JPH05507504A - 内毒素の毒性処理のための、亜鉛または銅イオンを束縛したアポ・トランスフェリンの利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内毒素の毒性処理のための、亜鉛または銅イオンを束縛したアポ・トランスフェ リンの利用 この発明は、内毒素の毒性を予防し、処置的治療を行なう薬剤として、二価の亜 鉛または銅イオンを束縛したアポ・トランスフェリンの利用に関する。

″１アポ・トランスフェリン“とは、平均分子量８０，０００ドルトンの糖タン パク質であり、主に三価の鉄イオンを可逆的に束縛できる。また、金属鉄以外に Ｃｕ（ＩＩ）やＭｎ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ｍ）、Ｚｎ（ＩＩ）なども束縛できる６ 人体や動物の組織内で１通常、アポ・トランスフェリンは、三価鉄とのタンパク 質−金属錯体である、トランスフェリンとして生じる。

アポ・トランスフェリンの主要な機能は、特定の三価鉄イオンと結合し移送する 能力があり、それによって可逆的に１または２個の鉄分子を束縛移送できること であると考えられる。このように、鉄は小腸内での吸収の後に、造血組織内の網 赤血球と共に、肝臓及びｎｌｌ内の鉄貯蔵所に移送される。

プラスマのアポ・トランスフェリン・イオン錯体くトランスフェリン）濃度の正 常な範囲は、２００■／准から４００■／准までである。

トランスフェリンが″＃自由状態”にある場合のさらに重要な機能は、その静菌 作用であると考えられる（Ｎａｒｔｉｎ　ＣＭ。

Ｊａｎｄｌ　ＪＨ，Ｆｉｎｌａｎｄ　Ｍ、　Ｊ　Ｉｒ＋ｆｅｄｔ　Ｄｉｓ　１９ ６３；　１１２：　１５８−１６３；Ｆｌｅｔｅｈｅｒ　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ　１８７１；　２０：　４９３−５００）　、鉄は、細菌にとって重要な 増殖因子である。トランスフェリンにより鉄のキレート環が生成されることで、 プラスマ中の自由鉄濃度は、細菌増殖に必要な最小限度に保たれている。ベルガ ー・アンド・ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ　ａｎｄ　Ｂｅｇｅｒ）は、鉄自由状態に あるトランスフェリンが、従来の抗生物質治療法を補足すると考え、広範囲のグ ラム陰性感染における付加的抗菌活性剤の機能を満足するのではないかと、トラ ンスフェリンの静菌作用を結論付けた（Ｂａｒｇｅｒ　Ｄ、　Ｂｅｇｅｒ　ＨＧ 、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｉ＋ｍ　Ａｃｔａ　１９８７；　１６３：　２８９−２９９ ：　Ａｒｚｎｅｉｎ−Ｆｏｒｓｃｈ／Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓ　１９８８；　３８：　 ８１７−８２０；　ａｎｄ　Ｐｒｏｇ　Ｃ１１ｎ　Ｂｉｏｌ　Ｒａｓ　１９８８ ；　２７２：　１１５−１２４）　。

三価の鉄を束縛したアポ・トランスフェリン、すなわちそれがトランスフェリン の形態にあるときも、内毒素の生物学的活動を減じさせる機能がある。内毒素を 中和するトランスフェリンの能力は、　ＤＨ３８４２１４３及びＤＥ　３８４４ ６６７に詳細が記されているように、鉄の荷重が増加するに従って増していくウ アポ・トランスフェリンは束縛鉄イオンを備えており、その鉄の量に依存して、 内毒素を中和する機能の多少が決まると言う事実は、他の金属イオンが束縛され ているときには、同じ効果が出ないだろうということを、必ずしも意味ＤＥ　３ ８４２１４３及びＤＥ　３８４４６６７中に記された結論に反して、ベルガーら は以下のように報告している。すなわち。

“・・・内毒素の束縛機能は、アポ・トランスフェリンに限られている。”　（ Ｂｅｒｇａｒ　Ｄ、　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｍ、　Ｂｅｒｇｅｒ　ＨＧ、　Ｃ１１ｎ　 Ｃｈｉｎ　Ａｃｔａ　１９９０；　１８９：　１　（Ｓｕｍｍａｒｙ））また、 アポ・トランスフェリンの束縛を行ない内毒素を中和する能力は、鉄が束縛され ていると減少するとも報告している（Ｂｅｒｇｅｒ　Ｄ、　Ｂｅｇｅｒ　ＨＧ、 　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｉｎ　Ａｃｔａ　１９８７；　１６３：　２８９−２９９；　 Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ／Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓ　１９８１１；　８１７−８ ２０；　ａｎｄ　Ｐｒｏｇ　Ｃ１１ｎ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｓ　１９８８；　２７２ ：　１１５−１２４；　Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ　Ａｒｃｈｉｖ　ｆｕｒ　Ｃｈ ｉｒｕｒｇｉｅ　１９９０；　５ｕｐｐ１．　１−６；　Ｂｅｒｇｓｒ　Ｄ、　 Ｗｉｎｔｅｒ　Ｍ、　Ｂｓｇｅｒ　ＨＧ、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｉｎ　Ａｃｔａ　１ ９９０；１８９：　ｐ、１−６）。この著者らは、゛″トランスフエリン内毒素 作用を増強する働きを見せる”とさえ述べている（Ｂｅｒｇｅｒ　Ｄ。

Ｗｉｎｔｅｒ　Ｍ、　Ｂｅｇｓｒ　ＨＧ、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｉ＋ｗ　Ａｃｔａ　 １９９０；　１８９：　ｐ、４）。

ベルガーらは、ＰＨのみならず、′反応培養基中の”二価陽イオン（Ｃａ”　、 　Ｋｇ”　、　Ｎｎ”　）の存在が、アポ・トランスフェリンによる内毒素の束 縛では、決定的に重要であるとも報告している（Ｂｅｒｇｅｒ　Ｄ、　Ｂｅｒｇ ａｒ　ＨＧ、　Ａｒｚｎｅｉｒａ−Ｆｏｒｓｃｈ／Ｄｒｕｇ　Ｒｅ５１９８８； 　３８：　８１７−８２０：　Ｐｒｏｇ　Ｃ１１ｎ　Ｂｉｏｌ　Ｒａｓ　１９８ ８；　２７２：　１１５−１２４；　Ｂｅｒｇａｒ　Ｄ、　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｍ、 　Ｂｅｇｅｒ　ＨＧ、　Ｃ１１ｎ　ＣｈｉＩＩＡｃｔａ　１９９０゜１８９：　 ｐ＋１−６　ａｎｄ　Ｂｅｒｇｅｒ　Ｄ、　Ｋｉｔｔｅｒｅｒ　ＶＲ，Ｂｅｇｅ ｒ　ＨＧ、　Ｅｕｒ　ＪＣｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９９０；　２０：　６６− ７１）　ａこの著者らは、単に、２■鳳０１／Ｑまたは３１１ｍｏｌ／Ｑ　（呵 ｇ”　）の濃度で、二価陽イオンが反応混合物中に存在しなければならないと述 べているだけであり、内毒素の束縛にイオン濃度が与える潜在的影響を記しては いない。同著者らは、溶液中のイオン濃度の増加、及び、アポ・トランスフェリ ン−陽イオン錯体の非直接的に関連した増加が、アポ・トランスフェリンによる 内毒素束縛の改善に導くとは結論していない、よって、これらの公表文献では。

