JPH05292978A - プロテインジスルフィドイソメラーゼの基質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の７９
位および８１位をそれぞれシステインおよびアラニンに
置き換えた変異型ヒトリゾチームをコードする遺伝子、
該遺伝子を利用した変異型ヒトリゾチームの製造法を提
供する。 【効果】 本発明の変異型ヒトリゾチームは、プロテイ
ンジスルフィドイソメラーゼの機能定量に用いる基質と
して有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、天然型ヒトリゾチーム
(以下、単にヒトリゾチームともいう)のアミノ酸配列の
７９位のロイシンがシステインで、また８１位のシステ
インがアラニンで置き換えられた変異型ヒトリゾチーム
をコードする遺伝子、該遺伝子を発現させるための発現
ベクター、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
該形質転換体を用いて変異型ヒトリゾチームを製造する
方法、並びにこのようにして製造した変異型ヒトリゾチ
ームに関する。本発明に係る変異型ヒトリゾチームは、
プロテインジスルフィドイソメラーゼ（以下、ＰＤＩと
いう）の機能定量に使用する基質として有用である。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決すべき課題】近年組換え
ＤＮＡ技術によって多くの異種蛋白質が大腸菌などの宿
主を用いて大量に発現されるようになった。しかし、多
くの蛋白質は大腸菌体内では正しい構造がとれず、不活
性型として蓄積されることが分かってきた。これらの事
実から、現在蛋白質に正しい構造を形成させることの重
要性が広く認識されてきている。生体内には蛋白質の正
しい構造形成を助けるいくつかの蛋白質の存在が知られ
ており、ＰＤＩもその一つである。高等生物由来の多く
の蛋白質がその構造の中にジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結
合）をもっていることは広く知られており、このＳ−Ｓ
結合が蛋白質の正しい構造形成を助け、かつ蛋白質の最
終の高次構造の安定化に寄与している。ＰＤＩはこのＳ
−Ｓ結合を形成する酵素として知られ、分子量約５５Ｋ
のポリペプチド鎖からなるホモダイマーとして機能を発
揮する。ＰＤＩは、生体内では主として小胞体（ＥＲ）
に局在している。ＰＤＩの機能定量は極めて重要である
が、現在の定量法は、還元条件下で変性させたリボヌク
レアーゼの再生を促進する因子がラット肝の小胞体に存
在するという発見（Ｇoldberger,Ｒ.Ｆ.，Ｅpstein,Ｃ.
Ｊ．and Ａnfinsen,Ｃ.Ｂ.；Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，２３
９，１４０６（１９６４））に基づいている。具体的に
は、還元してＳ−Ｓ結合を切断したリボヌクレアーゼ
や、誤ったＳ−Ｓ結合をもったリボヌクレアーゼを基質
とし、ＰＤＩ存在下でどの程度リボヌクレアーゼ活性が
もどるかを測定するものである。しかし、上記した如き
変性リボヌクレアーゼのかなりの部分が自律的に活性型
にもどるため、この方法には、条件設定が困難なことお
よび再現性のあるデータ収集に苦労するなど、多くの問
題点が存在する。

【０００３】本発明者らは、ＰＤＩの機能定量に使用さ
れるより優れた基質を求めて鋭意研究を重ねた結果、ヒ
トリゾチームの７９位のロイシンをシステインに、８１
位のシステインをアラニンに置換することにより得られ
る変異型ヒトリゾチームがＰＤＩの基質として極めて優
れていることを見い出し本発明を完成した。即ち、本発
明に係る変異型ヒトリゾチームは、それ自体が十分安定
であり、ＰＤＩの作用によって定量的にＳ−Ｓ結合を有
する反応生成物に変換されるため、信頼度の高いＰＤＩ
の機能定量が可能である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、天然型
ヒトリゾチームの７９位のロイシンがシステインで、８
１位のシステインがアラニンで置換されたポリペプチド
をコードする変異型ヒトリゾチーム遺伝子とその利用方
法を提供するものである。また本発明は、変異型ヒトリ
ゾチーム遺伝子とシグナルペプチドをコードしているヌ
クレオチド配列を含有し、真核生物内で自律的に複製可
能な発現ベクターを提供するものである。

【０００５】さらに本発明は、上記発現ベクターで形質
転換され、変異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得る
形質転換体、並びに、該形質転換体を培養し、培養液中
に分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を
分離し、所望により精製することからなる変異型ヒトリ
ゾチームの製造方法、およびこのようにして製造された
変異型ヒトリゾチームを提供するものである。天然型ヒ
トリゾチームは１３０個のアミノ酸からなり、そのアミ
ノ酸配列は公知である［日本生化学会編：生化学データ
ブック巻１、１８９頁（１９７９）］。また、このアミ
ノ酸配列に基づき、ヒトリゾチームをコードするＤＮＡ
が化学合成されている［Ｉkehara,Ｍ.ら、ケミカル・ア
ンド・ファーマシューティカル・ブリテン（Ｃhem.Ｐha
rm.Ｂull.）３４、２２０２（１９８６）］。この天然
型ヒトリゾチームのアミノ酸配列、それをコードするＤ
ＮＡ配列を以下に示す。 配列番号：１ アミノ酸配列 配列番号：２ ＤＮＡ配列

