JPH05292988A - ジヌクレオシドポリリン酸，ヌクレオシドポリリン酸又はそれらの誘導体の製造方法 - Google Patents
ジヌクレオシドポリリン酸，ヌクレオシドポリリン酸又はそれらの誘導体の製造方法Info
- Publication number
- JPH05292988A JPH05292988A JP4125668A JP12566892A JPH05292988A JP H05292988 A JPH05292988 A JP H05292988A JP 4125668 A JP4125668 A JP 4125668A JP 12566892 A JP12566892 A JP 12566892A JP H05292988 A JPH05292988 A JP H05292988A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adenosine
- atp
- derivatives
- derivative
- polyphosphate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/94—Saccharomyces
- Y10S435/942—Saccharomyces cerevisiae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 アデノシン−５’−三リン酸およびスルフェ
ートを反応基質として用い，アデノシン−５’−三リン
酸スルフリラーゼおよびジアデノシン四リン酸ホスホリ
ラーゼの二種の酵素を触媒とする二段階反応によりジア
デノシン四リン酸を生成させる。 【効果】 本発明によれば、従来のジヌクレオシドポリ
リン酸の製造法に比べ高純度でかつ高収率のジヌクレオ
シドポリリン酸が製造でき、また容易にこれを単離精製
できるので、工業的に有利にジヌクレオシドポリリン酸
の製造ができる。
ートを反応基質として用い，アデノシン−５’−三リン
酸スルフリラーゼおよびジアデノシン四リン酸ホスホリ
ラーゼの二種の酵素を触媒とする二段階反応によりジア
デノシン四リン酸を生成させる。 【効果】 本発明によれば、従来のジヌクレオシドポリ
リン酸の製造法に比べ高純度でかつ高収率のジヌクレオ
シドポリリン酸が製造でき、また容易にこれを単離精製
できるので、工業的に有利にジヌクレオシドポリリン酸
の製造ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬品又はその原料と
して有用なジヌクレオシドポリリン酸，ヌクレオシドポ
リリン酸又はそれらの誘導体の製造方法に関するもので
ある。
して有用なジヌクレオシドポリリン酸，ヌクレオシドポ
リリン酸又はそれらの誘導体の製造方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】ジアデノシンポリリン酸又はその誘導体
は，Ｇ1 阻害を起こしたＢＨＫ細胞に対するＤＮＡ合成
の促進作用〔エフ・グルムト（F.Grummt）, プロシーデ
ィング・オブ・ナシヨナル・アカデミック・サイエンス
（Pro.N.A.S.）７５巻，３７１頁（1978）〕，リン酸化
の阻害作用〔ピー・エフ・マネス（P.F.Maness）ら，ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）２５８巻，４０５５頁（1983）〕，血小板凝
集阻害作用〔エム・ジェイ・ハリソン（M.J.Harrison）
ら，フェブス・レターズ（FEBS Letters）５４巻，５７
頁（1975）〕等の生理作用を有している。このように，
ジアデノシンポリリン酸をはじめとするジヌクレオシド
ポリリン酸（以下ＮｐｎＮ’という。）もしくはヌクレ
オシドポリリン酸（以下ｐｎＮという。）又はそれらの
誘導体は医薬品及び医薬品原料としての利用が期待され
ている物質である。このジアデノシンポリリン酸又はそ
の誘導体を得る方法としては，ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）１２
６巻，１３５頁（1982）には，エシエリキア・コリ由来
のリジル−ｔＲＮＡ合成酵素，ヒスチジル−ｔＲＮＡ合
成酵素，フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素，酵母由
来のリジル−ｔＲＮＡ合成酵素，フェニルアラニル−ｔ
ＲＮＡ合成酵素，フザリウム由来のフェニルアラニル−
ｔＲＮＡ合成酵素，羊肝細胞由来のフェニルアラニル−
ｔＲＮＡ合成酵素等の種々のアミノアシル−ｔＲＮＡ合
成酵素によりアデノシン−５’−三リン酸（以下ＡＴＰ
という。）からジアデノシン四リン酸が，また，ＡＴＰ
の誘導体である２’−デオキシアデノシン−５’−三リ
ン酸からジアデノシン四リン酸の誘導体であるジデオキ
シアデノシン四リン酸が合成されることが報告されてい
る。また，バイオケミストリー（Biochemistry）２７
巻，２８５９頁（1988）には，ジアデノシン四リン酸ホ
スホリラーゼ（以下Ａｐ4 Ａホスホリラーゼという。）
の触媒作用により，ＡＴＰ又はその誘導体とアデノシン
−５’−ホスホスルフェート（以下ＡＰＳという。）と
を反応させてＮｐｎＮ’を合成する方法が提案されてい
る。
は，Ｇ1 阻害を起こしたＢＨＫ細胞に対するＤＮＡ合成
の促進作用〔エフ・グルムト（F.Grummt）, プロシーデ
ィング・オブ・ナシヨナル・アカデミック・サイエンス
（Pro.N.A.S.）７５巻，３７１頁（1978）〕，リン酸化
の阻害作用〔ピー・エフ・マネス（P.F.Maness）ら，ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）２５８巻，４０５５頁（1983）〕，血小板凝
集阻害作用〔エム・ジェイ・ハリソン（M.J.Harrison）
ら，フェブス・レターズ（FEBS Letters）５４巻，５７
頁（1975）〕等の生理作用を有している。このように，
ジアデノシンポリリン酸をはじめとするジヌクレオシド
ポリリン酸（以下ＮｐｎＮ’という。）もしくはヌクレ
オシドポリリン酸（以下ｐｎＮという。）又はそれらの
誘導体は医薬品及び医薬品原料としての利用が期待され
ている物質である。このジアデノシンポリリン酸又はそ
の誘導体を得る方法としては，ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）１２
６巻，１３５頁（1982）には，エシエリキア・コリ由来
のリジル−ｔＲＮＡ合成酵素，ヒスチジル−ｔＲＮＡ合
成酵素，フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素，酵母由
来のリジル−ｔＲＮＡ合成酵素，フェニルアラニル−ｔ
ＲＮＡ合成酵素，フザリウム由来のフェニルアラニル−
ｔＲＮＡ合成酵素，羊肝細胞由来のフェニルアラニル−
ｔＲＮＡ合成酵素等の種々のアミノアシル−ｔＲＮＡ合
成酵素によりアデノシン−５’−三リン酸（以下ＡＴＰ
という。）からジアデノシン四リン酸が，また，ＡＴＰ
の誘導体である２’−デオキシアデノシン−５’−三リ
ン酸からジアデノシン四リン酸の誘導体であるジデオキ
シアデノシン四リン酸が合成されることが報告されてい
る。また，バイオケミストリー（Biochemistry）２７
巻，２８５９頁（1988）には，ジアデノシン四リン酸ホ
スホリラーゼ（以下Ａｐ4 Ａホスホリラーゼという。）
の触媒作用により，ＡＴＰ又はその誘導体とアデノシン
−５’−ホスホスルフェート（以下ＡＰＳという。）と
を反応させてＮｐｎＮ’を合成する方法が提案されてい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし，上記した各ア
ミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の触媒作用によりＡＴＰ
又はその誘導体とアミノ酸とを反応させてＮｐｎＮ’を
合成する方法では，触媒として用いるアミノアシル−ｔ
