JPH05500900A - 耐塩性を付与する遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １８、前記遺伝子が配列列挙１に与えられるヌクレオチドコード配列を有する請 求の範囲第１７項記載の細胞。

１９、植物細胞である請求の範囲第１７項記載の細胞。

２０、酵母細胞である請求の範囲第１７項記載の細胞。

２１、Ｓ、ボムベ５ｏｄ２−１の耐ナトリウム性株。

２２、耐ナトリウム又はリチウム性を付与する遺伝子により形質転換された酵母 細胞の培養物。

２３、耐ナトリウム又はリチウム性を付与する遺伝子により形質転換された植物 。

２４、前記遺伝子が配列列挙に示されるｓ　ｏｄ２ヌクレオチド配列を有する請 求の範囲第２３項記載の植物。

２５、耐ナトリウム性植物に発芽することができる、耐ナトリウム性を付与する 遺伝子により形質転換された種子。

２６、前記遺伝子が配列列挙に示されるｓ　ｏｄ２ヌクレオチドコード配列を有 する請求の範囲第２５項記載の種子。

２７、細胞に耐ナトリウム性又は耐リチウム性を付与するための方法であって、 耐ナトリウム性又は耐リチウム性を付与する遺伝子により前記細胞を形質転換す ることを含んで成る方法。

２８、前記遺伝子が５ｏｄ２又はその変異体である請求の範囲第２７項記載の方 法。

２９、前記遺伝子が配列列挙に示されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第 ２８項記載の方法。

明　細　書 ・　する゛　− 青一見 塩化ナトリウムは、最っとも豊富な塩であり、そして一般的に土壌の潅灘に起因 する塩化に寄与する主要成分である。

もう１種のナトリウム塩、すなわち硫酸ナトリウムもまた、特に北米西部におけ る塩化に対する主要寄与体である。他の可溶性塩は“毒性”の土壌であるが、し かし通常はとんど出くわさない。

塩“毒“の主な徴候は、収穫量及び生命力の徐々の低下であり；最後には、植物 は発芽も生成もしないであろう。その初期段階においては、一般的に、収穫率の ２０％までの低下しか、フィールド条件下で明らかでないので、それは農夫によ り気づかれないであろう。

塩はイオン性材料であり、そして一般的に、カチオンは、生理学的ポンプにより 活性的に輸送される実体である。塩化ナトリウムの場合、クロリドイオンは、電 気的石電荷のバランスを維持するために単純にナトリウムイオンを伴う。ナトリ ウム輸送機構が完全に支配する。２種のタイプの輸送：活性（又はポンプ輸送） 及び受動性（又は拡散）が包含される。

植物は、カリウムを獲得し、そしてナトリウムを拒絶し又は輸送する。イオンの 獲得及び輸送の両者は活性ポンプを必要とする。受動性輸送は、濃度グラジェン トにより駆動される。

活性輸送は、代謝エネルギー源への結合を必要とする。

ある植物及び酵母は、他よりも一層“耐塩性”であるものとして同定されて来た 。植物内での塩排出及び輸送を包含する、損なわれていない植物のレベルで耐性 に寄与する広範囲の種類の生理学的機構が存在する。極端な基土生物は、高い内 部塩濃度を処理するためにひじょうに変性された細胞質生理学を有し；この機構 は、耐塩性の栽培変種植物を創造するために適切ではない。

耐塩性の程度は、一定の収穫物、たとえば大麦により示されるが、しかしすべて の場合において、収率の不利が塩のストレスにより生じる。長年の研究にもかか わらず、植物におけるナトリウム（又はクロリド）輸送又は耐性に直接的に包含 される単一の遺伝子又は遺伝子生成物はまだ同定されていない。“同時に”作用 する多くの遺伝子のすべてが必要とされることが考えられて来た。そのような遺 伝子の同定及び特徴化は、高い生物学的、農業的及び産業的重要なものである。

！里！ｈ 本発明は、細胞に耐塩性（ナトリウム及び／又はリチウムイオン）を付与する遺 伝子、細胞に耐塩性を付与する方法及び耐塩性細胞及び生物に関する。本発明は 、単一の遺伝子が細胞を耐ナトリウム性及び耐リチウム性に形質転換することが できる発見に一部基づかれる。スキゾサッカロマイセス母及び植物細胞を耐ナト リウム性及び耐リチウム性に形質転換することができる。その遺伝子は、十分な コピー数で細胞中で過剰発現され又は導入される場合、細胞を耐ナトリウム性表 現型に形質転換するためにそれ自体十分である。その遺伝子は、酵母、植物及び 他の生物の耐塩性種を創造するために使用され得る。

図面の簡単な説明 第１Ａ、Ｂ及び０図は、野生型困土ｊ孟ヱ左旦ヱ不土スポムベのカチオン耐性の ｐＨ依存性を示す。

第２図は、高ＮａＣ１濃度で寒天プレート上での野生型及び５ｏｄ２−Ｉｓ　ボ ムベ細胞の相対的増殖速度を示す。

第３Ａ、Ｂ及び０図は、ＮａＣ１濃度に対する液体培養での野生型、５ｏｄ２− １及びｐｓｏｄ２　ｕｒａ４−Ｄ１８Ｓ、ボムベ細胞の増殖速度を示す。

第４Ａ、Ｂ及び０図は、Ｎａｇ　ＳＯ４濃度に対する液体培養での野生型、５ｏ ｄ２−１及びｐｓｏｄ２　ｕｒａ４−ＤユＳ、ボムベ細胞の増殖速度を示す。

第５図は、野生型Ｓ、ボムベ細胞におけるナトリウム摂取を例示する。

第６図は、５ｏｄ２−Ｉｓ、ボムベ細胞におけるナトリウム摂取を例示する。

第７図は、野生型及び５ｏｄ２−Ｉｓ　ボムベ細胞からのナトリウム輸送を示す 。

第８図は、ｐｓｏｄ２のプラスミド地図を示す。

第９図は、５ｏｄ２遺伝子のコード領域及び損失地図を示す。

第１０図は、５ｏｄ２遺伝子のヌクレオチド及びコードされたアミノ酸配列であ る。

第１１Ａ図は、プローブとしてｐｓｏｄ２の５．８ｋｂのゲノム挿入体を用いて の野生型Ｓ、ボムベ細胞におけるｓｏｄ又遺伝子のサザンプロット分析である。

第１１Ｂ図は、第１１Ａ図におけるようにしてプローブされた５ｏｄ２−１細胞 における５ｏｄ２遺伝子のサザンプロット分析である。

第１１Ｃ図は、プローブとしてｐｓｏｄ２の２．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩ［ゲノム 挿入体を用いての５ｏｄ２−１細胞中のｓ。

ｄ２遺伝子のサザンプロット分析である。

第１２図は、５ｏｄ２：：ｕｒａ４からのゲノムＤＮＡのサザンプロット分析で ある。

第１３図は、ｐｓｏｄ２−ＡＤＨＩのプラスミド地図である。

第１４図は、ＬｉＣ１を含む寒天プレート上での野生型、５ｏｄ２−１．ｐｓｏ ｄ２−ＡＤＨＩ及びｐｓｏｄ２−ＡＤＨ２株の増殖を示す。

第１５図は、野生型、５ｏｄ２−１．ｐｓｏｄ２−ＡＤＨｌ、１ｅｕｌ−３２及 び５ｏｄ２：：ｕｒａ４のための外部ナトリウムの不在下でのナトリウム輸送を 示す。

第１６図は、第１５図と同じであるが、但し外部ナトリウムが存在する。

第１７図は、５ｏｄ２　ｃＤＮＡ挿入体を含むプラスミドｐＲＭ１を示す。

ロモーター〇ａｌｌの制御下でのｓ　ｏｄ２遺伝子を含むプラスミドｐｃＧｓ１ １Ｏ−ｓｏｄ２を示す。

第１９図は、炭素源としてガラクトースを用いて増殖されたＳ、セレビシアエの 耐リチウム性及びｐｃＧｓｌｌｏ−ｓｏｄ２による救済を示す。

第２０図は、炭素源としてガラクトースを用いて、高リチウム濃度で、ｐｃＧｓ ｌｌｏ−ｓｏｄ２により形質転換されたＳ、セレビシアエの増殖を示す。

１旦亘注豊星説皿 本発明の遺伝子は細胞に耐塩性を付与する。本明細書に使用される場合、耐塩性 の特徴は、野生型細胞（形質転換されていない）と比較して、特定のナトリウム 及び／又はリチウム濃度で生存する細胞（形質転換されている）の高められた能 力を示す。高等生物、たとえば植物の場合、耐塩性表現型は、野生型又は形質転 換されていない植物よりも特定のナトリウム又はリチウム濃度での形質転換され た種の高められた生存性又は生成力として明示され得る。

耐塩性を付与する遺伝子の好ましい態様は、配列列挙（及び第１０図）に示され るヌクレオチド配列（ゲノム）を有する。その遺伝子は５ｏｄ２として命名され 、そして酵母Ｓ、ボムベから単離できる。下記で詳細に記載されるように、その 遺伝子は、細胞、たとえば酵母及び植物細胞に対して耐塩性を付与する。適切な レベルで発現される遺伝子は、細胞に耐塩性表現型を付与するためにそれ自体十 分である。

本発明は、単一の遺伝子（すなわち、単一のタンパク質又はポリペプチド生成物 をコードする遺伝子）として、細胞に対して耐塩性を付与できるいづれかの核酸 配列を包含する。

これは、５ｏｄ２配列と同一の又は耐塩性を付与することにおいて活性的である 配列に対して十分に相補的な配列を有する核酸、及び５ｏｄ２ＤＮＡ配列又はそ の変異耐のいづれかの転写体を包含する。それはまた、配列列挙に与えられるア ミノ酸配列をコードするいづれかのヌクレオチド配列を包含する。

当業者に明らかなように、配列列挙に与えられる５ｏｄ２のヌクレオチド配列は 、遺伝子活性に必ずしも影響を及ぼさないで変更され得る。たとえば、配列中の ヌクレオチドの付加、欠失、挿入又は置換が行なわれ得る。変異形は等しい又は 改良された活性を有し、又は形質転換されるべき細胞タイプのコドン使用法に従 かうように企画され得る。さらに、遺伝子の活性フラグメントが同定され得る。

用語ｓ　ｏｄ２は、すべての変異体、すなわちこの遺伝子の耐塩性付与形を包含 する。

５ｏｄ２遺伝子の追加の変異体は、ハイブリダイゼーションスクリーニングによ り他の酵母種に同定され得る。配列列挙に示される５ｏｄ２配列又はそのオリゴ ヌクレオチド部分は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。

実際、５ｏｄ２配列は、この酵母種における５ｏｄ２相同体の存在を示すＳ、オ クトスボラス（五−土工エユ１工±ｒｕ上）のゲノムＤＮＡとハイブリダイズす ることが見出された。