【０００６】本発明の変異型ヒトリゾチーム遺伝子の調
製、該遺伝子を含有する発現ベクターの構築、該発現ベ
クターによる宿主細胞の形質転換、および得られた形質
転換体を用いる変異型ヒトリゾチームの製造は、全て本
出願人の出願に係る特開昭６４−８６８７６号および特
開平２−１６７０８５号に開示した方法に準じて行うこ
とができる。

【０００７】即ち、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配
列をコードしている合成遺伝子を含有する公知のプラス
ミドpＧＥＬ１２５[ヨシムラ(Ｋ.Ｙoshimura)バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョン(Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.)１４５、７１
２(１９８７)]から、シグナルペプチドの上流にのみＸh
oＩ制限部位を有するプラスミドpＥＲＩ ８６０２を得
る。

【０００８】次に、pＥＲＩ ８６０２に変異操作を加
え、８１位のシステインをアラニンに変換した発現プラ
スミドpＥＲＩ ８７２４を得る［Ｙ.Ｔaniyamaら：Ｊ.
Ｂiol.Ｃhem.，２６５，７５７０（１９９０）］。次
に、ＰＣＲ法［Ｌandtら：Ｇene，９６，１２５（１９
９０）］を用いてpＥＲＩ ８７２４に変異操作を加え、
ヒトリゾチームの７９位のロイシンをシステインに変換
する（図１参照）。

【０００９】即ち、はじめに、ＸhoＩプライマーとＬ７
９ＣＣ８１Ａプライマーを用いてＰＣＲを行った後、Ｐ
ＣＲで増幅されたＤＮＡ断片（上記二つのプライマーで
はさまれた部分）を切り出す。次にこのＤＮＡ断片とＳ
maＩプライマーを用いてpＥＲＩ ８７２４を用いて再度
ＰＣＲを行い、ＸhoＩプライマーとＳmaＩプライマーで
はさまれた領域を回収する。この領域の中に７９位と８
１位の変異が含まれる。

【００１０】このＤＮＡ断片からシグナルペプチドと変
異型ヒトリゾチームをコードしているＸhoＩ−ＳmaＩ断
片を切り出し、上記プラスミドpＥＲＩ ８６０２の９.
５kbＸhoＩ−ＳmaＩ断片とライゲーションし、変異型ヒ
トリゾチーム発現ベクター、プラスミドpＥＲＩＬ７９
ＣＣ８１Ａを構築する。プラスミドpＥＲＩＬ７９ＣＣ
８１Ａの構築模式図、並びに制限酵素切断地図を図２に
示す。

【００１１】以上に概説した一連の操作における個々の
操作は当業者によく知られている。例えば、ＤＮＡのク
ローニング等における大腸菌の形質転換は、コーエン
(Ｃohen)らの方法[Ｃohen,Ｓ.Ｎ.ら、プロシージング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)６９、２１１０(１９
７２)]によって行うことができる。大腸菌宿主としては
Ｅ.coli２９４、Ｅ.coliＤＨ１、Ｅ.coliＷ３１１０、
Ｅ.coliＣ６００などを用いることができる。

【００１２】また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿
入されたプラスミドＤＮＡを単離するには、アルカリ抽
出法[Ｂirnboim,Ｈ.Ｃ.およびＤoly,Ｊ.、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes．)７、１
５１３(１９７９)]等を利用することができる。次い
で、プラスミドＤＮＡを適当な制限酵素で処理すること
によって、挿入された該遺伝子を切り出し、たとえばア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミド電気
泳動によってこれを単離する。これらの一連の操作は公
知であり、文献、例えば「モレキュラー・クローニング
(Ｍolecular Ｃloning)(１９８２),Ｃold Ｓpring Ｈar
bor Ｌaboratory」に詳しく記載されている。

【００１３】ＤＮＡの化学合成は、たとえばＣreaらの
方法[Ｃrea,Ｒ.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Ｐroc.Ｎatl.Ａc
ad.Ｓci.ＵＳＡ)７５、７６５(１９７８)]などに従って
行うことができる。さらに、ＤＮＡの所望の部位に、特
異的に変異を起こさせるためには、ＰＣＲ法が用いら
れ、その配列の確認には、ジデオキシヌクレオチド合成
鎖停止法[Ｓanger,Ｆ．ら、プロシージング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Ｐroc.
Ｎatl.Ａcad.Ｓci.)ＵＳＡ,７４、５４６３(１９７７)]
が用いられる。