ＲＮＡを得るために，培養後の菌体あるいは肝細胞を破
砕後，酵素を精製する操作を経ているが，天然に存在す
る菌体あるいは細胞中のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵
素の含有量は極わずかであるために，目的とするＮｐｎ
Ｎ’を製造する際，大量の菌体を培養しあるいは大量の
細胞を用意し，処理しなければならないという欠点があ
った。また，ＡＰＳを用いる方法では，原料となるＡＰ
Ｓが不安定で高価であること及びＡＴＰ又はその誘導体
（文献ではＡＴＰ）からのＮｐｎＮ’（文献ではＡｐｎ
Ｎ’）への変換収率が低いためＡＴＰ又はその誘導体か
らＮｐｎＮ’を合成するのにコスト的な問題があった。
本発明は上記のような問題を解決するものであって，高
純度のＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体を高収率
で容易に得ることができる製造方法を提供することを目
的とする。
ミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の触媒作用によりＡＴＰ
又はその誘導体とアミノ酸とを反応させてＮｐｎＮ’を
合成する方法では，触媒として用いるアミノアシル−ｔ
ＲＮＡを得るために，培養後の菌体あるいは肝細胞を破
砕後，酵素を精製する操作を経ているが，天然に存在す
る菌体あるいは細胞中のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵
素の含有量は極わずかであるために，目的とするＮｐｎ
Ｎ’を製造する際，大量の菌体を培養しあるいは大量の
細胞を用意し，処理しなければならないという欠点があ
った。また，ＡＰＳを用いる方法では，原料となるＡＰ
Ｓが不安定で高価であること及びＡＴＰ又はその誘導体
（文献ではＡＴＰ）からのＮｐｎＮ’（文献ではＡｐｎ
Ｎ’）への変換収率が低いためＡＴＰ又はその誘導体か
らＮｐｎＮ’を合成するのにコスト的な問題があった。
本発明は上記のような問題を解決するものであって，高
純度のＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体を高収率
で容易に得ることができる製造方法を提供することを目
的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは，このよう
な課題を解決するために鋭意研究の結果、ＡＴＰスルフ
リラーゼとＡｐ4 Ａホスホリラーゼの共存下にＡＴＰも
しくはポリリン酸又はそれらの誘導体とスルフェートを
基質にして反応することにより，驚くべきことに高変換
率でＮｐｎＮ’もしくはｐｎＮ又はそれらの誘導体が製
造できることを，さらにこの反応系にアデノシン−５’
−二リン酸（以下ＡＤＰという。）をＡＴＰに変換する
酵素を共存させることにより，高純度でかつ高収率のＮ
ｐｎＮ’もしくはｐｎＮ又はそれらの誘導体が製造でき
ることを見出し，本発明を完成するに至った。すなわ
ち，本発明は，ＡＴＰ，ポリリン酸又はそれらの誘導体
およびスルフェートを反応基質として用い，ＡＴＰスル
フリラーゼおよびＡｐ4 Ａホスホリラーゼの二種の酵素
を触媒とする二段階反応によりＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又は
それらの誘導体を生成させることを特徴とするＮｐｎ
Ｎ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体の製造方法及び，ＡＤ
ＰをＡＴＰに変換する酵素の存在下に，ＡＴＰ，ポリリ
ン酸又はそれらの誘導体およびスルフェートを反応基質
として用い，ＡＴＰスルフリラーゼおよびＡｐ4 Ａホス
ホリラーゼの二種の酵素を触媒とする二段階反応によ
り，ＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体を生成させ
ることを特徴とするＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘
導体の製造方法を要旨とするものである。
な課題を解決するために鋭意研究の結果、ＡＴＰスルフ
リラーゼとＡｐ4 Ａホスホリラーゼの共存下にＡＴＰも
しくはポリリン酸又はそれらの誘導体とスルフェートを
基質にして反応することにより，驚くべきことに高変換
率でＮｐｎＮ’もしくはｐｎＮ又はそれらの誘導体が製
造できることを，さらにこの反応系にアデノシン−５’
−二リン酸（以下ＡＤＰという。）をＡＴＰに変換する
酵素を共存させることにより，高純度でかつ高収率のＮ
ｐｎＮ’もしくはｐｎＮ又はそれらの誘導体が製造でき
ることを見出し，本発明を完成するに至った。すなわ
ち，本発明は，ＡＴＰ，ポリリン酸又はそれらの誘導体
およびスルフェートを反応基質として用い，ＡＴＰスル
フリラーゼおよびＡｐ4 Ａホスホリラーゼの二種の酵素
を触媒とする二段階反応によりＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又は
それらの誘導体を生成させることを特徴とするＮｐｎ
Ｎ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体の製造方法及び，ＡＤ
ＰをＡＴＰに変換する酵素の存在下に，ＡＴＰ，ポリリ
ン酸又はそれらの誘導体およびスルフェートを反応基質
として用い，ＡＴＰスルフリラーゼおよびＡｐ4 Ａホス
ホリラーゼの二種の酵素を触媒とする二段階反応によ
り，ＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体を生成させ
ることを特徴とするＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘
導体の製造方法を要旨とするものである。
【０００５】以下，本発明を詳細に説明する。本発明の
ＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体の生成に関与す
る酵素反応は，ＡＴＰからＡｐ4 Ａを製造する方法を例
に示すと下記式１，式２のごとくである。すなわち，Ａ
ＴＰとスルフェートからＡＴＰスルフリラーゼの触媒作
用によりＡＴＰを硫酸化し（式１），生じたＡＰＳとＡ
ＴＰからＡｐ4 Ａホスホリラーゼの触媒作用によりＡｐ
4 Ａを製造する（式２）という二段階反応によるもので
ある。
ＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体の生成に関与す
る酵素反応は，ＡＴＰからＡｐ4 Ａを製造する方法を例
に示すと下記式１，式２のごとくである。すなわち，Ａ
ＴＰとスルフェートからＡＴＰスルフリラーゼの触媒作
用によりＡＴＰを硫酸化し（式１），生じたＡＰＳとＡ
ＴＰからＡｐ4 Ａホスホリラーゼの触媒作用によりＡｐ
4 Ａを製造する（式２）という二段階反応によるもので
ある。
【０００６】また通常，反応の平衡をいっそうＡｐ4 Ａ
生成の方向に傾けるために，式３に示すように，ピロリ
ン酸をリン酸に加水分解する酵素，すなわち，ピロホス
ファターゼ（以下ＰＰａｓｅという。）を共存させるこ
とが好ましい。
生成の方向に傾けるために，式３に示すように，ピロリ
ン酸をリン酸に加水分解する酵素，すなわち，ピロホス
ファターゼ（以下ＰＰａｓｅという。）を共存させるこ
とが好ましい。
【０００７】
【０００８】本発明でいうＮｐｎＮ’の誘導体とは，ジ
アデノシンポリリン酸の構造を基本骨格として有する化
合物であって，その構成部分であるＡＴＰ又はその誘導
体から変換される化合物をいう。このようなＮｐｎＮ’
の誘導体としては，アデニン環のＮ６位アルキル化，カ
ルボキシアルキル化，ベンゾイル化，カルボキシベンゾ
イル化誘導体，アデニン環のハロゲン化誘導体，ヒドロ
キシ誘導体，デアミノ誘導体，デオキシアミノ誘導体，
Ｎ6 ，Ｎ6 ―ジカルボキシメチルアデノシン四リン酸及
び五リン酸，Ｎ6 ，Ｎ6 ―ジカルボキシエチルアデノシ
ン四リン酸及び五リン酸，Ｎ6 ，Ｎ6 ―（Ｐ―ジカルボ
