JPH05292979A - 保護ペプチド融合インスリン様成長因子ｉ遺伝子 - Google Patents
保護ペプチド融合インスリン様成長因子ｉ遺伝子Info
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- JPH05292979A JPH05292979A JP4153492A JP15349292A JPH05292979A JP H05292979 A JPH05292979 A JP H05292979A JP 4153492 A JP4153492 A JP 4153492A JP 15349292 A JP15349292 A JP 15349292A JP H05292979 A JPH05292979 A JP H05292979A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメチオ
ニンを有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプチド
の該メチオニンを介してＩＧＦ−Ｉと融合している保護
ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉをコードしている遺伝子，それ
を含む発現プラスミド及びそれで形質転換した形質転換
体。 【効果】 これらを利用することによりＩＧＦ−Ｉ生産
の前駆体として有用な保護ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉの生
産ができる。
ニンを有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプチド
の該メチオニンを介してＩＧＦ−Ｉと融合している保護
ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉをコードしている遺伝子，それ
を含む発現プラスミド及びそれで形質転換した形質転換
体。 【効果】 これらを利用することによりＩＧＦ−Ｉ生産
の前駆体として有用な保護ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉの生
産ができる。
Description
【０００１】この発明はヒトインスリン様成長因子Ｉ
（以下ＩＧＦ−Ｉと略称する）の製造に関して用いられ
る保護ペプチド融合インスリン様成長因子Ｉをコードし
ている遺伝子、それを含むプラスミド及びそのプラスミ
ドで形質転換された形質転換体に関する。ところで、ヒ
トインスリン様成長因子Ｉは、ある種のホルモンにより
刺激されたヒトの組織，肝および腎において主として合
成される蛋白ホルモンであって、ヒト血清中に見出され
る。ＩＧＦ−Ｉは、インスリン様の活性および軟骨によ
る硫酸塩取込みを刺激する活性を有するとともに細胞内
での蛋白およびＤＮＡの合成を増強することが、知られ
ている。従って、それは成長の促進に有用であり、また
糖尿病の臨床治療においても有用でありうる。ＩＧＦ−
Ｉはヒト血清中に分泌される量がわずかであり、数トン
のヒト血清から数ｍｇしか単離できない。なお、ＩＧＦ
−Ｉ産生細胞から純粋な形で単離され、ＩＧＦ−Ｉが上
記の生物学的性質を有することが見出され、そのアミノ
酸配列が文献に報告されている。しかしながら、ＩＧＦ
−Ｉのより実行可能な商業的製造法が必要であり、かか
る必要性が本発明の完成に対する刺激となった。組換え
ＤＮＡ（遺伝子組換え）技術ならびに関連技術の適用
が、最も有効なＩＧＦ−Ｉの大量製造法となると考えら
れた。ＩＧＦ−Ｉは、次の配列の７０個のアミノ酸から
なることが知られている。
（以下ＩＧＦ−Ｉと略称する）の製造に関して用いられ
る保護ペプチド融合インスリン様成長因子Ｉをコードし
ている遺伝子、それを含むプラスミド及びそのプラスミ
ドで形質転換された形質転換体に関する。ところで、ヒ
トインスリン様成長因子Ｉは、ある種のホルモンにより
刺激されたヒトの組織，肝および腎において主として合
成される蛋白ホルモンであって、ヒト血清中に見出され
る。ＩＧＦ−Ｉは、インスリン様の活性および軟骨によ
る硫酸塩取込みを刺激する活性を有するとともに細胞内
での蛋白およびＤＮＡの合成を増強することが、知られ
ている。従って、それは成長の促進に有用であり、また
糖尿病の臨床治療においても有用でありうる。ＩＧＦ−
Ｉはヒト血清中に分泌される量がわずかであり、数トン
のヒト血清から数ｍｇしか単離できない。なお、ＩＧＦ
−Ｉ産生細胞から純粋な形で単離され、ＩＧＦ−Ｉが上
記の生物学的性質を有することが見出され、そのアミノ
酸配列が文献に報告されている。しかしながら、ＩＧＦ
−Ｉのより実行可能な商業的製造法が必要であり、かか
る必要性が本発明の完成に対する刺激となった。組換え
ＤＮＡ（遺伝子組換え）技術ならびに関連技術の適用
が、最も有効なＩＧＦ−Ｉの大量製造法となると考えら
れた。ＩＧＦ−Ｉは、次の配列の７０個のアミノ酸から
なることが知られている。
【化２】
【０００２】この発明の発明者らは、以下の諸必須工程
を用いて大量のＩＧＦ−Ｉを製造することに成功した。 工程１ ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を製造するプロセス。こ
のプロセスに続いて、保護ペプチドをコードする遺伝子
を、ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子（以下、ＩＧＦ−Ｉ
遺伝子と呼ぶ）と、該ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にリンカ
ーを用いるかまたは用いないで連結することからなると
ころの、保護ペプチドと融合したＩＧＦ−Ｉ（以下、融
合ＩＧＦ−Ｉと呼ぶ）をコードする遺伝子を製造するプ
ロセスを設ける。適当な「リンカー」には、ＩＧＦ−Ｉ
遺伝子の上流に保護ペプチドを連結するための適当な制
限酵素認識部位をもち、数個のアミノ酸をコードする遺
伝子が包含され得て、「リンカー」自身が該保護ペプチ
ドを構成する。とくに好ましい「リンカー」は後記の実
施例中で例示されているごときものである。適当な「融
合ＩＧＦ−Ｉ、すなわち保護ペプチドと融合したＩＧＦ
−Ｉ」は、後記の実施例において説明，例示されるごと
きものである。
を用いて大量のＩＧＦ−Ｉを製造することに成功した。 工程１ ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を製造するプロセス。こ
のプロセスに続いて、保護ペプチドをコードする遺伝子
を、ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子（以下、ＩＧＦ−Ｉ
遺伝子と呼ぶ）と、該ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にリンカ
ーを用いるかまたは用いないで連結することからなると
ころの、保護ペプチドと融合したＩＧＦ−Ｉ（以下、融
合ＩＧＦ−Ｉと呼ぶ）をコードする遺伝子を製造するプ
ロセスを設ける。適当な「リンカー」には、ＩＧＦ−Ｉ
遺伝子の上流に保護ペプチドを連結するための適当な制
限酵素認識部位をもち、数個のアミノ酸をコードする遺
伝子が包含され得て、「リンカー」自身が該保護ペプチ
ドを構成する。とくに好ましい「リンカー」は後記の実
施例中で例示されているごときものである。適当な「融
合ＩＧＦ−Ｉ、すなわち保護ペプチドと融合したＩＧＦ
−Ｉ」は、後記の実施例において説明，例示されるごと
きものである。
【０００３】工程２ プロモーター遺伝子および融合ＩＧＦ−Ｉをコードする
遺伝子をプラスミド中に挿入することからなる発現ベク
ター製造プロセス。とくに適当な「発現ベクター」に
は、プラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐなどが含まれう
る。とくに適当な「プラスミド」には、ｐＢＲ３２２な
どが含まれる。 工程３ 前記発現ベクターで宿主生物を形質転換することからな
る形質転換体製造プロセス。適当な「宿主生物」には、
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）（たとえばエシェリキア・コリＨＢ１０１など）な
どが含まれる。
遺伝子をプラスミド中に挿入することからなる発現ベク
ター製造プロセス。とくに適当な「発現ベクター」に
は、プラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐなどが含まれう
る。とくに適当な「プラスミド」には、ｐＢＲ３２２な
どが含まれる。 工程３ 前記発現ベクターで宿主生物を形質転換することからな
る形質転換体製造プロセス。適当な「宿主生物」には、
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）（たとえばエシェリキア・コリＨＢ１０１など）な
どが含まれる。
【０００４】工程４ 前記の形質転換体を適当な培地中で培養することからな
る融合ＩＧＦ−Ｉ製造プロセス。 工程５ 宿主生物の細胞から融合ＩＧＦ−Ｉを単離するプロセ
ス。 工程６ 前記融合ＩＧＦ−Ｉを保護ペプチド脱離反応に付すこと
からなるＩＧＦ−Ｉ製造プロセス。
る融合ＩＧＦ−Ｉ製造プロセス。 工程５ 宿主生物の細胞から融合ＩＧＦ−Ｉを単離するプロセ
ス。 工程６ 前記融合ＩＧＦ−Ｉを保護ペプチド脱離反応に付すこと
からなるＩＧＦ−Ｉ製造プロセス。
【０００５】「融合ＩＧＦ−Ｉ、すなわち保護ペプチド
と融合したＩＧＦ−Ｉ」なる表現における「保護ペプチ
ド」は、宿主生物細胞中でのプロテアーゼによる分解に
対してＩＧＦ−Ｉを保護するために使用され、該融合Ｉ
ＧＦ−Ｉの脱離反応によって除去される。すなわち、該
融合ＩＧＦ−Ｉは、脱離反応によってＩＧＦ−Ｉを調製
するための中間体であり、従って該保護ペプチドは、天
然または合成の蛋白、天然または合成のペプチド、ある
いはそれらの断片から誘導された任意の脱離可能な保護
ペプチドである。適当な「融合ＩＧＦ−Ｉ」は、蛋白ペ
プチドのメチオニンを介してその蛋白ペプチドと融合し
たＩＧＦ−Ｉである。この脱離反応に使用される適当な
試薬は、臭化シアンであり、この工程では、蛋白ペプチ
ドがそれのメチオニンを介してＩＧＦ−Ｉと融合してい
る融合ＩＧＦ−Ｉは、臭化シアンを用いる脱離反応によ
って高収率でＩＧＦ−Ｉに転化できる。本脱離反応は、
反応に悪影響を及ぼさない通常の溶媒中で緩和な条件下
に実施できる。
と融合したＩＧＦ−Ｉ」なる表現における「保護ペプチ
ド」は、宿主生物細胞中でのプロテアーゼによる分解に
対してＩＧＦ−Ｉを保護するために使用され、該融合Ｉ
ＧＦ−Ｉの脱離反応によって除去される。すなわち、該
融合ＩＧＦ−Ｉは、脱離反応によってＩＧＦ−Ｉを調製
するための中間体であり、従って該保護ペプチドは、天
然または合成の蛋白、天然または合成のペプチド、ある
いはそれらの断片から誘導された任意の脱離可能な保護
ペプチドである。適当な「融合ＩＧＦ−Ｉ」は、蛋白ペ
プチドのメチオニンを介してその蛋白ペプチドと融合し
たＩＧＦ−Ｉである。この脱離反応に使用される適当な
試薬は、臭化シアンであり、この工程では、蛋白ペプチ
ドがそれのメチオニンを介してＩＧＦ−Ｉと融合してい
る融合ＩＧＦ−Ｉは、臭化シアンを用いる脱離反応によ
って高収率でＩＧＦ−Ｉに転化できる。本脱離反応は、
反応に悪影響を及ぼさない通常の溶媒中で緩和な条件下
に実施できる。
【０００６】上記ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列から、いく
つかの特定の非自明の基準に従って、対応するヌクレオ
チド配列を発明した。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、クローニン
グベクターとしての既知のプラスミドに挿入することに
よって、クローン化した。組換えプラスミドからＩＧＦ
−Ｉ遺伝子を切出し、つぎに、プロモーターによる制御
下でのＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現を極大ならしめるように
特にデザインされたプラスミド中にＩＧＦ−Ｉ遺伝子を
挿入した。さらに、保護ペプチドをコードする構造遺伝
子を前記ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にかつそれに隣接して
挿入した。
つかの特定の非自明の基準に従って、対応するヌクレオ
チド配列を発明した。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、クローニン
グベクターとしての既知のプラスミドに挿入することに
よって、クローン化した。組換えプラスミドからＩＧＦ
−Ｉ遺伝子を切出し、つぎに、プロモーターによる制御
下でのＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現を極大ならしめるように
特にデザインされたプラスミド中にＩＧＦ−Ｉ遺伝子を
挿入した。さらに、保護ペプチドをコードする構造遺伝
子を前記ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にかつそれに隣接して
挿入した。
【０００７】以下に、本発明をより詳しく説明するが、
本発明はそれらに限定されるものではない。 ［１］ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の調製とクローニング： （１） ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の調製：遺伝暗号の多様性の
ため、上記アミノ酸配列から、ＩＧＦ−Ｉをコードする
多数のヌクレオチド配列を予言することが可能である。
多数の可能性のうちから最適の配列を本発明に従って決
定するに当って、いくつかの自明でない基準に従った。
まず、使用する予定の宿主生物に受容れられうるトリヌ
クレオチドコドンを使用すべきである。第二に、その配
列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿入できるよ
う、分子の末端に種々の制限酵素認識部位をもつことが
望ましい。さらに、周知のクローニングベクターの使用
が可能となるような部位を選択するようにすべきであ
る。第三に、合成が不必要に複雑であってはならず、ま
た、遺伝子の組立てを容易にすべく、誤まった交差ハイ
ブリッド化を極少にして、不可逆的なオフダイアゴナル
（ｏｆｆ−ｄｉａｇｏｎａｌ）な相互反応をできるだけ
避けるようにすべきである。
本発明はそれらに限定されるものではない。 ［１］ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の調製とクローニング： （１） ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の調製：遺伝暗号の多様性の
ため、上記アミノ酸配列から、ＩＧＦ−Ｉをコードする
多数のヌクレオチド配列を予言することが可能である。
多数の可能性のうちから最適の配列を本発明に従って決
定するに当って、いくつかの自明でない基準に従った。
まず、使用する予定の宿主生物に受容れられうるトリヌ
クレオチドコドンを使用すべきである。第二に、その配
列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿入できるよ
う、分子の末端に種々の制限酵素認識部位をもつことが
望ましい。さらに、周知のクローニングベクターの使用
が可能となるような部位を選択するようにすべきであ
る。第三に、合成が不必要に複雑であってはならず、ま
た、遺伝子の組立てを容易にすべく、誤まった交差ハイ
ブリッド化を極少にして、不可逆的なオフダイアゴナル
（ｏｆｆ−ｄｉａｇｏｎａｌ）な相互反応をできるだけ
避けるようにすべきである。
【０００８】「ＩＧＦ−Ｉ遺伝子部分をコードするため
に選んだ好ましい配列を一例を以下に示すことができ
る：
に選んだ好ましい配列を一例を以下に示すことができ
る：
【化３】
【０００９】この明細書における配列の表示において、
Ａ，Ｇ，ＣおよびＴは、それぞれ次の式を意味する：
Ａ，Ｇ，ＣおよびＴは、それぞれ次の式を意味する：
【化４】
【００１０】また、５’−末端のＡ，Ｇ，ＣおよびＴ
は、それぞれ次式を意味する：
は、それぞれ次式を意味する：
【化５】
【００１１】そして、３’−末端のＡ，Ｇ，ＣおよびＴ
は、それぞれ次式を意味する：
は、それぞれ次式を意味する：
【化６】
【００１２】上記の諸基準、とくに上記第二の基準を考
慮に入れるとき、次の少しく長い配列を選択することが
できる。実際、この発明の適当な実施態様として、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を選択して、それぞれ５’
末端および３’末端に導入することができる。さらに、
メチオニンコドン（ＡＴＧ）を、ＩＧＦ−ＩのＮ末端ア
ミノ酸コドンの上流に、これに隣接して、挿入し、２種
の停止コドン（ＴＧＡおよびＴＡＧ）を、Ｃ末端コドン
の下流に、これに隣接して、挿入した。
慮に入れるとき、次の少しく長い配列を選択することが
できる。実際、この発明の適当な実施態様として、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を選択して、それぞれ５’
末端および３’末端に導入することができる。さらに、
メチオニンコドン（ＡＴＧ）を、ＩＧＦ−ＩのＮ末端ア
ミノ酸コドンの上流に、これに隣接して、挿入し、２種
の停止コドン（ＴＧＡおよびＴＡＧ）を、Ｃ末端コドン
の下流に、これに隣接して、挿入した。
【化７】
【００１３】本発明は、相当する多数のオリゴヌクレオ
チドブロックのハイブリッド化およびライゲーションか
らなることを特徴とする、前記のごとき遺伝子の製造方
法にも関するものである。 (ｉ) オリゴヌクレオチド類の合成：実際、３０種の合
成オリゴヌクレオチドを作成することによって、上記の
拡張された配列を有する分子を合成することとした。そ
れら合成オリゴヌクレオチドを所定の段階でハイブリッ
ド化し、ライゲートするとき、上記の二重鎖ヌクレオチ
ド配列を与えるものである。
チドブロックのハイブリッド化およびライゲーションか
らなることを特徴とする、前記のごとき遺伝子の製造方
法にも関するものである。 (ｉ) オリゴヌクレオチド類の合成：実際、３０種の合
成オリゴヌクレオチドを作成することによって、上記の
拡張された配列を有する分子を合成することとした。そ
れら合成オリゴヌクレオチドを所定の段階でハイブリッ
ド化し、ライゲートするとき、上記の二重鎖ヌクレオチ
ド配列を与えるものである。
【００１４】この明細書におけるオリゴヌクレオチド類
の合成に関する記載においては、次の略号を用いる。Ａ
ｐ，Ｇｐ，ＣｐおよびＴｐは、それぞれ次式を意味す
る：
の合成に関する記載においては、次の略号を用いる。Ａ
ｐ，Ｇｐ，ＣｐおよびＴｐは、それぞれ次式を意味す
る：
【化８】
【００１５】また、３’末端のＡ，Ｇ，ＣおよびＴは、
それぞれ次式を意味する：
それぞれ次式を意味する：
【化９】
【００１６】ＡBzｐｏ，ＧiBｐｏ，ＣBzｐｏ，Ｔｐｏお
よびAcＵｐｏは、それぞれ次式を意味する。
よびAcＵｐｏは、それぞれ次式を意味する。
【化１０】
【化１１】 ＤＭＴｒはジメトキシトリチルであり、Ｂはアデニニ
ル，グアニニル，シトシニルおよびチミニル（便宜上、
保護基は示さない）、Ｕはウラシルであり、Ａｃはアセ
チルであり、ｍは１または２なる整数であり、ｎは１〜
１２の整数である。
ル，グアニニル，シトシニルおよびチミニル（便宜上、
保護基は示さない）、Ｕはウラシルであり、Ａｃはアセ
チルであり、ｍは１または２なる整数であり、ｎは１〜
１２の整数である。
【００１７】オリゴヌクレオチド類は次の通りである： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧ
ｐＴＯＨ （Ａｌ） （２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２） （３） ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＧｐＴｐＧＯＨ（Ｂ１） （４） ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （Ｂ２） （５） ＨＯＣｐＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ （Ｃ１） （６） ＨＯＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡ
ｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ （Ｃ２） （７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ （Ｄ１） （８） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ （Ｄ２） （９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ （Ｅ１） （１０） ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ （Ｅ２） （１１） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐ
ＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｆ１） （１２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ （Ｆ２） （１３） ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐ
ＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ （Ｇ１） （１４） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ （Ｇ２） （１５） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ （Ｈ１） （１６） ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡＯＨ （Ｈ２） （１７） ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ （Ｉ１） （１８） ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ （Ｉ２） （１９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ （Ｊ１） （２０） ＨＯＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ （Ｊ２） （２１） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐ
ＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ （Ｋ１） （２２） ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｋ２） （２３） ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐ
ＣｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴＯＨ （Ｌ１） （２４） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｌ２） （２５） ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ （Ｍ１） （２６） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧＯＨ （Ｍ２） （２７） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡＯＨ （Ｎ１） （２８） ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｎ２） （２９） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （Ｏ１） （３０） ＨＯＧｐＡｏＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＣＯＨ （Ｏ２）
ｐＴＯＨ （Ａｌ） （２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２） （３） ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＧｐＴｐＧＯＨ（Ｂ１） （４） ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （Ｂ２） （５） ＨＯＣｐＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ （Ｃ１） （６） ＨＯＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡ
ｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ （Ｃ２） （７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ （Ｄ１） （８） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ （Ｄ２） （９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ （Ｅ１） （１０） ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ （Ｅ２） （１１） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐ
ＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｆ１） （１２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ （Ｆ２） （１３） ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐ
ＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ （Ｇ１） （１４） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ （Ｇ２） （１５） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ （Ｈ１） （１６） ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡＯＨ （Ｈ２） （１７） ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ （Ｉ１） （１８） ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ （Ｉ２） （１９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ （Ｊ１） （２０） ＨＯＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ （Ｊ２） （２１） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐ
ＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ （Ｋ１） （２２） ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｋ２） （２３） ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐ
ＣｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴＯＨ （Ｌ１） （２４） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｌ２） （２５） ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ （Ｍ１） （２６） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧＯＨ （Ｍ２） （２７） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡＯＨ （Ｎ１） （２８） ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｎ２） （２９） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （Ｏ１） （３０） ＨＯＧｐＡｏＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＣＯＨ （Ｏ２）
【００１８】その逐次カップリング反応を第１表に示
す。 第１表 逐次カップリング法によるオリゴヌクレオチド
の構築（その１）
す。 第１表 逐次カップリング法によるオリゴヌクレオチド
の構築（その１）
【化１２】 第１表 逐次カップリング法によるオリゴヌクレオチド
の構築（その２）
の構築（その２）
【化１３】 第１表 逐次カップリング法によるオリゴヌクレオチド
の構築（その３）
の構築（その３）
【化１４】 第１表 逐次カップリング法によるオリゴヌクレオチド
の構築（その４）
の構築（その４）
【化１５】 モノ（またはジ、あるいはトリ）マー（Ｉ）は、広瀬の
方法（Ｔ．Ｈｉｒｏｓｅ、蛋白質・核酸、酵素ＩＳＳ
Ｎ，２５，２２５，（１９８０）、日本で発行）によっ
て調製でき、カップリングはリン酸トリエステル法
［Ｒ．Ｃｒｅａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，８，２３３１（１９８０）およびＭ．
Ｌ．Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，１６９１（１９８１）］に
より、セルロース担体上で実施できる。
方法（Ｔ．Ｈｉｒｏｓｅ、蛋白質・核酸、酵素ＩＳＳ
Ｎ，２５，２２５，（１９８０）、日本で発行）によっ
て調製でき、カップリングはリン酸トリエステル法
［Ｒ．Ｃｒｅａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，８，２３３１（１９８０）およびＭ．
Ｌ．Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，１６９１（１９８１）］に
より、セルロース担体上で実施できる。
【００１９】とくに、実施例１に記載したヘキサデカヌ
クレオチドＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐ
ＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ１）の合成に関し
て、合成法を説明することとする。ヘキサデカヌクレオ
チドＧ１合成のフローチャートを第２表に示す。 第２表 ヘキサデカヌクレオチドＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ
（Ｇ１）の合成法
クレオチドＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐ
ＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ１）の合成に関し
て、合成法を説明することとする。ヘキサデカヌクレオ
チドＧ１合成のフローチャートを第２表に示す。 第２表 ヘキサデカヌクレオチドＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ
（Ｇ１）の合成法
【化１６】
【化１７】 （ｉ）化学合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド化と
ライゲーション
ライゲーション
【００２０】第１図に示した所望しない相互反応の可能
性を極小にするために、一連の工程においてオリゴヌク
レオチド類をハイブリッド化し、ライゲートする。ライ
ゲーションはＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われ
る。オリゴヌクレオチドＡ１，Ｂ１およびＡ２；Ｃ１，
Ｂ２およびＣ２；Ｄ１，Ｅ１およびＤ２；Ｆ１およびＦ
２；Ｇ１，Ｈ１およびＧ２；Ｉ１，Ｈ２およびＩ２；Ｊ
１，Ｋ１およびＪ２；Ｌ１，Ｋ２およびＬ２；Ｍ１，Ｎ
１およびＭ２ならびにＯ１，Ｎ２およびＯ２をハイブリ
ッド化し、ライゲートして、それぞれ相当するブロック
１〜１０を得た。この場合、オリゴヌクレオチドＡ１，
Ｂ１およびＡ２ならびにＯ１，Ｎ２およびＯ２からそれ
ぞれ得たブロック１および１０を互いにハイブリッド化
し、ライゲートして、ダイマーを形成させた。ブロック
２と３；４と５；６と７および８と９をハイブリッド化
し、ライゲートして、それぞれブロック１１，１２，１
３および１４を得た。さらに、ブロック１１と１２およ
び１３と１４をハイブリッド化しライゲートし、ブロッ
ク１５および１６を得た。ブロック１，１５，１６およ
び１０をハイブリッド化し、ライゲートし、かくして得
たライゲーション生成物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断して、目的とするポリヌクレオチドＩＧＦ−Ｉ
を得た。
性を極小にするために、一連の工程においてオリゴヌク
レオチド類をハイブリッド化し、ライゲートする。ライ
ゲーションはＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われ
る。オリゴヌクレオチドＡ１，Ｂ１およびＡ２；Ｃ１，
Ｂ２およびＣ２；Ｄ１，Ｅ１およびＤ２；Ｆ１およびＦ
２；Ｇ１，Ｈ１およびＧ２；Ｉ１，Ｈ２およびＩ２；Ｊ
１，Ｋ１およびＪ２；Ｌ１，Ｋ２およびＬ２；Ｍ１，Ｎ
１およびＭ２ならびにＯ１，Ｎ２およびＯ２をハイブリ
ッド化し、ライゲートして、それぞれ相当するブロック
１〜１０を得た。この場合、オリゴヌクレオチドＡ１，
Ｂ１およびＡ２ならびにＯ１，Ｎ２およびＯ２からそれ
ぞれ得たブロック１および１０を互いにハイブリッド化
し、ライゲートして、ダイマーを形成させた。ブロック
２と３；４と５；６と７および８と９をハイブリッド化
し、ライゲートして、それぞれブロック１１，１２，１
３および１４を得た。さらに、ブロック１１と１２およ
び１３と１４をハイブリッド化しライゲートし、ブロッ
ク１５および１６を得た。ブロック１，１５，１６およ
び１０をハイブリッド化し、ライゲートし、かくして得
たライゲーション生成物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断して、目的とするポリヌクレオチドＩＧＦ−Ｉ
を得た。
【００２１】（２） ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニン
グ：ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニングのため、これを、
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を挿入できる適当な酵素認識部位をも
つ適切なプラスミド、すなわちクローニングベクターに
挿入する。この発明の適当な一具体化例として、エシェ
リキア・コリ（以下Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のために合
成したＩＧＦ−ＩをＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド（た
とえばｐＢＲ３２２など）に挿入し、クローニングを行
った。たとえば、第２図に示された通りの、ＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩ部位を有するプラスミドｐＢＲ３２２
（商業的に入手可能）を使用した場合には、このプラス
ミドをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した。この場
合には、そのプラスミドは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断したときの長い方の断片上に、アンプシリン抵
抗性のコード（Ａｍｐで示す）を有し、テトラサイクリ
ン抵抗性のコード（Ｔｅｔで示す）は、ＢａｍＨＩ部位
切断の結果消失する。ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで切断し
たプラスミドｐＢＲ３２２の長い方の断片を電気泳動に
より精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて大過剰のＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子とハイブリッド化し、ライゲートした。か
くして得た混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
（ＡＴＣＣ ３３６９４）を形質転換した。得られたい
くつかのアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性
の形質転換体の一つからプラスミドを単離し、制限酵素
による消失および電気泳動によって、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子
を含有することを確認した。このプロセスを第２図に示
す。このようにして得たプラスミドをｐＳｄＭ１と名付
ける。
グ：ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニングのため、これを、
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を挿入できる適当な酵素認識部位をも
つ適切なプラスミド、すなわちクローニングベクターに
挿入する。この発明の適当な一具体化例として、エシェ
リキア・コリ（以下Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のために合
成したＩＧＦ−ＩをＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド（た
とえばｐＢＲ３２２など）に挿入し、クローニングを行
った。たとえば、第２図に示された通りの、ＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩ部位を有するプラスミドｐＢＲ３２２
（商業的に入手可能）を使用した場合には、このプラス
ミドをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した。この場
合には、そのプラスミドは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断したときの長い方の断片上に、アンプシリン抵
抗性のコード（Ａｍｐで示す）を有し、テトラサイクリ
ン抵抗性のコード（Ｔｅｔで示す）は、ＢａｍＨＩ部位
切断の結果消失する。ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで切断し
たプラスミドｐＢＲ３２２の長い方の断片を電気泳動に
より精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて大過剰のＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子とハイブリッド化し、ライゲートした。か
くして得た混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
（ＡＴＣＣ ３３６９４）を形質転換した。得られたい
くつかのアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性
の形質転換体の一つからプラスミドを単離し、制限酵素
による消失および電気泳動によって、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子
を含有することを確認した。このプロセスを第２図に示
す。このようにして得たプラスミドをｐＳｄＭ１と名付
ける。
【００２２】（３） プラスミドｐＳｄＭ１中のＩＧＦ
−Ｉ遺伝子の配列 マキサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法を使用できる。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の配列決定のため、
プラスミドｐＳｄＭ１をＥｃｏＲＩで消化し、つぎに、
α−32Ｐ−ＡＴＰの存在下にＡＭＶ逆転写酵素で処理し
た。32Ｐ標識線状プラスミドをＢａｍＨＩで消化して、
二つの断片（２２４ｂｐ，４．０ｋｂｐ）を得た。小さ
い方の断片（２２４ｂｐ）を通常のマキサム−ギルバー
ト法［Ａ．ＭａｘａｍとＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５６
０（１９７７）］により分析した。他方、プラスミドｐ
ＳｄＭ１をを先にＢａｍＨＩで消化し、次に上記の通り
にして32Ｐで標識した。線状プラスミドをＥｃｏＲＩで
消化して二つの断片（２２４ｂｐ，４．０ｋｂｐ）を得
た。小さい方の断片（２２４ｂｐ）をマキサム−ギルバ
ート法で分析した。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の両側から配列決
定を行った結果は、設計したＩＧＦ−Ｉ遺伝子と一致し
た。
−Ｉ遺伝子の配列 マキサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法を使用できる。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の配列決定のため、
プラスミドｐＳｄＭ１をＥｃｏＲＩで消化し、つぎに、
α−32Ｐ−ＡＴＰの存在下にＡＭＶ逆転写酵素で処理し
た。32Ｐ標識線状プラスミドをＢａｍＨＩで消化して、
二つの断片（２２４ｂｐ，４．０ｋｂｐ）を得た。小さ
い方の断片（２２４ｂｐ）を通常のマキサム−ギルバー
ト法［Ａ．ＭａｘａｍとＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５６
０（１９７７）］により分析した。他方、プラスミドｐ
ＳｄＭ１をを先にＢａｍＨＩで消化し、次に上記の通り
にして32Ｐで標識した。線状プラスミドをＥｃｏＲＩで
消化して二つの断片（２２４ｂｐ，４．０ｋｂｐ）を得
た。小さい方の断片（２２４ｂｐ）をマキサム−ギルバ
ート法で分析した。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の両側から配列決
定を行った結果は、設計したＩＧＦ−Ｉ遺伝子と一致し
た。
【００２３】［２］プロモーター遺伝子の調製とクロー
ニング：宿主生物から融合ＩＧＦ−Ｉを得るため、プロ
モーター遺伝子を設計した。かかる基準で得たプロモー
ター遺伝子を、それが融合ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝
子の上流にかつそれに隣接する位置をとるよう、プラス
ミド中に挿入する。この発明の適当な具体化例として、
合成のｔｒｐプロモーターＩ遺伝子またはｔｒｐプロモ
ーターＩＩ遺伝子を調製した。
ニング：宿主生物から融合ＩＧＦ−Ｉを得るため、プロ
モーター遺伝子を設計した。かかる基準で得たプロモー
ター遺伝子を、それが融合ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝
子の上流にかつそれに隣接する位置をとるよう、プラス
ミド中に挿入する。この発明の適当な具体化例として、
合成のｔｒｐプロモーターＩ遺伝子またはｔｒｐプロモ
ーターＩＩ遺伝子を調製した。
【００２４】（１） 合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子
の調製とクローニング：この発明の適当な具体化例とし
て、次のタイプの合成プロモーター（以下ｔｒｐプロモ
ーターＩと呼ぶ）を合成した。実際には、１４種の合成
オリゴヌクレオチドブロックを作成し、それぞれの一本
鎖が少くとも７塩基ずつ重なるように組立て、完全な二
本鎖ヌクレオチド配列を得ることによって、１０７ｂｐ
の分子を合成した。
の調製とクローニング：この発明の適当な具体化例とし
て、次のタイプの合成プロモーター（以下ｔｒｐプロモ
ーターＩと呼ぶ）を合成した。実際には、１４種の合成
オリゴヌクレオチドブロックを作成し、それぞれの一本
鎖が少くとも７塩基ずつ重なるように組立て、完全な二
本鎖ヌクレオチド配列を得ることによって、１０７ｂｐ
の分子を合成した。
【化１８】
【００２５】（ｉ） オリゴヌクレオチド類の合成：オ
リゴヌクレオチドブロック類は次の通りである： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ （Ａ） （２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ （Ｂ） （３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴ
ｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｃ） （４） ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｄ） （５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ （Ｅ） （６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ （Ｆ） （７） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ （Ｇ） （８） ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ （Ｈ） （９） ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡ
ｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｉ） （１０） ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ （Ｊ） （１１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ （Ｋ） （１２） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ （Ｌ） （１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ （Ｍ） （１４） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣＯＨ （Ｎ）
リゴヌクレオチドブロック類は次の通りである： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ （Ａ） （２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ （Ｂ） （３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴ
ｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｃ） （４） ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｄ） （５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ （Ｅ） （６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ （Ｆ） （７） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ （Ｇ） （８） ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ （Ｈ） （９） ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡ
ｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｉ） （１０） ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ （Ｊ） （１１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ （Ｋ） （１２） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ （Ｌ） （１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ （Ｍ） （１４） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣＯＨ （Ｎ）
【００２６】これらの合成法は、上記ヘキサヌクレオチ
ドＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐ
ＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ （Ｇ１）の合成を参照すれば
説明されよう。
ドＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐ
ＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ （Ｇ１）の合成を参照すれば
説明されよう。
【００２７】（ｉｉ） 化学合成オリゴヌクレオチドの
ライゲーション：オリゴヌクレオチド類を、第３図に示
したごとくＩＧＦ−Ｉ遺伝子の場合と同様の方法に従っ
て、ハイブリッド化し、ライゲートした。
ライゲーション：オリゴヌクレオチド類を、第３図に示
したごとくＩＧＦ−Ｉ遺伝子の場合と同様の方法に従っ
て、ハイブリッド化し、ライゲートした。
【００２８】（ｉｉｉ） 合成ｔｒｐプロモーターＩ遺
伝子の分子クローニング：合成ｔｒｐプロモーターＩ遺
伝子のクローニングのため、合成ｔｒｐプロモーターＩ
を挿入できる適当な酵素認識部位をもつ適当なプラスミ
ドに、合成ｔｒｐプロモーター酵素を挿入する。この発
明の好ましい一実施態様として、クローニングを、第４
図に示した通り、プラスミドｐＢＲ３２５（商業的に入
手できる）を用いて実施した。プラスミドｐＢＲ３２５
をＥｃｏＲＩで切断し、合成ｔｒｐプロモーターＩをそ
れに挿入した。このようにして得たプラスミドｐＳＴ−
１を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。
伝子の分子クローニング：合成ｔｒｐプロモーターＩ遺
伝子のクローニングのため、合成ｔｒｐプロモーターＩ
を挿入できる適当な酵素認識部位をもつ適当なプラスミ
ドに、合成ｔｒｐプロモーター酵素を挿入する。この発
明の好ましい一実施態様として、クローニングを、第４
図に示した通り、プラスミドｐＢＲ３２５（商業的に入
手できる）を用いて実施した。プラスミドｐＢＲ３２５
をＥｃｏＲＩで切断し、合成ｔｒｐプロモーターＩをそ
れに挿入した。このようにして得たプラスミドｐＳＴ−
１を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。
【００２９】（２） ｔｒｐプロモーターＩＩ遺伝子の
調製：上記ｔｒｐプロモーターＩをプラスミドに正しい
方向で挿入するため、ｔｒｐプロモーターＩのＥｃｏＲ
Ｉ部位の次にある長さの塩基対鎖をもち、３’末端にＢ
ａｍＨＩ部位をもつ、次のタイプの合成プロモーター
（以下ｔｒｐプロモーターＩＩと呼ぶ）を調製した。実
際には、２２種のオリゴヌクレオチドブロックを作成
し、それぞれの一本鎖が少くとも７塩基ずつ重なるよう
に組合せ、完全な二本鎖ヌクレオチド配列を得ることに
よって、１６３ｂｐの分子を合成することとした。
調製：上記ｔｒｐプロモーターＩをプラスミドに正しい
方向で挿入するため、ｔｒｐプロモーターＩのＥｃｏＲ
Ｉ部位の次にある長さの塩基対鎖をもち、３’末端にＢ
ａｍＨＩ部位をもつ、次のタイプの合成プロモーター
（以下ｔｒｐプロモーターＩＩと呼ぶ）を調製した。実
際には、２２種のオリゴヌクレオチドブロックを作成
し、それぞれの一本鎖が少くとも７塩基ずつ重なるよう
に組合せ、完全な二本鎖ヌクレオチド配列を得ることに
よって、１６３ｂｐの分子を合成することとした。
【化１９】
【００３０】（ｉ） オリゴヌクレオチドの合成：８種
のオリゴヌクレオチドをさらに合成した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣ
ｐＴＯＨ （ＳＡ） （２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ （ＳＢ） （３） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣ
ｐＴｐＴｐＴＯＨ （ＳＣ） （４） ＨＯＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴ
ｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （ＳＤ） （５） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧ
ｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ＳＥ） （６） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＣＯＨ （ＳＦ） （７） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ＳＧ） （８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡ
ｐＡｐＣｐＡＯＨ （ＳＨ） これらの合成法は、前記ヘキサデカヌクレオチドＨＯＡ
ｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＧＯＨ （Ｇ１）の合成を参照すれば説明され
よう。
のオリゴヌクレオチドをさらに合成した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣ
ｐＴＯＨ （ＳＡ） （２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ （ＳＢ） （３） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣ
ｐＴｐＴｐＴＯＨ （ＳＣ） （４） ＨＯＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴ
ｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （ＳＤ） （５） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧ
ｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ＳＥ） （６） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＣＯＨ （ＳＦ） （７） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ＳＧ） （８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡ
ｐＡｐＣｐＡＯＨ （ＳＨ） これらの合成法は、前記ヘキサデカヌクレオチドＨＯＡ
ｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＧＯＨ （Ｇ１）の合成を参照すれば説明され
よう。
【００３１】（ｉｉ） 化学合成オリゴヌクレオチド類
のハイブリッド化とライゲーション：オリゴヌクレオチ
ドＡ〜ＮおよびＳＡ〜ＳＨを、第５図に示した通り、Ｉ
ＧＦ−Ｉ遺伝子の場合と同様のやり方に従ってハイブリ
ッド化し、ライゲートした。
のハイブリッド化とライゲーション：オリゴヌクレオチ
ドＡ〜ＮおよびＳＡ〜ＳＨを、第５図に示した通り、Ｉ
ＧＦ−Ｉ遺伝子の場合と同様のやり方に従ってハイブリ
ッド化し、ライゲートした。
【００３２】（３） ｔｒｐプロモーターＩＩ遺伝子の
クローニング：ｔｒｐプロモーターＩＩ遺伝子をプラス
ミドに挿入した。この発明の適当な一具体化例として、
ｔｒｐプロモーターＩＩ遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２
２に、第６図に示した通り、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉによってその部位を開裂することによって、挿入し
た。こうして得たプラスミド（ｔｒｐプロモーターＩＩ
ベクター）をプラスミドｐＴｒｐＥＢ７と名付ける。
クローニング：ｔｒｐプロモーターＩＩ遺伝子をプラス
ミドに挿入した。この発明の適当な一具体化例として、
ｔｒｐプロモーターＩＩ遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２
２に、第６図に示した通り、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉによってその部位を開裂することによって、挿入し
た。こうして得たプラスミド（ｔｒｐプロモーターＩＩ
ベクター）をプラスミドｐＴｒｐＥＢ７と名付ける。
【００３３】［３］蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の調製とク
ローニング：ＩＧＦ−Ｉと融合できる保護ペプチドの適
当な一例として、蛋白ペプチドＬＨが調製されている。 （１） 蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の調製：実際には、３
２種の合成オリゴヌクレオチドブロックを作成し、一本
鎖オーバラッピングにより組合せ、完全な二本鎖ヌクレ
オチド配列を得ることによって、２３３ｂｐの分子を合
成することとした。
ローニング：ＩＧＦ−Ｉと融合できる保護ペプチドの適
当な一例として、蛋白ペプチドＬＨが調製されている。 （１） 蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の調製：実際には、３
２種の合成オリゴヌクレオチドブロックを作成し、一本
鎖オーバラッピングにより組合せ、完全な二本鎖ヌクレ
オチド配列を得ることによって、２３３ｂｐの分子を合
成することとした。
【化２０】
【００３４】（ｉ） オリゴヌクレオチド類の合成：オ
リゴヌクレオチドブロック類は次の通りである： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ （ａ１） （２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡ
ｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ （ａ２） （３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ （ａ３） （４） ＨＯＴｐＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣ
ｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ａ４） （５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＴｐＧ
ｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ （ａ５） （６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ （ａ６） （７） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ （ｂ１） （８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＣｐＡ
ｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ （ｂ２） （９） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡ
ｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ （ｂ３） （１０） ＨＯＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｂ４） （１１） ＨＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ （ｂ５） （１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ （ｂ６） （１３） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣＯＨ （ｃ１） （１４） ＨＯＴｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ （ｃ２） （１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｃ３） （１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｃ４） （１７） ＨＯＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｃ５） （１８） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｃ６） （１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ （ｄ１） （２０） ＨＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＴｐＴＯＨ （ｄ２） （２１） ＨＯＧｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｄ３） （２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐ
ＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ （ｄ４） （２３） ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＧｐＧＯＨ（ｄ５） （２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｄ６） （２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｅ１） （２６） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ （ｅ２） （２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｅ３） （２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ （ｅ４） （２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
ＧｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ （ｅ５） （３０） ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （ｌ１） （３１） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴＯＨ （ｌ２） （３２） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＴＯＨ （ｌ３） （ｉｉ） 化学合成オリゴヌクレオチド類のハイブリッ
ド化とライゲーション：オリゴヌクレオチド１〜１３
を、第７図に示した通り、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の場合と同
様のやり方で、ハイブリッド化しライゲートした。
リゴヌクレオチドブロック類は次の通りである： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ （ａ１） （２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡ
ｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ （ａ２） （３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ （ａ３） （４） ＨＯＴｐＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣ
ｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ａ４） （５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＴｐＧ
ｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ （ａ５） （６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ （ａ６） （７） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ （ｂ１） （８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＣｐＡ
ｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ （ｂ２） （９） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡ
ｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ （ｂ３） （１０） ＨＯＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｂ４） （１１） ＨＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ （ｂ５） （１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ （ｂ６） （１３） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣＯＨ （ｃ１） （１４） ＨＯＴｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ （ｃ２） （１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｃ３） （１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｃ４） （１７） ＨＯＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｃ５） （１８） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｃ６） （１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ （ｄ１） （２０） ＨＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＴｐＴＯＨ （ｄ２） （２１） ＨＯＧｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｄ３） （２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐ
ＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ （ｄ４） （２３） ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＧｐＧＯＨ（ｄ５） （２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｄ６） （２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｅ１） （２６） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ （ｅ２） （２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｅ３） （２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ （ｅ４） （２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
ＧｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ （ｅ５） （３０） ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （ｌ１） （３１） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴＯＨ （ｌ２） （３２） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＴＯＨ （ｌ３） （ｉｉ） 化学合成オリゴヌクレオチド類のハイブリッ
ド化とライゲーション：オリゴヌクレオチド１〜１３
を、第７図に示した通り、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の場合と同
様のやり方で、ハイブリッド化しライゲートした。
【００３５】（２） 蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の分子ク
ローニング：蛋白ペプチドＬＨ遺伝子をプラスミドに挿
入した。この発明の適当な一具体化例として、蛋白ペプ
チドＬＨ遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２に、第８図に
示した通り、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによってその
部位を開裂することにより、挿入した。かくして得たプ
ラスミドをプラスミドｐＬＨ１０７と名付ける。
ローニング：蛋白ペプチドＬＨ遺伝子をプラスミドに挿
入した。この発明の適当な一具体化例として、蛋白ペプ
チドＬＨ遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２に、第８図に
示した通り、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによってその
部位を開裂することにより、挿入した。かくして得たプ
ラスミドをプラスミドｐＬＨ１０７と名付ける。
【００３６】［４］ＩＧＦ−Ｉ発現ベクターの構築：Ｉ
ＧＦ−Ｉ遺伝子を、プロモーター遺伝子を含有するプラ
スミドに挿入し、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を用いて宿主生物を
形質転換した。この発明の適当な一具体化例として、次
の組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＩＧＦ−Ｉ遺
伝子を発現させるべく確立した。上で調製したプラスミ
ドｐＳＴ−１をＥｃｏＲＩで消化し、生じた大きい断片
にＩＧＦ−Ｉ遺伝子を挿入した。こうして得た組換えプ
ラスミドをプラスミドｐＳＭ１ｔｒｐと名付、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ、たとえばＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１の形質転換に
用いた。このプロセスを第９図に示す。 （２） 組換えプラスミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐの
構築：プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化し、生じた大型断片（４．１ｋｂｐ）を
アガロースゲル電気泳動によって分離した。一方、ＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子をプラスミドｐＳｄＭ１からた単離し、上
記プロモータベクター（４．１ｋｂｐ）とライゲートし
た。得られたアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感
受性形質転換体の一つからプラスミドを単離し、制限酵
素による消化と電気泳動とによって、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子
を含有していることを確認した。こうして得たプラスミ
ドをプラスミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐと名付け、こ
のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉをＥ．ｃｏｌｉ
Ｆ−３と名付ける。このプロセスを第１０図に示した。
ＧＦ−Ｉ遺伝子を、プロモーター遺伝子を含有するプラ
スミドに挿入し、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を用いて宿主生物を
形質転換した。この発明の適当な一具体化例として、次
の組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＩＧＦ−Ｉ遺
伝子を発現させるべく確立した。上で調製したプラスミ
ドｐＳＴ−１をＥｃｏＲＩで消化し、生じた大きい断片
にＩＧＦ−Ｉ遺伝子を挿入した。こうして得た組換えプ
ラスミドをプラスミドｐＳＭ１ｔｒｐと名付、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ、たとえばＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１の形質転換に
用いた。このプロセスを第９図に示す。 （２） 組換えプラスミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐの
構築：プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化し、生じた大型断片（４．１ｋｂｐ）を
アガロースゲル電気泳動によって分離した。一方、ＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子をプラスミドｐＳｄＭ１からた単離し、上
記プロモータベクター（４．１ｋｂｐ）とライゲートし
た。得られたアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感
受性形質転換体の一つからプラスミドを単離し、制限酵
素による消化と電気泳動とによって、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子
を含有していることを確認した。こうして得たプラスミ
ドをプラスミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐと名付け、こ
のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉをＥ．ｃｏｌｉ
Ｆ−３と名付ける。このプロセスを第１０図に示した。
【００３７】［５］ＩＧＦ−Ｉ遺伝子およびプロモータ
ー遺伝子の配列決定：マキサム−ギルバート法を用いう
る。 （１） プラスミドｐＳｄＭ１ｔｒｐ中のＩＧＦ−Ｉ遺
伝子およびｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配列：プラス
ミドｐＳｄＭ１ｔｒｐ中のＩＧＦ−Ｉ遺伝子および合成
ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配列を、後記プラスミド
ｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐの場合と同様のやり方で決定
した。 （２） プラスミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐ中のＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子およびｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配
列：ＩＧＦ−Ｉ遺伝子および合成ｔｒｐプロモーターＩ
遺伝子の配列決定のため、プラスミドｐＳｄＭ１ｔｒｐ
をＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＰ（バクテリア アルカリ
ホスファターゼ）で処理し、つぎに、γ−32Ｐ−ＡＴＰ
の存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理した。
標識されたＤＮＡをＨｉｎｆＩで消化して、二つの断片
（１１０ｂｐおよび４８０ｂｐ）を得た。これらの断片
をマキサム−ギルバート法により分析した。［Ａ．Ｍａ
ｘａｍとＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，７４，５６０（１９７７）］。判明した
配列は、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子および合成プロモーターＩ遺
伝子の設計配列と一致した。
ー遺伝子の配列決定：マキサム−ギルバート法を用いう
る。 （１） プラスミドｐＳｄＭ１ｔｒｐ中のＩＧＦ−Ｉ遺
伝子およびｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配列：プラス
ミドｐＳｄＭ１ｔｒｐ中のＩＧＦ−Ｉ遺伝子および合成
ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配列を、後記プラスミド
ｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐの場合と同様のやり方で決定
した。 （２） プラスミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐ中のＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子およびｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配
列：ＩＧＦ−Ｉ遺伝子および合成ｔｒｐプロモーターＩ
遺伝子の配列決定のため、プラスミドｐＳｄＭ１ｔｒｐ
をＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＰ（バクテリア アルカリ
ホスファターゼ）で処理し、つぎに、γ−32Ｐ−ＡＴＰ
の存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理した。
標識されたＤＮＡをＨｉｎｆＩで消化して、二つの断片
（１１０ｂｐおよび４８０ｂｐ）を得た。これらの断片
をマキサム−ギルバート法により分析した。［Ａ．Ｍａ
ｘａｍとＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，７４，５６０（１９７７）］。判明した
配列は、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子および合成プロモーターＩ遺
伝子の設計配列と一致した。
【００３８】［６］融合ＩＧＦ−Ｉ発現ベクターの構
築：ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にリンカーを介在させまた
はさせずに、保護ペプチドをコードする遺伝子をＩＧＦ
−Ｉ遺伝子と連結することにより、融合ＩＧＦ−Ｉをコ
ードする遺伝子を調製した。この融合ＩＧＦ−Ｉは、蛋
白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合し
ている。本発明は、この様な融合ＩＧＦ−Ｉをコードす