ハイブリダイゼーションアッセイに使用するためには、５Ｏｄ２由来のヌクレオ チド配列は、プローブを生成するために検出できるラベル、たとえば放射性同位 体によりラベルされる。そのプローブは、適切な緊縮条件下で試験されるべき核 酸とのハイブリダイゼーションのためにインキュベートされる。

５ｏｄ２遺伝子又はその変異体は、本発明の方法に使用するためにいくつかの異 なった手段で得られる。５ｏｄ２遺伝子は、下記例において詳細に記載されるよ うにＳ　ボムベからの単離されたｄｅ　ｍｏｖｏであり得る。他方、その遺伝子 は、上記のように、配列列挙に与えられるヌクレオチド配列又はその変異体に従 って核酸合成のための標準技法により化学的に合成され得る。その合成は、たと えばβ−シアノエチルヌクレオチドホスホラミシト化学を用いての自動化ＤＮＡ 合成機により行なわれ得る。

５ｏｄ２の遺伝子生成物の推定されるアミノ酸配列はまた、配列列挙に与えられ る。そのタンパク質は、推定上のタンパク質対向輸送（ナトリウムポンプ）であ る。プロトン対向輸送は、膜を横切って及び細胞からナトリウムイオンを輸送す るために細胞膜を通しての内部に向けられたプロトングラジェントのエネルギー を使用する。５ｏｄ２−コードタンパク質は、種々のタイプの膜において機能す る。たとえば、５Ｏｄ２コード生成物は、Ｓ、ボムベ及びＳ、セレビシアエ（約 １２０億年、進化的に隔離された酵母種）及び植物（さらに長い時間、酵母から 隔離された）においてイオンを輸送するために機能する。原則的に、プロトン駆 動ポンプは、第一次プロトングラジェントによりいづれかの真核又は原核細胞に おいて作動すべきである。

５ｏｄ２タンパク質又はその同等物は、水又は溶液を脱塩化するために逆浸透に おいて有用である。この目的のためには、タンパク質は、適切な浸透膜に導入さ れ得る。タンパク質自体は、組換えＤＮＡ技法により生成され得又はそれは化学 的に合成され得る。

本発明の耐塩性付与遺伝子は、種々のタイプの耐塩性細胞を生成するために使用 され得る。その細胞は真核又は原核細胞であり得る。真核細胞は、酵母細胞、植 物細胞及び哺乳類細胞を包含する。耐塩性表現型の表示のための基準は、細胞タ イプにより変化するであろう。一般的に、導入される耐塩性付与遺伝子は、細胞 において発現されるべきであり、そしてその発現は、適切な場合、組織及び細胞 タイプ及び増殖段階に関して、調節されるべきである。発現を調節する適切な遺 伝子要素の使用は明らかに重要であるが、しかし非相同遺伝子の発現は、他の要 因、たとえば位置効果及びコドン使用により影響され得る。さらに、遺伝子が単 離される細胞と受容細胞との間の系統距離が大きくなるほど、操作が調節された 遺伝子発現の所望するレベルを達成するために必要とされるであろう可能性が高 くなる。

一般的に、耐塩性表現型は、受容細胞における遺伝子の十分に高いレベルの発現 に依存する。十分なレベルの遺伝子発現は、少なくとも２種の手段で達成され得 る。遺伝子の１つのコピー（又は複数のコピー）が、適切な調節要素と共に細胞 中に導入され、その結果、それは、耐塩性表現型を提供するために十分に高レベ ルで発現される。典型的には、これは、強いプロモーターの制御下で遺伝子を配 置することによって達成される。他方、遺伝子は、耐塩性をもたらすために、十 分な数のコピーで（又は十分な数のコピーに細胞内で増幅されるであろうような 手段で）細胞中に導入され得る。

細胞は、当業界において利用できる多くの手段のいづれかで、遺伝子により形質 転換され得る。形質転換の特定の方法は、中でも、受容細胞のタイプに依存する 。一般的に、遺伝子は、受容細胞タイプのために適切な遺伝子調節要素に結合さ れた発現ベクター（たとえば、ウィルス、プラスミド、トランスポゾン又はそれ らの組合せ）中に配置される。たとえば、植物の形質転換のためには、遺伝子は 、植物細胞において機能的な植物プロモーター又は他のプロモーターに結合され 得る０次に、耐塩性付与遺伝子を含む組換え発現ベクターが、感染又はトランス フェクションのいづれかの標準技法により細胞中に挿入される。

本発明の耐塩性付与遺伝子は、高いナトリウム又はリチウム環境下で高められた 生存性又は生産性を示す新規動物及び植物種を開発するために使用され得る。た とえば、耐塩性を付与する遺伝子は、高い塩濃度で培養中での増殖のための新規 酵母種を生成するために使用され得る。これらの新規種は、有意な塩分を有する 水又は供給原料による発酵を苛能にすることができる。

土壌において高ナトリウム濃度に耐性である新規植物種が生成され得る。これら の新規種は、潅概のための塩水を用いて乾燥又は半乾燥地域における収穫物栽培 を増強し、又は高い塩度の地域、たとえばカリフォルニアの沿岸平原の地域にお ける収穫物の生産を可能にする。その遺伝子は、新規耐塩性種の双子葉植物、た とえばトマト、キュウリ、ビート、ジャガイモ、等及び単子葉植物、たとえば小 麦、トウモロコシ、米、等を生産するために使用され得る。

（Ｔｉプラスミド）が、双子葉植物の形質転換のために使用され得る。好ましい 態様においては、遺伝子が、適切な選択可能マーカー、たとえば耐カナマイシン 性をコードする遺伝子を含む二元ＴｉプラスミドのＴＤＮＡｅＪｆ域中に挿入さ れる。遺伝子は、適切なプロモーター、たとえばカリフラワーマザイタウィルス ３５Ｓプロモーター下に置かれる。プラスミドは、アゲロバクチリア（ＡＪＬ工 ｏｂａｃｔｅｒｉａ）中に挿入される。岨換えＴｉプラスミドを担持するアゲロ バクチリアは、植物細胞及び細菌を培養中で同時増殖することによって植物細胞 （たとえば葉細胞）を感染するために使用される。感染された植物細胞は、それ らの染色体中に変性ＴＤＮＡを組込む。形質転換された細胞は、マーカー遺伝子 に基づいて選択され得る。標準の方法が、培養物におけるカルスの増殖からの形 質転換された植物細胞を苗木及び植物に再生するために使用される。再生された 植物は、耐塩性種の植物に発芽することができる種子を生成する。

広範囲の他のＤＮＡ介在形質転換技法、たとえば粒子影響（ｐａｒｔｉｃｌｅ　 ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ ｔｉｏｎ）及びマイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）が 利用できる。たとえば、アグロバクテリウム介在形質転換に耐性である単子葉植 物は、粒子衝撃により形質転換され得る。　Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ、　Ｗ、Ｊ 、　ｌｅ、＋　（１９９０）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　２　：６０３〜６ １８を参照のこと。

本発明は、次の例によりさらに例示される。

種々のｐＨＬ／へ／Ｌ／で、高濃度のＮａＣ１，ＫＣＩ又はＬｉＣ１を含む溶液 における野生型（株９７２）スキゾサッ力ロマイセスボムベのための耐増殖性及 び増殖能力を、種々の濃度の適切な試験塩により補足されたＥｄｉｎｂｕｒｇｈ 最少培地（ＥＭＭ）寒天プレート上に活性増殖細胞をプレートすることによって 評価し、ここでＥＭＭとは、水１！当たり次のものを含む：フタル酸水素カリウ ム３ｇ；リン酸水素二ナトリウム（無水）１．８ｇ；塩化アンモニウム５ｇ；グ ルコース２０ｇ；塩溶液（２２当たり：　１０７ｇのμｇｃｌ＝　・６ＨｚＯ１ ２ｇ（７）ＣａＣ１ｚ　、１００ｇ（７）ＫＣＩ、４ｇのＮａｚＳ０４）２０威 ；ビタミン溶液（５００ｄ当たり：イノシトール５ｇ、ニコチン酸５ｇ、パント テン酸カルシウム０．　５ｇ、ビオチン５ｍｇ）ｌｌｌＩＨ微量鉱物（２００ｄ 当たり２１ｇ（７）ＨｌＢＯｓ　、１．　０４　ｇ（７）ＭｎＳＯａ　Ｈ４Ｈｚ 　Ｏ，０，８ｇのＺｎ５Ｏｉ　７Ｈ２Ｏ，０，４ｇのＦｅｃ１３　・６Ｈｚ　０ ゜０．２２８　ｇ（７）ＫＭｎＯ４，８０ｔａｇＯ）ＣｕＳＯａ　・５Ｈｚ　０ ゜２ｇのクエン酸、２０ｍｇのＫ　Ｉ　）　０．　１　ｄ　（Ｍｉｔｃｈｉｓｏ ｎ、　Ｊ、Ｍ、。

（１９７０）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｓｃｈｉｚ ｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｏｎｂｅ　ｆｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｎ　Ｃｅ １ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｄ、Ｍ、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ）　１３１〜１６５ペ ージ、八ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ　；　Ｎｕｒｓｅ、　Ｐ 、Ｎ、＋　（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ％？２　：　５４７〜５５工）。コロニー の増殖及び生存性を数日間にわたってモニターした。相対的増殖速度を、４８時 間で、接眼レンズマイクロメーターによりコロニーの直径を測定することによっ て評価した。測定のための複数のコロニーは、ランダムに選択された。実験は、 同じプレートの異なった領域に試験された株をプレートすることによって、異な ったプレート間の増殖速度のわずかな相違のために内部的に調節された。典型的 なデータは、第１Ａ−Ｃ図に示される。耐ＮａＣ１及びＬｉＣ１性は、ｐＨによ り著しく影響されることが見出され、そしてＬｉＣ１はＮａＣ１よりも高い毒性 を示した。

高いナトリウム及びリチウム濃度で、細胞増殖速度は遅められ、又は最高レベル で、細胞は殺された。耐ＫＣＩ性は、ｐＨにより著しく影響されなかった。

高いＮａＣ１条件下で増殖することができる変異体を単離した。典型的な遺伝子 スクリーンは次の通りであった。寄託番号ＡＴＣＣ２４９６９、ＡＴＣＣ２６１ ８９及びＡＴＣＣ３８３６６としてＡａ＋ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃａ１ｌｅｃｔｉｏｎから自由に入手できる、急速に増殖する野生型Ｓ、ボ ムベ細胞（株９７２）を、遠心分離により収穫し、そして突然変異誘発のために 、０．４ｍｇ／ｄのニトロソグアニジンを含むＯ，ＬＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ ４）溶液に再懸濁した。細胞を、３０分間、暗室に置き、そして次に遠心分離に より蒸留水により数回洗浄した。次に、細胞を、３０ｍＭでのＬｉＣ１により補 足されたＥＭＭ寒天プレー）　（ｐＨ５，５）上に、プレート当たり１０ｂ〜１ ｏフ個の細胞の密度でプレートした。突然変異誘発されなかった野生型細胞をこ れらの条件により殺した。ＬｉＣｌを選択した。なぜならば、種々のｐＨレベル でのＬｉＣ１に対する野生型の増殖応答は、ＮａＣｌの応答に等しく、さらにＬ ｉＣ１はより毒性であり、そして従って、スクリーンを複雑にする濃度依存性浸 透効果を回避することができるからである。