キシベンゾイル）アデノシン四リン酸及び五リン酸，ジ
８―ブロムアデノシン四リン酸及びこれらの化合物の誘
導体等が具体例として挙げられる。ヌクレオシド（Ｎ，
Ｎ’）としては，アデノシン，グアノシン等が挙げられ
る。
アデノシンポリリン酸の構造を基本骨格として有する化
合物であって，その構成部分であるＡＴＰ又はその誘導
体から変換される化合物をいう。このようなＮｐｎＮ’
の誘導体としては，アデニン環のＮ６位アルキル化，カ
ルボキシアルキル化，ベンゾイル化，カルボキシベンゾ
イル化誘導体，アデニン環のハロゲン化誘導体，ヒドロ
キシ誘導体，デアミノ誘導体，デオキシアミノ誘導体，
Ｎ6 ，Ｎ6 ―ジカルボキシメチルアデノシン四リン酸及
び五リン酸，Ｎ6 ，Ｎ6 ―ジカルボキシエチルアデノシ
ン四リン酸及び五リン酸，Ｎ6 ，Ｎ6 ―（Ｐ―ジカルボ
キシベンゾイル）アデノシン四リン酸及び五リン酸，ジ
８―ブロムアデノシン四リン酸及びこれらの化合物の誘
導体等が具体例として挙げられる。ヌクレオシド（Ｎ，
Ｎ’）としては，アデノシン，グアノシン等が挙げられ
る。
【０００９】本発明でいうｐｎＮの誘導体とは，アデノ
シンポリリン酸の構造を基本骨格として有する化合物で
あって，その構成部分であるＡＴＰ又はその誘導体から
変換される化合物をいう。このようなｐｎＮの誘導体と
しては，アデニン環のＮ６位アルキル化，カルボキシア
ルキル化，ベンゾイル化，カルボキシベンゾイル化誘導
体，アデニン環のハロゲン化誘導体，ヒドロキシ誘導
体，デアミノ誘導体，デオキシアミノ誘導体，Ｎ6 ，Ｎ
6 ―ジカルボキシメチルアデノシン四リン酸及び五リン
酸，Ｎ6 ，Ｎ6 ―ジカルボキシエチルアデノシン四リン
酸及び五リン酸，Ｎ6 ，Ｎ6 ―（Ｐ―ジカルボキシベン
ゾイル）アデノシン四リン酸及び五リン酸，ジ８―ブロ
ムアデノシン四リン酸及びこれらの化合物の誘導体等が
具体例として挙げられる。ヌクレオシド（Ｎ）として
は，アデノシン，グアノシン等が挙げられる。
シンポリリン酸の構造を基本骨格として有する化合物で
あって，その構成部分であるＡＴＰ又はその誘導体から
変換される化合物をいう。このようなｐｎＮの誘導体と
しては，アデニン環のＮ６位アルキル化，カルボキシア
ルキル化，ベンゾイル化，カルボキシベンゾイル化誘導
体，アデニン環のハロゲン化誘導体，ヒドロキシ誘導
体，デアミノ誘導体，デオキシアミノ誘導体，Ｎ6 ，Ｎ
6 ―ジカルボキシメチルアデノシン四リン酸及び五リン
酸，Ｎ6 ，Ｎ6 ―ジカルボキシエチルアデノシン四リン
酸及び五リン酸，Ｎ6 ，Ｎ6 ―（Ｐ―ジカルボキシベン
ゾイル）アデノシン四リン酸及び五リン酸，ジ８―ブロ
ムアデノシン四リン酸及びこれらの化合物の誘導体等が
具体例として挙げられる。ヌクレオシド（Ｎ）として
は，アデノシン，グアノシン等が挙げられる。
【００１０】本発明に用いられるＡＴＰスルフリラーゼ
とＡｐ4 Ａホスホリラーゼは，これらを組み合わせてＡ
ｐ4 Ａを合成する能力を有するものであればいかなるも
のでもよい。ＡＴＰスルフリラーゼとＡｐ4 Ａホスホリ
ラーゼは，例えば，サッカロマイセス・セルビシエ（Ｉ
ＦＯ１００８）等の酵母由来の酵素、バチルス・ステア
ロサーモフィルス（ＮＣＡ１５０３株）やバチルス・コ
アギュランス（ＡＴＣＣ７０５０株）等のバチルス属や
サーマス属などの好熱性細菌由来の酵素などが挙げられ
る。さらにＡｐ4 Ａホスホリラーゼにおいてはエシエリ
キア・コリ（ＪＭ１０１Ｔｒ，Ｙ１０８９，ＩＢＰＣ１
１１），サッカロマイセス・セルビシエ（ＣＭＹ２１
４）由来の酵素等を，ＡＴＰスルフリラーゼにおいては
ペニシリウム・クリソゲニム（ＩＦＯ４６２６），アス
ペルギルス・ニガー，ネウロスボラ・クラツサ由来の酵
素等を挙げることができる。また、これら微生物の遺伝
子を導入した細菌も含まれる。
とＡｐ4 Ａホスホリラーゼは，これらを組み合わせてＡ
ｐ4 Ａを合成する能力を有するものであればいかなるも
のでもよい。ＡＴＰスルフリラーゼとＡｐ4 Ａホスホリ
ラーゼは，例えば，サッカロマイセス・セルビシエ（Ｉ
ＦＯ１００８）等の酵母由来の酵素、バチルス・ステア
ロサーモフィルス（ＮＣＡ１５０３株）やバチルス・コ
アギュランス（ＡＴＣＣ７０５０株）等のバチルス属や
サーマス属などの好熱性細菌由来の酵素などが挙げられ
る。さらにＡｐ4 Ａホスホリラーゼにおいてはエシエリ
キア・コリ（ＪＭ１０１Ｔｒ，Ｙ１０８９，ＩＢＰＣ１
１１），サッカロマイセス・セルビシエ（ＣＭＹ２１
４）由来の酵素等を，ＡＴＰスルフリラーゼにおいては
ペニシリウム・クリソゲニム（ＩＦＯ４６２６），アス
ペルギルス・ニガー，ネウロスボラ・クラツサ由来の酵
素等を挙げることができる。また、これら微生物の遺伝
子を導入した細菌も含まれる。
【００１１】また本発明に用いられるＡＤＰをＡＴＰに
変換する酵素としては、酢酸キナーゼ、カルバミン酸キ
ナーゼ、クレアチンキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼな
ど多くのものが使用できるが、酵素の入手の容易さなど
を勘案すると、酢酸キナーゼを使用するのが最も有利で
ある。
変換する酵素としては、酢酸キナーゼ、カルバミン酸キ
ナーゼ、クレアチンキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼな
ど多くのものが使用できるが、酵素の入手の容易さなど
を勘案すると、酢酸キナーゼを使用するのが最も有利で
ある。
【００１２】またＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素として
は，エシエリキア・コリ由来の酵素、酵母由来の酵素、
バチルス属やサーマス属などの耐熱性細菌由来の酵素な
どを具体例としてあげることができる。
は，エシエリキア・コリ由来の酵素、酵母由来の酵素、
バチルス属やサーマス属などの耐熱性細菌由来の酵素な
どを具体例としてあげることができる。
【００１３】エシエリキア・コリ、酵母、バチルス属や
サーマス属等の培養は周知の方法で行うことができる。
本発明における細菌を培養するに際して用いられる栄養
培地に関しては，炭素源として，例えば，グルコース，
シュークロース，フルクトース，殿粉加水分解物，糖
密，亜硫酸パルプ廃液の糖類，酢酸，乳酸等の有機酸
類，さらには使用する細菌が資化しうるアルコール類，
油脂，脂肪酸およびグリセリン等が使用でき，窒素源と
して，例えば，硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，
リン酸アンモニウム，アンモニア，アミノ酸，ペプト
ン，肉エキス，酵母エキス等の無機又は有機物が使用で
きる。さらに無機塩類として，例えば，カリウム，ナト
リウム，リン酸，亜鉛，鉄，マグネシウム，マンガン，
銅，カルシウム，コバルト等の各塩類，必要に応じて微
量金属塩，コーンステイープリカー，ビタミン類，核酸
等を使用してもよく，細菌の一般的栄養培地が使用でき
る。これらの培地を用いて，細菌を１０〜８０℃で，２
〜６時間，好気的に培養すればよい。
サーマス属等の培養は周知の方法で行うことができる。
本発明における細菌を培養するに際して用いられる栄養
培地に関しては，炭素源として，例えば，グルコース，
シュークロース，フルクトース，殿粉加水分解物，糖
密，亜硫酸パルプ廃液の糖類，酢酸，乳酸等の有機酸
類，さらには使用する細菌が資化しうるアルコール類，
油脂，脂肪酸およびグリセリン等が使用でき，窒素源と
して，例えば，硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，
リン酸アンモニウム，アンモニア，アミノ酸，ペプト
ン，肉エキス，酵母エキス等の無機又は有機物が使用で
きる。さらに無機塩類として，例えば，カリウム，ナト
リウム，リン酸，亜鉛，鉄，マグネシウム，マンガン，
銅，カルシウム，コバルト等の各塩類，必要に応じて微
量金属塩，コーンステイープリカー，ビタミン類，核酸
等を使用してもよく，細菌の一般的栄養培地が使用でき
る。これらの培地を用いて，細菌を１０〜８０℃で，２