アポ°トランスフェリンへの内毒素の束縛のためには、アポ・トランスフェリン に陽イオンが先ず束縛されることが、前提条件の一つでありえるとは、示されて いない。

内毒素は、グラム陰性細菌の細胞壁の構成因子であり、細菌の減衰によってのみ 放出される。内毒素は、ｌＸｌ０’ドルトンまでの分子量の高分子であり、また 、細菌の細胞壁からの複合タンパク質残留物を含む場合もある。内毒素分子は、 構造的及び免疫生物学的に異なる３つの副領域からできている。すなわち、 副領域１、〇−固有鐵、複数の反復したオリゴ糖類の単位からなり、それぞれが 最大５個の中性糖からできている。存在するオリゴ糖類の数は、細菌の菌株に依 存する。例として、我々の実験で用いたウマ流産菌の内毒素は、この部位に８つ のオリゴ糖類を持っている。

Ｗ、核オリゴ糖類、他の物質と共にＤ−アセチル−グルコサミン、グルコース、 ガラクトース、ヘプトース、２−ケト−３−デオキシオフトン酸から成東！笠主 、脂質Ａ（分子量２，０００ドルトン）は、加すン酸反応り−グルコサミンー二 糖類から成り、それに約７ａｌの長ｌＩｉ脂肪酸がアミドとエステルとして連な っている。毒性のキャリアーは脂質Ａであり、そのため、この部位の複数の脂肪 准残留物から毒性が由来している。

内毒素分子の大きさ及びその電荷特性により、内毒素の構造内の３つの副領域の 基や側鎖は、さまざまな化合物やタンパク質と結合できるが、これによってその 毒性には何等の影響も与えられない。通常、いわゆる脂質へ会合タンパク（］、 ｊｐｉｄ　Ａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる。脂質Ａと のタンバグ質結合がある。はとんどの場合では、このタンパク質成分の脂質Ａか らの分離は、ある種の内毒素の毒性に何等の影響も与えない。しかし、多数の内 毒素へのタンパク質の結合が、その毒性の大幅な増加を導くことが有り得るとい うことも発見されていた（Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ　Ｅ、　Ｔ）１．　ｅｔ　ａｌ、 　（１９８２））　：“細菌性内毒素：化学構造、生物学的活性、及び敗血症に おける役割’　、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　５ｕｐｐ １．３１：　８−２１）　。

例えば、ある量のタンパク質と結合したある種の内毒素が、同じタンパク質を分 離した内毒素の毒性よりも、１００倍も強い毒性を持ち得ることが観察されてい た（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ＤＣ＋　０ｕｄｅｓ　ＺＧ、　Ｂｅｔｚ　Ｊ　（１９８ ０）　：　”細胞脱顆粒メカニズムにおける脂質ＡとＡ会合タンパク質との役割 ′″、　Ｅａｋｅｒ　Ｄ、　ｌｊａｄｓｔｒｏｍＴ　（Ｅｄｓ）、　ＮＡＴＵＲ ＡＬ　ＴＯＸＩＮＳ、　ｐｐ　２８７−２９４．　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓ ｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。また、動物実験でも、タンパク質を分離した場合には、毒 性の減少が観測されていた（Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ　ＰＪ、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　 ＤＣ，（１９８４）　：　“細菌性内毒素のタンパク質成分”Ｅ、Ｔ。

Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ　（ｅｄｉｔｏｒ）　ＨＡＮＤＢＯＯにｏｆ　ＥＮＤＯＴＯ ＸＩＮＳ、Ｖｏｌ　１：　Ｃｈｅ＠１ｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｒ　 ｐｐ　３３ｇ−３７５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｔ＋］１ｓｈ ｅｒｓ　Ｂ、Ｖ、３　。

自由内毒素、すなわち生物学的に活性の内毒素は１通常、健康な人の血液中では 検知されない、しかし、生物学的に活性の内毒素量が増加した以下のような病理 学的状態が、血液中で生じることがある。

ａ）腸壁内への浸透性障害による、腸管から血液中への内毒素移動の増加。例え ば、過度の全腸炎やショック、あるいは腸内抗生物質療法中の放出増加。

ｂ）例えば、肝機能障害部分肝臓削除などの、肝臓による内毒素排除の減少。

Ｃ）抗生物質を用いた腹膜炎の処置中に見ることもあるような、大きなグラム陰 性病巣から放出された内毒素の増加。

損傷から生体器官を保護するために、健康な人のプラスマは、腸管から連続的に 移送されている内毒素を不活性にすることができる。血液への過度の内毒素の移 送は、プラスマの内毒素不活性化容量の急激な窮乏を引き起こすため、より大量 の生物学的に活性の内毒素がプラスマ中で見つかった場合、内毒素血液状態の臨 床的兆候とされる。この状態が続く場合、内毒素は細胞の減退を引き起こし、最 終的には器官の異常を引き起こす、これらの理由から、血液中への内毒素の流入 が増加したり、肝臓の内毒素除去が減少したりすることが予測されるときに、常 に血液内毒素を減少させるために、臨床尺度を追加する必要がある。

ある程度まで、プラスマ内毒素の活性は、おそらく多価７Ｓ−ＩｇＧ　ＩＩ剤が 含む脂質Ａ抗体のために、多価７Ｓ−ＩｇＧＴＡ剤を投薬することで減らすこと ができる。内毒素中和のさらに進んだ改善は、ＩｇＧ留分の免疫グロブリンを高 めたＩｇＧにより成し遂げられており、その中では、脂質Ａ抗体力価が高いレベ ルにある（Ａｐｐｓｌｍｅｌｋ　ＢＪ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　 Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　１９８７；２：　３９１−３９３）。

内毒素の脂質Ａ部分または核にモノクロナール抗生物質を投薬する場合、プラス マ内毒素の活性が減じられると、敗血症の致死率を下げ得ることが、臨床的研究 により示されている（ＢａｕＢａｒｔｎｅｒ　ＪＤ、　ａｔ　ａｌ、：内毒素核 種脂質への抗体による、外科患者のグラム陰性ショックと死亡。Ｌａｎｃｅｔ　 １９８５；ｉｉ：　５９−６３；　Ｄｕｎｎ　ＤＬ、　Ｐｒ１ｅｓｔ　ＢＰ、　 Ｃｏｎｄｉｅ　ＲＭ、：試験的敗血症中の内毒素に対するモノクロナール抗体と ポリクロナール抗体の防御機能容量。Ａｒｃｈ　Ｓｕｒｇ　１９８８；　１．２ ３：　１３８９−１３９３；Ｚｉｅｇｌｅｒ　ＥＪ、　ｅｔ　ａｌ、内毒素に対 する１（Ａ−ＩＡ人モノクロナール抗体を用いたグラム陰性菌血症と敗血症ショ ックの治療６Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　１．９９１．３２４：　４２９−４３ ６）　。

モノクロナール抗体による内毒素の中和には、その他に。

トランスフェリンによる内毒素の毒性中和がある（ＤＥ　３８４４６６７）　、 多価免疫グロブリンｇ！４剤をトランスフェリンに組み合わせると、　ＤＥ　３ ８４２１４３に記されているような共働薬効果が得られる。