数日間のインキュベーションの後、生存体を、追加の分析のためにＥＭＭプレー トに移した。合計２０株を集めた。はとんどの変異株は不安定であり、そしてＥ ＭＭ上でのインキュベーションの後、続く再試験により決定されるようにそれら の耐ＬｉＣ１性を失なった。多くの比較的安定性の株を、耐ＮａＣ１性のために スクリーンし、そして高レベルのＮａＣ１により補足されたＥＭＭプレート上で 増殖する株を単離した。一般的に、耐リチウム性及び耐ナトリウム性は、同じ株 において常に見出される。耐リチウム性は、ナトリウム惑受性株には見出されな かった。

耐ナトリウム及び耐カリウム性のアウトクロッシング及び再単離の後、１０種の そのような株を、インタークロスし、そして５ｏｄ２と命名される単一の結合グ ループに割り当てた。いくらかの減数分裂不安定性が、すべての対立遺伝子のた めに示された。典型的には、野生型にアウトクロスされる場合、耐ナトリウム性 株は、弱い耐ナトリウム又は耐リチウム性の野生型に対する強い耐ナトリウム又 は耐リチウム性を２：２の比で分離した。多くの細胞は、中間レベルの耐性を示 した。これは、たぶん増幅された遺伝子座で不平等にクロスオーバーすることに よって説明される。

典型的な対立遺伝子５ｏｄ２−１は、野生型の細胞よりも高い濃度のナトリウム 上で増殖することができる（第２図）。

この耐性はナトリウム特異性であり、そして耐カリウム性に影響を及ぼさない。

５ｏｄ２−１株が、二倍体においてａｄｅ６−２１６を補足するために使用され る５ｏｄ２−１　ａｄｅ６−２１０二重変異体を創造するためにａｄｅ６−２１ ０に交差された。

創造されたその二倍体、すなわち５ｏｄ２−１／野生型ａｄｅ６−２１０／ａｄ ｅ６−２１６は、耐ＬｉＣ１及び耐ＮａＣ１性であり、その変異が優性であるこ とを示した。

液体培養において株の耐ナトリウム性を確かめるために、野生型及び変異体、並 びにｐｓｏｄ２含有（ｐｓｏｄ２は１物学セクシヨンを参照のこと）細胞系を、 種々の濃度のＮａＣ１により補足されたＥＭＭ中でインキュベートした（第３Ａ −Ｃ図）。個々の細胞型を、ＥＭＭ中で一晩、増殖し、遠心分離により濃縮し、 そして次に、示されるようにして補足されたＥＭＭを有するフラスコに再懸濁し た。次に、フラスコを３０°Ｃで、回転振盪機に置き、そして４時間の安定化期 間の後、アリコートを、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数機での細胞数の測定のために、示さ れるような時間にわたって除去した。結果は第３Ａ−Ｃ図に示される。Ａ、野生 型；　Ｂ　、ｓ　ｏ　ｄ　２−上；Ｃ，ｐｓｏｄ２　ｕｒａ４−Ｄ１８．５ｏｄ ２−１及びｐｓｏｄ２　ｕｒａ４−Ｄ１８は、野生型よりもＮａＣ１に対して著 しく高い耐性を示した。−膜化された浸透応答が包含されないことを確かめるた めに、株をＫＣ耐性について試験した。耐ＫＣＩ性に対する効果は観察されなか った。培地の酸性化がこれらの後者の結果に影響を及ぼさないことを確かめるた めに、Ｉ）Ｆｌを実験の停止後、モニターし、そして種々の培養においてＥＭＭ 　（ｐＨ５，１〜５．６）の特徴を示すことが見出された。類似する実験が、カ チオンＣヒ対ＳＯ４”−の効果について試験するために行なわれた。主要な差異 は見出されなかった（第４Ａ−Ｃ図）。

すべてのこれらのデータは、ｐｓｏｄ２プラスミドの複数のコピーを有する５ｏ ｄ２　１又は細胞が、アニオン（Ｃ１−又は３０４”−）にかかわりなく耐ナト リウム性であり、モしてに゛に対する応答が影響されないことを示す、さらに、 野生型を殺すＮａ”の濃度での５ｏｄ２−１又はｐｓｏｄ２ｕｒａ４−Ｄ１８の 急速な増殖速度は、細胞に対するこの耐性の代価が低いことを示唆する。

二Ｎａ檜送皇旦λ 野生型及び変異体株におけるナトリウム輸送の研究を行なった。”Ｎａの摂取及 び輸送実験が、野生型細胞と５ｏｄ２二上とを比較するために行なわれた。摂取 研究のために、細胞を洗浄し、そして５ｗＭのＭＥＳ　（２−（Ｎ−モルホリノ ）−エタンスルホン酸）、５ｗＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ。

Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸））！ｌｌ液液ｐＨ５）　（５ｍＭのＮａＣ ｌ及びｌｄ当たり１μＣｉの”Ｎａを含む）に再懸濁した。野生型細胞における 摂取の運動分析は、その摂取速度がこのレベルの外来性ＮａＣ１で飽和されたこ とを示した。インキュベーションの後、培養物のアリコートを、濾過により集め 、次にＬｉＣ１停止溶液により洗浄し、そして細胞中の放射能をシンチレーショ ン計測機で定量化した。第５及び６図に示された点で、培養物を分け、そしてア ミロライド（１００、ｍ）　、ＣＣＣＰ　（カルボキシルシアニドｍ−クロロフ ェニルヒドロシン）（６ｍ）又はアミロライド及びＣＣＣＰの両者を添加した。

次に、サンプリングを、示されるようにして、類似する培養物に続けた。ナトリ ウム摂取は、細胞光たりのＮａの正味モル数として表わされる。野生型及び５ｏ ｄ２−土がこれらの条件下で比較される場合、５ｏｄ２−１細胞は、野生型細胞 よりもかなり低い正味摂取速度を有することが見出された（第５及び６図）。こ れらは正味の摂取実験であるので、野生型と５ｏｄ２−１との間のレベルの差異 は、減じられた摂取速度又は高められた輸送速度のいづれかによるものであった 。どの場合においても、実験は、耐ＮａＣ・ｌ性についての単純な説明を提供す る。

ナトリウム輸送速度を、ｐＨ１，０で上記のようなＭＥＳ／ＰＩＰＥＳ（正味ナ トリウム摂取速度が早い条件下）に”Ｎａと共に細胞（野生型又は５ｏｄ２−１ のいづれか）を予備充填し、そして次に濾過により細胞を洗浄し、ぞしてｐＨ７ ゜０又はｐＨ５，０でＭＥＳ／Ｐ　Ｉ　ＰＥＳ＋５ｎ＋Ｍの非放射性ＮａＣ１の 溶液にそれらを再懸濁することによって測定した。細胞中の”Ｎａ含有量は、一 定間隔で濾過により培養物のアリコートをサンプリングすることによって測定さ れた。５ｏｄ２−１は、野生型よりも早い速度で”Ｎａを輸送したく第７ｓｏｄ ２遺伝子が輸送ポンプシステム又はそのようなシステムのレギュレーターと示す 場合、複数コピーのプラスミド上での遺伝子の野生型バージョンの過剰発現は高 いＮａ”又はＬｉ″″環境から細胞を保護するために十分であるに違いない。従 って、ｓ　ｏｄ２″″ｕｒａ４−Ｄ１８　Ｓ、ボムベが、プラスミドベクターｐ ＦＬ２０におけるＳ、ボムベゲノムＤＮＡライブラリーにより形質転換された（ Ｃ１ａｒｋ、　Ｌ、　ｆｔ　ｅ　、　。

（１９８６）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３　：　８２ ５３〜８２５７）　、細胞を、細胞壁の除去及びプロトプラス形成のために、Ｎ ｏｖｏＺｙｍｅ２３４　（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて形質転換 した（Ｂｅａｃｈ、　Ｄ、ａｎｄ　Ｎｕｒｓｅ、　ｐ、＋　（１９８１）Ｎａｔ ｕｒｅ　２９０　：１４０〜１４２）。ウラシルを欠く培地（適切な栄養要求性 補足物＋１．２Ｍのソルビトールを有するＥＭＭ）上に、細胞をプレートした。

生存株（ウラシル栄養要求性を補足するプラスミドを担持するもの）を続いて、 試験するために、補足体を有するＥＭＭプレート及び３０ｍＭのＬｉＣ１プレー トにレプリカ−プレートした。

２種の生存体酵母株を単離し、そしてプラスミドを次のようにして調製した。細 胞を、２０ｄのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５０ｍＭのエチレン ジアミンテトラ酢酸（ｐＨ７，４）緩衝液で洗浄し、次に同じ緩衝液に再懸濁し 、そして等体積の４００ミクロンのガラスピーズと共に混合することによって破 壊した。上滑液を集め、フェノール／クロロホルム抽出し、そして核酸をイソプ ロパツールにより沈殿せしめた。その沈殿物を、１０ｍＭのトリス（ヒドロキシ メチル）アミノメタン、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ｐ）１７．４） 緩衝液に再溶解し、リボヌクレアーゼＡ、次にプロテイナーゼＫにより消化し、 フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめた。核酸 ペレ・ントを、前記のようにして再溶解し、そしてＣａ　Ｃ１ｚ洗浄によりコン ピテントにされたＥ、コリ　ＪＭ１０９中に形質転換した。

Ｅ、コリを、４０Ｒ／−のアンピシリンを含むし一ブイヨン上にプレートした。

次に、個々の調製物からの細菌側コロニーを用いて、プラスミドを調製した。種 々の制限エンドヌクレアーゼによる消化により判断されるのと同じ配列を両者と も示す２種のプラスミドを得た。酵母ゲノムＤＮＡ挿入体は５．８ｋｂの長さで あった。そのプラスミドを、ｐｓｏｄ２と命名した（第８図）。ゲノム挿入体は 、ｐＦＬ２０　ＢａｍＨＩ部位に挿入された５ａｕ３Ａフラグメントである。す べての単位はｋｂで存在する。Ｅ＝ＥｃｏＲＩ　；Ｈ＝Ｈｉｎｄｌ［［；Ｂ＝Ｂ ａｍＨＩ　；　５＝Ｓｐ　ｈ　Ｉ。

ｐｓｏｄ２プラスミドは単独で、野生型Ｓ、ボムベ細胞を耐リチウム及び耐ナト リウム性に形質転換できる（第３Ｃ図）。

ｐｓｏｄ２からの２．３ｋｂのＨｉｎｄｌｌＩフラグメントのｐＦＬ２０中への サブクローニングは、耐ナトリウム活性がｐｓｏｄ２プラスミドのこの部分に位 置することを示した。

