鉄含量がもっと低い場合の初期段階（図１）に、ラクトフェリン／免疫 グロブリン併用で体験されたものと類似の低下を生じさせる。もしも投与量か鉄 負荷のいずれかが増されなければ、低鉄ラクトフェリンのみの不活化能は、次に は血漿エンドトキシン活性の再起をもたらすであろう。血中への持続的エンドト キシン通過の症例においては、遅かれ早かれ不十分となるだろう。ラクトフェリ ンと免疫グロブリンの併用は、たとえラクトフェリン１ｇ当たり５００Ｐｇ以下 の鉄含量のラクトフェリンが用いられる場合でも、非常に効果的な代用療法の一 例である。

刺」−（図２） 動物実験は、腸から血中への高分子の軽装通過が、サイクロスポリンによる免疫 抑制下では２０倍増加するだろう、と証明している。免疫抑制は、腸から血中へ のエンドトキシンの通過もかなり増加させる［Ｎ１ｔｓｃｈｅ　Ｄ、　５ｔｅｈ ｌｅ　Ｌ　Ｈａ＋ａｅｌ−鳳ａｎｎＨ，ｒ腸性エンドトキシン血症に対するサイ クロスポリンによる免疫抑制の影響：動物実験による研究Ｊ　Ｌａｎｇｅｎｂｅ −ｃｋｓ　Ａｒｃｈｉｖ　ｆｉｉｒ　Ｃｈｉｒｕｒｇｉｅ　１９９０　（Ｓｕｐ ｐｌ、）］　、従って、この動物モデルが腸管から血流へのエンドトキシンの通 過が、経腸ラクトフェリン投与によって、どの程度影響されるかを決定するため に用いられた。

ウィスターラットがサイグロスポリン（１２■／　ｋｇ　／　ｄａｙ　；ｉ、ｍ 、）で４日間前処理された。１２時間の絶食後、抱水クロラール麻酔下で、開腹 術が実施された。次に、胃管が食道を通って十二指腸まで挿入された。この管を 通って、次に、動物は、Ｅ、　ｃｏｌｉの懸濁液（２、５Ｘ　１０”　ＣＦＵ／ 　ｋｇ　ｏｆ　ｂ。

瞥、）を受けた。次いで、抗生物質が管から投与された（ネオマイシン１６，２ ５０　ＩＵ／　ｋｇ　ｏｆ　ｂ、ｗ、とバシトラシン１　、２５０丁Ｕ／　ｋｇ 　ｏｆ　ｂ８ｗ、との混合物）。抗生物質の投与に続き、対照群（ｎ＝１４）は 、管を通して２．５％アルブミン溶液３００＋ａｇ／　ｋｇ　ｏｆ　ｂ、ｗ、を 受けた。治療群（ｎ＝１６）は、抗生物質投与直後に２．５％ラクトフェリン溶 液（ウシ・ラクトフェリン）３００■／　ｋｇ　ｏｆ　ｂｌｗ、を受けた。鉄含 量は、ラクトフェリン１ｇ当たりＦｅ１８４５μｇであった。

血漿エンドトキシン濃度を測定するために、Ｑ、２ｍ１２の血液検体が、十二指 腸管が置かれてすぐに、合計５時間にわたって６０分間隔で採取された。ゼロ点 を決定するための血液試料は、開腹術と細菌の投与に先立って採取された。エン ドトキシン濃度は、色素産生物質を併用するリムラス試験の変法を用いて測定さ れた。螢光分析が、血中サイクロスポリン濃度を測定するために用いられた。

監果 動物での平均血漿サイグロスポリン濃度は、実験開始時点で、１，１８１■／Ｉ ＩＱだった。サイクロスポリンによる前処理を受けていた動物全て、すなわち、 両群の動物においては、血漿エンドトキシン活性についてのゼロ点値は、３．２ ±２７ＥＵ／ｄｉで、わずかに上昇した。これは、サイクロスポリンによる前処 理の直接の結果である。管からの抗生物質の投与は、ラクトフェリンを受けた動 物におけると同様に、アルブミン対照群の動物で血漿エンドトキシン活性の増加 を生じさせた。この効果は、わずか３０分後に記録された。抗生物質投与の１時 間後、２群での血漿エンドトキシン濃度間には有意差は無かった。しかし、抗生 物質投与後２時間という早期に、アルブミンを受けた動物での平均血漿エンドト キシン濃度は、管を通してラクトフェリンを受けた群での値（この場合、この時 点での値は、１１．２７±５．７６ＥＵ／ｄｉであった）よりも有意（Ｐ＝０． ０４１）に高かった（１８．７±３、９５ＥＬｌ／ｄｔｌ）　、平均血漿エンド トキシン濃度は、アルブミン群では上昇し続けて、観察期間の終わりには３４． ５±８．５２ＥＵ／ｄＱに達するのに対し、血漿エンドトキシン活性の有意な増 加は、同じ期間中、ラクトフェリン群では見られなかった。観察期間の終わりの 時点、すなわち抗生物質投与の５時間後では、ラクトフェリン群での血漿エンド トキシン濃度は、９．４８±３．６４ＥＵ／ｄｌｌであった。この群とアルブミ ン群との差異は、この時点では非常に有意であった（Ｐ＜０．００１）。