ＤＥ　３８４４６６７に記されているように、アポ・トランスフェリンが内毒素 を中和する容量は、三価鉄イオンの成分が増加するに従い増大する。しかし、生 体内では、Ｆｅ２“に還元されることで、トランスフェリンから鉄が抜は落ちる 。酸素結合反応の酸素活性化、すなわち、好中球顆粒菌による酸素基の形成を、 Ｆｅ”“イオンの増加が、刺激し得るため、トランスフェリン療法が有害な酸素 基を生体中に不幸にも形成する可能性がある。しかし、酸素活性化と、それが必 然的に伴う損傷酸素基を導く非酵素性プロセス、いわゆるハーベルーヴアイス（ ）Ｉａｂｅｒ−リｅｉｓｓ）反応（Ｈａｂｅｒ　Ｆ、、　Ｗｅｉｓｓ　Ｊ、　Ｐ ｒｏｃ　ＲｏｙａｌＳｏｃ　［Ａ］　１９３４：　１４７：　３３２−３５１） が、トランスフェリンから分離した還元二価鉄により触媒化されることがある（ ＣａｒｌｉｎＧ、、　Ｄｊｕｒｓａｔｓｒ　Ｒ，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１９８４ ；　１７７：　２７−３０）　、敗血症中のプラスマ・プロテアーゼ活性の増加 は、トランスフェリン分子を分割させるもう一つの因子である（Ｅｓｐａｒｚａ 　１．＋Ｂｒｏｃｋ　ＪＨ，ＢＬｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　１９ ８０；　６２２：　２９７−３０４；Ｄａｒｉｎｇ　ＧＭ、　ａｔ　ａｌ、　Ｉ ｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ　１９８８；　５６：　２９１−２９３）　、このよう にして放出され、錯鉄を備えたトランスフェリンの部分は、好中球顆粒菌により 酸素基の形成も触媒化することができる（Ｂｒａｄｌｓｙ　ＥＢ、、　Ｅｄｅｋ ｅｒ　ＢＬ、　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９９１；　８８：１０９２−１ １０２）。一方、酸素基は細胞膜に直接的な損傷を引き起こすことができ、他方 で、プロスタグランジンの合成を増加させて、間接的に生体に損傷を与える。

内毒素の大部分を中和し、内毒素の生物学的効果を適当な程度まで制御する手段 として、適切な臨床薬剤であり、よって、内毒素の毒性を予防的かつ治療的に処 置する有効な薬剤として使用するのに適当な臨床薬剤を与えることが本研究の主 題である。この薬剤は、また、内毒素血液状態に有害な酸素基の好ましくない構 成を最小にする能力も備えなければならない。

したがって、この発明は、二価の亜鉛または銅イオンを備えたアポ・トランスフ ェリンを使用する。このようなアポ・トランスフェリン−金属錯体は、免疫グロ ブリン調剤との組合せやプラスマ・タンパク質溶液や血清保存液への添加にも適 当である。

インヴイトロ及びインヴイヴオ実験を行ない、二価の亜鉛または綱を備えたアポ ・トランスフェリン錯体の容量を試験し、また、不活性の内毒素に対し、これら の錯体を免疫グロブリンと組み合わせた試験を行なった。

インヴイトロ実験： Ａ）生物学的活性に対するトランスフェリン−金属錯体の影響の定量的研究 アポ・トランスフェリン−亜鉛とアポ・トランスフェリン−銅及び、これらそれ ぞれに免疫グロブリンを組み合わせて培養を行ない、３７℃で６０分間内毒素の 量的増加をさせた。

培養の後に１表面層中の内毒素の生物学的活性の定量的決定を１色素産生バクテ リアの膚を用いた改良リムルス試験により行なった（Ｎｉｔｓｃｈｅ　ａｔ　ａ Ｌ、　：Ｉｔａｔｓｏｎ　ＳＷ、　Ｌｅｖｉｎ　、ＬＮｏｖｉｔｓｋｙ　ＴＪ　 （ｅｄｓ、）リムルス遊走細胞溶解物試験による細菌性内毒素の検＠、ｐρ、　 ４１７−４２９　（１９８７））。

この改良リムルス試験の検知下限は、ＩＥＵ／ｄｌｌである。リムルス試験によ り計測した内毒素活性度は、内毒素の生物学的活性度に対応している（Ｎｉｔｓ ｃｈｅ　Ｄ、　Ｕｌｍｅｒ　Ａ、、　Ｆｌａｄ　ＨＤ：リムルス試験による内毒 素の決定と内毒素の生物学的活性度。

関連性が存在するか？−準備中）。内毒素計測に先立ち行なった実験では、ｚ　 ｕ　２？やｃｕ２＋イオンによってリムルス反応に何等の影響も見られなかった 。

実験に用いたアポ・トランスフェリンには、はぼ金属イオンがなかった（Ａｔｆ 、−０）　、原始吸光スペクトロスコピーによって、このアポ・トランスフェリ ン（Ａｔｆ、−（１）には、亜鉛が検知されなかった。また、同様に銅も検知さ れながった。

メグロウ（Ｍｅｇｒａｗ）とボウダ（Ｂｏｕｄａ　）により説明されている鉄分 析法（Ｍｅｇｒａｗ　ＲＥ、　Ｈｒｉｔｚ　ＡＭ、　Ｂａｂｓｏｎ　ＡＬ　ａｎ ｄＣａｒｒｏｌｌ　ＪＪ　（１９７３）　ｃｌｉｎ、　Ｂｉｏｃｈｅ＠、　６： 　２６６；　Ｂｏｕｄａ　Ｊ　（１９６ｇ）ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　Ａｃｔａ 　２１：　１５９）により、アポ・トランスフェリンの５％溶液に鉄が含まれて いないことが明らかとなった。

この方法の検知下限は、０．３μｇ／ｄｌである。

さまざまな量の塩化亜鉛（ＺｎＣ１□）をアポ・トランスフェリン（Ａｔｆ、− ０）に加え、アポ・トランスフェリンに対し亜鉛を４．８μｇ／ｇ含むアポ・ト ランスフェリン−亜鉛溶液（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）　）及び、アポ・トランスフ ェリンに対し亜鉛を５９８μｇ／ｇ含むアポ・トランスフェリン−亜鉛溶液（Ａ ｔｆ。

−Ｚｎ（Ｂ））を得た。

さまざまな量の塩化網（ＩＩ）　（ＣｕＣ１□）をアポ・トランスフェリン（Ａ ｔｆ、−０）に加え、アポ・トランスフェリンに対し銅を５７μｇ７ｇ含むアポ ・トランスフェリン−銅溶液（Ａｔｆ、−Ｃｕ（Ａ））及び、アポ・トランスフ ェリンに対し銅を７４０μｇ７ｇ含むアポ・トランスフェリン−銅溶液（Ａｔｆ 、−Ｃｕ（Ｂ）　）を得た。

アポ・トランスフェリン−鉄を参照基準として用いた。塩化鉄（ｍ　）　（Ｆｅ Ｃ１，）をアポ・トランスフェリン（Ａｔｆ、−０）に加え、１グラムのトラン スフェリン当り５９８μｇの鉄を含むアポ・トランスフェリン−鉄溶液を作った 。

以下のような免疫グロブリン溶液を用いた。すなわち、１２％ＩｇＧＮ　（Ｉｇ Ｇ／Ａ／Ｍ＝ペンタグロブリン）に７５−ＩｇＧ（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｉｎ　） 及び７５−ＩｇＧを添加した。

以下の細菌菌株からの内毒素を用いた。すなわち、プソイドモナス緑ｌ１ｌＩ菌 フィシャー・タイプ７、サルモネラウマ流産Ｎ　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｂ ｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉ）　（ＮＯＶＯＰＹＲＥＸＡＬ）　、　ＦＤＡ内毒素標準 ＶＯｎ　エシェリキア・コリ　０１１３：　Ｈｌ、Ｏ：　ＫＯを使用した。

“不活性パーセンテージ″の決定 各場合の内毒素不活性のパーセンテージは、最初に加えた内毒素濃度とタンパク 質と共に培養した後で測定した内毒素活性との差から計算した。試験を行なった 内毒素濃度の全領域（１０ＥＵ／ａ　〜１　、　ＯＯＯＥＵ／ａ）ニツイテの各 タンパク質濃度に対する“不活性度のパーセンテージ″は、試験を行なった異な った内毒素濃度に対して、このようにして決定した値に基づき計算した。