５．８ｋｂ−ｐＦＬ２０単離体からの２゜３ｋｂのＨｉｎｄｎ［部分を両端に有 するＥｃｏＲＩ−３ａ　Ｉ　Ｉフラグメントを、ｐＵＣ１１８中にサブクローン し、そして−組の欠失を、５ａＩＩ末端からのエキソヌクレアーゼ■を用いて行 なった（Ｈｅｎｉ　Ｋｏｆｆ、（１９８４）　Ｇｅｎｅ　２８　：　３５１．　 ｉｎ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ−ｆｒｏｍ　Ｐｒｏｍｅｇａ）。

ＨｉｎｄｌＩ［２，３ｋｂフラグメントをｐＵｃ１１９中にサブクローンし、そ して類似する組の欠失を反対の方向に行なった。

個々の構成体を、５ｏｄ２＋　ｌｅｕ　−３２株中へのｐＷＨ５（Ｗｒｉｇｈｔ 、　Ａ、ｆｌｅ、、　（１９８６）　Ｐ１ａｓ＋＋ｉｄ　１５　：　１５６〜１ ５８）による同時形質転換の後、耐ナトリウム活性チ・ラム活性について試験し た。同時形質転換は、ｐＵｃ１１８／１１９が酵母のための選択可能な栄養要求 マーカーを担持しないので必要とされる。活性遺伝子のための上流及び下流の必 要条件を定義する、いくらかのこれらの欠失のため結果が第９図に示される。第 ９図はまた、配列分析に基づく遺伝子構造の解釈も含む。配列、Ｓｔ、プライマ ー拡張及びノザンプロット分析並びに機能的試験により決定されるような５ｏｄ ２遺伝子の構造が示される。正の評点は、ＬｉＣ１プレート上での生存性及び増 殖を示す。

ｐＵｃ１１８／１１９における同じ一組の欠失を用いる場合、遺伝子は、ジデオ キシリボヌクレオチド　トリホスフェート／　Ｓ　ｅ　ｑ　ｕ　ｅ　ｎ　ａ　ｓ 　ｅ配列決定手段（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｕｓ）を用いて配列決定 された。上流のＨｉｎｄＩ［［部位のすぐ各側で開始するいくらかの２４００ｂ ｐのためのクローンを両方向にオーバーラツプするための配列が得られた。上流 及び下流は、推定上の読み取り枠に相関する。その遺伝子のヌクレオチド配列及 びコードされたタンパク質の推定上のアミノ酸配列が第１０図に示される。

活性領域は、短いイントロン（位置３１２〜３８８）を考慮する場合、位置１８ ８から位置１６６８ｂｐに拡張する読み取り枠を含む。位置７９５〜８１２（オ リゴヌクレオチド配列５　’　ｇｇａａｃｃｇｃｃａｔｔｃｃａｔｃ　−３’　 ）に位置し、そして上流のＨｉｎｄｎ［部位（位置１）又はＮｃｏｌ（位置４６ ２）部位のいづれかに拡張するオリゴヌクレオチドブライマーから合成される一 本鎖プローブを用いての３１分析は、位置３９０近くのイントロンの３′−スプ ライス連結部を位置づけた。

イントロンの存在は、次のようにして、直接的なｍＲＮＡ配列決定により確認さ れた。ＲＮＡを５ｏｄ２−１から調製し、そしてオリゴＵセファロースカラム（ Ｐｈａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）に通し、ポリアデニル化されたｍＲＮＡに冨む両 分を調製した。このＲＮＡを、オリゴヌクレオチドブライマー、すなわち５　’ 　−ｔｔａｇｃａｇｃａｔｇａｇｇｃｃｃ　−３’　（位置４１５〜４３６）に よりプライムされる逆転写酵素のための鋳型として使用した。配列決定反応は、 Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手された、Ｐｒｏｍｅｇａからの逆 転写酵素ＤＮＡ配列決定キットに基づかれた。その配列は、第９及び１０図に示 されるようにイントロンの位置を確証した。その遺伝子の下流での、位置２０６ ３からの欠失は活性的であり；１６００からの欠失は少量の活性を有し、そして １４３６からの欠失は不活性である。位置１７９への上流の欠失は活性的であり ；２０７への欠失は不活性である。

遺伝子の構造をさらに、ＰＴＺ１９ＲにおけるｃＤＮＡクローンを配列決定する ことによって確かめた（セクション■。

Ａ、１を参照のこと）。このクローンにおいて、上記のようなイントロン構造が 確かめられ、ポリアデニル化部位がヌクレオチド１９２４で及び位置８５での上 流の開始部位で存在することが示された。従って、位置１７９に向かって欠失さ れる構造体の活性は、たぶん、ベクターにおけるプロモーターからの転写に基づ く進行による。さらに、ｃＤＮＡの全体の配列が決定され、そして推定上のアミ ノ酸翻訳生成物は、５ｏｄ２として命されたものと同じであった。このｃＤＮＡ は５ｏｄ２−１株から調製されるので、それは、突然変異の性質が野生型配列、 たとえばｐＦＬ２０遺伝子バンクから単離される同じものの増幅であることを示 す。

５ｏｄ２−１”　に・　るブースミドの　、ｐＷＨ５における２、３ｋｂのＨｉ ｎｄＩ［［フラグメントを用いて、Ｉｅｕｌ−３２酵母を形質転換し、そして組 込み体を、酵母抽出物培地及び次にＥＭＭ上での培養により選択した。

同様に、ｐｓｏｄ２からの５’−３，５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［［フラ グメントを組込んだ。個々の株を５ｏｄ２−１に交差し、そして１ｅｕｌ−３２ の分離はプラスミド組込み体を示し、そして耐リチウム性を分析した。２．３ｋ ｂのＨｉｎｄＩ［［フラグ・メントに関しては、すべての子孫に対する耐リチウ ム性の再分類は、その分析を無意味にした。これは、土ｏｄ２−１株における増 幅された（下記を参照のこと）１±ｄ２遺伝子座との不均質なりロスオーバーに よると仮定された。３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ［組込み体に関しては 、Ｉｅｕｌ−３２マーカーが２．３ｋｂのフラグメントと同じ部位で組込まれた 。これらのデータ及び下記に記載されるサザンプロット結果に基づけば、しかし ５ｏｄ２−１における遺伝子座の増幅された性質が異常な組換え頻度をもたらす ことを認識すれば、ｐｓｏｄ２プラスミドが５ｏｄ２遺伝子座を表わすと思われ る。

サザンプロットが、ｐｓｏｄ２プラスミドにより表わされる遺伝子の構成を試験 するために使用された。典型的には、ＤＮＡを、野生型及び５ｏｄ２−１細胞の 両者から調製し、種々の制限エンドヌクレアーゼ酵素により消化し、電気泳動し 、そしてサザンブ０７トによりＧｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ膜（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）にトランスファーした。野生型ＤＮＡ及び５ｏｄ２−Ｉ ＤＮＡのプロットを、ｐｓｏｄ２からのニックトランスレートされた５、８ｋｂ のゲノム挿入体によりハイブリダイズした（ハイブリダイゼーシヨン：　３ｘＳ ＳＣ（ｌｘＳＣＣ＝０．１５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１５Ｍのクエン酸ナト リウム、ｐＨ７，４）、６５℃、−晩；最終洗浄、０゜ｌＸ５ＳＣ１６５°Ｃ） 。放射性活性プローブにハイブリダイズする制限フラグメントは、野生型ＤＮＡ 及び５ｏｄ２−ＩＤＮＡにおいて同一であった（それぞれ第１１Ａ及びＢ図）。

レーン１及び１４、ＨｉｎｄＩ［ｒ消化されたλＤＮＡ、残りのレーン、酵母ゲ ノムＤＮＡ：レーン２、）（ｉｎ　ｄ　Ｉｎ　；レーン３、ＨｉｎｄＩ［Ｉ／Ｐ ｓ　ｔ　Ｉ　；レーン４、Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　；レーン５、Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　／　 Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩ　；レーン６、ＰｖｕＩＩ　；レーン７、Ｐｖｕｌｌ／Ｈｉｎ ｄｌＩ［；レーン８、ＰｖｕＩＩ／ＥｃｏＲＩ；レーン９、ＥｃｏＲＩ；レーン １０、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ；レーン１１、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩ［；レー ン１２、Ａ、ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌｎ、Ｂ、ＢａｍＨＩ；レーン１３、Ａ、Ｂ ａｍＨＩＳＢ、ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌ［Ｉ。

しかしながら、５ｏｄ２−ＩＤＮＡにおいては、いくつかのバンドが他のバンド に相関してひじように増幅された。プロットの同等のオートラジオグラフィー照 射に基づけば、１０ｄ２−ＩＤＮＡの弱いシグナルのバンド強度は、野生型ＤＮ Ａに関して同じであった。さらに、野生型ＤＮＡにおけるすべての類似する大き さのバンドは、類似する強度のものであった。従って、弱いシグナルの強度プロ フィールは、単一コピーのゲノムＤＮＡフラグメントの表示であることが推定さ れる。野生型ＤＮＡの）ｌｉｎｄｌ［Ｉ消化物（第１１Ａ図）においては、５つ のバンドが見える：ｐｓｏｄ２プラスミドに同定される３、５ｋｂ、２．３ｋｂ 及び０．３ｋｂのフラグメント及びプラスミド消化物に存在しない１．５ｋｂ及 び９ｋｂでのハンド。これらの同じバンドは５ｏｄ２−ＩＤＮＡに存在するが、 しかしながら３．５ｋｂ、２，３ｋｂ及び０．３ｋｂのフラグメントはひじょう に増幅される（第１１Ｂ図）。ｐｓｏｄ２クローンにより表わされる全体の領域 が増幅されると思われる。しかしながら、追加の非増幅バンドも存在し、そして これらは、ｐｓｏｄ２配列のある部分の第二コピーを表わすと思われる。

同じプロットがｐｓｏｄ２の２．３ｋｂのＨｉｎｄｌ［［配列によりハイブリダ イズされる場合、追加の非増幅バンドは存在しなかった。Ｓ　ボムベゲノムにｐ ｓｏｄ２の２．３ｋｂのＨｉｎｄＩ［Ｉフラグメントのたった１つのコピーが存 在すると結論づけられる（第１１Ｃ図）。

損なわれていない野生型及び５ｏｄ２−ＩＤＮＡを、電気泳動し、サザンプロッ トし、そしてＨｉｎｄｌ［Ｉ２．３ｋｂフラグメントによりプローブした。急速 に移動するエピソーム又はプラスミドバンドの痕跡は検出され得なかった。ｓ　 ｏｄ２配列の増幅がひじょうに大きなエピソームフラグメント上に染色体的に位 置し、又は存在することが結論づけられる。

遺伝子バンクを、５ｏｄ２−１からのゲノムＤＮＡを用いてプラスミドベクター ｐＷＨ５に調製した。この遺伝子バンクを用いて、５ｏｄ２−１における５ｏｄ ２遺伝子座の増幅された性質に適合する高い頻度で野生型細胞をリチウム／ナト リウム耐性に形質転換した。