〜６時間，好気的に培養すればよい。
【００１４】これらの菌体から上記の三種の酵素を得る
ためには，例えば，先ず培養物から菌体を集菌したの
ち，ホモジナイザー，ブレンダー，マントンゴーリン，
ダイノミル，フレンチプレス，超音波処理，凍結融解，
リゾチーム処理等により細胞を破砕して得ることが出来
る。次に上記細胞破砕液（細胞抽出液）にカチオン系高
分子凝集剤を添加して，細胞破砕片及び核酸を沈澱させ
る。
ためには，例えば，先ず培養物から菌体を集菌したの
ち，ホモジナイザー，ブレンダー，マントンゴーリン，
ダイノミル，フレンチプレス，超音波処理，凍結融解，
リゾチーム処理等により細胞を破砕して得ることが出来
る。次に上記細胞破砕液（細胞抽出液）にカチオン系高
分子凝集剤を添加して，細胞破砕片及び核酸を沈澱させ
る。
【００１５】ここでカチオン系高分子凝集剤としては，
例えば，ポリアミノアルキルメタアクリレート類，ポリ
アミノアルキルメタアクリレートとアクリルアミドの共
重合物類，ポリアクリルアミドのマンニッヒ変性物類，
ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類，ポリビニルイ
ミダゾリン類，ポリアクリルアミド類，アミン系重縮合
物類などがあげられる。その際の高分子凝集剤の添加量
としては，凝集剤の種類によって異なるが，破砕した微
生物の乾燥重量１００重量部に対し１〜４０重量部が好
ましい。このカチオン系高分子凝集剤を予め水に溶解し
た後，細胞破砕液に添加して１０分間から２４時間撹拌
する。
例えば，ポリアミノアルキルメタアクリレート類，ポリ
アミノアルキルメタアクリレートとアクリルアミドの共
重合物類，ポリアクリルアミドのマンニッヒ変性物類，
ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類，ポリビニルイ
ミダゾリン類，ポリアクリルアミド類，アミン系重縮合
物類などがあげられる。その際の高分子凝集剤の添加量
としては，凝集剤の種類によって異なるが，破砕した微
生物の乾燥重量１００重量部に対し１〜４０重量部が好
ましい。このカチオン系高分子凝集剤を予め水に溶解し
た後，細胞破砕液に添加して１０分間から２４時間撹拌
する。
【００１６】また，ｐＨの調整が必要な場合には，適宜
１０〜２００ｍＭになるように緩衝液を加えることもで
きるし，タンパク質の安定化のために，グルコースを細
胞破砕液１００重量部に対し，１〜５０重量部添加して
もよい。次いで沈澱させた細胞破砕片及び核酸を分離す
る。そのためには，例えば，静置するか，遠心分離する
か，あるいは濾過するかして行えばよい。これらの操作
により，粗酵素標品を得ることができる。さらに高度に
精製された酵素標品を得るには，ゲル濾過クロマトグラ
フィー，疎水性クロマトグラフィー，アフィニティーク
ロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィ等の各
種クロマトグラフィーを用いることができる。
１０〜２００ｍＭになるように緩衝液を加えることもで
きるし，タンパク質の安定化のために，グルコースを細
胞破砕液１００重量部に対し，１〜５０重量部添加して
もよい。次いで沈澱させた細胞破砕片及び核酸を分離す
る。そのためには，例えば，静置するか，遠心分離する
か，あるいは濾過するかして行えばよい。これらの操作
により，粗酵素標品を得ることができる。さらに高度に
精製された酵素標品を得るには，ゲル濾過クロマトグラ
フィー，疎水性クロマトグラフィー，アフィニティーク
ロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィ等の各
種クロマトグラフィーを用いることができる。
【００１７】第一発明において，ＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又
はそれらの誘導体の製造に際して，たとえば同一の反応
器の中に緩衝液，ＡＴＰ又はその誘導体、硫酸イオン
（ＳＯ4 2- ），マグネシウムイオン（Ｍｇ2+），ＡＴＰ
スルフリラーゼ及びＡｐ4 Ａホスホリラーゼを共存させ
て反応させればよく，また，反応をスムーズに進めるた
めに，必要に応じて，ＰＰａｓｅを共存させることがで
きる。
はそれらの誘導体の製造に際して，たとえば同一の反応
器の中に緩衝液，ＡＴＰ又はその誘導体、硫酸イオン
（ＳＯ4 2- ），マグネシウムイオン（Ｍｇ2+），ＡＴＰ
スルフリラーゼ及びＡｐ4 Ａホスホリラーゼを共存させ
て反応させればよく，また，反応をスムーズに進めるた
めに，必要に応じて，ＰＰａｓｅを共存させることがで
きる。
【００１８】第二発明において，ＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又
はそれらの誘導体の製造に際して，たとえば同一の反応
器の中に緩衝液，ＡＴＰ又はその誘導体，硫酸イオン，
マグネシウムイオン，ＡＴＰスルフリラーゼ，Ａｐ4 Ａ
ホスホリラーゼ，ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素及びリ
ン酸供与体を共存させて反応させればよく，また，反応
をスムーズに進めるために，必要に応じてＰＰａｓｅを
共存させることができる。
はそれらの誘導体の製造に際して，たとえば同一の反応
器の中に緩衝液，ＡＴＰ又はその誘導体，硫酸イオン，
マグネシウムイオン，ＡＴＰスルフリラーゼ，Ａｐ4 Ａ
ホスホリラーゼ，ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素及びリ
ン酸供与体を共存させて反応させればよく，また，反応
をスムーズに進めるために，必要に応じてＰＰａｓｅを
共存させることができる。
【００１９】このときに用いられる反応器としては、反
応をスムーズに進行させうるものであればいかなるもの
でもよく、各々の酵素量、基質液の濃度、ｐＨ及び供給
速度、反応温度などによって反応器の大きさ及び形状を
選定すればよい。その反応器の形状としては、例えば、
膜型の反応器、カラム型反応器を使用することができ
る。この中でも膜型反応器は、反応生成物が低分子であ
るので、特に有効に使用できる。この際、酵素は高分子
物質であるので、各酵素はそのまま反応器の中にとどま
った状態で使用することができる。
応をスムーズに進行させうるものであればいかなるもの
でもよく、各々の酵素量、基質液の濃度、ｐＨ及び供給
速度、反応温度などによって反応器の大きさ及び形状を
選定すればよい。その反応器の形状としては、例えば、
膜型の反応器、カラム型反応器を使用することができ
る。この中でも膜型反応器は、反応生成物が低分子であ
るので、特に有効に使用できる。この際、酵素は高分子
物質であるので、各酵素はそのまま反応器の中にとどま
った状態で使用することができる。
【００２０】また、カラム型反応器の場合には、使用す
る酵素を適当な担体、例えばセルロース、デキストラ
ン、アガロースなどのような多糖類の誘導体、ポリスチ
レン、エチレン−マレイン酸共重合体、架橋ポリアクリ
ルアミドなどのようなビニルポリマーの誘導体、Ｌ−ア
ラニン、Ｌ−グルタミン酸共重合体、ポリアスパラギン
酸などのようなポリアミノ酸又はアミドの誘導体、ガラ
ス、アルミナ、ヒドロキシアパタイトなどのような無機
物の誘導体などに結合、包括あるいは吸着させて、いわ
ゆる固定化酵素としてカラムに充填して使用すればよ
い。
る酵素を適当な担体、例えばセルロース、デキストラ
ン、アガロースなどのような多糖類の誘導体、ポリスチ
レン、エチレン−マレイン酸共重合体、架橋ポリアクリ
ルアミドなどのようなビニルポリマーの誘導体、Ｌ−ア
ラニン、Ｌ−グルタミン酸共重合体、ポリアスパラギン
酸などのようなポリアミノ酸又はアミドの誘導体、ガラ
ス、アルミナ、ヒドロキシアパタイトなどのような無機
物の誘導体などに結合、包括あるいは吸着させて、いわ
ゆる固定化酵素としてカラムに充填して使用すればよ
い。
【００２１】上述の反応器は、連続的に操作することを