内毒素不活性度容量の決定 アポ・トランスフェリン−綱の容量を定量化するために、アポ・１〜ランスフェ リン−亜鉛とアポ・トランスフェリン−鉄、及びアポ・トランスフェリン−亜鉛 とアポ・トランスフェリン−銅が免疫グロブリンと共にある時の不活性内毒素に 対して“不活性度容量”を決定した。計測精度を改善するために、このパラメー ターは同じに決めず、１０ＥＵ／、ｉＱと１００ＥＵ／ｄｉ！の内毒素過剰濃度 で決定した。このパラメーターは、タンパク質試料と共に（６０分間で３７℃で ）培養した後に表面層中に工ＯＥＵ／Ｊまたは１０　ｏｒ：ｕｉｄｌの自由内毒 素濃度に達するように、各タンパク質試料に添加した内毒素の量に対して（ＥＵ ＃Ｑ）計算した。この内毒素濃度は、添加した内毒素の量と培養後の表面層で計 測した内毒素濃度間の関係に基づき、各試料（アポ・トランスフェリン−亜鉛、 アポ・トランスフェリン−綱、免疫グロブリン、さらに、アポ・トランスフェリ ン−亜鉛とアポ・トランスフェリン−銅それぞれと免疫グロブリンを加えた各試 料）に対して計算した。内毒素の濃度を増した（Ｉ　ＯＥＵ／ａ、　２５ＥＵ／ ｄｉ、　５０ＥＵ／ａ、　１００ＥＵ／ｄｌｌ、　２００ＥＵ／ｄｌｌ、　３０ ０ＥＵ／ｄｉｍ、　５００ＥＵ／ｄｌｌ、　７５０ＥＵ／ｄｌｌ、　１　、　Ｏ ＯＯＥＵ／ｄｇ）さまざまなタンパク質試料と共に６０分間培養を行なった一連 の計測で、不活性度容量を決定した。

反応試料中のアポ・トランスフェリン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−鋼 の濃度は、３１２．５■／ｄｌｌであった。

アポ・トランスフェリン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−鋼を免疫グロブ リンと組み合わせて行なった計測では。

反応混合液中の各タンパク質部分の濃度は３１２■Ｉａであった。

所与の条件下で各タンパク質試料（■／ｄｌｌ）が不活性にできた平均内毒素濃 度は、この方法で決められた内毒素量から、過剰の内毒素の所与の量（１０ευ ／ａまたは１００Ｅυ／ｄｌｌ）を差し引いた値である。１００ＥＵ／ａのタン パク質濃度に関しては、この量の内毒素が、各アポ・トランスフェリン−金属錯 体またはアポ・トランスフェリン−金属と免疫グロブリンの組合せの“平均不活 性度容量（ＥＵ／１００■）″のゲージである。

結果： １）アポ・トランスフニリン−金属錯体：金属イオン自由状態のアポ・トランス フェリン（Ａｔｆ、−０）で内毒素を培養すると、内毒素の濃度とタイプに依存 して。

３２．２％から４３．６％の内毒素活性度の平均減少度が記録された。

亜鉛濃度４．８μｇ／ｇのアポ・トランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ ）　）で内毒素を培養すると、内毒素の濃度とタイプに依存して、７２．５％か ら８２．４％の内毒素活性度の平均減少度が記録された。

亜鉛濃度５９８μｇ／ｇのアポ・トランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ ）　）で内毒素を培養すると、内毒素の濃度とタイプに依存して、９１．４％か ら９７．８％の内毒素活性度の平均減少度が記録された。

銅濃度５７μｇｉｇのアポ・トランスフェリン−銅（Ａｔｆ、−Ｃｕ（Ａ））で 内毒素を培養すると、内毒素の濃度とタイプに依存して、８４％から８９．３％ の内毒素活性度の平均減少度が記録された。

銅濃度７４０μｇ／ｇのアポ・トランスフェリン−鋼（Ａｔｆ。

−Ｃｕ　（Ｂ）　）で内毒素を培養すると、内毒素の濃度とタイプに依存して、 ９０．８％から９６．７％の内毒素活性度の平均減少度が記録された。

鉄濃度５９８μｇ／ｇのアポ・トランスフェリン−鉄（丁ｒｆ。

−Ｆｅ）で内毒素を培養すると、内毒素の濃度とタイプに依存して、９２．２％ から９７．６％の内毒素活性度の平均減少度が記録された。　ａ）　１０ＥＵ／ ｄＱを越えた内毒素について。

不活性容量は以下のようである。

ｒ　）　Ａｔｆ、−０：ウマ流産菌に対して１．８Ｅυ／１００■、エシェリキ ア・コリに対して２．３ＥＵ／１００■、緑Ｉｌ菌に対して２、７ＥＵ／１００ ■であった。

■）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）　：ウマ流産菌に対して１１　、　ＩＥＵ／１．０ ０ｍｇ、エシェリキア・コリに対して１６　、３ＥＵ／１００ｍｇ、緑膿菌に対 して１４　、９ＥＵ／１００■であった。

ｍ　）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）　：ウマ流産菌に対して６６　、８ＥＵ／１００ ■、エシェリキア・コリに対して８７　、０２Ｅｔｌ／１００■、緑膿菌に対し て７２　、４９ＥＬｌ／１００■であった。

ＩＶ　）　Ａｔｆ、−Ｃｕ（Ａ）　：ウマ流産菌に対して３４．６ＥＵ／１００ ｍｇ、エシェリキア・コリに対して４３　、８Ｅｔｌ／１．００■、緑ｌ１Ｍに 対して３９　、７ＥＵ／１００■であった。

Ｖ）　Ａｔｆ、−Ｃｕ（Ｂ）　：ウマ流産菌に対して７０　、　Ｉ　Ｅｌ／１０ ０ｍｇ。

エシェリキア・コリに対して７９　、４ＥＵ／１００■、緑膿菌に対して６４　 、６ＥＵ／１００■であった。

ＶＩ）　Ｔｒｆ、−Ｆｓ　：ウマ流産菌に対して７６　、７ＥＵ／１００．、エ シェリキア・コリに対して７８　、２ＥＵ／１００■、緑膿菌に対して７３　、 ８ＥＵ／１００ｑであった。

ｂ　）　１００ＥＵ／ｄｌｌを越えた内！ｌ素について、不活性容量は以下のよ うである。

ｒ　、）　Ａｔｆ、−０：ウマ流産菌に対して１７．８ＥＵ／１００ｍｇ、　ｘ シェリキア・コリに対して１９　、４ＥＵ／ＬＯＯ■、緑膿菌に対して２０　、 ６ＥＵ／１００■であった。

ｆｆ　、）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）　：ウマ流産菌に対してｌ　Ｏ９、７ＥＵ／ １００■、エシェリキア・コリに対して１３７　、４ＥＵ／１００ｍｇ、緑膿菌 に対して１４５　、５ＥＵ／１００■であった。

Ｄｌ、）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）　：ウマ流産菌に対して５０７　、６ＥＵ／１ ００■、エシェリキア・コリに対して５７８　、５Ｅｔｌ／１００■、緑膿菌に 対して６４７　、３ＥＵ／１００■であった。

ＩＶ、）　Ａｔｆ、−Ｃｕ（Ａ）　ニウマ流産菌に対して３６２ＥＵ／１００ｍ ｇ、エシェリキア・コリに対して３８７　、４ＥＵ／１００ｍｇ、緑膿菌に対し て４０９　ＥＵ／１００■であった。

Ｖ、）　Ａｔｆ、−Ｃｕ（Ｂ）　：ウマ流産菌に対して５２２　、４ＥＵ／１０ ０■、エシェリキア・コリに対して５２７ＥＵ／１００■、緑膿菌に対して５８ ５　、１　ＥＵ／１００■であった。

Ｖｌ、）　Ｔｒｆ、−Ｆｅ　：ウマ流産菌に対して４１８．７εＩＪ／１００ｍ ｇ、エシェリキア・コリに対して５７１　、　Ｉ　ＥＵ／１００■、緑膿菌に対 して６４３　、９　ＥＵ／１００■であった。