る遺伝子の発現ベクターにも関するものである。この発
明の適当な一具体化例として、次のタイプの、蛋白ペプ
チドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の発
現ベクターを調製した。本発明は、保護ペプチドをコー
ドする遺伝子を、リンカーを介在させまたはさせずに、
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と該ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流で連結し
て構築されるかかる遺伝子の発明のためのプロセスにも
関するものである。
築：ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にリンカーを介在させまた
はさせずに、保護ペプチドをコードする遺伝子をＩＧＦ
−Ｉ遺伝子と連結することにより、融合ＩＧＦ−Ｉをコ
ードする遺伝子を調製した。この融合ＩＧＦ−Ｉは、蛋
白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合し
ている。本発明は、この様な融合ＩＧＦ−Ｉをコードす
る遺伝子の発現ベクターにも関するものである。この発
明の適当な一具体化例として、次のタイプの、蛋白ペプ
チドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の発
現ベクターを調製した。本発明は、保護ペプチドをコー
ドする遺伝子を、リンカーを介在させまたはさせずに、
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と該ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流で連結し
て構築されるかかる遺伝子の発明のためのプロセスにも
関するものである。
【００３９】（１） 蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の発現ベ
クターの構築：蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を、プロモータ
ー遺伝子を含有するプラスミドに挿入し、蛋白ペプチド
ＬＨ遺伝子により宿主生物を形質転換する。この発明の
好適な一具体化例として、Ｅ．ｃｏｌｉ中で蛋白ペプチ
ドＬＨ遺伝子を発現させるべく、次の組換えプラスミド
を確立した。ＴｒｐプロモーターＩＩプラスミドｐＴｒ
ｐＥＢ７をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、生じ
た大断片（４．１ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動に
より分離した。他方、蛋白ペプチドＬＨ遺伝子をプラス
ミドｐＬＨ１０７から単離し、前記プロモーターベクタ
ー（４．１ｋｂｐ）とライゲートした。この混合物を用
いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。得られ
たアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性形質転
換体の一つからプラスミドを単離し、それが蛋白ペプチ
ドＬＨ遺伝子を含有していることを、制限酵素による消
化と電気泳動とによって確認した。このようにして得た
プラスミドをプラスミドｐＬＨｔｒｐと名付ける。この
プロセスを第１１図に示した。
クターの構築：蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を、プロモータ
ー遺伝子を含有するプラスミドに挿入し、蛋白ペプチド
ＬＨ遺伝子により宿主生物を形質転換する。この発明の
好適な一具体化例として、Ｅ．ｃｏｌｉ中で蛋白ペプチ
ドＬＨ遺伝子を発現させるべく、次の組換えプラスミド
を確立した。ＴｒｐプロモーターＩＩプラスミドｐＴｒ
ｐＥＢ７をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、生じ
た大断片（４．１ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動に
より分離した。他方、蛋白ペプチドＬＨ遺伝子をプラス
ミドｐＬＨ１０７から単離し、前記プロモーターベクタ
ー（４．１ｋｂｐ）とライゲートした。この混合物を用
いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。得られ
たアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性形質転
換体の一つからプラスミドを単離し、それが蛋白ペプチ
ドＬＨ遺伝子を含有していることを、制限酵素による消
化と電気泳動とによって確認した。このようにして得た
プラスミドをプラスミドｐＬＨｔｒｐと名付ける。この
プロセスを第１１図に示した。
【００４０】（２） 蛋白ペプチドＬＨと融合したＩＧ
Ｆ−Ｉの発現ベクターの構築：ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、蛋
白ペプチドＬＨ遺伝子含有プラスミドに、プロモーター
遺伝子の下流に、それに隣接して、挿入する。この発明
の好適な一具体化例として、Ｅ．ｃｏｌｉ中での蛋白ペ
プチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉの発現のため、次の組
換えプラスミドを確立した。この段階では、リンカー
を、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にこれに隣接して、挿入し
た。 （ａ） 蛋白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉをコー
ドする遺伝子の発現ベクターの構築：上記で調製したプ
ラスミドｐＬＨｔｒｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、生じた大きい断片を分取アガロースゲル電
気泳動によって分離した。一方、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、
前記ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化により、上で調製
したプラスミドｐＳｄＭ１から単離し、その上流に、そ
れに隣接して、オリゴヌクレオチドｍ１およびｍ２をリ
ンカーとして連結した。こうして得たリンカーつきＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子を上記プラスミドｐＬＨｔｒｐの大型断片
とライゲートした。混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ
１０１を形質転換した。得られたアンピシリン抵抗性、
テトラサイクリン感受性の形質転換体の一つからプラス
ミドを単離し、それが、蛋白ペプチドＬＨと融合したＩ
ＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を含有することを、制限酵
素による消化と電気泳動とによって確認した。かくして
得たプラスミドをプラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐと名
付ける。このプロセスを第１２図に示す。
Ｆ−Ｉの発現ベクターの構築：ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、蛋
白ペプチドＬＨ遺伝子含有プラスミドに、プロモーター
遺伝子の下流に、それに隣接して、挿入する。この発明
の好適な一具体化例として、Ｅ．ｃｏｌｉ中での蛋白ペ
プチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉの発現のため、次の組
換えプラスミドを確立した。この段階では、リンカー
を、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にこれに隣接して、挿入し
た。 （ａ） 蛋白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉをコー
ドする遺伝子の発現ベクターの構築：上記で調製したプ
ラスミドｐＬＨｔｒｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、生じた大きい断片を分取アガロースゲル電
気泳動によって分離した。一方、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、
前記ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化により、上で調製
したプラスミドｐＳｄＭ１から単離し、その上流に、そ
れに隣接して、オリゴヌクレオチドｍ１およびｍ２をリ
ンカーとして連結した。こうして得たリンカーつきＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子を上記プラスミドｐＬＨｔｒｐの大型断片
とライゲートした。混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ
１０１を形質転換した。得られたアンピシリン抵抗性、
テトラサイクリン感受性の形質転換体の一つからプラス
ミドを単離し、それが、蛋白ペプチドＬＨと融合したＩ
ＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を含有することを、制限酵
素による消化と電気泳動とによって確認した。かくして
得たプラスミドをプラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐと名
付ける。このプロセスを第１２図に示す。
【００４１】かくして得た、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧ
Ｆ−Ｉをコードする遺伝子は次の通りである。
Ｆ−Ｉをコードする遺伝子は次の通りである。
【化２１】
【化２２】
【００４２】そして、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ
をコードする遺伝子は次の通りである：
をコードする遺伝子は次の通りである：
【化２３】
【化２４】
【００４３】［５］宿主生物での融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子
の発現：融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を発現させるため、こう
して得たプロモーター遺伝子と融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と
を有するプラスミドを用いて宿主生物を形質転換し、つ
ぎにそのプラスミドを有する宿主生物を、同化可能な炭
素源および窒素源を含有する栄養培地中で、好気性条件
下に（たとえば振とう培養、深部培養など）培養する。
栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコース，フルクト
ース，スクロース，グリセリン，でん粉などのごとき炭
水化物である。包含されうる他の炭素源は、キシロー
ス，ガラクトース，マルトース，デキストリン，ラクト
ースなどである。好ましい窒素源は、酵母エキス，ペプ
トン，グルテン粉，綿実粉，大豆粉，コーンスチープリ
カー，乾燥酵母，小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アン
モニウム，硫酸アンモニウム，燐酸アンモニウム，尿
素，アミノ酸などのごとき無機および有機の窒素化合物
である。炭素源および窒素源は、これらを組合せて用い
るのが有利であるが、微量の成長因子およびかなりの量
の無機栄養源を含有する相対的に低純度の材料も使用に
適しているので、それらは必ずしも純粋な形で使用する
ことを要しない。所望の時には、炭酸カルシウム，燐酸
ナトリウムまたはカリウム，塩化ナトリウムまたはカリ
ウム，マグネシウム塩類，銅塩類などの無機塩類を培地
に添加してもよい。培養混合物の撹拌および通気は種々
の方法で達成できる。撹拌は、プロペラまたは類似の機
械的撹拌装置により、醗酵槽の回転または振とうによ
り、種々のポンプ装置により、または無菌の空気を培地
に通すことにより、もたらされる。撹拌は、醗酵混合物
に無菌空気を通過させることにより遂行しうる。醗酵
は、通常約２０℃と４２℃との間の温度で、好ましくは
３５〜３８℃の間の温度で、数時間ないし５０時間にわ
たって行う。こうして産出された融合ＩＧＦ−Ｉは、他
の既知の生物学的活性物質の回収に一般的に用いられる
慣用の手段によって培養培地から回収できる。一般的に
は、産出された融合ＩＧＦ−Ｉは宿主生物の細胞中に見
出され、従って、融合ＩＧＦ−Ｉは、培養液を濾過また
は遠心分離して得られる細胞から、減圧下の濃縮、超音
波処理などの細胞破砕，ＨＰＬＣ，凍結乾燥，ｐＨ調
節，樹脂（たとえばアニオンまたはカチオン交換樹脂，
非イオン性吸着樹脂）を用いての処理，慣用の吸着剤
（たとえば活性炭，珪酸，シリカゲル，セルロース，ア
ルミナ）での処理，ゲル濾過，晶出などの常法によっ
て、分離できる。
の発現：融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を発現させるため、こう
して得たプロモーター遺伝子と融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と
を有するプラスミドを用いて宿主生物を形質転換し、つ
ぎにそのプラスミドを有する宿主生物を、同化可能な炭
素源および窒素源を含有する栄養培地中で、好気性条件
下に（たとえば振とう培養、深部培養など）培養する。
栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコース，フルクト
ース，スクロース，グリセリン，でん粉などのごとき炭
水化物である。包含されうる他の炭素源は、キシロー
ス，ガラクトース，マルトース，デキストリン，ラクト
ースなどである。好ましい窒素源は、酵母エキス，ペプ
トン，グルテン粉，綿実粉，大豆粉，コーンスチープリ
カー，乾燥酵母，小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アン
モニウム，硫酸アンモニウム，燐酸アンモニウム，尿
素，アミノ酸などのごとき無機および有機の窒素化合物
である。炭素源および窒素源は、これらを組合せて用い
るのが有利であるが、微量の成長因子およびかなりの量
の無機栄養源を含有する相対的に低純度の材料も使用に
適しているので、それらは必ずしも純粋な形で使用する
ことを要しない。所望の時には、炭酸カルシウム，燐酸
ナトリウムまたはカリウム，塩化ナトリウムまたはカリ
ウム，マグネシウム塩類，銅塩類などの無機塩類を培地
に添加してもよい。培養混合物の撹拌および通気は種々
の方法で達成できる。撹拌は、プロペラまたは類似の機
械的撹拌装置により、醗酵槽の回転または振とうによ
り、種々のポンプ装置により、または無菌の空気を培地
に通すことにより、もたらされる。撹拌は、醗酵混合物
に無菌空気を通過させることにより遂行しうる。醗酵
は、通常約２０℃と４２℃との間の温度で、好ましくは
３５〜３８℃の間の温度で、数時間ないし５０時間にわ
たって行う。こうして産出された融合ＩＧＦ−Ｉは、他
の既知の生物学的活性物質の回収に一般的に用いられる
慣用の手段によって培養培地から回収できる。一般的に
は、産出された融合ＩＧＦ−Ｉは宿主生物の細胞中に見
出され、従って、融合ＩＧＦ−Ｉは、培養液を濾過また
は遠心分離して得られる細胞から、減圧下の濃縮、超音
波処理などの細胞破砕，ＨＰＬＣ，凍結乾燥，ｐＨ調
節，樹脂（たとえばアニオンまたはカチオン交換樹脂，
非イオン性吸着樹脂）を用いての処理，慣用の吸着剤
（たとえば活性炭，珪酸，シリカゲル，セルロース，ア
ルミナ）での処理，ゲル濾過，晶出などの常法によっ
て、分離できる。
【００４４】（１） 蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ
をコードする遺伝子の宿主生物中での発現：蛋白ペプチ
ドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を発現させる
ため、プロモーター遺伝子と、蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ
ＧＦ−Ｉとを有するプラスミドを用いて宿主生物を形質
転換し、つぎに、そのプラスミドを有する宿主生物を適
当な培地中で培養する。得られた培養液から蛋白ペプチ
ドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉを単離する。
をコードする遺伝子の宿主生物中での発現：蛋白ペプチ
ドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を発現させる
ため、プロモーター遺伝子と、蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ
ＧＦ−Ｉとを有するプラスミドを用いて宿主生物を形質
転換し、つぎに、そのプラスミドを有する宿主生物を適
当な培地中で培養する。得られた培養液から蛋白ペプチ
ドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉを単離する。
【００４５】（ｉ） 蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ
をコードする遺伝子のプラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐ
を用いての、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現：ｐＬＨＳｄＭｍ
ｔｒｐを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１をＬブロス
中で一夜培養したものを、トリプトファン不含Ｍ９培地
で希釈し、β−インドールアクリル酸誘導の条件下に細
胞を３７℃で３時間インキュベートした。融合ＩＧＦ−
Ｉ産出の検知は、矢内原の方法［矢内原ら、Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｈｏｒｏｍｏｎｅｓ ｉｎ Ｐａｎｃｒｅａｓ，
３，２８（１９８３）］に従って、ＩＧＦ−Ｉ断片（２
６−４６）の抗体を用いる放射免疫測定法（以下ＲＩＡ
という）によって実施した。
をコードする遺伝子のプラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐ
を用いての、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現：ｐＬＨＳｄＭｍ
ｔｒｐを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１をＬブロス
中で一夜培養したものを、トリプトファン不含Ｍ９培地
で希釈し、β−インドールアクリル酸誘導の条件下に細
胞を３７℃で３時間インキュベートした。融合ＩＧＦ−
Ｉ産出の検知は、矢内原の方法［矢内原ら、Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｈｏｒｏｍｏｎｅｓ ｉｎ Ｐａｎｃｒｅａｓ，
３，２８（１９８３）］に従って、ＩＧＦ−Ｉ断片（２
６−４６）の抗体を用いる放射免疫測定法（以下ＲＩＡ
という）によって実施した。
【００４６】（ｉｉ） 蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−
Ｉの単離：培養液を遠心分離して、湿潤細胞ペーストを
得て、細胞を超音波処理によって破壊した。遠心分離に
よってペレットを集め、つぎに、０．１Ｍのジチオスレ
イトール（以下、ＤＴＴと略称する）を含有する８Ｍ尿
素溶液に溶解した。遠心分離後、溶液をＳ３００カラム
クロマトグラフィにより精製した。ＲＩＡによって検知
された活性画分を集め、透析して、所望の成分を含有す
る蛋白を得た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
たところ、正規の位置（分子量１５，５００）に融合Ｉ
ＧＦ−Ｉが検出された。
Ｉの単離：培養液を遠心分離して、湿潤細胞ペーストを
得て、細胞を超音波処理によって破壊した。遠心分離に
よってペレットを集め、つぎに、０．１Ｍのジチオスレ
イトール（以下、ＤＴＴと略称する）を含有する８Ｍ尿
素溶液に溶解した。遠心分離後、溶液をＳ３００カラム
クロマトグラフィにより精製した。ＲＩＡによって検知
された活性画分を集め、透析して、所望の成分を含有す
る蛋白を得た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
たところ、正規の位置（分子量１５，５００）に融合Ｉ
ＧＦ−Ｉが検出された。
【００４７】こうして得た蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ
−Ｉは次の通りである。
−Ｉは次の通りである。
【化２５】
【００４８】［７］融合ＩＧＦ−ＩのＩＧＦ−Ｉへの変
換およびＩＧＦ−Ｉの単離：こうして得た融合ＩＧＦ−
Ｉは、保護ペプチドを臭化シアンを用いた脱離反応によ
ってＩＧＦ−Ｉに変換できる。この場合、ＩＧＦ−Ｉは
アミノ酸配列の５９番目の位置にメチオニンをもつが、
ＩＧＦ−Ｉの５９番目のメチオニンと６０番目のチロシ
ンとを連結するアミド結合の開裂は、ＩＧＦ−Ｉの最初
のアミノ酸の前方のメチオニンとＩＧＦ−Ｉの最初のア
ミノ酸、すなわちグリシン、とを連結するアミド結合の
開裂よりもあとで起こる。この現象、すなわちメチオニ
ン隣接結合の開裂の順序は本発明者らによりはじめて見
出されたものである。この現象に従って、蛋白ペプチド
は、適当な条件を選択すれば、臭化シアンによって該融
合ＩＧＦ−Ｉから脱離反応により容易に除去できる。こ
の反応は、通常、反応に悪影響を及ぼさない慣用の溶媒
中、緩和な条件下で行われる。反応温度はとくに限定さ
れず、通常は、冷却ないし加温のもとで反応を行う。
換およびＩＧＦ−Ｉの単離：こうして得た融合ＩＧＦ−
Ｉは、保護ペプチドを臭化シアンを用いた脱離反応によ
ってＩＧＦ−Ｉに変換できる。この場合、ＩＧＦ−Ｉは
アミノ酸配列の５９番目の位置にメチオニンをもつが、
ＩＧＦ−Ｉの５９番目のメチオニンと６０番目のチロシ
ンとを連結するアミド結合の開裂は、ＩＧＦ−Ｉの最初
のアミノ酸の前方のメチオニンとＩＧＦ−Ｉの最初のア
ミノ酸、すなわちグリシン、とを連結するアミド結合の
開裂よりもあとで起こる。この現象、すなわちメチオニ
ン隣接結合の開裂の順序は本発明者らによりはじめて見
出されたものである。この現象に従って、蛋白ペプチド
は、適当な条件を選択すれば、臭化シアンによって該融
合ＩＧＦ−Ｉから脱離反応により容易に除去できる。こ
の反応は、通常、反応に悪影響を及ぼさない慣用の溶媒
中、緩和な条件下で行われる。反応温度はとくに限定さ
れず、通常は、冷却ないし加温のもとで反応を行う。
【００４９】蛋白ペプチドＬＨのメチオニンを介して蛋
白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉからの蛋白ペプチ
ドＬＨの離脱：融合ＩＧＦ−Ｉを、６０％蟻酸中２５℃
で３時間臭化シアンで処理した。凍結乾燥後、残渣を、
５０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有する８Ｍ尿
素溶液に溶解させ、透析して、還元型ＩＧＦ−Ｉの粗混
合物を得た。この混合物をカチオン交換クロマトグラフ
ィ（ＣＭ５２）によって精製し、ＲＩＡで検知された活
性画分を集めて、透析した。透析後の画分を高速液体ク
ロマトグラフィにかけて、純粋な還元型ＩＧＦ−Ｉを得
た。この還元ＩＧＦ−Ｉを、通常の再生法（ｒｅｆｏｌ
ｄｉｎｇ）によって酸化型ＩＧＦ−Ｉに変換した。精製
されたＩＧＦ−Ｉは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）に際して単一のバンドを示し、またそのＩ
ＧＦ−Ｉは、ＨＰＬＣにおいて、Ｈｕｍｂｅｌ博士から
贈られたＩＧＦ−Ｉの標品と重なった。ＩＧＦ−Ｉのア
ミノ酸配列を、エドマン法とカルボキシペプチダーゼ法
とを組合せて、決定した。そのＩＧＦ−ＩはＢＡＬＢ／
ｃ３Ｔ３マウス細胞による［ 3Ｈ］−チミジン取込みア
ツセイにおいて生物活性を示した。
白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉからの蛋白ペプチ
ドＬＨの離脱：融合ＩＧＦ−Ｉを、６０％蟻酸中２５℃
で３時間臭化シアンで処理した。凍結乾燥後、残渣を、
５０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有する８Ｍ尿
素溶液に溶解させ、透析して、還元型ＩＧＦ−Ｉの粗混
合物を得た。この混合物をカチオン交換クロマトグラフ
ィ（ＣＭ５２）によって精製し、ＲＩＡで検知された活
性画分を集めて、透析した。透析後の画分を高速液体ク
ロマトグラフィにかけて、純粋な還元型ＩＧＦ−Ｉを得
た。この還元ＩＧＦ−Ｉを、通常の再生法（ｒｅｆｏｌ
ｄｉｎｇ）によって酸化型ＩＧＦ−Ｉに変換した。精製
されたＩＧＦ−Ｉは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）に際して単一のバンドを示し、またそのＩ
ＧＦ−Ｉは、ＨＰＬＣにおいて、Ｈｕｍｂｅｌ博士から
贈られたＩＧＦ−Ｉの標品と重なった。ＩＧＦ−Ｉのア
ミノ酸配列を、エドマン法とカルボキシペプチダーゼ法
とを組合せて、決定した。そのＩＧＦ−ＩはＢＡＬＢ／
ｃ３Ｔ３マウス細胞による［ 3Ｈ］−チミジン取込みア
ツセイにおいて生物活性を示した。
【００５０】［８］ＩＧＦ−Ｉの放射免疫測定：矢内原
［矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ
Ｐａｎｃｒｅａｓ，３，２８ （１９８３）］が確立
した方法に従って、ＩＧＦ−ＩのＲＩＡを行った。上記
の試料または標準試料（ＩＧＦ−Ｉ断片（２６−４
６））の０．１ｍｌを、試料用緩衝液［０．０１Ｍ Ｐ
ＢＳ、０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ中、０．５％ＢＳＡ（ｐ
Ｈ７．４）（０．４ｍｌ）］、ＩＧＦ−Ｉ（２６−４
６）に対するウサギの抗血清（０．１ｍｌ）および 125
Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ（２６−４６）（０．１ｍｌ）と混合し
た。混合物を４℃に４８時間放置し、つぎに、ウサギ血
清（０．１ｍｌ）、ウサギγ−グロブリン抗血清（０．
１ｍｌ）および５％ＰＥＧ６０００（０．９ｍｌ）を加
えた。４℃でさらに２時間放置したのち、遠心分離（３
krpm、４℃、30分間）によってペレットを集め、γ−カ
ウンターで放射活性を測定した。この放射活性からＩＧ
Ｆ−Ｉの含量を算出した。
［矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ
Ｐａｎｃｒｅａｓ，３，２８ （１９８３）］が確立
した方法に従って、ＩＧＦ−ＩのＲＩＡを行った。上記
の試料または標準試料（ＩＧＦ−Ｉ断片（２６−４
６））の０．１ｍｌを、試料用緩衝液［０．０１Ｍ Ｐ
ＢＳ、０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ中、０．５％ＢＳＡ（ｐ
Ｈ７．４）（０．４ｍｌ）］、ＩＧＦ−Ｉ（２６−４
６）に対するウサギの抗血清（０．１ｍｌ）および 125
Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ（２６−４６）（０．１ｍｌ）と混合し
た。混合物を４℃に４８時間放置し、つぎに、ウサギ血
清（０．１ｍｌ）、ウサギγ−グロブリン抗血清（０．
１ｍｌ）および５％ＰＥＧ６０００（０．９ｍｌ）を加
えた。４℃でさらに２時間放置したのち、遠心分離（３
krpm、４℃、30分間）によってペレットを集め、γ−カ
ウンターで放射活性を測定した。この放射活性からＩＧ
Ｆ−Ｉの含量を算出した。
【００５１】［９］ＩＧＦ−Ｉの生物学的アツセイ：Ｂ
ＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３マウスの胚線維芽細胞（クローンＡ
３１）をトリプシン処理し、５％のウシ胎児血清と２５
ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’
−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含有するダル
ベツコ−フォークトの改変イーグル 培地中に、１０5 細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。１０
０μｌづつを０．３ｃｍ 2 のウエル（９６ウエルのマイ
クロタイタープレート、コスター社製）に入れた。均一
な単層細胞が形成されてから（最初のプレート調製から
５〜７日後）３〜４日後に、培地を除去し、培養物を３
回洗い、つぎに、０．２μＣｉ／ウエルの［ 3Ｈ］チミ
ジン（０．６７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および被検試料を加え
た。２４時間のインキュベーションののち、培地を除去
し、細胞をＰＢＳで洗い、放射能測定のためトリプシン
処理した。細胞を半自動のマルチプルセルハーベスタ
（ＬＡＶＯ，ＭＡＳＨ，ラボ・サイエンス）を使用し
て、ガラスフィルターに捕捉した。取込まれた［ 3Ｈ］
チミジンを、アクタゾール２（ニュー・イングランド・
ニュクリアー）８ｍｌ中で、パッカード・トライ−カー
ブ液体シンチレーションカウンタを用いて、カウントし
た。以下、実施例を示し、この発明を説明する。
ＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３マウスの胚線維芽細胞（クローンＡ
３１）をトリプシン処理し、５％のウシ胎児血清と２５
ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’
−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含有するダル
ベツコ−フォークトの改変イーグル 培地中に、１０5 細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。１０
０μｌづつを０．３ｃｍ 2 のウエル（９６ウエルのマイ
クロタイタープレート、コスター社製）に入れた。均一
な単層細胞が形成されてから（最初のプレート調製から
５〜７日後）３〜４日後に、培地を除去し、培養物を３
回洗い、つぎに、０．２μＣｉ／ウエルの［ 3Ｈ］チミ
ジン（０．６７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および被検試料を加え
た。２４時間のインキュベーションののち、培地を除去
し、細胞をＰＢＳで洗い、放射能測定のためトリプシン
処理した。細胞を半自動のマルチプルセルハーベスタ
（ＬＡＶＯ，ＭＡＳＨ，ラボ・サイエンス）を使用し
て、ガラスフィルターに捕捉した。取込まれた［ 3Ｈ］
チミジンを、アクタゾール２（ニュー・イングランド・
ニュクリアー）８ｍｌ中で、パッカード・トライ−カー
ブ液体シンチレーションカウンタを用いて、カウントし
た。以下、実施例を示し、この発明を説明する。
【００５２】実施例１ ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ１）の合成 （１） ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵ
ｐｏ−セルロースの合成： ｉ） ＨＯＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロースの調製：ＤＭ
ＴｒＯＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（１３０．４ｍ
ｇ，４．５９μｍｏｌｅ* ）（Ｒ．Ｃｒｅａ* の方法1
により製造）のメタノール／クロロホルム（１：９ｖ／
ｖ，５．０ｍｌ）懸濁液にＴＣＡ／クロロホルム（２：
８ｗ／ｖ，５．０ｍｌ）を冷却下に加え、０℃で１０分
間撹拌する。クロロホルム（２ｍｌ）およびメタノール
（６．０ｍｌ）で洗浄後、濾紙上のセルロース付加物
（ＨＯＧ iBｐｏACＵｐｏ−セルロース）を乾燥させた。
この際、水はピリジン（２ｍｌ）との共沸混合物として
分離した。* この値は、クロロホルム洗液の吸光度を５
０７ｎｍで測定して算出した。 １） Ｒ．Ｃｒｅａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，８，２３３１（１９８０） ｉｉ） ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏ−- の調製：
ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏ−ＣＥ（３９．９ｍ
ｇ，２３．０μｍｏｌｅ）をトリエチルアミン−アセト
ニトリル（１：１ｖ／ｖ，５ｍｌ）を室温で１時間処理
して得られたホスホジエステルトリマー（ＤＭＴｒＯＴ
ｐｏＡBzｐｏＴｐｏ−- ）を乾燥させた。水はピリジン
との共沸混合物（０．５ｍｌ，２×１ｍｌ）として分離
した。 ｉｉｉ） カップリング トリマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏ−- ）セル
ロース付加物（ＨＯＧｐｏ Ｕｐｏ−セルロース）と１
０ｍｌ容丸底フラスコ中で混合した。混合物を乾燥させ
（水はピリジンとの共沸混合物（２×１ｍｌ）として分
離）、無水ピリジン（１ｍｌ）に再懸濁させた。メンチ
レンスルホニルニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ）（６
８．０ｍｇ，２３０μｍｏｌｅ）をこの懸濁液に加え、
室温で１時間撹拌した。次いでピリジンを反応容器に加
え、セルロース付加物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，２
分間）により回収した。 ｉｖ） 未反応５’ヒドロキシル基のアセチル化：前記
セルロース付加物をピリジン−無水酢酸溶液（１０：１
ｖ／ｖ，５．５ｍｌ）に懸濁し、室温で３０分間撹拌し
た。ピリジン（５ｍｌ）中で反復遠心分離（３０００ｒ
ｐｍ，２分間）し、メタノール（１５ｍｌ）で洗浄、室
温で３０分間真空乾燥することにより、セルロース生成
物（１１３．９ｍｇ）を得た。このセルロース付加物
（ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−
セルロース）は次のカップリング工程に使用できる。
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ１）の合成 （１） ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵ
ｐｏ−セルロースの合成： ｉ） ＨＯＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロースの調製：ＤＭ
ＴｒＯＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（１３０．４ｍ
ｇ，４．５９μｍｏｌｅ* ）（Ｒ．Ｃｒｅａ* の方法1
により製造）のメタノール／クロロホルム（１：９ｖ／
ｖ，５．０ｍｌ）懸濁液にＴＣＡ／クロロホルム（２：
８ｗ／ｖ，５．０ｍｌ）を冷却下に加え、０℃で１０分
間撹拌する。クロロホルム（２ｍｌ）およびメタノール
（６．０ｍｌ）で洗浄後、濾紙上のセルロース付加物
（ＨＯＧ iBｐｏACＵｐｏ−セルロース）を乾燥させた。
この際、水はピリジン（２ｍｌ）との共沸混合物として
分離した。* この値は、クロロホルム洗液の吸光度を５
０７ｎｍで測定して算出した。 １） Ｒ．Ｃｒｅａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，８，２３３１（１９８０） ｉｉ） ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏ−- の調製：
ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏ−ＣＥ（３９．９ｍ
ｇ，２３．０μｍｏｌｅ）をトリエチルアミン−アセト
ニトリル（１：１ｖ／ｖ，５ｍｌ）を室温で１時間処理
して得られたホスホジエステルトリマー（ＤＭＴｒＯＴ
ｐｏＡBzｐｏＴｐｏ−- ）を乾燥させた。水はピリジン
との共沸混合物（０．５ｍｌ，２×１ｍｌ）として分離
した。 ｉｉｉ） カップリング トリマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏ−- ）セル
ロース付加物（ＨＯＧｐｏ Ｕｐｏ−セルロース）と１
０ｍｌ容丸底フラスコ中で混合した。混合物を乾燥させ
（水はピリジンとの共沸混合物（２×１ｍｌ）として分
離）、無水ピリジン（１ｍｌ）に再懸濁させた。メンチ
レンスルホニルニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ）（６
８．０ｍｇ，２３０μｍｏｌｅ）をこの懸濁液に加え、
室温で１時間撹拌した。次いでピリジンを反応容器に加
え、セルロース付加物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，２
分間）により回収した。 ｉｖ） 未反応５’ヒドロキシル基のアセチル化：前記
セルロース付加物をピリジン−無水酢酸溶液（１０：１
ｖ／ｖ，５．５ｍｌ）に懸濁し、室温で３０分間撹拌し
た。ピリジン（５ｍｌ）中で反復遠心分離（３０００ｒ
ｐｍ，２分間）し、メタノール（１５ｍｌ）で洗浄、室
温で３０分間真空乾燥することにより、セルロース生成
物（１１３．９ｍｇ）を得た。このセルロース付加物
（ＤＭＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−
セルロース）は次のカップリング工程に使用できる。
【００５３】（２） ＤＭＴｒＯＧiBｐｏＧiBｐｏＣBz
ｐｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロー
スの合成：ＤＭＴｒＯＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏ
ＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロースは、ＤＭ
ＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロ
ース（１１３．９ｍｇ）とＤＭＴｒＯＧiBｐｏＧiBｐｏ
ＣBzｐｏ−ＣＥ（４３．７ｍｇ）から前記と同様の条件
により合成した。
ｐｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロー
スの合成：ＤＭＴｒＯＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏ
ＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロースは、ＤＭ
ＴｒＯＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロ
ース（１１３．９ｍｇ）とＤＭＴｒＯＧiBｐｏＧiBｐｏ
ＣBzｐｏ−ＣＥ（４３．７ｍｇ）から前記と同様の条件
により合成した。
【００５４】（３） ＤＭＴｒＯＡBzｐｏＣBzｐｏＣBz
ｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧ
iBｐｏAcＵｐｏ−セルロースの合成：ＤＭＴｒＯＡBzｐ
ｏＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡ
BzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（１０５．
８ｍｇ）はＤＭＴｒＯＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏ
ＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（１０
９．５ｍｇ）とＤＭＴｒＯＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏ−
ＣＥ（４４．０ｍｇ）から同様の条件により合成した。
ｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧ
iBｐｏAcＵｐｏ−セルロースの合成：ＤＭＴｒＯＡBzｐ
ｏＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡ
BzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（１０５．
８ｍｇ）はＤＭＴｒＯＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏ
ＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（１０
９．５ｍｇ）とＤＭＴｒＯＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏ−
ＣＥ（４４．０ｍｇ）から同様の条件により合成した。
【００５５】（４） ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＣBzｐｏＧiB
ｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐ
ｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース
の合成：ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏ
ＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBz
ｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（９４．５ｍ
ｇ）はＤＭＴｒＯＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧ
iBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡ BzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ
−セルロース（１０５．８ｍｇ）とＤＭＴｒＯＣ Bzｐｏ
ＣBzｐｏＧiBｐｏ−ＣＥ（４３．５ｍｇ）から同様の条
件により合成した。
ｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐ
ｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース
の合成：ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏ
ＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBz
ｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（９４．５ｍ
ｇ）はＤＭＴｒＯＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧ
iBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡ BzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ
−セルロース（１０５．８ｍｇ）とＤＭＴｒＯＣ Bzｐｏ
ＣBzｐｏＧiBｐｏ−ＣＥ（４３．５ｍｇ）から同様の条
件により合成した。
【００５６】（５） ＤＭＴｒＯＡBzｐｏＡBzｐｏＡBz
ｐｏＣBzｐｏＣBZｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐ
ｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiB
ｐｏAcＵｐｏ−セルロースの合成：ＤＭＴｒＯＡBzｐｏ
ＡBzｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣBZｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＣ
BzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBzｐ
ｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（９０．４ｍ
ｇ）は、ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏ
ＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBz
ｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（９４．５ｍ
ｇ）とＤＭＴｒＯＡBzｐｏＡBzｐｏＡBzｐｏ−ＣＥ（４
５．１ｍｇ）から同様の条件下で合成した。この最終段
階では未反応５’−ヒドロキシ基はアセチル基で保護す
る必要はなかった。
ｐｏＣBzｐｏＣBZｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐ
ｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiB
ｐｏAcＵｐｏ−セルロースの合成：ＤＭＴｒＯＡBzｐｏ
ＡBzｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣBZｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＣ
BzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBzｐ
ｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（９０．４ｍ
ｇ）は、ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏ
ＣBzｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＴｐｏＡBz
ｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロース（９４．５ｍ
ｇ）とＤＭＴｒＯＡBzｐｏＡBzｐｏＡBzｐｏ−ＣＥ（４
５．１ｍｇ）から同様の条件下で合成した。この最終段
階では未反応５’−ヒドロキシ基はアセチル基で保護す
る必要はなかった。
【００５７】（６） ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨの合成：Ｄ
ＭＴｒＯＡBzｐｏＡBzｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＧ
iBｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣiBｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBz
ｐｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロー
ス（９０．４ｍｇ）を０．５Ｍ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
テトラメチルグアニジニウムピリジン２−アルドキシマ
ート［ジオキサン−水（１：１ ｖ／ｖ，１ｍｌ）中］
と封管中、２０℃で２０時間処理した。反応混合物に２
８％（ｗ／ｗ）アンモニア水（１２ｍｌ）を加え、６０
℃で２時間加熱した。固形セルロースを濾別し、水（１
０ｍｌ）で洗浄した。濾液と洗液を蒸発乾固させ、残渣
を８０％酢酸水溶液（２５ｍｌ）で室温で１５分間処理
した。溶媒留去後、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチル ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５，２５ｍｌ）に溶かし、
ジエチルエーテル（３×２５ｍｌ）で洗浄した。水層を
蒸発乾固し、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５，２ｍｌ）に溶解し、溶液中に粗
ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨを得た。
ｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨの合成：Ｄ
ＭＴｒＯＡBzｐｏＡBzｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＧ
iBｐｏＡBzｐｏＣBzｐｏＣiBｐｏＧiBｐｏＧiBｐｏＣBz
ｐｏＴｐｏＡBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏAcＵｐｏ−セルロー
ス（９０．４ｍｇ）を０．５Ｍ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
テトラメチルグアニジニウムピリジン２−アルドキシマ
ート［ジオキサン−水（１：１ ｖ／ｖ，１ｍｌ）中］
と封管中、２０℃で２０時間処理した。反応混合物に２
８％（ｗ／ｗ）アンモニア水（１２ｍｌ）を加え、６０
℃で２時間加熱した。固形セルロースを濾別し、水（１
０ｍｌ）で洗浄した。濾液と洗液を蒸発乾固させ、残渣
を８０％酢酸水溶液（２５ｍｌ）で室温で１５分間処理
した。溶媒留去後、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチル ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５，２５ｍｌ）に溶かし、
ジエチルエーテル（３×２５ｍｌ）で洗浄した。水層を
蒸発乾固し、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５，２ｍｌ）に溶解し、溶液中に粗
ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨを得た。
【００５８】（７） ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨの精製： ｉ） 粗生成物の最初の精製はカラムクロマトグラフィ
ー（バイオゲルＰ２２４×２．６ｃｍ ＩＤ）により行
った。最初の溶出ピークに相当する画分（５０ｍＭ Ｎ
Ｈ4 ＯＡｃ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍｌ／分）を取
り、凍結乾燥し最初の精製物を得た。 ｉｉ） 最初の精製物の２回目の精製はＨＰＬＣ（ＣＤ
Ｒ−１０，２５ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ）になり１Ｍ酢
酸アンモニウム−１０％（ｖ／ｖ）水性エタノールから
４．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（ｖ／ｖ）水性エタ
ノールまでの直線勾配（８０分間，１ｍｌ／分，６０
℃）を用いて行い、２回目の精製物を得た。 ｉｉｉ） ２回目の精製物の第３回目の精製は逆相ＨＰ
ＬＣ［Ｒｐ−１８−５μ（×７７），１５ｃｍ×４ｍｍ
ＩＤ］により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから０．１
Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル
水溶液までの直線勾配（４０分間，１．５ｍｌ／分，室
温）を用いて行い、最終精製物（ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈ）を得た。
ｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨの精製： ｉ） 粗生成物の最初の精製はカラムクロマトグラフィ
ー（バイオゲルＰ２２４×２．６ｃｍ ＩＤ）により行
った。最初の溶出ピークに相当する画分（５０ｍＭ Ｎ
Ｈ4 ＯＡｃ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍｌ／分）を取
り、凍結乾燥し最初の精製物を得た。 ｉｉ） 最初の精製物の２回目の精製はＨＰＬＣ（ＣＤ
Ｒ−１０，２５ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ）になり１Ｍ酢
酸アンモニウム−１０％（ｖ／ｖ）水性エタノールから
４．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（ｖ／ｖ）水性エタ
ノールまでの直線勾配（８０分間，１ｍｌ／分，６０
℃）を用いて行い、２回目の精製物を得た。 ｉｉｉ） ２回目の精製物の第３回目の精製は逆相ＨＰ
ＬＣ［Ｒｐ−１８−５μ（×７７），１５ｃｍ×４ｍｍ
ＩＤ］により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから０．１
Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル
水溶液までの直線勾配（４０分間，１．５ｍｌ／分，室
温）を用いて行い、最終精製物（ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈ）を得た。
【００５９】（８） オリゴヌクレオチドの分析 （ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐ
ＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ） ｉ）ホスホジエステラーゼによる消化 ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（５μｇ，６１．７μｌ）０．２
Ｍ ＭｇＣｌ2 （１０μｌ），０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．５）（１０μｌ）および０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ水溶液（１３．３μｌ）の混合物をホスホジエス
テラーゼ（５単位，５μｌ）で室温にて２０分間処理
し、続いて１００℃で２分間加熱した。 ｉｉ） ＨＰＬＣ分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ（ＣＤＲ
−１０，２５ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ）により水〜２．
０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ３．４）の直線勾配（４０
分間，１．５ｍｌ／分，６０℃）を用いて行った。標準
品の面積を比較することにより、各ピーク面積からその
ヌクレオチド組成を決定した。 計算値：ｐＣOH ５，０００，ｐＡOH ４，０００， ｐＴOH ２，０００，ｐＧOH ４，０００ 実測値：ｐＣOH ４，７６７，ｐＡOH ４，１２７， ｐＴOH ２，０５４，ｐＧOH ４，０５２
ＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ） ｉ）ホスホジエステラーゼによる消化 ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（５μｇ，６１．７μｌ）０．２
Ｍ ＭｇＣｌ2 （１０μｌ），０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．５）（１０μｌ）および０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ水溶液（１３．３μｌ）の混合物をホスホジエス
テラーゼ（５単位，５μｌ）で室温にて２０分間処理
し、続いて１００℃で２分間加熱した。 ｉｉ） ＨＰＬＣ分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ（ＣＤＲ
−１０，２５ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ）により水〜２．
０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ３．４）の直線勾配（４０
分間，１．５ｍｌ／分，６０℃）を用いて行った。標準
品の面積を比較することにより、各ピーク面積からその
ヌクレオチド組成を決定した。 計算値：ｐＣOH ５，０００，ｐＡOH ４，０００， ｐＴOH ２，０００，ｐＧOH ４，０００ 実測値：ｐＣOH ４，７６７，ｐＡOH ４，１２７， ｐＴOH ２，０５４，ｐＧOH ４，０５２
【００６０】実施例２ オリゴヌクレオチド（Ａ１，Ａ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｃ１，
Ｃ２，Ｄ１，Ｄ２，Ｅ１，Ｅ２，Ｆ１，Ｆ２，Ｇ２，Ｈ
１，Ｈ２，Ｉ１，Ｉ２，Ｊ１，Ｊ２，Ｋ１，Ｋ２，Ｌ
１，Ｌ２，Ｍ１，Ｍ２，Ｎ１，Ｎ２，Ｏ１およびＯ２）
の合成：下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載のＧ
１と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧ
ｐＴＯＨ （Ａ１） （２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２） （３） ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＧｐＴｐＧＯＨ（Ｂ１） （４） ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （Ｂ２） （５） ＨＯＣｐＧｐＧｏＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ （Ｃ１） （６） ＨＯＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡ
ｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ （Ｃ２） （７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ （Ｄ１） （８） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ （Ｄ２） （９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ （Ｅ１） （１０） ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ （Ｅ２） （１１） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐ
ＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｆ１） （１２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ （Ｆ２） （１３） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ （Ｇ２） （１４） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ （Ｈ１） （１５） ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡＯＨ （Ｈ２） （１６） ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ （Ｉ１） （１７） ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ （Ｉ２） （１８） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ （Ｊ１） （１９） ＨＯＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ （Ｊ２） （２０） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐ
ＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ （Ｋ１） （２１） ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｋ２） （２２） ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐ
ＣｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴＯＨ （Ｌ１） （２３） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｌ２） （２４） ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ （Ｍ１） （２５） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧＯＨ （Ｍ２） （２７） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡＯＨ （Ｎ１） （２８） ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｎ２） （２９） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （Ｏ１） （３０） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＣＯＨ （Ｏ２）
Ｃ２，Ｄ１，Ｄ２，Ｅ１，Ｅ２，Ｆ１，Ｆ２，Ｇ２，Ｈ
１，Ｈ２，Ｉ１，Ｉ２，Ｊ１，Ｊ２，Ｋ１，Ｋ２，Ｌ
１，Ｌ２，Ｍ１，Ｍ２，Ｎ１，Ｎ２，Ｏ１およびＯ２）
の合成：下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載のＧ
１と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧ
ｐＴＯＨ （Ａ１） （２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２） （３） ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＧｐＴｐＧＯＨ（Ｂ１） （４） ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （Ｂ２） （５） ＨＯＣｐＧｐＧｏＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ （Ｃ１） （６） ＨＯＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡ
ｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ （Ｃ２） （７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ （Ｄ１） （８） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ （Ｄ２） （９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ （Ｅ１） （１０） ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ （Ｅ２） （１１） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐ
ＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｆ１） （１２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ （Ｆ２） （１３） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ （Ｇ２） （１４） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ （Ｈ１） （１５） ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡＯＨ （Ｈ２） （１６） ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ （Ｉ１） （１７） ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ （Ｉ２） （１８） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ （Ｊ１） （１９） ＨＯＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ （Ｊ２） （２０） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐ
ＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ （Ｋ１） （２１） ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｋ２） （２２） ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐ
ＣｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴＯＨ （Ｌ１） （２３） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｌ２） （２４） ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ （Ｍ１） （２５） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧＯＨ （Ｍ２） （２７） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡＯＨ （Ｎ１） （２８） ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｎ２） （２９） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （Ｏ１） （３０） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＣＯＨ （Ｏ２）
【００６１】実施例３ オリゴヌクレオチド（ａ１，ａ２，ａ３，ａ４，ａ５，
ａ６，ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４，ｂ５，ｂ６，ｃ１，ｃ
２，ｃ３，ｃ４，ｃ５，ｃ６，ｄ１，ｄ２，ｄ３，ｄ
４，ｄ５，ｄ６，ｅ１，ｅ２，ｅ３，ｅ４，ｅ５，ｌ
１，ｌ２，ｌ３）の合成：下記オリゴヌクレオチドを実
施例１記載のＧ１と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ （ａ１） （２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡ
ｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ （ａ２） （３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ （ａ３） （４） ＨＯＴｐＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣ
ｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ａ４） （５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＴｐＧ
ｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ （ａ５） （６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ （ａ６） （７） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ （ｂ１） （８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＣｐＡ
ｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ （ｂ２） （９） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡ
ｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ （ｂ３） （１０） ＨＯＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｂ４） （１１） ＨＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ （ｂ５） （１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ （ｂ６） （１３） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣＯＨ （ｃ１） （１４） ＨＯＴｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ （ｃ２） （１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｃ３） （１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｃ４） （１７） ＨＯＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｃ５） （１８） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｃ６） （１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ （ｄ１） （２０） ＨＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＴｐＴＯＨ （ｄ２） （２１） ＨＯＧｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｄ３） （２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐ
ＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ （ｄ４） （２３） ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＧｐＧＯＨ （ｄ５） （２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｄ６） （２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｅ１） （２６） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ （ｅ２） （２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｅ３） （２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ （ｅ４） （２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
ＧｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ （ｅ５） （３０） ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（ｌ１） （３１） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｌ２） （３２） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＴＯＨ （ｌ３）
ａ６，ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４，ｂ５，ｂ６，ｃ１，ｃ
２，ｃ３，ｃ４，ｃ５，ｃ６，ｄ１，ｄ２，ｄ３，ｄ
４，ｄ５，ｄ６，ｅ１，ｅ２，ｅ３，ｅ４，ｅ５，ｌ
１，ｌ２，ｌ３）の合成：下記オリゴヌクレオチドを実
施例１記載のＧ１と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ （ａ１） （２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡ
ｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ （ａ２） （３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ （ａ３） （４） ＨＯＴｐＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣ
ｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ａ４） （５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＴｐＧ
ｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ （ａ５） （６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ （ａ６） （７） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ （ｂ１） （８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＣｐＡ
ｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ （ｂ２） （９） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡ
ｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ （ｂ３） （１０） ＨＯＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｂ４） （１１） ＨＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ （ｂ５） （１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ （ｂ６） （１３） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣＯＨ （ｃ１） （１４） ＨＯＴｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ （ｃ２） （１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｃ３） （１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｃ４） （１７） ＨＯＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｃ５） （１８） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｃ６） （１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ （ｄ１） （２０） ＨＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＴｐＴＯＨ （ｄ２） （２１） ＨＯＧｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ （ｄ３） （２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐ
ＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ （ｄ４） （２３） ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＧｐＧＯＨ （ｄ５） （２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｄ６） （２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ （ｅ１） （２６） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ （ｅ２） （２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ （ｅ３） （２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ （ｅ４） （２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
ＧｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ （ｅ５） （３０） ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（ｌ１） （３１） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｌ２） （３２） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＴＯＨ （ｌ３）
【００６２】実施例４ オリゴヌクレオチド（ｍ１およびｍ２）の合成：下記オ
リゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ｍ１） （２） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＴ
ｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ （ｍ２）
リゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ｍ１） （２） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＴ
ｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ （ｍ２）
【００６３】実施例５ オリゴヌクレオチド（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，
Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，ＭおよびＮ）の合成：下記オリゴ
ヌクレオチドを実施例１と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ （Ａ） （２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ （Ｂ） （３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴ
ｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｃ） （４） ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｄ） （５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ （Ｅ） （６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ （Ｆ） （７） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ （Ｇ） （８） ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ （Ｈ） （９） ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡ
ｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｉ） （１０） ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ （Ｊ） （１１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ （Ｋ） （１２） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ （Ｌ） （１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ （Ｍ） （１４） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣＯＨ （Ｎ）
Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，ＭおよびＮ）の合成：下記オリゴ
ヌクレオチドを実施例１と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ （Ａ） （２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ （Ｂ） （３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴ
ｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ （Ｃ） （４） ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｄ） （５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ （Ｅ） （６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ （Ｆ） （７） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ （Ｇ） （８） ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ （Ｈ） （９） ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡ
ｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯＨ （Ｉ） （１０） ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ （Ｊ） （１１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ （Ｋ） （１２） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ （Ｌ） （１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ （Ｍ） （１４） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣＯＨ （Ｎ）
【００６４】実施例６ オリゴヌクレオチド（ＳＡ，ＡＢ，ＳＣ，ＳＤ，ＳＥ，
ＳＦ，ＳＧおよびＳＨ）の合成： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣ
ｐＴＯＨ （ＳＡ） （２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ （ＳＢ） （３） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣ
ｐＴｐＴｐＴＯＨ （ＳＣ） （４） ＨＯＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴ
ｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （ＳＤ） （５） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧ
ｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ＳＥ） （６） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＣＯＨ （ＳＦ） （７） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ＳＧ） （８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡ
ｐＡｐＣｐＡＯＨ （ＳＨ）
ＳＦ，ＳＧおよびＳＨ）の合成： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣ
ｐＴＯＨ （ＳＡ） （２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ （ＳＢ） （３） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣ
ｐＴｐＴｐＴＯＨ （ＳＣ） （４） ＨＯＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴ
ｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ （ＳＤ） （５） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧ
ｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ （ＳＥ） （６） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＣＯＨ （ＳＦ） （７） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ （ＳＧ） （８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡ
ｐＡｐＣｐＡＯＨ （ＳＨ）
【００６５】実施例７ ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の製造：各オリゴヌクレオチド（Ａ１
−Ｏ１）（０．４ｎＭ）の一部を、７４ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１０ｍＭ ＤＴＴ，１．６ｍ
Ｍメルカプトエタノール，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および
０．５ｍＭＡＴＰを含有する溶液１００μｌ中でＴ4 ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ製）を用いて３７℃で
２０分間リン酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵
素を１００℃で５分間インキュベートし不活性化した。
リン酸化オリゴヌクレオチドのライゲーションは図３に
示すようにして行い、まず１０断片ブロックを得、最終
的にはクローニング用のＩＧＦ−Ｉ遺伝子を得る。ライ
ゲーションはＴ4 ＤＮＡリガーゼ（７単位）を用い、１
００ｍＭＡＴＰ（０．５μｌ）含有溶液中にて４℃で２
３時間（標準条件）行った。各段階におけるオリゴヌク
レオチドのライゲーション生成物は、トリス−ＥＤＴＡ
緩衝溶液中２−１６％グラジエントＰＡＧＥで、臭化エ
チジウム染色により同定した。
−Ｏ１）（０．４ｎＭ）の一部を、７４ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１０ｍＭ ＤＴＴ，１．６ｍ
Ｍメルカプトエタノール，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および
０．５ｍＭＡＴＰを含有する溶液１００μｌ中でＴ4 ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ製）を用いて３７℃で
２０分間リン酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵
素を１００℃で５分間インキュベートし不活性化した。
リン酸化オリゴヌクレオチドのライゲーションは図３に
示すようにして行い、まず１０断片ブロックを得、最終
的にはクローニング用のＩＧＦ−Ｉ遺伝子を得る。ライ
ゲーションはＴ4 ＤＮＡリガーゼ（７単位）を用い、１
００ｍＭＡＴＰ（０．５μｌ）含有溶液中にて４℃で２
３時間（標準条件）行った。各段階におけるオリゴヌク
レオチドのライゲーション生成物は、トリス−ＥＤＴＡ
緩衝溶液中２−１６％グラジエントＰＡＧＥで、臭化エ
チジウム染色により同定した。
【００６６】実施例８ ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニング：プラスミドｐＢＲ３
２２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア
ーゼで消化した。反応を、６５℃で５分間加熱して終了
させ、断片を０．５％アガロースゲル電気泳動により分
離した。ｐＢＲ３２２由来の大きな断片３９８５ｂｐを
回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１２℃で１８時間ライゲ
ートさせ、２２４ｂｐＩＧＦ−Ｉ遺伝子を得た。ライゲ
ーション混合部を用いてクッシュナー法により、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリン耐性形
質転換体をテトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）を含有
するプレート上で選択した。アンピシリンに耐性でテト
ラサイクリンに感受性を示す５クローンの１つから分離
したプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで
消化させ、適当なサイズマーカーと比較した。予期した
２２４ｂｐＩＧＦ−Ｉ断片が生じた。このプラスミドは
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の完全ヌクレオチド配列によって特徴
づけられ、ｐＳｄＭ１と命名し、発現ベクターの構築に
使用した。
２２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア
ーゼで消化した。反応を、６５℃で５分間加熱して終了
させ、断片を０．５％アガロースゲル電気泳動により分
離した。ｐＢＲ３２２由来の大きな断片３９８５ｂｐを
回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１２℃で１８時間ライゲ
ートさせ、２２４ｂｐＩＧＦ−Ｉ遺伝子を得た。ライゲ
ーション混合部を用いてクッシュナー法により、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリン耐性形
質転換体をテトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）を含有
するプレート上で選択した。アンピシリンに耐性でテト
ラサイクリンに感受性を示す５クローンの１つから分離
したプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで
消化させ、適当なサイズマーカーと比較した。予期した
２２４ｂｐＩＧＦ−Ｉ断片が生じた。このプラスミドは
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の完全ヌクレオチド配列によって特徴
づけられ、ｐＳｄＭ１と命名し、発現ベクターの構築に
使用した。
【００６７】実施例９ 合成ｔｒｐプロモーター遺伝子Ｉの構築：ブロックＩ，
ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれのオリゴヌクレオチド（Ｂ
−Ｍ）をＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、
前述のようにＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートした。次
いでこのブロック（Ｉ−ＩＩＩ）と未リン酸化オリゴヌ
クレオチド（Ａ，Ｎ）を縮合させた。最後のライゲーシ
ョン生成物を分取用７．５％ＰＡＧＥにより精製し、１
０７ｂｐの合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子を得た。
ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれのオリゴヌクレオチド（Ｂ
−Ｍ）をＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、
前述のようにＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートした。次
いでこのブロック（Ｉ−ＩＩＩ）と未リン酸化オリゴヌ
クレオチド（Ａ，Ｎ）を縮合させた。最後のライゲーシ
ョン生成物を分取用７．５％ＰＡＧＥにより精製し、１
０７ｂｐの合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子を得た。
【００６８】実施例１０ 合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のクローニング：プラ
スミドｐＢＲ３２５をＥｃｏＲＩで消化し、線状ｐＢＲ
３２５を前記ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子とライゲート
した。このライゲーション混合物によるＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１の形質転換体を抗生物質含有プレート上でス
クリーニングし、 RＡｍｐ SＣｍコロニー４つを得た。
この４コロニーから得たプラスミドをそれぞれＨｐａＩ
で消化した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によ
りこれらプラスミドから得た断片をＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＥｃｏＲＩ消化によるｐＢＲ３２５の断片と比較し
た。４つのプラスミドのうちの１つは正しい方向のプロ
モーター遺伝子（ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子）を有
し、他のものは逆方向に挿入されていた。
スミドｐＢＲ３２５をＥｃｏＲＩで消化し、線状ｐＢＲ
３２５を前記ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子とライゲート
した。このライゲーション混合物によるＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１の形質転換体を抗生物質含有プレート上でス
クリーニングし、 RＡｍｐ SＣｍコロニー４つを得た。
この４コロニーから得たプラスミドをそれぞれＨｐａＩ
で消化した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化によ
りこれらプラスミドから得た断片をＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＥｃｏＲＩ消化によるｐＢＲ３２５の断片と比較し
た。４つのプラスミドのうちの１つは正しい方向のプロ
モーター遺伝子（ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子）を有
し、他のものは逆方向に挿入されていた。
【００６９】実施例１１ 合成ｔｒｐプロモーターII遺伝子の構築およびクローニ
ング：ｔｒｐプロモーターＩＩ遺伝子は前述と同じ方法
で構築した。合成遺伝子はＥｃｏＲＩ，ｐＢＲ３２２の
ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、続いてＥ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１をライゲーション生成物で形質転換させた。 R
Ａｍｐおよび SＴｅｔの形質転換体から得たプラスミド
をＨｐａＩで消化してバンド（４．１ｋｂｐ）を確認
し、続いてＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥで９０ｂｐの
バンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消
化による５６ｂｐの断片はＰＡＧＥでサイズマーカーと
比較することにより確認した。このプラスミドをｐＴｒ
ｐＥＢ７と命名し、発現ベクターの構築に使用した。
ング：ｔｒｐプロモーターＩＩ遺伝子は前述と同じ方法
で構築した。合成遺伝子はＥｃｏＲＩ，ｐＢＲ３２２の
ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、続いてＥ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１をライゲーション生成物で形質転換させた。 R
Ａｍｐおよび SＴｅｔの形質転換体から得たプラスミド
をＨｐａＩで消化してバンド（４．１ｋｂｐ）を確認
し、続いてＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥで９０ｂｐの
バンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消
化による５６ｂｐの断片はＰＡＧＥでサイズマーカーと
比較することにより確認した。このプラスミドをｐＴｒ
ｐＥＢ７と命名し、発現ベクターの構築に使用した。
【００７０】実施例１２ ＩＧＦ−Ｉ発現ベクター（ｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐ）
の構築：ＴｒｐプロモータＩＩベクター（ｐＴｒｐＥＢ
７）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥ
により大きな断片（４．１ｋｂｐ）を得た。この断片を
プラスミドｐＳｄＭ１から製造したＩＧＦ−Ｉ遺伝子と
ライゲートした。このライゲーション混合物でＥ．ｃｏ
ｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリン耐性でテ
トラサイクリン感受性の形質転換体を選択した。得られ
たプラスミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩで消化し、７．５％ＰＡＧＥでＩＧＦ−
Ｉ遺伝子（２２４ｂｐ）を確認した。
の構築：ＴｒｐプロモータＩＩベクター（ｐＴｒｐＥＢ
７）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥ
により大きな断片（４．１ｋｂｐ）を得た。この断片を
プラスミドｐＳｄＭ１から製造したＩＧＦ−Ｉ遺伝子と
ライゲートした。このライゲーション混合物でＥ．ｃｏ
ｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリン耐性でテ
トラサイクリン感受性の形質転換体を選択した。得られ
たプラスミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩで消化し、７．５％ＰＡＧＥでＩＧＦ−
Ｉ遺伝子（２２４ｂｐ）を確認した。
【００７１】実施例１３ ＩＧＦ−Ｉ遺伝子およびｔｒｐプロモータ遺伝子の配列
決定：マキサム−ギルバート法によるＩＧＦ−Ｉ遺伝子
およびｔｒｐプロモータ遺伝子の配列決定のため、プラ
スミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩで消化
し、大腸菌アルカリホスホターゼを用い３７℃で１時間
処理した。フエノール抽出およびエタノール沈澱後、プ
ラスミドをγ−32ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ ポリヌクレ
オチドキナーゼを用い３７℃で１時間リン酸化し、最後
にＨｉｎｆＩで消化し、２つの断片（１１００ｂｐ，４
８０ｂｐ）を得た。各断片はマキサム−ギルバート法
［Ａ．Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５
６０（１９７７）］に従って配列決定した。得られたＩ
ＧＦ−Ｉおよびｔｒｐプロモータ遺伝子の配列は設計し
たものと一致した。
決定：マキサム−ギルバート法によるＩＧＦ−Ｉ遺伝子
およびｔｒｐプロモータ遺伝子の配列決定のため、プラ
スミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩで消化
し、大腸菌アルカリホスホターゼを用い３７℃で１時間
処理した。フエノール抽出およびエタノール沈澱後、プ
ラスミドをγ−32ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ ポリヌクレ
オチドキナーゼを用い３７℃で１時間リン酸化し、最後
にＨｉｎｆＩで消化し、２つの断片（１１００ｂｐ，４
８０ｂｐ）を得た。各断片はマキサム−ギルバート法
［Ａ．Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５
６０（１９７７）］に従って配列決定した。得られたＩ
ＧＦ−Ｉおよびｔｒｐプロモータ遺伝子の配列は設計し
たものと一致した。
【００７２】実施例１４ プラスミドｐＳｄＭ１中ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の配列決定：
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の配列を調べるため、プラスミドｐＳ
ｄＭ１をＥｃｏＲＩで消化し、次いでα−32Ｐ−ＡＴＰ
の存在下にＡＭＶ逆転写酵素（生化学工業（株）より購
入）を用い３７℃で３０分間処理した。32Ｐで標識され
た線状プラスミドをＢａｍＨＩで消化し、２つの断片
（２２４ｂｐ，４．０ｂｐ）を得た。小さい断片（２２
４ｂｐ）は分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り回収し、マキサム−ギルバート法の手順に従って配列
決定した。一方、プラスミドｐＳｄＭ１はまずＢａｍＨ
Ｉで消化し、次に前述のように32Ｐで標識した。線状プ
ラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、２つの断片（２２４ｂ
ｐ，４．０ｋｂｐ）を得た。小さい断片（２２４ｂｐ）
は前述のようにマキサム−ギルバート法により分析し
た。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の両側からの配列決定の結果は、
設計したＩＧＦ−Ｉ遺伝子と一致した。
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の配列を調べるため、プラスミドｐＳ
ｄＭ１をＥｃｏＲＩで消化し、次いでα−32Ｐ−ＡＴＰ
の存在下にＡＭＶ逆転写酵素（生化学工業（株）より購
入）を用い３７℃で３０分間処理した。32Ｐで標識され
た線状プラスミドをＢａｍＨＩで消化し、２つの断片
（２２４ｂｐ，４．０ｂｐ）を得た。小さい断片（２２
４ｂｐ）は分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り回収し、マキサム−ギルバート法の手順に従って配列
決定した。一方、プラスミドｐＳｄＭ１はまずＢａｍＨ
Ｉで消化し、次に前述のように32Ｐで標識した。線状プ
ラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、２つの断片（２２４ｂ
ｐ，４．０ｋｂｐ）を得た。小さい断片（２２４ｂｐ）
は前述のようにマキサム−ギルバート法により分析し
た。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の両側からの配列決定の結果は、
設計したＩＧＦ−Ｉ遺伝子と一致した。
【００７３】実施例１５ 蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の調製：各オリゴヌクレオチド
（ａ２−ｌ２）の一部（０．４ｎＭ）を５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），２０ｍＭ ＤＴＴ，５０
μｇ／ｍｌ ＢＳＡ，１ｍＭスペルミジン，１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 および２ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液４０μ
ｌ中で２．５単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼを用
い３７℃で３時間リン酸化した。反応終了後、反応混合
物中の酵素を１００℃で５分間インキュベートして不活
性化した。リン酸化オリゴヌクレオチドと２つのオリゴ
ヌクレオチド（ａ１およびｌ３）のライゲーションは第
７図に示すようにして行い、まず６フラグメントブロッ
クを得、最終的にクローニング用の蛋白ペプチドＬＨ遺
伝子（２３６ｂｐ）を得た。ライゲーションはＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（５単位）を用い、５０ｍＭ ＡＴＰ含有溶
液（１μｌ）中１６℃で５時間行った。各段階のオリゴ
ヌクレオチドのライゲーション生成物はＴｒｉｓ−ＥＤ
ＴＡ緩衝液中２−１６％グラジエントＰＡＧＥで臭化エ
チジウム染色により同定した。
（ａ２−ｌ２）の一部（０．４ｎＭ）を５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），２０ｍＭ ＤＴＴ，５０
μｇ／ｍｌ ＢＳＡ，１ｍＭスペルミジン，１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 および２ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液４０μ
ｌ中で２．５単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼを用
い３７℃で３時間リン酸化した。反応終了後、反応混合
物中の酵素を１００℃で５分間インキュベートして不活
性化した。リン酸化オリゴヌクレオチドと２つのオリゴ
ヌクレオチド（ａ１およびｌ３）のライゲーションは第
７図に示すようにして行い、まず６フラグメントブロッ
クを得、最終的にクローニング用の蛋白ペプチドＬＨ遺
伝子（２３６ｂｐ）を得た。ライゲーションはＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（５単位）を用い、５０ｍＭ ＡＴＰ含有溶
液（１μｌ）中１６℃で５時間行った。各段階のオリゴ
ヌクレオチドのライゲーション生成物はＴｒｉｓ−ＥＤ
ＴＡ緩衝液中２−１６％グラジエントＰＡＧＥで臭化エ
チジウム染色により同定した。
【００７４】実施例１６ 蛋白ペプチドＬＨ遺伝子のクローニング：前述のように
して合成した蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３６ｂｐ）を
実施例８と同様の方法でｐＢＲ３２２に挿入した。Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１形質転換体から得たプラスミド
（ｐＬＨ１０７）は、制限酵素分析により蛋白ペプチド
ＬＨ（２３６ｂｐ）を有していることが明らかになっ
た。
して合成した蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３６ｂｐ）を
実施例８と同様の方法でｐＢＲ３２２に挿入した。Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１形質転換体から得たプラスミド
（ｐＬＨ１０７）は、制限酵素分析により蛋白ペプチド
ＬＨ（２３６ｂｐ）を有していることが明らかになっ
た。
【００７５】実施例１７ ｔｒｐプロモーターＩＩ遺伝子の構築：ブロックＩ’，
ＩＩ’，ＩＩＩ’およびＩＶ’の各オリゴヌクレオチド
（Ｂ〜ＳＧ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸
化し、次いで前述のようにＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲ
ートした。これらのブロック（Ｉ’〜ＩＶ’）と未リン
酸化オリゴヌクレオチド（ＡおよびＳＨ）を続いて縮合
した。最終ライゲーション生成物は分取用７．５％ＰＡ
ＧＥで精製し、１６３ｂｐのｔｒｐプロモーターＩＩ遺
伝子を得た。
ＩＩ’，ＩＩＩ’およびＩＶ’の各オリゴヌクレオチド
（Ｂ〜ＳＧ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸
化し、次いで前述のようにＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲ
ートした。これらのブロック（Ｉ’〜ＩＶ’）と未リン
酸化オリゴヌクレオチド（ＡおよびＳＨ）を続いて縮合
した。最終ライゲーション生成物は分取用７．５％ＰＡ
ＧＥで精製し、１６３ｂｐのｔｒｐプロモーターＩＩ遺
伝子を得た。
【００７６】実施例１８ ｔｒｐプロモータＩＩ遺伝子のクローニング：実施例１
７で構築したｔｒｐプロモータＩＩ遺伝子をｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、次い
でＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１をライゲーション生成物を
用い形質転換させた。RＡｍｐ， SＴｅｔ形質転換体か
ら得たプラスミドをＨｐａＩで消化してバンド（４．１
ｋｂｐ）を確認し、次いでＢａｍＨＩで消化しＰＡＧＥ
にて９０ｂｐのバンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ消化による５６ｂｐの断片をＰＡＧＥにて
サイズマーカーと比較することにより、確認した。この
プラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクターの
構築に用いた。
７で構築したｔｒｐプロモータＩＩ遺伝子をｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、次い
でＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１をライゲーション生成物を
用い形質転換させた。RＡｍｐ， SＴｅｔ形質転換体か
ら得たプラスミドをＨｐａＩで消化してバンド（４．１
ｋｂｐ）を確認し、次いでＢａｍＨＩで消化しＰＡＧＥ
にて９０ｂｐのバンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ消化による５６ｂｐの断片をＰＡＧＥにて
サイズマーカーと比較することにより、確認した。この
プラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクターの
構築に用いた。
【００７７】実施例１９ 蛋白ペプチドＬＨ発現ベクター（ｐＬＨｔｒｐ）の構
築：実施例１８で製造したｔｒｐプロモーターＩＩベク
ター（ｐＴｒｐＥＢ７）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消
化し、分取用アガロースゲル電気泳動により大きな断片
（４．１ｋｂｐ）を得た。この断片をＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ消化によりプラスミドｐＬＨ１０７から調製した
蛋白ペプチドＬＨ遺伝子とライゲートした。ライゲーシ
ョン混合物を用いＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換
させ、アンピシリンに耐性でテトラサイクリン感受性を
示す形質転換体を得た。形質転換体から得たプラスミド
（ｐＬＨｔｒｐ）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、
７．５％ＰＡＧＥにて蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３６
ｂｐ）を確認した。
築：実施例１８で製造したｔｒｐプロモーターＩＩベク
ター（ｐＴｒｐＥＢ７）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消
化し、分取用アガロースゲル電気泳動により大きな断片
（４．１ｋｂｐ）を得た。この断片をＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ消化によりプラスミドｐＬＨ１０７から調製した
蛋白ペプチドＬＨ遺伝子とライゲートした。ライゲーシ
ョン混合物を用いＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換
させ、アンピシリンに耐性でテトラサイクリン感受性を
示す形質転換体を得た。形質転換体から得たプラスミド
（ｐＬＨｔｒｐ）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、
７．５％ＰＡＧＥにて蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３６
ｂｐ）を確認した。
【００７８】実施例２０ ＩＧＦ−Ｉ発現ベクターｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐの構築：
プラスミドｐＳｄＭ１をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化
し、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子（２２４ｂｐ）を得た。一方、実
施例４（２）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍ２）を
実施例７に記載したようにＴ４プリヌクレオチドキナー
ゼでリン酸化した。このリン酸化オリゴヌクレオチド、
実施例４（１）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍ１）
およびＩＧＦ−Ｉ遺伝子（２２４ｂｐ）を混合し、１０
０ｍＭＡＴＰを含有する溶液中でＴ４リガーゼを用い４
℃で２０時間処理した。ライゲーション混合物をＢａｍ
ＨＩで消化し、次いで分取用ＰＡＧＥで精製してリンカ
ー付きＩＧＦ−Ｉ遺伝子（２４２ｂｐ）を得た。この遺
伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ消化によりｐＬＨ
ｔｒｐから得た断片をライゲートし、ライゲーション混
合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換させ
た。プラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐ含有Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１をＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−６と命名し、１９８
４年９月１７日に寄託番号ＦＥＲＭ−７８４８の下に、
工業技術院微生物工業技術研究所（日本国茨城県筑波郡
谷田部町東１丁目，郵便番号３０５）に寄託した。該寄
託金はその後１９８５年２月２８日に同所のブタペスト
条約に基づく国際寄託に変更された（寄託番号ＦＥＲＭ
−ＢＰ７２９）。形質転換体から得たプラスミド（ｐＬ
ＨＳｄＭｍｔｒｐ）をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（１９
８，２２４ｂｐ），ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（２４
２ｂｐ）およびＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ（４５６ｂｐ）で
消化し、７．５％ＰＡＧＥにてｔｒｐプロモーター，蛋
白ペプチドＬＨおよびＩＧＦ−Ｉ遺伝子を確認した。
プラスミドｐＳｄＭ１をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化
し、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子（２２４ｂｐ）を得た。一方、実
施例４（２）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍ２）を
実施例７に記載したようにＴ４プリヌクレオチドキナー
ゼでリン酸化した。このリン酸化オリゴヌクレオチド、
実施例４（１）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍ１）
およびＩＧＦ−Ｉ遺伝子（２２４ｂｐ）を混合し、１０
０ｍＭＡＴＰを含有する溶液中でＴ４リガーゼを用い４
℃で２０時間処理した。ライゲーション混合物をＢａｍ
ＨＩで消化し、次いで分取用ＰＡＧＥで精製してリンカ
ー付きＩＧＦ−Ｉ遺伝子（２４２ｂｐ）を得た。この遺
伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ消化によりｐＬＨ
ｔｒｐから得た断片をライゲートし、ライゲーション混
合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換させ
た。プラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐ含有Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１をＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−６と命名し、１９８
４年９月１７日に寄託番号ＦＥＲＭ−７８４８の下に、
工業技術院微生物工業技術研究所（日本国茨城県筑波郡
谷田部町東１丁目，郵便番号３０５）に寄託した。該寄
託金はその後１９８５年２月２８日に同所のブタペスト
条約に基づく国際寄託に変更された（寄託番号ＦＥＲＭ
−ＢＰ７２９）。形質転換体から得たプラスミド（ｐＬ
ＨＳｄＭｍｔｒｐ）をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（１９
８，２２４ｂｐ），ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（２４
２ｂｐ）およびＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ（４５６ｂｐ）で
消化し、７．５％ＰＡＧＥにてｔｒｐプロモーター，蛋
白ペプチドＬＨおよびＩＧＦ−Ｉ遺伝子を確認した。
【００７９】実施例２１ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆ−６における蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ
ＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の発現：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆ
−６（プラスミド ｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐ含有Ｅ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１）（ＦＥＲＭＢＰ−７２９）をアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ含有Ｌブロス中で一晩培養し、０．
２％グルコース，０．５％カザミノ酸（酸加水分解カゼ
イン），５０μｇ／ｍｌビタミンＢ1 および２５μｇ／
ｍｌアンピシリン含有Ｍ−９培地に１：２０の割合で希
釈した。β−インドールアクリル酸を加え最終濃度１０
μｇ／ｍｌとした。この時のＡ600 は０．５であった。
次に、菌体を２時間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ，４
℃，５分間）により収集した。
ＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の発現：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆ
−６（プラスミド ｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐ含有Ｅ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１）（ＦＥＲＭＢＰ−７２９）をアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ含有Ｌブロス中で一晩培養し、０．
２％グルコース，０．５％カザミノ酸（酸加水分解カゼ
イン），５０μｇ／ｍｌビタミンＢ1 および２５μｇ／
ｍｌアンピシリン含有Ｍ−９培地に１：２０の割合で希
釈した。β−インドールアクリル酸を加え最終濃度１０
μｇ／ｍｌとした。この時のＡ600 は０．５であった。
次に、菌体を２時間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ，４
℃，５分間）により収集した。
【００８０】実施例２２ ＩＧＦ−Ｉの分離および精製 （１） 融合ＩＧＦ−Ｉの分離および精製 湿潤細胞ペースト（６０ｇ）を１０ｍＭＰＢＳ−ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８．０）１５０ｍｌに懸濁し、菌体を超音波処
理により破壊した。菌体残屑を１８０００ｒｐｍで３０
分間遠心分離してペレット化した。得られたペレットを
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／８Ｍ尿素
−０．１Ｍジチオスレイトール（５０ｍｌ）に溶かし、
３５，０００ｒｐｍ，２５℃で３０分間遠心分離した。
上清を取り、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）／８Ｍ尿素および１０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルで平衡化したセファクリルＳ３００スーパーファイン
カラム（５．０×８６．６ｃｍ，１７００ｍｌ樹脂）に
かけた。溶出は４℃で平衡緩衝液を用い、流速０．６ｍ
ｌ／分で行った。セファクリルＳ３００クロマトグラフ
ィを行い、画分１７ｍｌを集めた。セファクリルＳ３０
０クロマトグラフィを行った。定量は全クロマトグラフ
ィ段階について画分後直ちに行った。活性画分を集め、
合わせた画分２５５ｍｌを１Ｍ酢酸水溶液８ｌを用い室
温で３時間透析し、次いで新たに１Ｍ酢酸水溶液８ｌを
用い一晩透析した。透析画分は凍結乾燥し、所望の成分
を含有する融合ＩＧＦ−Ｉ ４５０ｍｇを得た。この融
合ＩＧＦ−Ｉは、１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥにて分子量１
５，５００の位置にバンドを示す。 （２） 臭化シアンによる融合ＩＧＦ−Ｉからの蛋白ペ
プチドＬＨの脱離 操作（１）により得た融合ＩＧＦ−Ｉ（２２５ｍｇ）を
６０％ギ酸３６ｍｌに溶解した。臭化シアン（３６ｍ
ｇ）を加え、２５℃以下で３時間撹拌下に反応させた。
蒸留水２３４ｍｌを加えた後、ギ酸および臭化シアンを
凍結乾燥により除去した。残渣を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）／８Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプト
エタノール３６ｍｌに溶かした。この溶液を０．０１Ｍ
ＡｃＯＮＨ4 （ｐＨ４．６）／８Ｍ尿素−５０ｍＭ２
−メルカプトエタノール（バッファーＡ）４００ｍｌを
用い室温で３時間、２回透析し、次いで新しいバッファ
ーＡ４００ｍｌを用い一晩透析した。透析溶液はバッフ
ァーＡで平衡化したカチオン交換樹脂ＣＭ５２カラム
（１．６×７．５ｃｍ １５ｍｌ樹脂）にかけた。カラ
ムはバッファーＡ（６０ｍｌ）を用い、室温にて流速
０．２５ｍｌ／分で洗浄し、バッファーＡ（１２０ｍ
ｌ）から０．２Ｍ ＡｃＯＮＨ4 ／８Ｍ尿素−５０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール（１２０ｍｌ）までの直線
勾配で溶出した。画分（Ｎｏ．５７〜Ｎｏ．１００）
２．９ｍｌを集めた。 （３） 高速液体クロマトグラフィ：操作（２）により
得たプール画分を用いた。 カラム：ベックマンウルトラポアＲＰＳＣ（４．６×７
５ｍｍ） 流 速：１ｍｌ／分 溶 出：０．０１Ｍトリフルオロ酢酸中１０％から６０
％までのアセトニトリルの直線勾配；５０分間 クロマトグラフィーは１５回繰返して還元型ＩＧＦ−Ｉ
含有画分を集めた。保持時間２９．３２分の主ピークは
還元型ＩＧＦ−Ｉに相当する。前述の操作により還元Ｉ
ＧＦ−Ｉ約２．４ｍｇを得た。この還元型ＩＧＦ−Ｉは
通常の再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）法により酸化型ＩＧ
Ｆ−Ｉに変えた。このＩＧＦ−Ｉは、ＨＰＬＣにおいて
Ｈｕｍｂｅｌ 博士のＩＧＦ−Ｉ標品と重なった。 （４） ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸分析および配列分析：Ｉ
ＧＦ−Ｉのアミノ酸組成はウォーターズ社製アミノ酸分
析システムを用いて得た。ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列
は、第３表に示すように、エドマン法（ＤＩＢＩＴＣ
法）［Ｊ．Ｙ．Ｃｈａｎｇ ら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．，１５３，６０７（１９７６）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，５７８，１８８（１９７
９）］とカルボキシペプチダーゼ法を組合せて決定し
た。
Ａ（ｐＨ８．０）１５０ｍｌに懸濁し、菌体を超音波処
理により破壊した。菌体残屑を１８０００ｒｐｍで３０
分間遠心分離してペレット化した。得られたペレットを
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／８Ｍ尿素
−０．１Ｍジチオスレイトール（５０ｍｌ）に溶かし、
３５，０００ｒｐｍ，２５℃で３０分間遠心分離した。
上清を取り、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）／８Ｍ尿素および１０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルで平衡化したセファクリルＳ３００スーパーファイン
カラム（５．０×８６．６ｃｍ，１７００ｍｌ樹脂）に
かけた。溶出は４℃で平衡緩衝液を用い、流速０．６ｍ
ｌ／分で行った。セファクリルＳ３００クロマトグラフ
ィを行い、画分１７ｍｌを集めた。セファクリルＳ３０
０クロマトグラフィを行った。定量は全クロマトグラフ
ィ段階について画分後直ちに行った。活性画分を集め、
合わせた画分２５５ｍｌを１Ｍ酢酸水溶液８ｌを用い室
温で３時間透析し、次いで新たに１Ｍ酢酸水溶液８ｌを
用い一晩透析した。透析画分は凍結乾燥し、所望の成分
を含有する融合ＩＧＦ−Ｉ ４５０ｍｇを得た。この融
合ＩＧＦ−Ｉは、１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥにて分子量１
５，５００の位置にバンドを示す。 （２） 臭化シアンによる融合ＩＧＦ−Ｉからの蛋白ペ
プチドＬＨの脱離 操作（１）により得た融合ＩＧＦ−Ｉ（２２５ｍｇ）を
６０％ギ酸３６ｍｌに溶解した。臭化シアン（３６ｍ
ｇ）を加え、２５℃以下で３時間撹拌下に反応させた。
蒸留水２３４ｍｌを加えた後、ギ酸および臭化シアンを
凍結乾燥により除去した。残渣を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）／８Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプト
エタノール３６ｍｌに溶かした。この溶液を０．０１Ｍ
ＡｃＯＮＨ4 （ｐＨ４．６）／８Ｍ尿素−５０ｍＭ２
−メルカプトエタノール（バッファーＡ）４００ｍｌを
用い室温で３時間、２回透析し、次いで新しいバッファ
ーＡ４００ｍｌを用い一晩透析した。透析溶液はバッフ
ァーＡで平衡化したカチオン交換樹脂ＣＭ５２カラム
（１．６×７．５ｃｍ １５ｍｌ樹脂）にかけた。カラ
ムはバッファーＡ（６０ｍｌ）を用い、室温にて流速
０．２５ｍｌ／分で洗浄し、バッファーＡ（１２０ｍ
ｌ）から０．２Ｍ ＡｃＯＮＨ4 ／８Ｍ尿素−５０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール（１２０ｍｌ）までの直線
勾配で溶出した。画分（Ｎｏ．５７〜Ｎｏ．１００）
２．９ｍｌを集めた。 （３） 高速液体クロマトグラフィ：操作（２）により
得たプール画分を用いた。 カラム：ベックマンウルトラポアＲＰＳＣ（４．６×７
５ｍｍ） 流 速：１ｍｌ／分 溶 出：０．０１Ｍトリフルオロ酢酸中１０％から６０
％までのアセトニトリルの直線勾配；５０分間 クロマトグラフィーは１５回繰返して還元型ＩＧＦ−Ｉ
含有画分を集めた。保持時間２９．３２分の主ピークは
還元型ＩＧＦ−Ｉに相当する。前述の操作により還元Ｉ
ＧＦ−Ｉ約２．４ｍｇを得た。この還元型ＩＧＦ−Ｉは
通常の再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）法により酸化型ＩＧ
Ｆ−Ｉに変えた。このＩＧＦ−Ｉは、ＨＰＬＣにおいて
Ｈｕｍｂｅｌ 博士のＩＧＦ−Ｉ標品と重なった。 （４） ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸分析および配列分析：Ｉ
ＧＦ−Ｉのアミノ酸組成はウォーターズ社製アミノ酸分
析システムを用いて得た。ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列
は、第３表に示すように、エドマン法（ＤＩＢＩＴＣ
法）［Ｊ．Ｙ．Ｃｈａｎｇ ら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．，１５３，６０７（１９７６）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，５７８，１８８（１９７
９）］とカルボキシペプチダーゼ法を組合せて決定し
た。
【００８１】第３表 ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列の決定
【化２６】
【図１】ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の構築の工程を示した図で
す。
す。
【図２】ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクロ−ニングの工程を示し
た図です。
た図です。
【図３】合成ｔｒｐプロモ−タ−Ｉ遺伝子の構築の工程
を示した図です。
を示した図です。
【図４】合成ｔｒｐプロモ−タ−Ｉ遺伝子のクローニン
グの工程を示した図です。
グの工程を示した図です。
【図５】合成ｔｒｐプロモ−タ−ＩＩ遺伝子の構築の工
程を示した図です。
程を示した図です。
【図６】合成ｔｒｐプロモ−タ−ＩＩ遺伝子のクローニ
ングの工程を示した図です。
ングの工程を示した図です。
【図７】蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の構築の工程を示した
図です。
図です。
【図８】蛋白ペプチドＬＨ遺伝子のクロ−ニングの工程
を示した図です。
を示した図です。
【図９】組換えプラスミドｐＳｄＭ１ｔｒｐの構築の工
程を示した図です。
程を示した図です。
【図１０】組換えプラスミドｐＳｄＭ１−３２２ｔｒｐ
の構築の工程を示した図です。
の構築の工程を示した図です。
【図１１】組換えプラスミドｐＬＨｔｒｐの構築の工程
を示した図です。
を示した図です。
【図１２】組換えプラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐの構
築の工程を示した図です。
築の工程を示した図です。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/18 // Ｃ０７Ｋ 1/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 小野 裕樹 大阪府三島郡島本町青葉３−12−３−402 (72)発明者 北口 忠司 尼崎市久々知西町１−９−９
Claims (4)
- 【請求項１】 保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメ
チオニンを有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプ
チドの該メチオニンを介してインスリン様成長因子Ｉと
融合している保護ペプチド融合インスリン様成長因子Ｉ
をコードしている遺伝子。 - 【請求項２】 保護ペプチド融合インスリン様成長因子
Ｉが次のアミノ酸配列を有する請求項１の遺伝子。 【化１】 - 【請求項３】 請求項１または２記載の遺伝子を含むプ
ラスミド。 - 【請求項４】 請求項１または２記載の遺伝子を含むプ
ラスミドで形質転換された形質転換体。
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