−１すなわち　活　化された５ｏｄ２″″然・　の店 ｐｓｏｄ２のＨｉｎｄＩ［Ｉ２．３ｋｂフラグメントを、ｐＵＣ１１８中にサブ クローンし、そしてｄａｍ−ＪＭ１０３　Ｅ。

Ｄ　ＩＪ中に形質転換した。そのプラスミドを単離し、そして制限エンドヌクレ アーゼＢｃｌｌにより消化し、読み取り枠内の位置１１５５から読み取り枠の下 流の位置１９５５に拡張するフラグメントを除去した。従って、読み取り枠の約 半分が欠失された。Ｓ、ボムベからのｕｒａ４遺伝子を、プラスミドｐｕｒａ４ からのＨｉｎｄｌ［［フラグメントとして単離した。ＨｉｎｄｌｌＩ／ＢａｍＨ Ｉオリゴヌクレオチドリンカーを、前記単離されたｕｒａ４遺伝子に連結し、そ して次にその且ｒａ４遺伝子を、ｐＵｃ１１８におけるＨｉｎｄｌｌ［２，３ｋ ｂフラグメントのＢｃｌＩ部位中に連結した。調製の後、その得られたプラスミ ドを用いて、遺伝子構造のＳ、ポムベニ倍形質転換し、そしてＥＭＭ＋１．２Ｍ のソルビトール＋１００ｇ／ｄのロイシンプレート上にプレートした。組込みに ついての選択の後、ウラシルのための原栄養性を示す１２０株を、耐ナトリウム 及び耐リチウム性について特徴づけた。

ＥＭＭ上でほとんど増殖せず、そしてＥＭＭ＋１５０ｍＭのＮａＣ１上で増殖で きなかった７株を単離した。これらの株は、二重相同組換え出来事に起因する遺 伝子置換又は５ｏｄＩ遺伝子の機能を妨げる５ｏｄ２での挿入を示すことが推定 された。これらの株はＥＭＭ　（＋ロイシン）上で胞子からほとんど発芽しない が、しかしながら、Ｎ　ａ　ｚ　ＨＰ　０４を排除し、そしてそれをに、ＨＰＯ ４に交換し、そしてｐＨを５．５に調節することによって製造されたＥＭＭ　Ｃ 士ロイシン）上ではより良好に増殖した。そのような配合物は、２６ｍＭのＮａ ゛を有するＥＭＭに比較して、約０．５ｍＭの最終ナトリウム濃度を有する。遺 伝子ノックアウト株５ｏｄ２：：ｕｒａ４のためのＤＮＡを調製するために使用 された。いくつかの株からのゲノムＤＮＡを、調製し、そして種々の制限酵素に より消化し、そしてアガロースゲル電気泳動の後、サザンプロットをＧｅｎｅ　 ５ｃｒｅｅｎ上で調製した。次に、その膜を、ｐｓｏｄ２からのニックトランス レートされた２、３ｋｂのゲノムフラグメントに高い緊縮下でハイブリダイズせ しめた。その結果は、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ２．３ｋｂフラグメントが５ｏｄ２：：ｕ ｒａ４株に存在しないことを示した（第１２図）。レーン１〜５、Ｂｃ１１消化 ；レーン６〜１０、Ｈｉｎｄｌｌ［消化、レーンＬ、６ｓｏｄ２　１；レーン２ ，７不活性化株に３５−１；レーン３．８不活性化株に８８−１；レーン４゜９ 不活性化株に１６−２；レーン５，１０不活性化株に１５−５．従って、このフ ラグメントは破壊された。Ｋ１５−５は、追加の実験のために使用された。

前記破壊体の表現型は、ナトリウム感受性、リチウム感受性及びアンモニウム感 受性であった。後者はたぶん、アンモニアによる細胞質のアルカリ化に起因し、 そして推定上のタンパク質対向輸送をコードする５ｏｄ２遺伝子は、ｐＨ調節に 一部、役割を示す。

゛・　プラスミドの 遺伝子増幅は５ｏｄ２−１変異体機能において役割を示すので、ｐｓｏｄ２から の読み取り枠に連結される強いプロモーターを含むプラスミドの構成は、ゲノム 中への再結合の後、耐ナトリウム性を引き起こすように機能するべきである。プ ラスミドｐＡＲＴ５、すなわちアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを含む ｐ　ＡＲＴ　１　（ＭｃＬｅｏｄ、　Ｍ、星？、、　（１９８７）ＥＭＢＯＪ、 　６　：　３６６５〜３６７１）の誘導体を使用した。Ｎｄｅ１部位を、位置１ ８８での５ｏｄ２読み取り枠の推定上の開始コドンでのオリゴ変異誘発により挿 入した（変異誘発性オリゴヌクレオチド５　’　−ｔｔｇｃｃｔａａｔｔｃａｔ ａｔｇｇｇｃｔｇｇ　−３’を用いる）。

位置６３０での内部Ｎｄｅ１部位の除去に続いて（変異誘発性オリゴヌクレオチ ド５　’　−ｃｔｇｇａｔｔｔｇｃｇｔａｔｇｃａｔｔｇｔ　−３’を用いる） 、遺伝子をＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵｃ１１９から切り出し 、そしてＰＡＲＴ５中に連結し、プラスミドｐｓｏｄ２−ＡＤＨを生成した（第 １３図）。

イセスボムベ株中にトランスフェクトし、そしてプラスミドを組込んだ株を、Ｙ ＥＡ培地上での増殖及びウラシル及びアデニンにより補足されたＥＭＭ上での選 択により選択した。

次に、プラスミド含有株を、耐ＬｉＣ１及び耐ＮａＣ１性について試験した。野 生型、すなわち５ｏｄ２−１及びｐｓ。

ｄ２−ＡＤＨｉｎｔ　１ｅｕｌ−３２株を、ＬｉＣ１を示される濃度で含むＥＭ Ｍ寒天プレート上にプレートした。（第１４図：ＡＤＨ１＝ｐｓｏｄ２−ＡＤＨ Ｉ及びＡＤＨ２＝ｐｓ　ｏ　ｄ　２−ＡＤＨ２）。増殖率を第１図について決定 し、そして２０ｍＭのＬｉＣ１に基づいてＡＤＨＩに対して１００％として表わ された。ＡＤＨプロモーターの後ろに５ｏｄ２遺伝子を過剰発現する株は、強い 耐Ｌｉ゛及び耐Ｎａ”性を有する。異なったＡＤＨ株間での耐性の差異はたぶん 、個々の場合、ゲノム組込みの特定の情況に影響を及ぼす０位置６７０又は８３ ０でのインフレームＡＴＧでＮｄｅｌ制限部位を挿入することに基づく類似する 構成は、続く酵母への形質転換に基づいての耐リチウム性に関して不活性であっ た。

第１０図に定義されるように、イントロンがオリゴ変異誘発により除去されてい るｐｓｏｄ２−ＡＤＨのバージョンはまた、機能的であり、そしてイントロン士 前記遺伝子のバージョンと同じレベルの耐ナトリウム／リチウム性を付与する。

５ｏｄ２−１　び　ｓ　ｏ　ｄ−２−ＡＤＨ１からのナトリウム１斑 野生型、５ｏｄ２−１、ｐｓｏｄ２−ＡＤＨＩ及び５ｏｄ２：：ｕｒａ４株を、 上記のようにして”Ｎによりラベルし、そして細胞からのＮａの輸送を、６ｎ＋ ＭのＮａＣ１を含むＭＥＳ／ＰＩＰＥＳ緩衝液又はナトリウムを含まないＭＥＳ ／ＰＩＦＥＳ緩衝液への再懸濁に続いてモニターした。５ｏｄ２−１及びｐｓｏ ｄ２−ＡＤＨ１株は、両条件下で、野生型よりもより急速にナトリウムを輸送し た。５ｏｄ２：：ｕｒａ土株は、野生型よりもよりゆっくりと輸送した（第１５ 、及び１６図）。

５ｏｄ２への西　１　゛　する　１ＤＮＡ酵母の他の種、たとえばスキゾサッ力 ロマイセス（ジャポニカス及びｔ’））−７！、、（４”ｌ）及びサッカロマイ セスセレビシアエのサザンプロット分析を行なった。ハイブリダイゼーションシ グナルは、Ｓ、セレビシアエに関しては見出されなかった。スキゾサッカロマイ セスオクトスポラスの場合、ハイブリダイゼーションシグナルは見出された。こ れらの２種の酵母は、Ｓ　ボムベからの５ｏｄ２に類似する遺伝子を含むことが 結論づけられる。

■、す・・カロマイセス　セレビシアエにお番る５ｏｄ２’　−１！と１１ 他の生物におけるｓ　ｏｄ２遺伝子の利用性を示すために、酵母サッカロマイセ スセレビシアエ（Ｓ　ボムベかう１２０億年、進化的に隔離された）を、形質転 換のために選択した。

５ｏｄ２遺伝子を、ＥｃｏＲＩによりｐＲＭｌ　（下記セクションＩＩ［、Ａ、 １を参照のこと）から切り出し、フレノウによりプラント末端化し、ＢａｍＨＩ リンカ−により連結し、そしてＳ、セレビシアエクローニングベクターｐｃＧｓ １１０におけるＢａｍＨＩ部位の両方向に挿入した。正しい配向（プラスミドｐ ｃＧｓ１１０−ｓ　ｏｄ２）において、主ユｄ２遺伝子は、ガラクトース誘発性 プロモーターＧａ　ｌ　１の制御下に存在した（第１８図）。

前方及び後方の配向の両者のプラスミドを用いて、Ｓ、セレビシアエ株ＢＦ３０ ５−１５ｄを形質転換した（ｍａｔ　ａ、　１ｅｕ２−３＋　１ｅｕ２−１１２ ．　ｈｉｓ３−１１．　ｈｉｓ３−１５．　ｔｒｐｌ、　ｕｒａ３＋　ａｒｇ５ ＋６゜ａｄｅｌ、　ｍｅｔ１４．　ｇａｌ”　）　６次に、その細胞を、必要に 応じて炭素源としてグルコース又はガラクトースにより補足された酵母窒素塩基 （Ｄｉｒｃｏ）に基づく培地上で増殖せしめた。

炭素源としてグルコースを用いる場合、Ｓ、セレビシアエの耐ナトリウム及び耐 リチウム性は、ひじょうに高（開始する。このバックグラウンドに対しては、５ ｏｄ２による追加の増強は、ｇａｌｌプロモーターを誘発するのに十分なガラク トースの存在下で低いグルコース濃度でさえ検出され得なかった。効果を示すた めには、たぶん同等の耐塩性機構が、Ｓ、セレビシアエから検出されるべきであ る。

しかしながら、炭素源としてガラクトースを用いる場合、Ｓ、セレビシアエは、 一層、リチウムに対して敏感である。

ｇａｌｌプロモーターを誘発するガラクトースの存在下で、ｐｃＧｓｌ　１Ｏ− ｓｏｄ２構成体を担持する。Ｓ、セレビシヱ舌株（第１９図及び第２０図、株３ 及び４）は、エンプティープラスミドのみを担持する株（第２０図、株１及び２ ）又はｇａｌｌプロモーターに関して逆方向に５ｏｄ２遺伝子を有するプラスミ ドを担持する株のためのコロニー形成を妨げるリチウム濃度で生存する。その救 済は、相当の増殖遅延の後、生じる。

これらの細胞の生理学を詳しく調査することはできなかったが、しかし５ｏｄ２ は、リチウム毒性からこれらの細胞を明らかに救済する。

ガラクトース増殖細胞は目立って、よりナトリウム感受性でなく、そして従って 、耐イオン性のこの観点は、調査され得なかった。ガラクトース増殖の間、ある 特定（たぶん誘発性）の不可欠な経路が、特にリチウム感受性であると思われる 。Ｓ、ボムベに行なわれる生理学に基づけば、その耐性の機構は、たぶん低い内 部リチウム濃度を維持するレベルで存在する。

５ｏｄ２遺伝子は、Ｓ、セレビシアエに耐イオン性を付与するためにトランスジ ェニック的に機能するように製造され得ることがわかった。耐ナトリウム性の増 強の失敗は、未知レベルの発現又は高い固有レベルの耐ナトリウム性に連結され る最適な膜挿入を得るための失敗に関係する。ｐＥＧｓｌｌｏ−ｓｏｄ２は、ナ トリウム過敏性変異体に耐ナトリウム性を付与するであろうと思われる。

■、タバコ　への５Ｏｄ２゛　−の Ａ、５ｏｄ２　ｃＤＮＡクローンの単離及び特徴化１、Ｓ、ボムベｍＲＮＡ由来 ｃＤＮＡライブラリーの構成全体のＲＮＡを、増殖の対数相で収穫されたＳ、ボ ムベ５ｏｄ２−１　変異細胞から抽出した。ＲＮＡのポリＡ（＋）画分を単離し 、そして二重鎖ｃＤＮＡを合成するために使用した。ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチ ラーゼにより処理し、そしてＥｃｏＲＩリンカ−に連結した。付着端を生成する ためにＥｃｏＲＩにより消化した後、ｃＤＮＡをｐＴＺ１９ＲＤＮＡのＥｃｏＲ １部位に連結した。Ｅ、コリ株ＤＨ５αを、連結生成物によるエレクトロポレー ションにより形質転換し、そして細胞を、形質転換体の選択のためにアンピシリ ンを含むプレート上に広げた。

クローンによるハイブリダイゼーションによりスクリーンした。ハイブリダイゼ ーション−陽性コロニーはまれであり、４０．０００の組換え体中１つ以下の頻 度で生じる。

３、ｃＤＮＡクローンの配置゛　び゛ツムクローンとの較 十分な長さの５ｏｄ２　ｃＤＮＡクローン（ｐ　ＲＭ　１　）を、鎖停止方法を 用いて配列決定し、そしてその配列を５ｏｄ２ゲノムクローンの配列と比較した 。この比較は、ゲノムクローン中の７５塩対におよぶイントロンの存在及び位置 を確証した。

Ｂ、　ベタ　−　への５ｏｄ２′　−のコード令　の１入 １、下記の植物発現ベクターはすべて、Ｔｉプラスミド由来の二元ベクター、ｐ ＢＩＮ１９に基づかれる。（Ｂｅｖａｎ、　Ｍ。

（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓ）介在形質転換が、植 物に耐カナマイシン性を付与する。

２．５ｏｄ２　ＤＮＡ中に制限部位を導入するためへの特定部位突然変異誘発 ａ、５ｏｄ２　ｃＤＮＡクローン ５ｏｄ２　ｃＤＮＡ配列のコード領域内に存在するＮｃ。

１部位を、特定オリゴヌクレオチド突然変異誘発により除去した。そのアミノ酸 配列は、この変化により変えられなかった。ＮｃｏＩ部位を、開始コドンの位置 に創造し、そしてＢａｍＨ１部位を、停止コドンの後に導入した。得られた構造 体を、ＲＭ２．３と呼ぶ。

ｂ、イントロンを含むゲノム５ｏｄ２クローン。

Ｎｃｏ１部位の除去及び導入を、ｃＤＮＡクローンに関しての同じ手段で行なっ た。ＢａｍＨＩ部位は、停止コドンの後に導入されなかった。得られた構造体は 、ＲＤｌ、２と呼ばれる。

Ｃ，ゲノムｓ　ｏｄ２クローン、イントロン除去。

ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列の比較により定義されるイントロンを、特定オリ ゴヌクレオチド突然変異誘発を用いて５ｏｄ２ゲノムクローンから除去した。そ のアミノ酸配列は変更されなかった。次に、ｃＤＮＡ配列に行なわれた同じ変化 が５ｏｄ２ゲノムクローンのイントロン不含バージョンに行なわれた。得られた 構造体は、Ｒ４Ｍｕｔ３と呼ばれる。

３、プロモーター及び翻訳エンハンサ−０種々の強さのプロモーターに５ｏｄ２ 遺伝子を結合したプラスミド構成体を製造した。

ａ、カリフラワーモザイク　ウィルス３５Ｓプロモーター（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ 、　Ｒ，Ａ、　ｆｔ煮、　（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、　６　：　３９０１〜３ ９０７）。

構造体ＲＭ２．３．ＲＤ１．２及びＲ４Ｍｕｔ３を、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ　 （ＲＭ２．３及びＲ４Ｍｕ　ｔ　３）又はＮｃｏｌ及びＨｉｎｄｌＩ［（ＲＤｌ 、２）により切断した。その切断されたＤＮＡを、適切にＮｃｏｌ−ＢａｍＨＩ 又はＨｉｎｄｌ［Ｉ−ＢａｍＨＩアダプターに連結し、ＢａｍＨＩにより切断し 、そしてＢａｍＨＩにより切断されたｐＢ１１６２ＤＮＡ　（Ｐｌａｎｔ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　５ａｓｋａｔｏｏｎ、　Ｃａ ｎａｄａから入手できる）により連結した。これは、植物形質転換に使用するた めの３種の構造体：ｐ３５−ＲＭ２．３．ｐ３５−ＲＤｌ、２及びｐ３５−Ｒ４ Ｍｕｔ３を生成した。個々のそれらの構成体において、５ｏｄ２コード領域は、 カリフラワーモザイク　ウィルス３５Ｓプロモーター、及びノパリンンシンター ゼ遺伝子からの下流の転写停止配列の制御下に存在する。

ｂ、アルファルファ　モザイク　ウィルスＲＮＡ４翻訳エンハンサ−を有するタ ンデムＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｋａｙ、　Ｒ，星？、（１９８７）　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２３６　：　１２９９〜１３０２）。

構造体ＲＭ２．３及びＲ４Ｍｕｔ３をＮｃｏＩ及びＢａｍＨｌにより切断し、そ して同じ２種の酵素により切断されたＰ　Ｂ　Ｉ　５２４　Ｄ　ＮＡ　（Ｐｌａ ｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　５ａｓｋａｔｏｏ ｒ＋＋　Ｃａｎａｄａから入手できる）に連結した。構造体ｐＲＤ１．２をＮｃ ｏＩ及びＨｉｎｄｌｌＩにより切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩアダプター に連結し、ＢａｍＨＩにより切断し、そしてＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより切断 されたｐＢＩ５２４　ＤＮＡに連結した。これは、植物形質転換に使用される３ 種の構造体ｐＴ３５ＡＭＶ−ＲＭ２，３．ｐＴ３５ＡＭＶ−ＲＤｌ、２及びｐＴ ３５−Ｒ４Ｍｕｔ３を生成した。個々のそれらの構造体において、ｓ　ｏｄ２コ ード領域は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのタンデムバージョン及びｎｏｓ遺伝 子からの下流の転写停止配列の制御下にある。

さらに、高レベルの翻訳を付与する５′側の転写された、非翻訳リーダー配列を コードするＤＮＡ配列が、タンデム３５ＳプロモーターとＮｃｏ１部位との間に 存在する。

のｐ３５−ＲＭ２．３．ｐ３５−ＲＤｌ、２．ｐ３５−Ｒ４Ｍｕｔ３．ｐＴ３５ ＡＭＶ−ＲＭ２．３．ｐＴ３５ＡＭＶ−ＲＤｌ、２及びｐＴ３５入ＭＶ−Ｒ４Ｍ ｕ　ｔ　３の導入を、Ｅ。

２ｉＤＨ５α及び旦−ユ丈ＲＫ２０１３との３種の親の接合（ｔｒｉ−ｐａｒｅ ｎｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ）により行なった。

２、Ａ、ツマファシェンスによる植物組織の感染上記プラスミドを担持するＡ、 ツマファシェンス株ＭＰ９０により、標準技法を用いて感染せしめた。

３、耐カナマイシ性形質転換体の選択 惑染せしめられた組織を、ＭＳ塩及びＭＳビタミン、３％スクロース、２．５Ｉ Ｉｇ／ｆのベンジルアデニン、０．１ａ＋ｇ／２のナフタレン酢酸、５００ｍｇ ／ｆのカルベニシリン（ｐＨ５，６）及び１力月ごとに新しい培地に移される１ ００ｍｇ／２のカナマイシンを含むＭＳ培地（Ｍａｒａｓｈｉｇｅ、　Ｔ、ａｎ ｄ　Ｓｋｏｏｇ＋Ｆ、（１９６２）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏ１．旦：　４７３ 〜４９７）上で培養した。新芽条が現われるにつれて、それらを除去し、そして ベンジルアデニンを欠き、そして半分の量のカルベニシリン及びカナマイシンを 含む上記培地上に移した。根が形成される場合、植物を土壌に移した。

４、耐カナマイシンについての再生成体の再試験植物を土壌に移す場合、葉外植 片を元の選択培地上に置く。

カナマイシンの存在下でカルスを生成する植物が、形質転換体として確認される と思われた。

Ｄ、５ｏｄ２ｉ　−の　のため９【！紅遺支並友叉バユ櫃ｌ旦祈旦■璽 １、ノ　−　された　における５ｏｄ２−　の完全なＲＮＡを、形質転換された 及び対照の植物の葉から単離した。そのＲＮＡを、ＤＮＡアーゼにより処理し、 汚染するＤＮＡを除去した。第１鎖ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）によりプライム された完全なＲＮＡから逆転写酵素により合成した。ｓｏｄ２ｍＲＮＡ由来のＤ ＮＡを、５ｏｄ２特異的プライマーを用いて、ポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に より増幅した。この反応は、〔α”Ｐ）ｄＣＴＰの存在及びオートラジオグラフ ィーによりモニターされるＰＣＲ生成物の存在下で行なわれた。負の対照は、形 質転換されていない植物及び逆転写酵素がｃＤＮＡ合成反応から排除されている 反応から抽出されたＲＮＡを包含した。形質転換された植物に由来するｃＤＮＡ から合成された正しい大きさのＰＣＲ生成物の存在及び対照の反応におけるＰＣ Ｒ生成物の不在は、形質転換された植物組織における５ｏｄ２転写体の存在を証 認する。