【００１４】本発明の発現プラスミドは、真核細胞内で
自律的に複製可能な発現ベクター群の内から選択された
ベクターのプロモーターの下流に、シグナルペプチドを
コードしている遺伝子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連
結させて挿入することにより組立てられる。本明細書で
は、ＧＬＤプロモーターを用い、天然型ヒトリゾチーム
をコードしている発現プラスミドpＥＲＩ ８６０２を使
用して本発明の発現プラスミドの構築例を示したが、そ
の他、プラスミドpＰＨＯ１７、pcＤＸ[Ｏkayama,Ｈ.お
よびＢerg,Ｐ.、モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)３、２８０(１９８
３)]、pＫＳＶ−１０(ファルマシア社製)なども利用し
得る。

【００１５】酵母宿主の場合には、プロモーターとし
て、たとえばＰＨＯ５プロモーター、ＧＬＤプロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＰＨＯ
８１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０
プロモーターなどが、動物細胞宿主を用いた場合には、
プロモーターとして、たとえばＳＶ４０初期遺伝子プロ
モーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショ
ックプロモーターなどがそれぞれ利用できる。なお発現
にエンハンサーの利用も効果的である。

【００１６】本発明のプラスミドpＥＲＩＬ７９ＣＣ８
１Ａは、酵母宿主内で変異型ヒトリゾチームを発現さ
せ、分泌させるのに好適である。とくに好ましい宿主は
サッカロマイセス・セレビシエ(Ｓaccharomyces cerevi
siae)ＡＨ２２Ｒ^-である。本発明の変異型ヒトリゾチー
ム遺伝子を、動物細胞用ベクターに挿入することによ
り、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵母細胞
(ＣＨＯ)、さらには他の真核細胞を宿主として用い得
る。

【００１７】真核細胞の形質転換方法は当業者既知であ
り、例えば酵母の形質転換は、ヒネン(Ｈinnen)らの方
法[プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳ
Ａ)７５、１９２７(１９７８)]により、また、真核細胞
の形質転換は、「蛋白質・核酸・酵素・２８巻、１９８
３年、“組み換え遺伝子の細胞への導入と発現"(共立出
版)」記載の方法で行うことができる。形質転換体の培養
も、当業者既知の方法のいずれを用いても行うことがで
きる。

【００１８】酵母を使用する場合、培地としては、例え
ばバークホルダー(Ｂurkholder)最小培地[ボスチャン
(Ｂostian,Ｋ.Ｌ.)ら、プロシージングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ,７
７、４５０５(１９８０)]が挙げられる。培養は通常１
５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜３７℃で１０〜１４
４時間、好ましくは２４〜９６時間行い、必要に応じて
通気や攪拌を加えてもよい。

【００１９】動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした
形質転換体を使用する場合には、培地として例えばイー
グル(Ｅagle)のＭＥＭ[Ｈ.Ｅagle、サイエンス(Ｓcienc
e)１３０、４３２(１９５９)]、ダルベッコ(Ｄulbecco)
の改良イーグル培地(Ｍodified Ｅagle's Ｍedium)[Ｏr
gad ＬaubおよびＷilliam Ｊ.Ｒutter、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)
２５８、６０４３(１９８３)]などが挙げられる。培養
は通常３０〜４２℃、好ましくは３５℃〜３７℃で約１
〜１０日間行う。

【００２０】培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上
清とを分離する。本発明の発現ベクターによれば、生成
した変異型ヒトリゾチームは効率良く分泌されるので、
上清から得られるが、細胞内に残存する場合には、当分
野における通常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチ
プレスなどを利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕
法、細胞溶解酵素による破砕法などにより細胞を破砕し
た後抽出する。さらに必要ならば、トリトン−Ｘ１０
０、デオキシコーレートなどの界面活性剤を加え、産生
された変異型ヒトリゾチームを抽出する。得られた変異
型ヒトリゾチームは、通常のタンパク質精製法、例えば
塩析、等電点沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ、ＦＰ
ＬＣ等)などに従って精製することができる。

【００２１】以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明する。尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、
如何なる意味においても、本発明を制限するものではな
い。

【００２２】実施例１ ７９位のアミノ酸がシステイン
に、又、８１位のアミノ酸がアラニンに変換されたヒト
リゾチーム（Ｌ７９ＣＣ８１Ａ）の遺伝子の調製 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の７９位ロイシン
をシステインに又、８１位システインをアラニンに変換
するためにランツ（Ｌａｎｄｔ）らの方法［ジーン（Ｇ
ene）９６，１２５（１９９０）］に従って、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を行い、ヒトリゾチーム遺伝
子［ヨシムラ（Ｋ.Ｙoshimura），バイオケミカル・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂio
chem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.）１４５，７１２（１９
８７）］の変異を行った。方法の概略を図１に示す。