２）アポ・トランスフェリン−金属錯体と７Ｓ　ＩｇＧ　：アポ・トランスフェ リン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−銅と７３　ＩｇＧ試料との組合せで 、内毒素の不活性度が改善される。アポ・トランスフェリン（３１２＊／ｄＱ） と７Ｓ　ＩｇＧと共に内毒素を培養すると、亜鉛、銅、鉄のないアポ・トランス フェリン（Ａｔｆ、−０）を用いたときの１００ＥＵ／ｄＱでの内毒素濃度で、 最大６１％から６８％の内毒素活性度が減少する。

１００ＥＵ／ｄｉｌを越える範囲の内毒素濃度では、この組合せで。

内毒素活性度はわずかではあるが、４７．１％から５４．９％減少する。

７５　ｒｇＧ試料と共に亜鉛濃度４．８μｇ／ｇのアポ・トランスフェリン−亜 鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ））で内毒素を培養すると、内毒素の濃度とタイプに依 存して、８３．１％から８９．１％の内毒素活性度の平均減少度が記録された。

７Ｓ　ＩｇＧ試料と共に亜鉛濃度５９８μｇ／ｇのアポ・トランスフェリン−亜 鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）　）で内毒素を培養すると、内毒素の濃度とタイプに 依存して、９４，４％から９７．８％の内毒素活性度の平均減少度が記録された 。

７Ｓ　ＩｇＧ試料と共に銅濃度５７μｇ／ｇのアポ・トランスフェリン−鋼（Ａ ｔｆ、−Ｃｕ（Ａ）　）で内毒素を培養すると、内毒素の濃度とタイプに依存し て、８７．２％から９３．１％の内毒素活性度の平均減少度が記録さ九た。

ａ）ＩＯＥＵ／ａを越えた内毒素について、不活性容量は現下のようである。

１　、）　Ａｔｆ、−０ドアＳ　ＩｇＧ　：　ラフ流産菌に対し、テロ、　ＩＥ ＬＩ／１００■、エシェリキア・コリに対して１０　、６ＥＵ／１００■、緑膿 菌に対して１１　、４ＥＵ／１００ｗであった。

Ｕ、）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）と７５℃ｇＧ：”７７流産菌に対し１：２４．２ ＥＵ／１．００ｑ、Ｘ−シｘ　’Ｊ　キ７　・：Ｉ　ＩＪ　ニ対しテ３０．　Ｉ ＥＬＩ／１００■、緑膿菌に対して２７　、５ＥＵ／１００ｍｇであった。

ｍ、）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）と７５℃ｇＧ：ウマ流産菌に対して７４．ＩＥυ ／１００■、エシェリキア・コリに対して９８　、９ＥＵ／１００■、緑膿菌に 対して８６．８ευ７１００■であった。

ＩＶ、）　Ａｔｆ、−Ｃｕ（Ａ）と７５℃ｇＧ：ウマ流産菌に対して４０．１Ｅ Ｕ／１００■、エシェリキア・コリに対して５０　、６ＥＵ／１００■、緑膿菌 に対して４６　、３ＥＬＩ／１１００Ｉ１であった。

ｂ　”）　１００ＥＵ／ｄａを越えた内毒素について、不活性容量は以下のよう である。

１　、）　Ａｔｆ、−０と７ＳＩｇＧ：ウマ流産菌に対して２８．６５ＥＵ／１ ．００■、エシェリキア・コリに対して３０　、７ＥＬｌ／１００■、緑膿菌に 対して３９　、　ＩＥＵ／１００■であった。

Ｕ　、）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）と７３　ＩｇＧ　：ウマ流産菌に対して１５１ ゜５　ＥＵ／１００■、エシェリキア・コリに対して１７７．９Ｅｔｌ／１００ ■、緑膿菌に対して１９５　、５ＥＵ／１００■であった。

［、）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（８）と７ＳＩｇＧ：ウマ流産菌に対して５３８゜４Ｅ υ／１００■、エシェリキア・コリに対して６０２．７ＥＵ／１１００Ｉｌ１、 緑膿菌に対して６７５　、１Ｅｔｌ／１００■であった。

ＩＶ、）　Ａｔｆ、−Ｃｕ（Ａ）と７ＳＩｇＧ：ウマ流産菌に対して５５４゜７ 　ＥＵ／１００■、エシェリキア・コリに対して５４７．３ＥＬｌ／１００ｍｇ 、緑膿菌に対しテロ　０８　、１　ＥＵ／ＬＯＯｗ：であった。

３）アポ・トランスフェリン−亜鉛とＩｇＧ／Ａ／Ｍ　（１２％ＩｇＧ）　：　 ｌ　２％ＩｇＭとＩｇＡを添加したＩｇＧ試料（ＩｇＧ／Ａ／Ｍ）にアポ・トラ ンスフェリン−亜鉛を加えると、不活性化容量にさらに改善をもたらす。ＩｇＧ ／Ａ／Ｍ　（１２％ＩｇＭ　）（３１２■／ｄｉ）と亜鉛濃度４．８μｇ／ｇの アポ・トランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ））　（３１２ｇ／ｄＱ） を組み合わせ、内毒素を培養したとき、内毒素の濃度とタイプに依存して、内毒 素活性度は８４．７％から９２．６％減少している。

ＩｇＧ／Ａ／Ｍ　（１２％ＩｇＭ）　（３１２ｇ／ｄＱ）と亜鉛濃度５９８１！ Ｊ　ｇ／ｇのアポ・トランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ））　（３１ ２■／（ｉｌｌ）を組み合わせ、内毒素を培養したとき、内毒素の濃度とタイプ に依存して、内毒素活性度は９４．８％から９８．１％減少している。

ａ）ＩＯＥＵ／ｄ１を越えた内毒素について、不活性容量は以下のようである。

Ｉ　、）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）とＩｇＧ／Ａ／Ｍ　：ウマ流産菌に対して２６ ．９ＥＵ／１．００■、エシェリキア・コリに対して３１　、５ＥＵ／１００■ 、緑膿菌に対して２４　、９Ｅｔｌ／１００■であった。

ＩＴ　、）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）とＩｇＧ／Ａ／Ｍ　：ウマ流産菌に対して９ ３．８ＥＩＪ／１０（ｌｑ、　エシェリキア・コリに対して１０８．５ＥＬｌ／ １００■、緑膿菌に対して９７　、８ＥＵ／１００ｍｇであった。

ｂ　）　１００ＥＵ／ｄｌｌを越えた内毒素について、不活性容量は以下のよう である。

１　、＞　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）とＩｇに／Ａ／Ｍ　：ウマ流産苗に対して１４ １゜ＩＥＬＩ／１００＠ｇ、エシェリキア・コリに対して１７３．２ＥＬｌ／１ ００■、緑膿菌に対して１９２　、５ＥＵ／１００■であった。

■、）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）とＩｇＧ／Ａ／Ｍ　：ウマ流産菌に対して６８８ ＥＵ／１００■、エシェリキア・コリに対して８２８ＥＵ／１００■、緑膿菌に 対して７９６　、９　ＥＵ／１００■であった。

Ｂ）媒介物質ＩＬＬとＩｎ２の放出の影響アポ・トランスフェリンと二価亜鉛イ オンの錯体による内毒素の生物学的活性度の不活性化度に対するパラメーターと して、単核細胞からのＩＬＬとＩｎ２の放出をさらに用いた。