２、ＬｉＣ１０上　でのトランスジェニック　からカルスの　び　の 植物が耐カナマイシン性について再試験される時点で、そレラハまた、カナマイ シンを欠き、そして種々のレベルのしｉＣｌを含む元の選択培地上に置かれた。

１３０ｍＭはどの高いレベルのＬｉＣ１上に置かれた、形質転換された組織から のカルス形成及び植物の再生が観察された。このレベルのＬｉＣ１の存在下で対 照の形質転換されていない組織の再生は観察されなかった。これらの観察は、酵 母５ｏｄ２遺伝子を発現する植物が予測される表現型と一致する。

ＩＶ、　Ａ、　リアナ　Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ　へのｓ。

丈ｌ這藍五皇星λ Ａ、形質転換された植物の生成（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｎａｔ ｅ　５ｃｈａ＋ｉｄｔ　ａｎｄ　Ｌｏｔｈａｒ　Ｗｉｌｌｔａｉｔｚｅｒ（１９ ８８）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ旦」朋虹旦ヱ：５８３〜５８６）。

１、Ａ、ツマファシェンスによる植物組織の感染。

アラビドプシス叉悲ヱ±（へｒａ上±土！上玉上土ｔｈａｌｉａｎａ）ｖａｒ　 ＲＬＤ０ 葉外植片を、ＭＳ塩＋８５ビタミン、３％スクロース、１ｔａｇ／ｉの２．４− ジクロロフェノキシ酢酸、０．２ｍｇ／ｌのキネチン、０．８％寒天培地（ｐＨ ５，６）上で２日間、予備培養した。次に、葉外植片を、上記プラスミドを担持 する込ユツマファシエンス及びタバコ細胞支持細胞層と共にさらに２日間、同時 培養した。

２、耐カナマイシン性形質転換体の選択外植片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％ スクロース、ＩＢ／ＩＩｉのベンジルアデニン、０．１ｏ＋ｇ／Ｉｌのナフタレ ン酢酸、５００ｍｇ／ｆ！のカルベニシリン、２５ｍｇ／ｆ！のカナマイシン、 ０．８％寒天を含む選択培地（ｐＨ５，６）に移した。芽条が生成される場合、 それらは、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％スクロース、１ｍｇ／ｉ、のベンジルア デニン、０．４−ｇ／ｌのナフタレン酢酸、Ｑ、１ｖｓｇ／ｌのジベレリン酸、 ５００ａ＋ｇ／　１のカルベニシリン及び０．８％寒天を含む芽条成長培地（ｐ Ｈ５，６）に置いた。芽条が３〜４ＣＩＩの長さになる場合、それらを、Ｑ、５ ＸＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、１ｔａｇ／ｌのインドール−３−酪酸、２５０−ｇ／ ｌのカルベニシリン、０．８％寒天を含む根用培地（ｐＨ５，６）に移した。苗 を、成熟するまで、アゼニック（無菌）状態で成長せしめ、そして種子（Ｒ２） を個々の植物から集めた。

３、Ｒ３種子の生成。

Ｒ２種子を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２５ｍｇ／ｌのカナマイシン、０．８％寒 天を含む培地（ｐＨ５，６）上で発芽せしめた。４枚葉段階以上に成長した苗を 、土壌に移し、そして成熟せしめた。個々の植物からの種子（Ｒ３）を集めた。

４、耐カナマイシン性についての推定上の形質転換体の再試験。

それぞれ独立して形質転換された系統からのＲ３種子を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン 、２５ｍｇ／ｆ！のカナマイシン、０．８％寒天を含む発芽用培地（ｐＨ５，６ ）上に置いた。発芽し、そして双葉段階以上に成長した種子は、耐カナマイシン 性であると推定された。耐カナマイシン性に真に成長したＲ３種子系を、追加の 分析のために選択した。

Ｂ、５ｏｄ２゛　−〇　のためにノ　−　れたＡ、　リアナ　の　算ｉ １、形質転換された植物における５ｏｄ２転写体の存在についての試験。

タバコ植物における５ｏｄ２転写体を同定するために使用された同じ方法を、八 −Ｕヱ±植物のために使用した。転写体は、形質転換された植物からの組織に存 在した。存在する転写体のレベルは、植物から植物で異なった。

２、ＬｉＣ１の存在下での発芽及び成長の試験。

Ｒ３種子を、カナマイシンと欠き、そして１２．５＋＋＋ＭのＬｉＣ１を補足さ れた発芽用培地上に置いた。これらの条件下で、トランスジェニック系の１種（ ＃７５）が、対照植物よりもＬｉＣ１に対して耐性であり、そして４枚葉段階で 、対照よりも大きく且つより縁の濃い葉を有する植物を生成した。

これらの植物を、６枚葉段階で、種子生成のために土壌に移した、ＬｉＣｌの存 在下で最っとも著しい成長を示した系統はまた、最高レベルの５ｏｄ２転写体を 有した。この観察は、形質転換された植物における５ｏｄ２遺伝子の発現のレベ ルを高める予測された効果に一致する。

皿皿１ゑ立法 当業者は、本明細書に記載される特定の方法に類似する多くの通常の方法を用い て理解し、又は確かめるであろう。そのような類似する方法は、本発明の範囲内 にあり、そして次の請求の範囲により包含される。