【００２３】ｉ）Ｌeu⁷⁹をＣys⁷⁹に、又、Ｃys⁸¹をＡla
⁸¹に変換するための、ＤＮＡオリゴマーの合成 常法に従って、以下の３本のオリゴマーを合成した。

【化１】 Ala ⁸¹ Cys ⁷⁹ L79CC81Aプライマー 5' TGA GGC AGA GCA GTG ACA GGC 3' XhoI 認識部位 XhoIプライマー 5' CTC CTC GAG TAT AAA AAC AAT GAG ATC 3' SmaI 認識部位 SmaIプライマー 5' CTCA CCC GGG TCG AGG TAT TAA ACA CC 3'

【００２４】ii）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
るヒトリゾチーム遺伝子の変異 ＢＩＯ−ＢＩＫ社製５００μlサンプリングチューブに
１０×リアクションバッファー（ＰＣＲ用、宝酒造）１
０μl、１.２５mＭデオキシリボヌクレオタイドトリフ
ォスフェイトミックス（dＡＴＰ，dＣＴＰ，dＧＴＰ，
ＴＴＰ，各１.２５mＭ含）１６μl、ＸhoＩプライマー
１μg、Ｌ７９ＣＣ８１Ａプライマー１μg、鎖型用プラ
スミド［ヒトリゾチームのＣys⁸¹をＡlaに変換するため
の変異をヒトリゾチーム遺伝子上に持っているプラスミ
ド（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ
（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.））２６５，７５７０（１９９
０）］５０ngをまぜ、滅菌水で全量１００μlにあわ
せ、これにタックポリメラーゼ（Ｔaq.ＤＮＡ polymera
se、宝酒造、５０００units／ml）０.５μlを加えて、
混合した。ミネラルオイル（Ｓigma Ｃat Ｍ−３５１
６）１００μlでサンプルを覆い、チューブのふたをし
て、ＤＮＡ Ｔhermal Ｃycler（型名ＰＪ２０００Ｐerk
in−Ｅlmer Ｃetus Ｉnstruments）にセットした。取り
扱い説明書p１８に記述されているファイル５を用いて
ＰＣＲを行った。具体的には、９４℃、１分で鎖型プラ
スミドＤＮＡの２本鎖をほどき、３７℃、２分で２種の
プライマーを鎖型ＤＮＡに相補（アニール）させ、７２
℃、３分でタックポリメラーゼによるＤＮＡ鎖伸長反応
を行い、このサイクルを２５回繰り返した。反応後、オ
イルを除き、水飽和クロロホルム１００μlで抽出して
水層（反応液）中のオイルを除き、残りの水溶液をＢＩ
Ｏ−ＢＩＫ社製１５００μl用サンプリングチューブに
うつし、常法に従い、エタノール沈澱によりＤＮＡを集
めた。これをＮusieve ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂio
Ｐroducts）を用いた１.５％のアガロースゲル電気泳
動を行い、ＰＣＲで増幅された、ＸhoＩプライマーとＬ
７９ＣＣ８１Ａプライマーではさまれた約０.２９kbの
ＤＮＡ断片を切り出し、フィルター付遠心チューブ（Ｓ
ＵＰＲＥＣ^TM−０１、宝酒造）を用いて回収した。常法
に従い、エタノール沈澱によりＤＮＡを集めた。この２
９０鎖長のＤＮＡ断片全量とＳmaＩプライマー１μg、
上記と同じ鎖型用プラスミド５０ngを用いて、上記と同
条件で２回目のＰＣＲを行った。増幅された０.４８kb
のＤＮＡ断片（７９位と８１位に変異を持ち、かつ、Ｘ
hoＩプライマーとＳmaＩプライマーではさまれた領域が
増幅されている）を上記と同様の方法で回収した。７９
位及び８１位に変異を持った本発明の変異型ヒトリゾチ
ームの構造遺伝子およびアミノ酸配列を以下に示す。 配列番号：３ 配列番号：４

【００２５】実施例２ 変異型ヒトリゾチームＬ７９Ｃ
Ｃ８１Ａの酵母発現用プラスミドの構築 ｉ）０.４８kb、９.５kb断片の調製 実施例１で得られた０.４８kbのＤＮＡ断片（変異型ヒ
トリゾチームＬ７９ＣＣ８１Ａの遺伝子）の沈澱を、制
限酵素ＳmaＩ用反応液［２０mＭ Ｔris，１０mＭ Ｍg a
cetate，５０mＭ Ｋ acetate，１mＭ ＤＴＴ］に溶か
し、制限酵素ＳmaＩ（８ユニット）を加え、全量１０μ
lとし、３０℃、１時間反応させた後、制限酵素ＸhoＩ
用反応液［５０mＭ Ｔris，１０mＭ ＭgＣl₂，１００m
Ｍ ＮaＣl，１mＭ ジチオスレイトール］と、制限酵素
ＸhoＩ（１０ユニット）を加え、全量１００μlとし、
３７℃、１時間、制限酵素消化を行い、６０℃、１５分
間加熱し、反応を停止させた。同様の方法でプラスミド
pＥＲＩ８６０２［バイオケミカル・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュニケーション（Ｂiochem.Ｂiophys.
Ｒes.Ｃommun.）１５２，９６２（１９８８）］をＳma
ＩとＸhoＩで消化して９.５kbのＸhoＩ−ＳmaＩ断片を
得た。