アポ・トランスフェリン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−亜鉛と免疫グロ ブリンの組合せで、内毒素を培養した（６０分間、３７℃）、その後、単核細胞 で表面層を培養し、単核ｍ胞により放出された媒介物質インタロイキン１とイン タロイキン６の濃度を、その表面層で計測した。アポ・トランスフェリン１ｇ当 り４．８μｇの亜鉛濃度のアポ・トランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ ）　）及び、アポ・トランスフェリン１ｇ当り５９８μｇの亜鉛濃度のアポ・ト ランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ））を使用した。

１２％ＩｇＧ　（Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ）を添加した７Ｓ　ＩｇＧ　（ＩｇＧ ／Ａ／Ｍ）を免疫グロブリンとして用いた。

以下のような細菌株からの内毒素を用いた。すなわち、サルモネラウマ流産菌（ Ｓａｌ＋＋＋ｏｎｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉ）　（ＮＯＶＯＰＹＲＥ ＸＡＬｌ）とエシェリキア・コリ０１１３：　ＨＩＯ：　ＫＯからのＦＤＡ内毒 素標準規格ＥＣ−５ 免疫グロブリンと組み合わせたアポ・トランスフェリン−亜鉛及び、アポ・トラ ンスフェリン−亜鉛を３７℃で６０分間内毒素と共に培養した。参照基準タンパ ク質として、各ケースについて個々の亜鉛容量に加熱変性処理した７Ｓ　ＩｇＧ 　（８０℃、１０分間）を用いた（７Ｓ　ｒｇＧのグラム当り亜鉛４．６μｇま たは５９８μｇ）。試料内のタンパク質濃度は、それぞれ３１２ｍｇ／ｃｌｌｌ ｔ’あった。　５０ＥＵ／ｄｌｌカら５００ＥＵ／ｄｉ！ノ内毒素濃度で、培養 を行なった。

培養の後で、健康なドナーから得た単核細胞で培養した（１６時間、３７℃）、 その後、放出された媒介物質ＩＬＬとＩｎ２の濃度を決めた。ＩＬＬは、ＥＩ、 ４〜６．１胸腺腫細胞系を用いた繊維芽細胞増殖試験の方法により計測した（Ｌ ｏｐｐｎｏｗ、Ｈ，；Ｆｌａｄ、Ｈ，−Ｄ；Ｕ１鵬ｅｒ、Ａ、Ｊ、　ａｔ　ａｌ 、’人体皮膚繊維非細胞を用いたインタロイキン１の検知″Ｉｍｍｕｎｂｉｏ１ ．／１９８９，１７９，２８３−２９１）　、　Ｉ　Ｌ　６濃度も、マウス・ハ イブリドーマ（７ＴＤ１）へのＩＬ６依存性を利用した増殖試験を用いて決定し た（Ｖａｎ　Ｄａｍｎｓ　Ｊ、　Ｃａｙｐｈａｓ　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ８７）　Ｅｕｒ、　ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｙａ、１６８：　５４３：Ｖａｎ　０ｅ ｒｓ　Ｍ）ＩＪ＞　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｈｅｙｄｅｎ　Ａ、ａｎｄ　Ａａｒｄｅｎ ＬＡ、（１９８ｇ）Ｃ１ｉｎ、　８ＸＰ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７１：　３１４ −４１９）　。

結果： アポ・トランスフェリン−亜鉛と共に内毒素を培養した結果は、単核細胞からの 内毒素起因媒介物質の放出の減少があった。この効果は、アポ・トランスフェリ ンの亜鉛荷重に依存し、亜鉛濃度を上げると改善できる。免疫グロブリンとアポ ・トランスフェリンを組み合わせると、アポ・トランスフェリン錯体の媒介物質 放出に与える抑制効果が、さらに強化される。

１、）参照基準タンパク質　（加熱処理７ＳＩｇＧ）既に亜鉛を添加した加熱不 活性化７ＳＩｇＧで内毒素（５００ＥＵ／ａ）を培養したものを、参照基準タン パク質として用いたが、その処理の後、４．６μｇ／ｇの亜鉛濃度（Ｚｎ（Ａ） ）の参照基準タンパク質と５９８μｇ／ｇの亜鉛濃度（Ｚｎ（Ｂ））の参照基準 タンパク質の間には−ｇ介物質の放出量に何等の違いも見られなかった。

ＴＬ−１ウマ流産菌からの内毒素を用いた参照基準タンパク質の培養の後、ＩＬ −１の平均放出量は、２，６８５Ｕ／ＩＩＱであり、エシェリキア・コリからの 内毒素を用いた培養後のＩＬ−１の放出量は２，９６８Ｕ／ｍｅであった。

ＩＬ−６：ウマ流産前からの内毒素を用いた参照基準タンパク質の培養の後、Ｉ Ｌ−６の平均放出量は、３，６２１１Ｊ／■ａであり、エシェリキア・コリから の内毒素を用いた培養後のＩＬ−６の放出量は５　、９７４Ｕ／ｒａＱであった 。

工１．）　アポ・トランスフェリン−亜鉛ａ　）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）で５０ ０ＥＵ／ｄｉ！の内毒素を培養した後の工Ｌ１の平均放出量は、ウマ流産前では ３２１Ｕ／ｍｕであり。

エシェリキア・コリでは、４１２Ｕ／ＩＩｎであった。

アポ・トランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、４ｎ（＾））で培養した後のＩＬ６の 平均放出量は、ウマ流産前では１，１３２Ｕ／ｌｌＱであり、エシェリキア・コ リでは、１，８２５Ｕ／ｍｕであった・ ｂ）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）の内毒素を培養した後のＩＬＬの平均放出量は、ウ マ流産前では１０２Ｕ／ａｎでありエシェリキア・コリでは、４７Ｕ／璽Ｑであ った。

のＩＬ６の平均放出量は、ウマ流産前では５２６Ｕ／ｍＱであり、エシェリキア ・コリでは、３１６Ｕ／ｍｌｌであった。

ＩＩＩ、）　アポ・トランスフェリン−亜鉛とＩｇＧ／Ａ／Ｍ　（１２％ＩｇＭ ） ＩｇＡと１２％ＩｇＭを添加した７５℃ｇＭ試料（ＩｇＧ／Ａ／Ｍ）とアポ・ト ランスフェリン−亜鉛の組合せにより、５００ＥＵ／ｄＲの内毒素を培養した後 、３１２ｍｇ１ａの免疫グロブリン濃度、及び３１２ｍｇ／ａのアポ・トランス フェリン濃度で以下のような結果を得た。

ａ）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）とＩ　ｇ　Ｇ／Ａ／Ｈの組合せで、ＩＬＩの平均放 出量は、ウマ流産前からの内毒素で２２７［１／１ｌＩＱであり、エシェリキア ・コリからの内毒素で２６７０／ｍＱであった。

培養後のＩＬ６の放出量は、ウマ流産前からの内毒素で８７２Ｕ／ＩＩＱであり 、エシェリキア・コリからの内毒素で６３１１Ｊ／ＩＩＱであった８ ｂ）　Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）とＩｇＧ／Ａ／Ｍ　（１２％）の組合せで、ＩＬＬ の平均放出量は、ウマ流産前からの内毒素で３１０／ｍｕであり、エシェリキア ・コリからの内毒素で１７Ｕ／ｍＱであった。

培養後のＩＬ６の放出量は、ウマ流産前からの内毒素で１８６０／ｍ１２であり 、エシェリキア・コリからの内毒素で１３７０／ｍｕであった。

Ｃ）　プラスマ内毒素活性に与える。亜鉛または銅とのアポ・トランスフェリン 錯体の影響 健康なドナーからの人プラスマを１＝１０に希釈し、加熱によって（８０℃、１ ０分間）不活性化した。その後、アポ・トランスフェリン−亜鉛またはアポ・ト ランスフェリン−銅を添加した。ブラスマ中のアポ・トランスフェリン−亜鉛濃 度は２８０ｇ＋ｇ７Ｍであり、アポ・トランスフェリン−鰐の濃度は２８４ｍｇ ／ａｌｌであった。同じ亜鉛または銅濃度にそれぞれの場合で成るように、アル ブミン亜鉛またはアルブミン鋼を参照基準プラスマ試料に添加した。（緑膿菌内 毒素とエシェリキア・コリ内毒素の）内毒素を、その後、既にアポ・トランスフ ェリン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−綱、および、アルブミン−亜鉛ま たはアルブミン−銅を添加したプラスマに添加し、プラスマ試料中で３００ＥＵ ／ｄｌｌまたは１゜０００ＥＵ／Ｊの内毒素活性レベルにし、６０分間３７℃で 培養した。培養に続き、試料中の内毒素の活性をリムルス試験で計測した。

プラスマの内毒素活性度は、アルブミンのみ（アルブミン−銅）を添加した試料 に比較して、アポ・トランスフェリン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−銅 を添加した試料では、顕著な減少がみられた。

ａ）４．８μｇ／ｇのアルブミンを含む亜鉛（Ｚｎ（Ａ））の場合も、５９８μ ｇ／ｇのアルブミンを含む亜鉛（Ｚｎ　（Ｂ）　）の場合でも、アルブミン−亜 鉛を加えた内毒素の培養後の、ブラスマ内毒素の活性は、添加した内毒素の活性 レベルに比較し最大約４％低かった。１グラムのアルブミン当り７４０ｇｇの綱 を含むアルブミン−銅で培養しても、約４％というほぼ同じ値の内毒素活性度の 減少が記録された。

ｂ）プラスマにＡｔｆ、−Ｚｎ（Ａ）を添加した結果、３００ＥＵ／ｄＱの内毒 素濃度の添加で８３．４％±４．２％（ｎ＝２０）までのブラスマ中内毒素活性 の減少があり、１　、　ＯＯＯＥＵ／ｄＩ２の内毒素濃度の添加で６９．１％± ６．８で（ｎ　＝　１８）までの減少があった６ Ｃ）アポ・トランスフェリン１グラム当り５９８ｇｇの亜鉛含有量のアポ・トラ ンスフェリン−亜鉛Ａｔｆ　、　−Ｚｎ　（Ｂ）をプラスマに添加した結果、５ ００ＥＵ／ａの内毒素濃度の添加で９３．９％±２．９％（ｎ＝２０）までの培 養後プラスマ中内毒素活性の減少があり、１，０ＯＯＥＵ／ｄＱの内毒素濃度の 添加で９４．８％±２．７％（ｎ＝２０）までの減少があった。

ｄ）　アポ・トランスフェリン１グラム当り７４０μｇの銅含有量のアポ・トラ ンスフェリン−亜鉛Ａ　ｔｆ　、　−Ｃｕ　（Ｂ）をプラスマに添加した結果、 　５００ＥＵ／ｄｎの内毒素濃度の添加で９２゜７％±４．１％（ｎ＝１．６） までの培養後プラスマ中内毒素活性の減少があり、１，０ＯＯＥＵ／ｄｌｌの内 毒素濃度の添加で９０．８％±３．４％（ｎ＝１６）までの減少があった。

結果の総括評価： １、）二価亜鉛または綱イオンとのアポ・トランスフェリン錯体は、内毒素の生 物学的活性度を減じる機能があり、その有効性の度合いは、用いたアポ・トラン スフェリン濃度に依存し、したがって、生体中の内毒素毒性の予防的処置と治療 的処置に対する薬剤として優れて適合するや２、）金属イオンの無いアポ・トラ ンスフェリンは、内毒素活性度にわずかな効果を備えるだけである。

３、）アポ・トランスフェリン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−綱が内毒 素の毒性を減じる度合いは、アポ・トランスフェリンにより束縛された亜鉛また は鯛の量が増すと増加する。使用したアポ・トランスフェリンの亜鉛または銅の 濃度は、アポ・トランスフェリン１グラム当り少なくともＯ０ｌμｇなければな らない。

４、）生体中の内毒素の毒性処置のための薬剤として、三価鉄イオンの代わりに 二価亜鉛または銅イオンと錯結合したアポ・トランスフェリンを用いることは、 トランスフェリンとほぼ同様の内ｌＩ素中和容量となり、かつ、これらのアポ・ トランスフェリン−金属錯体の投薬が生体内で毒性酸素基の構成を刺激しないと いう大きな利点を提供する。

５、）アポ・トランスフェリン−亜鉛と共に亜鉛イオンを添加することや、アポ ・トランスフェリン−銅と共に綱イオンを添加することで、一群のペルオキシダ ーゼと共に、″スーパーオキシドジスムターゼ酵素を活性化することができる。

したがって、アポ・トランスフェリン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−胴 の投薬は、生体中の内毒素の毒性のその他の予防的処置や治療的処置に比べて重 要な利点を備えており、内毒素の中和に加えて、内毒素血液状態にある大量に生 み出される毒性酸素基の除去の改善をも行なう。

６、）また、内毒素中和にアポ・トランスフェリン−亜鉛を用いると、内毒素の 中和を達成できるという利点があるばかりでなく、タンパク質の合成を刺激する という利点もあり。

その結果、亜鉛イオンがＤＮＡとＲＮＡの合成を促進するため、潜在的に、創傷 治癒過程にも利点がある。

７、）アポ・トランスフェリン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−銅錯体は 、プラスマタンパク質と結びつくことができ、よって、免疫グロブリン溶液にＩ ｇＧ単体またはその他のプラスマタンパク質、特にＩｇＭと丁ｇＡを含むことも できる。

８、）その他のプラスマタンパク質とのアポ・トランスフェリン−亜鉛とアポ・ トランスフェリン−鋼の組合せは、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む免疫グロブリンの 場合には特に、個々の成分単体よりも、はるかに大きな内毒素の生物学的活性度 の減少が達成される。

９、）内毒素を中和する共同薬効果により、内毒素の血流への移送が長引き増加 するようなすへての疾病の内毒素の毒性減少について、アポ・トランスフェリン −亜鉛とアポ・トランスフェリン−綱が特に最適な治療手段となる。

以下の例により、発明のさまざまな面をさらに詳細に説明する。

例　ｌ 以下の実験は、プラスマ中の内毒素を不活性化するアポ・トランスフェリンの二 価亜鉛または銅荷重の重要さを客観的に計量するために、アポ・トランスフェリ ン−亜鉛を用いて１０に希釈し、加熱によって不活性化した（８０℃、５分間） 後、亜鉛の量を変化させたアポ・トランスフェリンをこのプラスマに添加した。

この反応試料のアポ・トランスフェリン濃度は、３００ｗ／ａであった。アポ・ トランスフェリンの亜鉛荷重は、Ｉｎ（Ａ２の量を変えて添加しｔｌｌＷＪシた 結果、アポ・トランスフェリンの亜鉛に対するモル比として、２８：１．１：Ｌ ｌ：３を得た。

不活性化したプラスマにアポ・トランスフェリン−亜鉛を加えた後、さまざまの 濃度のエシェリキア・コリからの内毒素を、このプラスマ試料に加え、反応試料 中の内毒素濃度を５０．１００，２００．３００．５００．７５０．１，０００ ．１　、５００ＥＵ／ｄ１とした。内毒素の添加直後に、この試料を６０分間３ ７℃で培養した。その後、試料中の残留内毒素活性度を計測した。ｌ０ＥＵ／ｄ ｌｌを越える内毒素について。

さまざまのアポ・トランスフェリン−亜鉛溶液の不活性化容量を、この方法で得 られた値に基づき計算した。

アポ・トランスフェリン−亜鉛の１００　、／ａに対する不活性容量の値を、ア ポ・トランスフェリンの亜鉛に対するモル比の関数として計算した。１０ＥＵ／ ｄｌｌを越える内毒素に到達するように、この計算を行なった。