聚凰剋星 配列１０　Ｎｏ、　：　１ 配列の型：対応するタンパク質と共にヌクレオチド配列の長さ：　２３３１ 配列の種類ニゲツムＤＮＡ 起源生物：酵母　Ｓ、ボムベ ａａｇｃｔＬｔｇｕ　ｓｃヒｃｃａａｔｃａ　ａａａａｇｓｔ８ａｃ　セａａｇ ｇｔ、ａｃｃｃ　Ｃ９９七ｃｃｔｃａａ　ｑＴｔａ七ａ＊ａモモ＝@６０ ｃａｇｇｃａＪｃａ　ｃｇｃａｔｃ＋＋ｇｔｃ　ｃｇｔｇｇｃｔａａｃ　ｔｇＥ ａｔｃｔ：、ｕ七　ｇｃｃａｃａヒｔｔｔ　ａヒｇｃｇａａ狽＝@Ｌ２Ｑ ｃＬｃｔａａｌＩａａａ　５ａｔａ七七８七ａｑ　ｇａｓヒｔｔａｔｔａ　ｃａ ａｇａａａａｃａ　ｔｔｃｔｃｔ七９七ｇ　ｑａｔａｔｔｑモモ煤@１６０ ）ｌｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｆｐ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　八ｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ 　Ｌｙｓ　ＶａＬ　１ｌｉｓ　Ｌｅｕ　＾ｌａＬｅｕ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｌｓ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｉｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ 　Ｐｈｅ　５ｅｒ　ＧｌｕＧＴＴ　ＴＴＴ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　丁ＴＡ　 ＣＴＡ　Ｃ７丁　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　Ｇ　９七５ｃｑｔＬｑｓａ　３２１ Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｔｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　ＡｌｇＧＣＴ　ＡＡＡ　ＣＴＣＧＴＡ　ＧＡＣＣＣＴ　ＴＴＴ　丁ＣＣ ＴにＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　丁ＡＣＴｒＧ　４７７Ａｌａ 　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｔ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ 　Ａｓｐ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ＬｅｕＧＣＡ　ＡＴＡ　ＧＡＡ　 ＣＴＣＣＣＣＧＧＴ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　八Ａτ　ＴＴ Ｔ　ＣＧＡ　ＡＧＣＡＴＣ５フ３Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ、Ｐｈｅ　Ａｔｇ　Ｓ ｅｒ　Ｘ１ｅＡＴＴ　Ｇ丁＾　Ａ’ｒＧ　ＣＴＡ　ττ八　ＣＣＡ　ＧＴＴ　Ａ ＴＧ　ＧＣＴ　ＴＡＣＧＧＧ　ＴＧＧ　ＴＴＡ　ＧＴｒ　ＡＣＡ　ＧＣＴ@６４ １ Ｘｌｅ　Ｖａｌ　Ｍｅ七　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐ【ａ　Ｖａｌ　Ｍｅヒ　Ａｌａ　 Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　＾１ａＣＴＧ　ＡＴＣＧＣ Ａ　ＧＧＡ　’ｒＣＴ　ＡＴＡ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　ＣＨＡＴ　ＣＣＴ　 ＧＴＴ　ＣＴＡ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　Ｔｒf　７１７ Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　丁ｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＬｅｕＭＧ　ＣＡＣＣ，Ｃ Ｔ　ＣＡＧ　入入入　ＴＡＣＣＧＴ　ＴＴＡ　入子τ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　入ＴＴ 　ＭＡＴ　丁入Ｔ　丁へ丁　ＴＣＣ１０O５ Ｌｙｓ　Ｈｉ、ｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｘ１ｅ 　Ａｓｐ　Ａｌａ　工１ｅ　Ｓａｒτｙｒ　Ｔｙｔ　５ｅｔＣＴＴ　ＣＣＧ　Ｃ ＴＡ　ＧＣＧ　ＡＴＡ　Ｃ（Ｔ　ＴｒＡ　ＴＴＡ　ＴＧＴ　丁ＣＴ　ＧＧＧ　Ａ ＴＡ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　入ｆｆ　ＡＴＴ@１０５３ Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　入１ａ　Ｉｌｅ　Ｐｚｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　 Ｓｅｒ　Ｇｉｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　１ｌａＧＧＡ　にＴＴ　Ｃ ＡＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＴｒＧ　ＡＴＣＴＣＣｍ　ｍ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　 ＴＴＡ　ｍ　ＡＡＣ１１０１Ｇｌｙ　Ｖａｌ＾ｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　 Ｍｅ仁Ｓ＠ｒ　Ｐｈｅ、　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｘｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　 ＡｓｎＡＴＣＡＴＴ　ＣＣＣＴＣＣＡＡＴ　ＡＡＴ　ＴＴＴ　入へτ　ＴＧＧ　 ＴＣＴ　ＧＴ’ｒ　ＧＡＡ　ＧＧＣＴｒＧ　ＣＣＴ　ＣＴＴ　１２S５ １１ｅ　ヱｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　ＡＳｎ　ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　 Ｓｅｒ　Ｖａｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＶａｌＴＧＧ　ＣＧＴ　Ｔ ＴＡ　ＡＴＴ　ＧＴＣＴｒＴ　ＡＧＣＡＴＡ　ＴＴ（：　ＡＣＴ　ＣＴＡ　ＧＴ Ｔ　ＴＧＴ　Ｃ０丁　ＣＧＡ　ＴＴＡ　P２９：Ｉ Ｔｒｐ　Ａｒｑ　Ｌｅｕ　工１ｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　八ｒｇ　Ａｒｇ　ＬｅｕＣＣＧ　ＣＴＴ　Ｃ ＴＡ　ｍ　ＴＣＧ　ＣＴＧ　ＭＧ　ＣＣＴ　ＴＴＡ　ＧＴＴ　ＣＣＧ　ＧＡＣＡ Ｔｒ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＴＧＧ　１３４P Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　 ｖａｌ　Ｐｔｏ　八ｓｐ　Ｘｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＴｒｐＡ八Ａ　へＧＭ　Ｇ ＣＣＣＴＴ　ＴＴＣＣＴＴ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＴＴＣＧＧＡ　ＣＣＡ　ＡＴＡ　 ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＴＧＣＧＣＡ　１３［P９ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　１（ｘｓ　Ｐｈｅ 　Ｇｌｙ　ｆ’ｒｏ　工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａ撃■ ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ｍ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＣＴ Ｇ　ＴＴＧ　ＴＣＣＣＣＧ　ＧＡＴ　ＧＭ　ＡＴＴ　１４３f７ Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｍｅセ八へａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　八ｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ｌ１ｅＧ入八　ＡＡｃ　ｘＧ ’ｒ　ＡＴｒ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＴＣＡ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＴＴＴ　Ｔ ＣＡ　ＡＣＡ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＣＡ`　１４８５ Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｃ　Ｉｌｅ　Ｔ）Ｔ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　丁ｈｒ　Ｔｈｒ　 Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌ、ｅｕ　ＡＳｎ　Ｇｌ■ ＡＴＡ　Ａ’ｌＴ　ＴＧＣＣＣＧ　ＡＴＣＡＴＴ　ＴＣＧ　ＴｒＴ　ＧＴＴ　Ａ ＴＣＴＴＡ　丁ＣＣＴＣＡ　ＡＴＣＡＴ’ｒ　ＧＴＴ　１５R］ １１ｅ　ｌｉｅ　丁ｒＰ　Ｐｒｏ　Ｘ１ｅ　工ｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　 Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｘｌｅ　Ｉｌｅ　ＶａｌＣＡＴ　ＧＧ’Ｔ　 丁ＴＣＡＧＴ　ＡＴＣＣＡＴ　ＣＴＡ　丁ＴＡＧ丁Ｇ　ＡＴＴ　ＴＣＧ　ＣＣＡ 　八ＡＧ　丁ＴＡＡへＡ　ＡＧＴ　１５■I ＋（ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ｖａｌ 　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　５ｅ■ ＣＴＧ　ＴＡＴ　ＴｒＡ　ＡＡＴ　ＣＧＡ　ＡＭ　ＧＴＣＡＣＣＭＧ　丁ＣＣＧ ＡＴ　ＴＣＣＧＡＴ　丁τＧ　ＧＡＧ　ＴｒＡ　１６２９Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅ ｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　ｒｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓ、ｐ　Ｓ ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅ■ ａｇａｔａａ９ヒｑａｔ仁Ｃ七Ｃａ９ａａヒ　ｃａｃｓａｇｇｅ七ａ　ａｃｃδ ｃｃａａｃａ　ｑｑｑｓセ９９ａ９セ　ｑ七３七暑セｔセｔq　１８５８ Ｃセセａｃｔａｃ仁Ｃ七ａａａａａｔａｔ七　９七δヒａａ七セｔｃ　ｔａａａ ａｅ七９ａ七　ｃりａｇａ辷ａＣ七ｇ　ａｇａａａａｇヒ−メ@１９７１１ Ｍａａｔｅｇヒセーヒ　ヒセａａセｔｔＢａ　ａｔｅセａ七ｔセｔｇ　＋ｔｔ９ ９ｃｔ８ａｌａ　ｃｔｔａｃｅａａ辷♂　ヒ七Ｃ９七セｅ９b辷　２０３８ ｔｃａａａｃａａｔａ　ｃｃａａ虹ｃｔ１．ａｃ　ｇａａａｃａｃｃセヒ　ａｃ ｑｃｔｔｃａセｅ　ａａａｇセｃｔｓｃｔ　仁セ９９”七Ｃ≠■■@２０９８ ｔａａｔ、ａセｔｈｔｉ　ｔｔａＬｔｔｇｔｔｇ　七セ９七ａａｔｔａｔ　ａｃ ａａａｃ七ａａＰ　ａｃセａヒを辷セａセ　９セミｓｇａａ≠ャq　２１５８ ａセａａａヒＣセｃａ　ｃｃセ８Ｃｔａａａａ　ＣａＣａ七（ｉａｃｇ　セａｃ ｔｔｃｓａａｇ　ｇｇｃｃセａａｃセａ　ｃｔａ仁ａａｇａモ煤@２２７８ ヒｑｑｔａａｔｓｔヒ　ｔａａｉｔａｇｔｇセ　七ｔｅｔａセｔａｇ七　δ９９ 仁ａｇｃｔｔｅ　ａａａｑｔａ七ｑｔａ　七ａａ、、、１ａXｃセｔ　２３３１ ｐＨの関数としての野生型の耐ナトリウム性Ｆｉｇ、ｌ八 ｐＨの関数としての野生型の耐リチウム性ｐＨの関数としての野生型の耐カリウ ム性ｐＨ６での野生型及びｓｏｄ　２−１の耐ナトリウム性０．４　０．６　０ ．８　１．０　１．２　１．４　１６ＮａＣ１濃度（Ｍ） Ｆｉｇ、　２ 増殖速度−野生型ｖｓ　ＮａＣ１濃度（Ｍ）Ｆｉｇ、　３Ａ 増殖速度−５ｏｄ　２−Ｉ　Ｖ３　ＮａＣ１濃度（Ｍ）増殖速度−ｐｓｏｄ２　 ｕｒａ４−０１８　ｖｓ　ＮａＣ１濃度ＣＭ）増殖速度−野生型ｖｓ　Ｎａ□ｓ ｏ、濃度（Ｍ）Ｆｉｇ＋４Ａ 増殖速度−５ｏｄ　２−１　ｖｓ　Ｎａ＊ＳＯａ濃度（Ｍ）時間（時） Ｆｉｇ、　４Ｂ 増殖速度−ｐｓｏｄ２　ｕｒａ４−０１８　ｖｓ　ＮａｇＳ　Ｏａ濃度（Ｍ）Ｆ ｉｇ＋６ 野生型及びｓｏｄ　２−１からのナトリウム輸送Ｆｉｇ、　７ ０　：：ｌ：　ｔ２　：　二　＝　二　＝　＝　ミ　＝二＝＝　三＝ミ＝；５　 ミＦｉｇ、１０ 、Ｏ Ｆｉｇ、ＩＩＡ ”　−１，４ Ｆｉｇ、ｌｌＢ Ｆｉｇ、１２ Ｆｉｇ、１３ 野生型、　ｓｏｄ　２−１．　ＡＤＨ１及びＡＤＨ２の耐リチウム性Ｆｉｇ、　 １４ 外部ナトリウムの不在下でのナトリウム輸送外部ナトリウムの存在下でのナトリ ウム輸送時間（分） Ｓ、セレビシアエのｓｏｄ　２救済 リチウム濃度（＋ｓＭ　） Ｆｉｇ、　１９ Ｆｉｇ、２０ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年４月２Ｚ日

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞に耐ナトリウム性又は耐リチウム性を付与する単離された遺伝子又はそ のフラグメント。
2. ２．配列列挙１に示されるｓｏｄ２ヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１項 記載の遺伝子。
3. ３．前記細胞が分裂酵母細胞Ｓ．ボムベである請求の範囲第１項記載の遺伝子。
4. ４．前記細胞が酵母Ｓ．セレビシアエである請求の範囲第１項記載の遺伝子。
5. ５．前記細胞が植物細胞である請求の範囲第１項記載の遺伝子。
6. ６．配列列挙に示されるｓｏｄ２ヌクレオチド配列を有する単離された遺伝子。
7. ７．細胞に耐ナトリウム性を付与する遺伝子をコードする単離されたタンパク質 。
8. ８．配列列挙に示されるアミノ酸配列を有する請求の範囲第７項記載の単離され たタンパク質。
9. ９．細胞に耐ナトリウム性を付与する遺伝子又はそのフラグメントを含む発現ベ クター。
10. １０．前記遺伝子が強いプロモーターの制御下にある請求の範囲第９項記載の発 現ベクター。
11. １１．前記プロモーターが酵母プロモーターである請求の範囲第１１項記載の発 現ベクター。
12. １２．前記プロモーターが植物プロモーターである請求の範囲第１１項記載の発 現ベクター。
13. １３．配列列挙に示されるｓｏｄ２ヌクレオチド配列に融合されたアルコールデ ヒドロゲナーゼプロモーターを有するプラスミド。
14. １４．野生型Ｓ．ボムベ及びＳ．セレビシアエに耐ナトリウム性及び耐リチウム 性を付与することができる、プラスミドヘクターｐＦ２０における５．８ｋｂの Ｓ．ボムベ野生型ゲノムＤＮＡ挿入体から成るプラスミドｐｓｏｄ２。
15. １５．植物細胞中で機能的なプロモーターの制御下で耐ナトリウム性を付与する 遺伝子及び選択可能な遺伝子マーカーを、そのＴ領域に含む組換えＴｉプラスミ ド。
16. １６．前記耐ナトリウム性付与遺伝子が配列列挙１に示されるｓｏｄ２ヌクレオ チドコード配列を有する請求の範囲第１５項記載の組換えＴｉプラスミド。
17. １７．請求の範囲第１項記載の遺伝子により形質転換された細胞。
18. １８．前記遺伝子が配列列挙１に与えられるヌクレオチドコード配列を有する請 求の範囲第１７項記載の細胞。
19. １９．植物細胞である請求の範囲第１７項記載の細胞。
20. ２０．酵母細胞である請求の範囲第１７項記載の細胞。
21. ２１．Ｓ．ボムベｓｏｄ２−１の耐ナトリウム性株。
22. ２２．耐ナトリウム又はリチウム性を付与する遺伝子により形質転換された酵母 細胞の培養物。
23. ２３．耐ナトリウム又はリチウム性を付与する遺伝子により形質転換された植物 。
24. ２４．前記遺伝子が配列列挙に示されるｓｏｄ２ヌクレオチド配列を有する請求 の範囲第２３項記載の植物。
25. ２５．耐ナトリウム性植物に発芽することができる、耐ナトリウム性を付与する 遺伝子により形質転換された種子。
26. ２６．前記遺伝子が配列列挙に示されるｓｏｄ２ヌクレオチドコード配列を有す る請求の範囲第２５項記載の種子。
27. ２７．細胞に耐ナトリウム性又は耐リチウム性を付与するための方法であって、 耐ナトリウム性又は耐リチウム性を付与する遺伝子により前記細胞を形質転換す ることを含んで成る方法。
28. ２８．前記遺伝子がｓｏｄ２又はその変異体である請求の範囲第２７項記載の方 法。
29. ２９．前記遺伝子が配列列挙に示されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第 ２８項記載の方法。