【００２６】ii）０.４８kb ＸhoＩ−ＳmaＩ断片と９.
５kb ＸhoＩ−ＳmaＩ断片の連結 i)で得た０.４８kb ＸhoＩ−ＳmaＩ断片と９.５kb断片
をＤＮＡライゲーションキット（ＤＮＡ ligation ki
t，宝酒造）を用いて、１６℃、３０分反応させ、ＤＮ
Ａを結合させた。その１／５量を用いてＥcoli ＨＢ１
０１を形質転換し、変異リゾチームＬ７９ＣＣ８１Ａの
酵母発現用プラスミド（pＥＲＩＬ７９ＣＣ８１Ａ）を
得た。

【００２７】実施例３ 酵母形質転換体の調製 実施例２で得た発現用プラスミドを用い、ヒネン（Ｈin
en）らの方法［プロシージングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐroc.Ｎatl.Ａca
d.Ｓci.ＵＳＡ）７５，１９２７，（１９７８）］に従
い、Ｓ.セレビシエＡＨ２２Ｒ^-／pＥＲＩＬ７９ＣＣ８
１Ａを得た。この形質転換株は通商産業省工学技術院微
生物工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２９０
６として寄託されている（受託日：平成４年３月２６
日）。

【００２８】実施例４ 形質転換体Ｓ.セレビシエＡＨ
２２Ｒ^-／pＥＲＩＬ７９ＣＣ８１Ａの培養 実施例３で得た形質転換体Ｓ.セレビシエＡＨ２２Ｒ^-／
pＥＲＩＬ７９ＣＣ８１Ａを試験管中のバークホルダー
（Ｂurkholder）［アメリカン・ジャーナル・オブ・ボ
タニー（Ａmer.Ｊ.Ｂot.）３０，２０６，（１９４
３）］の改変培地III（１Ｌ当たりＫＨ₂ＰＯ₄ ０.４g、
グルコース１０g、アスパラギン５g、シュークロース８
０gを含有）５ml、２４本に接種し３０℃で７２時間培
養した。得られた培養液を、上記培地III２０mlを含
む、三角フラスコ２４本に移し、３０℃、２４時間培養
し、さらに上記培地III３８０mlを含む１リットル三角
フラスコ２４本に移し、３０℃、７２時間、培養した。

【００２９】実施例５ 変異型ヒトリゾチームＬ７９Ｃ
Ｃ８１Ａ−cの分離、精製 実施例４で得た培養液を遠心分離し、上清と菌体に分離
した。この上清（約９Ｌ）を、５０mＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pＨ６.５）で平衡化した陽イオン交換樹脂
（Ｉndion）カラム（０.７cm×１５cm）に吸着させ、同
緩衝液１リットルで洗浄後、０.５Ｍ ＮaＣlを含む同緩
衝液で溶出した。溶出液を１mlずつ分取し、２８０nmの
吸光度を測定し、ピークを集め、これを限外濾過膜（Ｙ
Ｍ５）を用いて濃縮し、５０mＭリン酸ナトリウム緩衝
液で数回洗って、脱塩した。これを高速液体クロマトグ
ラフィー（Ａsahi pak ＥＳ５０２Ｃ）によりさらに精
製した。５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む、０.６
Ｍ硫酸ナトリウム１０→６０％の直線濃度勾配により５
０分間溶出を行い、保持時間３７分に現れる２８０nmの
吸収ピークを分取し、これをＬ７９ＣＣ８１Ａ−cとし
た。この溶出パターンを図３に示す。

【００３０】実施例６ 精製変異型ヒトリゾチームＬ７
９ＣＣ８１Ａ−cの分析 ｉ）Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−cのチオール基の定量 実施例５で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品Ｌ７
９ＣＣ８１Ａ−cのチオール基の定量をエルマンの方法
［アチーブス・オブ・バイオケミストリィ・アンド・バ
イオフィジックス（Ａrch.Ｂiochem.Ｂiophys.）８２，
７０〜７７（１９５９）］により行った。その結果、Ｌ
７９ＣＣ８１Ａ−c １分子当たり２個のチオール基が存
在することが分かった。