前提として説明したものであるが、このような思想に基
づいて他の反応器を用いることもできるし、場合によっ
ては、バッチ式の反応器を使用してバッチ式に操作して
反応させることもできる。
前提として説明したものであるが、このような思想に基
づいて他の反応器を用いることもできるし、場合によっ
ては、バッチ式の反応器を使用してバッチ式に操作して
反応させることもできる。
【００２２】次にバッチ式の反応器でＮｐｎＮ’を製造
する場合を例にとり、反応条件について説明すると，Ａ
ＴＰスルフリラーゼは０．００５ｕｎｉｔ／ｍｌ〜５０
００ｕｎｉｔ／ｍｌが適当である。Ａｐ4 Ａホスホリラ
ーゼはＡＴＰスルフリラーゼのｕｎｉｔ数に対して２倍
程度が好ましい。ＡＴＰ又はその誘導体は１０μ以上，
特に１ｍＭ以上，さらに１０ｍＭ以上，スルフェートは
１μＭ以上，特に１００μＭ以上，さらに１ｍＭ以上，
アセチルリン酸はＡＴＰ又はその誘導体の濃度に対して
１０ないし１／１０2 当量，特に２ないし１／１０当
量，さらに１ないし１／２当量の濃度で添加するのが望
ましく，その添加方法は特に限定されるものではなく，
反応スタート時に一括して添加してもよいし，分割して
添加してもよい。スルフェートとしては，例えば，硫酸
アンモニウム，硫酸マグネシウム，硫酸ナトリウム，硫
酸カリウム等が挙げられる。また，反応をスムーズに進
めるために，ＰＰａｓｅを添加したり，マグネシウムイ
オン，マンガンイオン，カルシウムイオン，コバルトイ
オン，カドミウムイオン等の金属イオンを添加すること
もできる。ＰＰａｓｅは０．０１ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１０
０ｕｎｉｔ／ｍｌが好ましい。さらに，ＡＤＰをＡＴＰ
に変換する酵素は１ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１００ｕｎｉｔ／
ｍｌが好ましい。
する場合を例にとり、反応条件について説明すると，Ａ
ＴＰスルフリラーゼは０．００５ｕｎｉｔ／ｍｌ〜５０
００ｕｎｉｔ／ｍｌが適当である。Ａｐ4 Ａホスホリラ
ーゼはＡＴＰスルフリラーゼのｕｎｉｔ数に対して２倍
程度が好ましい。ＡＴＰ又はその誘導体は１０μ以上，
特に１ｍＭ以上，さらに１０ｍＭ以上，スルフェートは
１μＭ以上，特に１００μＭ以上，さらに１ｍＭ以上，
アセチルリン酸はＡＴＰ又はその誘導体の濃度に対して
１０ないし１／１０2 当量，特に２ないし１／１０当
量，さらに１ないし１／２当量の濃度で添加するのが望
ましく，その添加方法は特に限定されるものではなく，
反応スタート時に一括して添加してもよいし，分割して
添加してもよい。スルフェートとしては，例えば，硫酸
アンモニウム，硫酸マグネシウム，硫酸ナトリウム，硫
酸カリウム等が挙げられる。また，反応をスムーズに進
めるために，ＰＰａｓｅを添加したり，マグネシウムイ
オン，マンガンイオン，カルシウムイオン，コバルトイ
オン，カドミウムイオン等の金属イオンを添加すること
もできる。ＰＰａｓｅは０．０１ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１０
０ｕｎｉｔ／ｍｌが好ましい。さらに，ＡＤＰをＡＴＰ
に変換する酵素は１ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１００ｕｎｉｔ／
ｍｌが好ましい。
【００２３】反応のｐＨとしては、おおむね中性付近、
すなわち、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜９の範囲
が使用され、緩衝液で調整することができる。この緩衝
液としては、これらのｐＨに適した通常のものを使用す
ることができる。また、反応の温度としては、酵素の失
活が起こらず、反応がスムーズに進行する範囲であれば
特に限定されるものではないが、２０℃から５０℃の範
囲が好ましい。
すなわち、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜９の範囲
が使用され、緩衝液で調整することができる。この緩衝
液としては、これらのｐＨに適した通常のものを使用す
ることができる。また、反応の温度としては、酵素の失
活が起こらず、反応がスムーズに進行する範囲であれば
特に限定されるものではないが、２０℃から５０℃の範
囲が好ましい。
【００２４】このようにした反応生成物をイオン交換ク
ロマトグラフィー等一般に広く用いられている方法で精
製して，ＮｐｎＮ’を単離すればよい。リン酸供与体と
してはアセチルリン酸が使用される。アセチルリン酸
は、アンモニウム塩、カリウム・リチウム塩、ナトリウ
ム塩などの塩として使用することができるが、入手のし
やすさから二ナトリウム塩を用いることが好ましい。ア
セチルリン酸はＡＴＰの濃度に対して１／１０ないし１
００倍当量、特に１ないし５０倍当量の濃度で用いるの
が好ましい。その添加方法は特に限定されるものではな
く、反応スタート時に一括して添加してもよいし、分割
して添加してもよい。
ロマトグラフィー等一般に広く用いられている方法で精
製して，ＮｐｎＮ’を単離すればよい。リン酸供与体と
してはアセチルリン酸が使用される。アセチルリン酸
は、アンモニウム塩、カリウム・リチウム塩、ナトリウ
ム塩などの塩として使用することができるが、入手のし
やすさから二ナトリウム塩を用いることが好ましい。ア
セチルリン酸はＡＴＰの濃度に対して１／１０ないし１
００倍当量、特に１ないし５０倍当量の濃度で用いるの
が好ましい。その添加方法は特に限定されるものではな
く、反応スタート時に一括して添加してもよいし、分割
して添加してもよい。
【００２５】
【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお，ＡＴＰスルフリラ−ゼ，Ａｐ4 Ａホスホリラ
ーゼの活性測定は以下の方法により測定した。
る。なお，ＡＴＰスルフリラ−ゼ，Ａｐ4 Ａホスホリラ
ーゼの活性測定は以下の方法により測定した。
【００２６】ＡＴＰスルフリラーゼの活性測定法 下に示す組成の反応溶液を３０℃に保ち、適量の酵素試
料液を加えて反応を開始した。１０分後に３Ｎの硫酸を
０．０５ｍｌ加え反応を停止した。反応終了後のリン酸
濃度を、和光純薬工業株式会社製無機リン酸測定試薬ホ
スファＣ―テストワコーにより定量した。１分間に２μ
ｍｏｌのリン酸、すなわち１μｍｏｌのピロリン酸が生
成するＡＴＰスルフリラーゼの量を１ｕｎｉｔとした。 反応溶液組成（総量０．５ｍｌとする） トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム １０ｍＭ モリブデン酸ナトリウム １０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ピロフォスファターゼ ０．４ｕ／ｍｌ 試料（ＡＴＰスルフリラーゼ溶液） 適量
料液を加えて反応を開始した。１０分後に３Ｎの硫酸を
０．０５ｍｌ加え反応を停止した。反応終了後のリン酸
濃度を、和光純薬工業株式会社製無機リン酸測定試薬ホ
スファＣ―テストワコーにより定量した。１分間に２μ
ｍｏｌのリン酸、すなわち１μｍｏｌのピロリン酸が生
成するＡＴＰスルフリラーゼの量を１ｕｎｉｔとした。 反応溶液組成（総量０．５ｍｌとする） トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム １０ｍＭ モリブデン酸ナトリウム １０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ピロフォスファターゼ ０．４ｕ／ｍｌ 試料（ＡＴＰスルフリラーゼ溶液） 適量
【００２７】Ａｐ4 Ａホスホリラーゼの活性測定法 下に示す組成の反応溶液を３０℃に保ち、適量の酵素試
料を加えて反応を開始した。１０分後に沸騰水浴中１分
間加熱し，反応を停止した。反応終了後のＡｐ4 Ａ濃度
を下に示すＨＰＬＣにより定量した。１分間に１μｍｏ
ｌのＡｐ4 Ａが分解するＡｐ4 Ａホスホリラーゼの量を