抗生物質投与後２時間間がらｗｔ察期間の終わりまで、アルブミン群の場合より も有意に低いままであったラクトフェリンを管から受けた動物での平均血漿エン ドトキシン濃度は、腸における治療上明らかなエンドトキシンの不活化が、ラク トフェリンの経腸投与によって達成され得る、ということを証明している。エン ドトキシン血症の腸性源のこの減弱は、同時に、エンドトキシンを中和するため の血漿の固有の機序における負荷を減じる。従って、ラクトフェリンの経腸投与 は、経口であっても管を通してであっても、エンドトキシン血症の治療における 補助療法として適当である：１　ａ）敗血症患者で、エンドトキシン血症の腸性 成分は、経腸適用法の使用に影響され得るので、それはエンドトキシン不活化剤 による全身療法に加えて実施されなければならない。

ｂ）新生児で起こるような、また、サイクロスポリンによる免疫抑制療法中に予 想すべき、腸管での透過性障害から起こる腸性エンドトキシン血症患者で。

Ｃ）例えば潰瘍性大腸炎やクローン病のような炎症性の腸の状態、および、他の 炎症性腸炎の型で起こるような、腸から血中へのエンドトキシンの通過増大から 起こる腸性エンドトキシン血症患者で。

ｄ）殺菌性抗生物質による治療下で起こるような、細菌崩壊の増加によってひき 起こされる腸からのエンドトキシンの流入増加から起こる腸性エンドトキシン血 症患者で。

ｅ）新生児における肝熟成障害や、閉塞性黄痘やＲＥＳ機能低下のような、肝臓 への実質障害から起こるような、エンドトキシンの肝排泄障害を有する患者で。

第１図 エンドトキシン活性に及ぼすｉ、Ｖ、ラクトフェリンとｉ、ｖ、免疫グロブリン の影響（動物実験） エンドトキシン［ＥＵ／市コ 細菌（ｉ、ｐ、） 第２図 ラクトフェリンの経腸投与による腸由来エンドトキシン血症の治療エンドトキシ ン［ＥＵ／ｄｉｌ］ 抗生物質（経口） 要約書 エンドトキシン血症の場合のエンドトキシンの毒性作用を減少させる治療のため の、鉄イオンと結合しているラクトフェリンの使用。

国際調査報告 Ｉｎ１ｅ″′ｌｌｅ″”　Ａ″’−””　”’ＫＴ／ＤＥ　９１１００２１４１ ｅｍｗ１ｍｎｍｌ　Ａ９Ｎｅａ−Ｉｖ　、、、／ＤＥ９１１００２１４国際調査 報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．エンドトキシンの毒性作用の予防的処置ならびに治療的処置のための薬剤と しての、金属イオンと結合しているラクトフェリンの使用。
2. ２．鉄、亜鉛、銅、コバルト、マンガンまたはマグネシウムといった金属イオン を使用することを特徴とする請求の範囲第１項の使用。
3. ３．鉄由来の金属イオンを使用することを特徴とする、請求の範囲第１項または 第２項の使用。
4. ４．ラクトフェリンの鉄含量が、ラクトフェリン１ｇ当たり０．１μｇないしそ れ以上であることを特徴とする請求の範囲第１項の使用。
5. ５．ラクトフェリンと免疫グロブリンとを併用することを特徴とする、請求の範 囲第１項ないし第４項のいずれかの使用。
6. ６．ＩｇＧ単独を含有するか、またはＩｇＧとＩｇＭおよびＩｇＡとを含有する 免疫グロブリン溶液を使用することを特徴とする請求の範囲第５項の使用。
7. ７．血漿蛋白質溶液または保存血清中においてラクトフェリンを強化することを 特徴とする、上記請求の範囲のいずれかの項、特に第５項または第６項の使用。
8. ８．ラクトフェリンとコロニー促進因子（ＣＳＦ）とを併用することを特徴とす る、請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかの使用。
9. ９．ラクトフェリンの剤型が経口投与のためのものであることを特徴とする、請 求の範囲第１項ないし第６項のいずれかの使用。
10. １０．ラクトフェリンの剤型が腸管への管を通しての直接投与のためのものであ ることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかの使用。