【００３１】 ii）Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−cのカルボシキメチル化 実施例５で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品Ｌ７
９ＣＣ８１Ａ−c１００μgを、０.４Ｍトリス塩酸緩衝
液、２.５mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８.２に溶かし、ヨード酢
酸（０.２９mg／μl，１Ｎ ＮaＯＨ）２μlを加え、遮
光し、室温で３０分間、振盪した。これを逆相高速液体
クロマトグラフィー（Ａquapore ＲＰ３００ column，
Ｂrownlee Ｌaboratories（Ｓanta Ｃlara，ＣＡ，ＵＳ
Ａ））にかけ、溶出液Ａ（０.１％ ＴＦＡ，Ｈ₂Ｏ）と
溶出液Ｂ（０.０５％ ＴＦＡ，ＣＨ₃ＣＮ）を用いて、
Ｂ％ ２０→５０％の直線濃度勾配により、７５分間溶
出を行い、４０分に現れる２３０nmの吸収ピークを分取
した。

【００３２】iii）カルボキシメチル化されたＬ７９Ｃ
Ｃ８１Ａ−c（ＣＭ−Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−c）のトリプシ
ン消化 ii)で得られたＣＭ−Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−cを０.５Ｍト
リス塩酸緩衝液pＨ８.０、５００μlに溶かし、トリプ
シン（１mg／ml，１０^-3ＮＨＣl）２μlを加え、３７
℃、２時間反応した。これをii)で用いた逆相高速液体
クロマトグラフィーにかけ、Ｂ％ ５→４５％の直線濃
度勾配により、６０分間溶出を行い、４２分に現れる２
３０nmのピークを分取した（図４）。これを、アプライ
ドバイオシステムズ社製、気相自動プロテインシークエ
ンサー（Ａpplied Ｂiosystems model ４７７Ａ）にか
け、下記に示すペプチドシークエンスを得た。このペプ
チドシークエンスは、ヒトリゾチームの６３番から９７
番に相当するシークエンスであり、７９位のロイシンが
システインに、又、８１位のシステインがアラニンに変
換されていることと、６５番と７７番の２つのシステイ
ンがカルボキシメチル化されていることを確認した。

【００３３】

【化２】 カルボキシメチル化 カルボキシメチル化 ↓ ↓ 65 77 79 95 Y-W-C-N-D-G-K-T-P-G-A-V-N-A-C-H-C-S-A-S-A-L-L-Q-D-N-I-A-D-A-V-A-C-A-K

【００３４】これは、６５番と７７番の２つのシステイ
ンがＳ−Ｓ結合を形成せず、ＳＨ基を持っていることを
示しており、又、７９、９５位間に非天然型のＳ−Ｓ結
合が形成されていることを示している（図５）。

【００３５】実施例７ Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−cにおける
生体外Ｓ−Ｓ結合形成 ｉ）グルタチオン及びプロテインジスルフィドイソメラ
ーゼ(ＰＤＩ)による酸化 実施例５で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品Ｌ７
９ＣＣ８１Ａ−c、５０μgを０.２mＭ酸化型グルタチオ
ン２mＭ還元型グルタチオンの存在下、１００mＭリン酸
ナトリウム緩衝液pＨ７.５、１mlに溶かし、プロテイン
ジスルフィドイソメラーゼ(Ｐrotein disulfide−isome
rase，ＰＤＩ、宝酒造)２０μgを添加した。これを３７
℃で反応させ１時間後に、反応液２００μlを実施例６
−ii)で使用した逆相高速液体クロマトグラフィーにか
けＢ％２０→５０％の直線濃度勾配により７５分間溶出
を行ったところ、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−c(４０分に現れる
２３０nmのピーク)に加えて、３８.５分、３９.５分に
新しいピークが現れた。３８.５分のピーク由来の産物
をＬ７９ＣＣ８１Ａ−ａ、３９.５分のピーク由来産物
をＬ７９ＣＣ８１Ａ−bとした（図６）。各ピークの割
合の時間変化を調べた。３８.５分のピークの割合の時
間変化を図７に示す(−・−)。又、ＰＤＩ非存在下で同
様の反応を行い３８.５分のピークの時間変化も図７に
示した(−▲−)。グルタチオンやＰＤＩの存在下ではＬ
７９ＣＣ８１Ａ−cから主にＬ７９ＣＣ８１Ａ−aが生成
した。

【００３６】ii）空気酸化 Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−c１０μgを１００mＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液pＨ７.５、又は、１００mＭ酢酸ナトリウム
緩衝液pＨ６.０、２００μlに溶かし、３０℃で２日間
放置した。反応液を実施例７−i)と同様の逆高速液体ク
ロマトグラフィーにかけ、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−a、b、c
の割合を調べたところ、pＨ７.５ではa：b：c＝２２：
７１：７の割合で、又、pＨ６.０ではa：b：c＝３９：
１１：４９の割合になっており、空気酸化の場合は溶媒
のpＨが高い方がＬ７９ＣＣ８１Ａ−bが多く生成するこ
とが判明した。