１ｕｎｉｔとした。 反応溶液組成（総量０．５ｍｌとする） トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム ５ｍＭ Ａｐ4 Ａ １ｍＭ 試料（Ａｐ4 Ａホスホリラーゼ溶液） 適量 リン酸１カリウム １００ｍＭ ＨＰＬＣ移動相 過塩素酸テトラブチルアンモニウム ３ｍＭ リン酸１カリウム ３０ｍＭ メタノール ２５ｖｏｌ％ 水 ７５ｖｏｌ％ ＨＰＬＣの流速は０．６ｍｌ／分，検出はＵＶの吸収
（λ＝２５４ｎｍ）を測定することにより行った。ま
た，カラムはノバパックＣ１８（ウオーターズ社製）カ
ラムを使用した。
料を加えて反応を開始した。１０分後に沸騰水浴中１分
間加熱し，反応を停止した。反応終了後のＡｐ4 Ａ濃度
を下に示すＨＰＬＣにより定量した。１分間に１μｍｏ
ｌのＡｐ4 Ａが分解するＡｐ4 Ａホスホリラーゼの量を
１ｕｎｉｔとした。 反応溶液組成（総量０．５ｍｌとする） トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム ５ｍＭ Ａｐ4 Ａ １ｍＭ 試料（Ａｐ4 Ａホスホリラーゼ溶液） 適量 リン酸１カリウム １００ｍＭ ＨＰＬＣ移動相 過塩素酸テトラブチルアンモニウム ３ｍＭ リン酸１カリウム ３０ｍＭ メタノール ２５ｖｏｌ％ 水 ７５ｖｏｌ％ ＨＰＬＣの流速は０．６ｍｌ／分，検出はＵＶの吸収
（λ＝２５４ｎｍ）を測定することにより行った。ま
た，カラムはノバパックＣ１８（ウオーターズ社製）カ
ラムを使用した。
【００２８】参考例１ グルコース濃度１％，酵母エキス濃度１％，リン酸濃度
０．１％および若干のミネラル類を含んだ培地を殺菌し
た後，ｐＨを６．５に調整し，バチルス ステアロサー
モフィルス（ＮＣＡ１５０３株）を接種し，培養を行っ
た。６０℃で３時間培養後，培地中のグルコースが消費
されたことを確認し，遠心分離にて菌体をえた。
０．１％および若干のミネラル類を含んだ培地を殺菌し
た後，ｐＨを６．５に調整し，バチルス ステアロサー
モフィルス（ＮＣＡ１５０３株）を接種し，培養を行っ
た。６０℃で３時間培養後，培地中のグルコースが消費
されたことを確認し，遠心分離にて菌体をえた。
【００２９】参考例２ 参考例１により得られた湿菌体を凍結融解法で破砕した
のち，ポリアクリルアミド系の凝集剤を用いて除核酸を
おこなった。生じた沈澱を遠心分離により除去して，粗
酵素液を得た。あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカ
ラムに粗酵素液をアプライしたところ，ＡＴＰスルフリ
ラーゼが吸着されたので，同緩衝液で十分洗浄したの
ち，同緩衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウ
ムの直線濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回
収し，１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを加えた。この
活性画分を，１Ｍ硫酸アンモニウムを５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロ
ースカラムにアプライした。同緩衝液で十分洗浄したの
ち，５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
したフェニルセファロースカラムにアプライした。同緩
衝液で十分洗浄した後，５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で溶出した。得られた活性画分を回収し，濃
縮，透析後，５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で平衡化したマトレックスゲルブルーＡカラムにアプラ
イした。同緩衝液で十分洗浄した後，１Ｍ塩化カリウム
を含む同緩衝液で溶出した。活性画分を回収し，濃縮後
ポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ，単一なバ
ンドが得られた。酵素標品の比活性は，１１．１Ｕ／ｍ
ｇであった。
のち，ポリアクリルアミド系の凝集剤を用いて除核酸を
おこなった。生じた沈澱を遠心分離により除去して，粗
酵素液を得た。あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカ
ラムに粗酵素液をアプライしたところ，ＡＴＰスルフリ
ラーゼが吸着されたので，同緩衝液で十分洗浄したの
ち，同緩衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウ
ムの直線濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回
収し，１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを加えた。この
活性画分を，１Ｍ硫酸アンモニウムを５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロ
ースカラムにアプライした。同緩衝液で十分洗浄したの
ち，５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
したフェニルセファロースカラムにアプライした。同緩
衝液で十分洗浄した後，５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で溶出した。得られた活性画分を回収し，濃
縮，透析後，５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で平衡化したマトレックスゲルブルーＡカラムにアプラ
イした。同緩衝液で十分洗浄した後，１Ｍ塩化カリウム
を含む同緩衝液で溶出した。活性画分を回収し，濃縮後
ポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ，単一なバ
ンドが得られた。酵素標品の比活性は，１１．１Ｕ／ｍ
ｇであった。
【００３０】参考例３ グルコース濃度１％，酵母エキス濃度１％，リン酸濃度
０．１％および若干のミネラル類を含んだ培地を殺菌し
た後，ｐＨを７．２に調整し，サッカロマイセス・セル
ビシエ（ＩＦＯ１００８）を接種し，培養を行った。２
８℃で８時間培養後，遠心分離にて菌体をえた。
０．１％および若干のミネラル類を含んだ培地を殺菌し
た後，ｐＨを７．２に調整し，サッカロマイセス・セル
ビシエ（ＩＦＯ１００８）を接種し，培養を行った。２
８℃で８時間培養後，遠心分離にて菌体をえた。
【００３１】参考例４ 参考例３により得られた湿菌体をソニケーターにより破
砕したのち，ポリアクリルアミド系の凝集剤を用いて除
核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離により除去して，
粗酵素液を得た。あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカ
ラムに粗酵素液をアプライし，十分洗浄したのち，同緩
衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウムの直線
濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回収し，Ａ
ｐ4 Ａホスホリラーゼを得た。
砕したのち，ポリアクリルアミド系の凝集剤を用いて除
核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離により除去して，
粗酵素液を得た。あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカ
ラムに粗酵素液をアプライし，十分洗浄したのち，同緩
衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウムの直線
濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回収し，Ａ
ｐ4 Ａホスホリラーゼを得た。
【００３２】実施例１ 参考例２で得たＡＴＰスルフリラーゼ０．２５ｕｎｉｔ
／ｍｌ，参考例４で得たＡｐ4 Ａホスホリラーゼ０．５
ｕｎｉｔ／ｍｌを用いて，バッチ法でＡｐ4 Ａの合成を
行った。このとき，ＡＴＰ１５ｍＭ，硫酸マグネシウム
１０ｍＭ，ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭか
らなる反応液を３０℃で６時間反応させた。得られた反
応生成物を，Ａｐ4 Ａホスホリラーゼの活性測定法と同
じ条件でＨＰＬＣにより分析したところ，５．０ｍＭの
Ａｐ4 Ａが生成していた。反応生成物がＡｐ4 Ａである
ことをリン核磁気共鳴スペクトルにより同定した。
／ｍｌ，参考例４で得たＡｐ4 Ａホスホリラーゼ０．５
ｕｎｉｔ／ｍｌを用いて，バッチ法でＡｐ4 Ａの合成を
行った。このとき，ＡＴＰ１５ｍＭ，硫酸マグネシウム
１０ｍＭ，ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭか
らなる反応液を３０℃で６時間反応させた。得られた反
応生成物を，Ａｐ4 Ａホスホリラーゼの活性測定法と同
じ条件でＨＰＬＣにより分析したところ，５．０ｍＭの
Ａｐ4 Ａが生成していた。反応生成物がＡｐ4 Ａである
ことをリン核磁気共鳴スペクトルにより同定した。
【００３３】実施例２ 参考例２で得たＡＴＰスルフリラーゼ０．２５ｕｎｉｔ
／ｍｌ，参考例４で得たＡｐ4 Ａホスホリラーゼ０．５
ｕｎｉｔ／ｍｌを用いて，バッチ法でＡｐ4 Ａの合成を
行った。このとき，ＡＴＰ１５ｍＭ，硫酸マグネシウム
３０ｍＭ，ＰＰａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）
０．７１ｕｎｉｔ／ｍｌ，酢酸キナーゼ（ユニチカ社
製）０．００４ｕｎｉｔ／ｍｌ，ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）５０ｍＭからなる反応液にアセチルリン酸を
反応開始時に１ｌ当たり３．１ｍｌ添加し，１時間毎に
１ｌ当たり３．１ｍｌ追加しながら，３０℃で６時間反
応させた。得られた反応生成物を，Ａｐ4 Ａホスホリラ
ーゼの活性測定法と同じ条件でＨＰＬＣにより分析した
ところ，６．０ｍＭのＡｐ4 Ａが生成していた。反応生
成物がＡｐ4 Ａであることをリン核磁気共鳴スペクトル
により同定した。
／ｍｌ，参考例４で得たＡｐ4 Ａホスホリラーゼ０．５
ｕｎｉｔ／ｍｌを用いて，バッチ法でＡｐ4 Ａの合成を
行った。このとき，ＡＴＰ１５ｍＭ，硫酸マグネシウム
３０ｍＭ，ＰＰａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）
０．７１ｕｎｉｔ／ｍｌ，酢酸キナーゼ（ユニチカ社
製）０．００４ｕｎｉｔ／ｍｌ，ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）５０ｍＭからなる反応液にアセチルリン酸を
反応開始時に１ｌ当たり３．１ｍｌ添加し，１時間毎に
１ｌ当たり３．１ｍｌ追加しながら，３０℃で６時間反
応させた。得られた反応生成物を，Ａｐ4 Ａホスホリラ
ーゼの活性測定法と同じ条件でＨＰＬＣにより分析した
ところ，６．０ｍＭのＡｐ4 Ａが生成していた。反応生
成物がＡｐ4 Ａであることをリン核磁気共鳴スペクトル
により同定した。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、高純度でかつ高収率の
ＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体が製造でき、ま
た容易にこれを単離精製できるので、工業的に有利にＮ
ｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体の製造ができる。
ＮｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体が製造でき、ま
た容易にこれを単離精製できるので、工業的に有利にＮ
ｐｎＮ’，ｐｎＮ又はそれらの誘導体の製造ができる。
Claims (2)
- 【請求項１】 アデノシン−５’−三リン酸，ポリリン
酸又はそれらの誘導体およびスルフェートを反応基質と
して用い，アデノシン−５’−三リン酸スルフリラーゼ
およびジアデノシン四リン酸ホスホリラーゼの二種の酵
素を触媒とする二段階反応によりジヌクレオシドポリリ
ン酸，ヌクレオシドポリリン酸又はそれらの誘導体を生
成させることを特徴とするジヌクレオシドポリリン酸，
ヌクレオシドポリリン酸又はそれらの誘導体の製造方
法。 - 【請求項２】 アデノシン−５’−二リン酸をアデノシ
ン−５’−三リン酸に変換する酵素の存在下に，アデノ
シン−５’−三リン酸，ポリリン酸又はそれらの誘導体
およびスルフェートを反応基質として用い，アデノシン
−５’−三リン酸スルフリラーゼおよびジアデノシン四
リン酸ホスホリラーゼの二種の酵素を触媒とする二段階
反応によりジヌクレオシドポリリン酸，ヌクレオシドポ
リリン酸又はそれらの誘導体を生成せしめることを特徴
とするジヌクレオシドポリリン酸，ヌクレオシドポリリ
ン酸又はそれらの誘導体の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04125668A JP3080771B2 (ja) | 1992-04-17 | 1992-04-17 | ジヌクレオシドポリリン酸又はその誘導体の製造方法 |
| US08/045,877 US5306629A (en) | 1992-04-17 | 1993-04-15 | Method for producing dinucleoside polyphosphate, nucleoside polyphosphate or derivatives thereof |
| EP93106234A EP0566140B1 (en) | 1992-04-17 | 1993-04-16 | Method for producing dinucleoside polyphosphate, nucleoside polyphosphate or derivatives thereof |
| DE69319369T DE69319369T2 (de) | 1992-04-17 | 1993-04-16 | Verfahren zur Herstellung von Dinukleosid-Polyphosphat, Nukleosid-Polyphosphat oder Derivate davon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04125668A JP3080771B2 (ja) | 1992-04-17 | 1992-04-17 | ジヌクレオシドポリリン酸又はその誘導体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292988A true JPH05292988A (ja) | 1993-11-09 |
| JP3080771B2 JP3080771B2 (ja) | 2000-08-28 |
Family
ID=14915704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04125668A Expired - Fee Related JP3080771B2 (ja) | 1992-04-17 | 1992-04-17 | ジヌクレオシドポリリン酸又はその誘導体の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5306629A (ja) |
| EP (1) | EP0566140B1 (ja) |
| JP (1) | JP3080771B2 (ja) |