ａ）２８：ｌ：　アポ・トランスフェリン−亜鉛１００■当り１９．２ＥＵ ｂ）１：１：　アポ・トランスフェリン−亜鉛１００■当り８７．ＩＥＵ ｃ）１：３：　アポ・トランスフェリン−亜鉛１００■当り２７９．８ＥＵ アポ・トランスフェリン溶液中の亜鉛の割合を上げることで、不活性容量を増す ことができる。例えば、アポ・トランスフニリン試料中のアポ・トランスフェリ ンと亜鉛のモル比を２８：１から１＝３にして、亜鉛の割合を増せば、不活性容 量は１４．５倍になる０モル比１：３では、アポ・トランスフェリン分子の大部 分がそれぞれ２分子の亜鉛と結合していると予想される。

例　２ 抗生物質を用いたグラム陰性感染療法で起きている状態を模擬するために、先ず 腹腔中に細菌を植えつけ１次に殺菌抗生物質を静脈に投薬して急激に細菌を減少 させて、血液中での内毒素の増加を動物実験で起こさせた。麻酔をかけたウィス ター（す１ｓｔａｒ）ラット（２５０〜３００ｇ）の布置動脈に血液捕集カテー テルを挿入した。ラットの腹腔中に違った種の細菌を定まった数だけ植えつけた にシャリキア・コリ、クレブシラ（Ｋｌｅｂｓｉｌｌａ）種、プソイドモナス緑 膿菌、それぞれをす、ｗ、　１　ｋｇ当り７．５Ｘ１０’の濃度、すなわち、ｂ 、ｗ。

１ｋｇ当り全体で２．３Ｘ１０’）、腹腔に細菌を植えつけてから３０分後、実 験を行なう試料（アポ・トランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ））また は免疫グロブリンと組み合わせたアポ・トランスフェリン−亜鉛）　２５０　ａ ｇ／ｋｇ　ｂ、ｗ、の投薬量でバーとユーザーを用いて静脈カテーテルから静脈 投薬した。

対照群のラットにも同濃度のアルブミン−亜鉛と同じ亜鉛含有量を対応した投薬 量だけ静脈から与えた。内毒素血液状態を引き起こすために、殺菌抗生物質（Ｉ ＭＩＰＥＮＥＭ＝Ｚｉｅｎａｍ＊）を、細菌誘発試験の１時間後に静脈投薬した 。内毒素活性度を決定する目的で血液を採取し、Ｉｉｉ菌の植えつけ前とＭ菌誘 発試験後６時間おいてから６０分間隔でその血液中の細菌を計数した。

以下の試料を静脈に投薬した。

Ｚｎ”ｊ／　ｇを５９８μｇ含む亜鉛濃度のアポ・トランスフェリン（Ａｔｆ、 −Ｚｎ（Ｂ））　、　７Ｓ　ＩｇＧを添加したＩｇＧ　（１２％）　（ＩｇＧ／ Ａ／Ｍ）と組み合わせたアポ・トランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ） ）　、。

結果 ａ）アルブミン−亜鉛を静脈に投薬した場合、抗生物質の投薬後、プラスマ内毒 素の活性が大端に増加した。早くも、抗生物質の投薬後１時間で、２３４ＥＵ／ ｄｌｉの平均内毒素活性度に達した。抗生物質投薬後５時間で、平均プラスマ内 毒素活性度は２７８±３１ＥＵ＃Ｑに達した。

ｂ）アポ・トランスフェリン−亜鉛（Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）　）を静脈に投薬し た場合、抗生物質投薬後１時間の、プラスマ内毒素活性度の初期増加量は、アル ブミン対照群に比較して、はぼ６８．３％±７．２％だけ減少した。実験終了時 、すなわち、抗生物質投薬の５時間後でも、Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ）群のラットの 内毒素活性度は、アルブミン対照群よりも、なお、６３．５％±６．５％低かっ た。

ｃ）１２％ｒｇＭを加えた免疫グロブリン（ＩｇＧ／Ａ／Ｍ）と組み合わせて、 アポ・トランスフェリン（Ａｔｆ、−Ｚｒ＋（Ａ））を静脈に投薬する場合、抗 生物質投薬後１時間の、プラスマ内毒素活性度の初期増加量は、アルブミン対照 群に比較して、はぼ７３％だけ減少した。実験終了時、すなわち、抗生物質投薬 の５時間後でも、この組合せを投薬したラットの内毒素活性度は、アルブミン対 照群よりも、なお、８３．２％±７．９％低かった・ アポ・トランスフェリンを免疫グロブリンと組み合わせて得られた不活性度容量 の増大により、内毒素が長時間に渡って血流に入り続ける場合でさえ、プラスマ 内毒素活性度の劇的な増加の制御が可能となる。アポ・トランスフェリン−亜鉛 （Ａｔｆ、−Ｚｎ（Ｂ））のみを適用すると、初期の段階でのみ、アポ・トラン スフェリン−亜鉛と免疫グロブリンを組み合わせた場合と同様の、内毒素活性度 の減少が起きる。投薬量か亜鉛荷重を増さない限り、アポ・トランスフェリン− 亜鉛単体の不活性容量は、内１ｇ−素が血液中に入り続ける場合には、不十分と なろうし、プラスマ内毒素活性を再び増すことにもなろう。アポ・トランスフェ リン−亜鉛と免疫グロブリンの組合せは、亜鉛成分がアポ・トランスフェリンに 対して５００μｇ／ｇのアポ・トランスフェリンを用いる場合でさえ、非常に効 果的な治療手段となる。

要釣書 内毒素の毒性機能を減少させるための、二価の金属陽イオンを蓄積したアポ・ト ランスフェリンの利用。

国際調査報告 に＠評−−−＾帥軸−−階　ＰＣＴ／ＤＥ９２１００２３０

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．内毒素の毒性を予防処置または治療処置するために，二価亜鉛または銅陽イ オンを含んだアポ・トランスフェリンを使用すること。
2. ２．アポ・トランスフェリン分子が亜鉛または銅の陽イオンを１または２個束縛 することを特徴とする請求の範囲第１項記載の使用方法。
3. ３．アポ・トランスフェリン−金属中の上記遷移金属の１つの成分が，アポ・ト ランスフェリン１グラム当り０．１μｇ以上であることを特徴とする請求の範囲 第１項記載の使用方法。
4. ４．アポ・トランスフェリン−亜鉛錯体またはアポ・トランスフェリン−銅錯体 とタンパク質との組合せを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか に記載の使用方法。
5. ５．タンパク質としてプラスマ・タンパク質を用いることを特徴とする請求の範 囲第４項記載の使用方法。
6. ６．プラスマ・タンパク質としてトランスフェリンを用いることを特徴とする請 求の範囲第５項記載の使用方法。
7. ７．プラスマ・タンパク質として免疫グロブリンを用いることを特徴とする請求 の範囲第５項記載の使用方法。
8. ８．免疫グロブリンとしてＩｇＧまたは、ＩｇＧとＩｇＭとＩｇＡとを用いるこ とを特徴とする請求の範囲第７項記載の使用方法。
9. ９．アポ・トランスフェリン−亜鉛またはアポ・トランスフェリン−銅を免疫グ ロブリン溶液に添加することを特徴とする請求の範囲第７項または第８項に記載 の使用方法。
10. １０．プラスマ・タンパク質溶液中に、アポ・トランスフェリン−亜鉛またはア ポ・トランスフェリン−銅を濃縮することを特徴とする請求の範囲第１項ないし 第９項のいずれかに記載の使用方法。
11. １１．プラスマ・タンパク質溶液が血清保存液の形態であることを特徴とする請 求の範囲第１０項記載の使用方法。