【００３７】実施例８ Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−a、Ｌ７９
ＣＣ８１Ａ−b及びＬ７９ＣＣ８１Ａ−ｃのアミノ酸分
析 実施例７−i)、ii)の方法に従い、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−a
とＬ７９ＣＣ８１Ａ−bを生成させ逆相高速液体クロマ
トグラフィーを行い、相当するピークを分取し、乾固し
た。Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−cも実施例５の方法に従って調
製し、上記と同様に、逆相高速液体クロマトグラフィー
で最終精製を行った。Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−a、Ｌ７９Ｃ
Ｃ８１Ａ−b、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−ｃ及び天然型ヒトリ
ゾチームを各１０μgずつ用意しピコタグ ワークステー
ション(ＰＩＣＯ ＴＡＧ Ｗork Ｓtation,Ｗaters)を用
いて塩酸加水分解を行った後、アミノ酸分析機(Ｂeckma
n，６３００Ｅ)を用いてアミノ酸分析を行った。その結
果、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−a、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−b、Ｌ７
９ＣＣ８１Ａ−c共にアミノ酸組成に差はなく、天然型
リゾチームに比べて、アラニンが１残基増え、ロイシン
が１残基減少していることがわかり、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ
−a、b、c共に目的とする変異型リゾチームであること
を確認した。

【００３８】実施例９ Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−a及びＬ７
９ＣＣ８１Ａ−bのＳ−Ｓ結合の位置の決定 ｉ）トリプシ消化物の同定 実施例８と同条件でＬ７９ＣＣ８１Ａ−a及びＬ７９Ｃ
Ｃ８１Ａ−bを精製し、各々、約１００μlずつを実施例
６−iii)と同条件でトリプシン分解した。Ｌ７９ＣＣ８
１Ａ−a由来のトリプシン消化物を逆相高速液体クロマ
トグラフィーにかけＢ％５→４５％の直線濃度勾配によ
り６０分間溶出を行った(図８−a)。各ピークを分取
し、ペプチドシークエンスを行った。Ｌ７９ＣＣ８１Ａ
−aは図９に示すようにトリプシンにより１７個のペプ
チドに分断されるはずであるが、これらのうちＴ４、Ｔ
６、Ｔ８、Ｔ１３、６位と１２８位のＳ−Ｓ結合を含む
Ｔ２＋Ｔ１７、３０位と１１６位のＳ−Ｓ結合を含むＴ
５＋Ｔ１５ ６５、７７、７９、９５位間にかかる２本
のＳ−Ｓ結合を含むＴ９＋Ｔ１０の各ペプチドを同定し
た。Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−b由来のトリプシン消化物はＢ
％５→４５％の直線濃度勾配により、９０分間溶出を行
い各ピーク分取し、上述と同様に同定した(図８−b)。
Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−a由来のペプチドＴ９＋Ｔ１０とＬ
７９ＣＣ８１Ａ−b由来のペプチドＴ９＋Ｔ１０のアミ
ノ酸分析を実施例８と同じ方法で行ったが、両者にアミ
ノ酸組成の差は見られなかった。

【００３９】ii）Ｓ−Ｓ結合の位置決定 島津プロテインシークエンサー(ＰＳＱ−１)を用いると
シスチン由来のシステインを検出することが可能であ
り、これによりＳ−Ｓ結合の位置を決定することができ
る。Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−a由来のトリプシン消化ペプチ
ドＴ９＋Ｔ１０とＬ７９ＣＣ８１Ａ−b由来のＴ９＋Ｔ
１０を本シークエンサーで分析し、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−
a由来のＴ９＋Ｔ１０では８段目と２６段目に又、Ｌ７
９ＣＣ８１Ａ−b由来のＴ９＋Ｔ１０では１０段目と２
６段目にＳ−Ｓ結合由来のシステインを検出した。この
結果よりＬ７９ＣＣ８１Ａ−aは６５−７７位間と７９
−９５位間にＳ−Ｓ結合が形成されており又、Ｌ７９Ｃ
Ｃ８１Ａ−bは６５−７９位間と７７−９５位間にＳ−
Ｓ結合が形成されていることが判明した(図９)。

【００４０】実施例１０ 精製変異型ヒトリゾチームＬ
７９ＣＣ８１Ａ−a、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−bおよびＬ７９
ＣＣ８１Ａ−cの活性測定 実施例５及び７で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標
品、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−a、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−b及びＬ
７９ＣＣ８１Ａ−cについて比活性を測定した。タンパ
ク質の定量は２８０nmでの吸光度を用いて行い、変異型
ヒトリゾチームについては天然型ヒトリゾチームの吸光
度定数を代用した。その結果、市販の天然型ヒトリゾチ
ームの比活性を１００としたとき、変異型ヒトリゾチー
ムＬ７９ＣＣ８１Ａ−a、Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−b、Ｌ７９
ＣＣ８１Ａ−cの比活性はそれぞれ５％、８４％、８６
％であることがわかった。

【００４１】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly 5 10 15 Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala 20 25 30 Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly 35 40 45 Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp 50 55 60 Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser 65 70 75 80 Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala 85 90 95 Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp 100 105 110 Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys 115 120 125 Gly Val 130

【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：３９６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 配列： AAGGTTTTCG AGAGATGCGA ATTAGCCAGA ACTTTGAAGA GATTGGGTAT GGACGGCTAC 60 CGTGGTATTT CTTTAGCCAA CTGGATGTGT CTTGCTAAGT GGGAATCCGG CTATAACACT 120 AGAGCTACCA ATTACAACGC TGGCGACCGT TCTACAGACT ATGGTATTTT CCAAATTAAC 180 TCTAGATATT GGTGTAACGA TGGCAAGACT CCAGGTGCCG TCAACGCCTG TCACTTATCT 240 TGCTCAGCTT TGCTTCAGGA CAACATTGCT GATGCTGTTG CCTGCGCTAA GAGAGTTGTC 300 CGTGACCCAC AGGGTATTAG AGCCTGGGTC GCTTGGAGAA ACAGATGCCA AAATAGAGAT 360 GTCAGACAAT ACGTTCAAGG TTGTGGTGTT TAATAG 396

【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：３９６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 配列： AAGGTTTTCG AGAGATGCGA ATTAGCCAGA ACTTTGAAGA GATTGGGTAT GGACGGCTAC 60 CGTGGTATTT CTTTAGCCAA CTGGATGTGT CTTGCTAAGT GGGAATCCGG CTATAACACT 120 AGAGCTACCA ATTACAACGC TGGCGACCGT TCTACAGACT ATGGTATTTT CCAAATTAAC 180 TCTAGATATT GGTGTAACGA TGGCAAGACT CCAGGTGCCG TCAACGCCTG TCACTGCTCT 240 GCCTCAGCTT TGCTTCAGGA CAACATTGCT GATGCTGTTG CCTGCGCTAA GAGAGTTGTC 300 CGTGACCCAC AGGGTATTAG AGCCTGGGTC GCTTGGAGAA ACAGATGCCA AAATAGAGAT 360 GTCAGACAAT ACGTTCAAGG TTGTGGTGTT TAATAG 396

【００４４】配列番号：４ 配列の長さ：１３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly 5 10 15 Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala 20 25 30 Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly 35 40 45 Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp 50 55 60 Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Cys Ser 65 70 75 80 Ala Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala 85 90 95 Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp 100 105 110 Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys 115 120 125 Gly Val 130

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトリゾチーム遺伝子の変異を行うための模
式図。

【図２】 プラスミドpＥＲＩＬ７９ＣＣ８１Ａの構築
模式図並びに制限酵素地図。

【図３】 変異型ヒトリゾチームＬ７９ＣＣ８１Ａの高
速液体クロマトグラフィーによる精製を示す図。

【図４】 カルボキシメチル化したＬ７９ＣＣ８１Ａ−
cのトリプシン消化物の逆相高速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示すグラフ。

【図５】 Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−cの一次構造を示す模式
図。

【図６】 Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−cのＳ−Ｓ結合形成にお
よぼすＰＤＩの効果を逆相高速液体クロマトグラフィー
で調べたグラフ。

【図７】 図６に於ける３８.５分に出現するピークの
割合の時間変化を示すグラフ。

【図８】 Ｌ７９ＣＣ８１Ａ−aおよび−bのトリプシン
消化物の逆相高速液体クロマトグラフィーのグラフ。

【図９】 ヒトリゾチームＬ７９ＣＣ８１Ａの一次構造
およびトリプシン消化ペプチドを示す模式図。

【図１０】 プロテインシークエンサーを用いたジスル
フィド結合の位置決定を示す模式図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/36 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の
   第７９位のロイシンがシステインで、８１位のシステイ
   ンがアラニンで置き換えられたポリペプチドをコードし
   ている変異型ヒトリゾチーム遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の変異型ヒトリゾチーム
   遺伝子を含有し、真核生物内で自律的に複製可能な発現
   ベクター。
3. 【請求項３】 プラスミドpＥＲＩＬ７９ＣＣ８１Ａで
   ある請求項２に記載の発現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項２または３に記載の発現ベクター
   で形質転換されており、変異型ヒトリゾチームを産生
   し、分泌し得る宿主細胞。
5. 【請求項５】 形質転換体サッカロマイセス・セレビシ
   エＡＨ２２Ｒ^-／pＥＲＩＬ７９ＣＣ８１Ａである請求項
   ４に記載の宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項４または５に記載の形質転換体を
   培養し、培養液中に分泌されたタンパク質を分離し、所
   望により精製することからなる、請求項１に記載の変異
   型ヒトリゾチームの製造方法。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法で製造された請求
   項１に記載の変異型ヒトリゾチーム。