| DE (1) | DE69319369T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001247464A (ja) * | 2000-03-08 | 2001-09-11 | Unitika Ltd | ジヌクレオシドポリりん酸の経皮吸収方法 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2028119C (en) * | 1989-02-28 | 2000-05-16 | Hiroshi Yamauchi | Process for producing nucleosides |
| JPH0812581A (ja) * | 1994-06-30 | 1996-01-16 | Fujirebio Inc | 虚血性心疾患治療剤 |
| GB9620209D0 (en) * | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
| GB9626815D0 (en) | 1996-12-23 | 1997-02-12 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
| KR102504764B1 (ko) * | 2017-06-21 | 2023-03-02 | 주식회사 종근당 | 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트 화합물의 제조방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4971903A (en) * | 1988-03-25 | 1990-11-20 | Edward Hyman | Pyrophosphate-based method and apparatus for sequencing nucleic acids |
-
1992
- 1992-04-17 JP JP04125668A patent/JP3080771B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-04-15 US US08/045,877 patent/US5306629A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-04-16 DE DE69319369T patent/DE69319369T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-04-16 EP EP93106234A patent/EP0566140B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001247464A (ja) * | 2000-03-08 | 2001-09-11 | Unitika Ltd | ジヌクレオシドポリりん酸の経皮吸収方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69319369T2 (de) | 1998-12-17 |
| DE69319369D1 (de) | 1998-08-06 |
| EP0566140A3 (en) | 1994-11-30 |
| EP0566140B1 (en) | 1998-07-01 |
| US5306629A (en) | 1994-04-26 |
| JP3080771B2 (ja) | 2000-08-28 |
| EP0566140A2 (en) | 1993-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chenault et al. | Cofactor regeneration for enzyme-catalysed synthesis | |
| WO2011110056A1 (zh) | 一种微生物生产环腺苷酸的方法 | |
| CN112961890A (zh) | 烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法 | |
| Esipov et al. | A cascade of thermophilic enzymes as an approach to the synthesis of modified nucleotides | |
| CN102605027A (zh) | 一种氧化型辅酶ii的酶催化制备方法 | |
| Taran et al. | Enzymatic transglycosylation of natural and modified nucleosides by immobilized thermostable nucleoside phosphorylases from Geobacillus stearothermophilus | |
| JP3080771B2 (ja) | ジヌクレオシドポリリン酸又はその誘導体の製造方法 | |
| EP0385486B1 (en) | Process for producing fructose-1,6-diphosphate | |
| JP3098591B2 (ja) | ３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸の製造方法 | |
| JPH0573392B2 (ja) | ||
| US4882276A (en) | Process for producing physiologically active substance by multienzyme process | |
| CN115433750A (zh) | 一种烟酰胺单核苷酸的制备方法 | |
| Orengo et al. | Regulation of a thermostable pyrimidine ribonucleoside kinase by cytidine triphosphate | |
| JP2001269192A (ja) | グアノシン類及びその中間体の製造方法 | |
| JPH01320995A (ja) | ヌクレオシド化合物の製造方法 | |
| JP3135649B2 (ja) | ジアデノシンポリリン酸の製造方法 | |
| Bochkov et al. | Hydrolytic approach for production of deoxyribonucleoside-and ribonucleoside-5′-monophosphates and enzymatic synthesis of their polyphosphates | |
| Kimura et al. | The conversion of native adenylylated glutamine synthetase into phosphotyrosine enzyme by micrococcal nuclease | |
| JPH0254077B2 (ja) | ||
| Čukelj | Immobilization of a whole cell catalyst for cellodextrin production | |
| JPH05137572A (ja) | 耐熱性アデノシン−５’−３リン酸スルフリラーゼ及びその製造法 | |
| JPH10117793A (ja) | アデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその誘導体の製造方法 | |
| Heppel | [14] Adenylic acid ribosidase: Adenosine 5′-monophosphate→(ATP) Adenine+ ribose 5-phosphate | |
| JPH0157959B2 (ja) | ||
| JPS58146286A (ja) | 含セレンアミノ酸の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |