JPH05256765A - 顕微分光光度計 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】積算平均してスペクトルのデータを得る測定に
ついて、試料の退色に基づくスペクトルの変化を検知
し、退色する前のスペクトルのみについて積算平均を行
うことにより、退色によるスペクトルへの影響を除去し
測定の信頼性を高める。 【構成】積算平均を行う際、初回の測定のスペクトルを
基準（処理６０２）とし、二回目より各測定のスペクト
ルと基準スペクトルとを比較して（処理７）その変化量
があらかじめ測定前に設定しておいた値より大きくなっ
た時点で測定を中止し、励起光シャッターを閉じて試料
への励起光照射を遮断した後（処理７０２）、スペクト
ルの変化量が設定値より小さいスペクトルについてのみ
積算平均を行い（処理９）、測定結果および積算した回
数を表示する（処理１０）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は蛍光測定の際、積算平均
を行いスペクトルを得る顕微分光光度計について、特に
蛍光測定のデータ処理方法および試料の退色を防止する
機能に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一般に顕微分光光度計は、励起光光源，
顕微鏡部と分光器，検出器、およびデータ処理部と表示
部で構成され、試料台にセットした試料の反射光，透過
光または蛍光を分光器で分光し、データ処理部でスペク
トルに換算した後積算平均したものを表示部にスペクト
ルや計算結果として表示する。

【０００３】このうち蛍光測定は、キセノンランプや水
銀ランプ等の光源から励起光を試料に照射し、試料が励
起されて出す蛍光を測定するものである。

【０００４】積算平均は、複数回測定を行い各測定でそ
の都度スペクトルを得、それらのスペクトルを加算して
測定回数で割ることによりノイズを相対的に低下させて
スペクトルのＳ／Ｎ比を高めようとする方法であり、こ
れについては特開平2− 163622号に示されるように、ス
ペクトルの安定性や再現性を改善したものが知られてい
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記した積算
平均によるスペクトルの安定性の改善は外部ノイズに対
しての処理であるため、スペクトル自体の変化の検知が
できないという問題が残っていた。

【０００６】ある物質の蛍光を測定する場合、励起光の
照射によって物質の状態が変化し図４のように蛍光強度
やスペクトルの波形が時間とともに変化する現象は一般
に退色と呼ばれている。顕微分光光度計における一般的
な蛍光分析法の一つに、各物質はそれぞれ固有の蛍光ス
ペクトルパターンを持っていることを利用し、あらかじ
め複数の既知物質を標準サンプルとして蛍光を測定し、
未知物質と前記標準サンプルの蛍光スペクトルパターン
を比較して未知試料の同定を行うという方法がある。

【０００７】しかし、上記方法で未知試料の同定を行う
際に未知物質が退色して蛍光スペクトル波形が時間とと
もに変化する場合、従来の測定方法では積算平均すると
図４のように試料が退色する前のスペクトルと退色した
後のスペクトルが重なってしまうため、標準物質のスペ
クトルパターンとの一致度が低くなり正しい結果が得ら
れなかった。

【０００８】また、退色し易い物質において、励起光に
よる測定時以外の試料の観察や測定終了後に励起光を照
射し続けることにより、退色が進行し試料が変化するこ
とがあった。しかし、従来の測定方法では測定中に試料
の退色する時点を検出できず指定回数の測定が終了する
まで励起光を照射していたため、試料を破壊する可能性
があった。

【０００９】さらに、試料を測定する際、今までは測定
スポットより大きい領域に励起光を照射し測定スポット
の蛍光のみを分光する方法だったので、他の測定点が測
定スポットの近辺に存在する場合、それらにも励起光が
照射されていた。従って、まだ測定していない領域まで
励起光の照射による退色や破壊の可能性があった。

【００１０】本発明の目的は、第一に積算平均して蛍光
スペクトルのデータを得る測定において退色によるスペ
クトルの変化を検知し、変化の小さな間のスペクトルの
みについて積算平均を行うことにより、退色によるスペ
クトルへの影響を除去し測定の信頼性を高めることにあ
る。

【００１１】第二に、試料観察時に励起光よりも光エネ
ルギーの弱い光源を用い、また、測定時に試料上の測定
スポットのみに励起光を照射してそれ以外の領域には励
起光の照射を防止し、さらに退色に基づくスペクトルの
変化を検知し測定を中止する時点で、励起光の照射も同
時に中止することにより以後の励起光による試料の退色
を最小限におさえることにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記目的を解決するため
に本発明による顕微分光光度計は、図２に示すようにあ
らかじめ設定されている回数（ＮＵＭ回）の測定を行い
積算平均してスペクトルを得る機能のうち、一回目の測
定のスペクトル１を基準とし二回目より各測定のスペク
トルと基準スペクトルとを比較して、その変化量があら
かじめ測定前に設定しておいた指定量より大きくなった
時点を検出し（スペクトルｉ）、その時指定されている
設定回数ＮＵＭに達していなくても測定を中止しそこま
での測定データ（スペクトル１〜スペクトルｉ−１）、
即ち退色の影響が大きくなるまでのスペクトルについて
のみ積算平均を行い、積算した回数（スペクトルｉ−
１）を表示するという特徴を備えている。

【００１３】また、励起光を試料に照射する過程におい
て、途中に励起光をしぼるための絞りまたはピンホール
などを設け、励起光を測定領域のみに照射するととも
に、自動で開閉できる励起光をカットするためのシャッ
ターを設けスペクトルの変化により測定を中止した時点
で同時にシャッターを閉じ、励起光の照射を遮断すると
いう特徴を備えている。

【００１４】さらに、励起光光源とは別に試料に退色な
どの影響を与えない程度に照射エネルギーが弱い光源を
用いて試料観察を行い、測定時のみ励起光により試料を
照射するか、または励起光と試料の間に自動で取付け・
取外しができる励起光を弱めるフィルタを設け、測定時
以外はフィルタにより励起光を減光して試料の観察や位
置確認を行い、測定時のみフィルタを取外して試料を測
定するという特徴を備えている。

【００１５】

【作用】測定する試料が退色し易い物質の場合、スペク
トルを加算中に時間と共に試料の蛍光強度が減少してノ
イズが大きくなりスペクトルとして十分なデータが得ら
れなくなったり、図５に示すように試料の蛍光スペクト
ルの波形が退色する前と退色した後で変化してしまい、
積算平均してもデータの信頼性が低い場合があった。本
発明では図２に示すようにスペクトルの積算を行う際、
一回目の積算のスペクトルに対する以後のスペクトルの
変化量を検知し、この変化量が大きくなると測定を中止
するため、退色し易い物質の測定においても退色の影響
を排除したスペクトルを得ることができ、実際に繰返し
測定した回数を表示することにより、測定を中止した時
点や試料の退色の速さなどの情報を得ることができる。

【００１６】また、測定前後に励起光により試料を観察
したり、試料を測定する際に測定していない領域まで励
起光を照射していたため、測定以外で励起光により試料
が退色する場合があった。そこで、測定時以外は励起光
をフィルタにより減光するか、または照射エネルギーの
弱い別光源を用いて試料観察を行い、さらに、スペクト
ルの積算を中止した時点で励起光の照射も同時に中止す
ることにより、励起光照射によって試料に与える影響を
効果的に減少させることができる。

【００１７】

【実施例】顕微分光光度計における蛍光測定は、図３に
示すように顕微鏡２を通して励起光光源１より励起光を
試料３に照射し、試料３が励起されて出す蛍光を分光器
４で分光し検知器５で蛍光の信号を検知した後データ処
理部６でスペクトルに換算する。これを複数回繰返し測
してスペクトルを積算，平均した後表示部７においてス
ペクトルを表示するものである。

【００１８】図２に本発明の一実施例を示す。まず、処
理１で測定回数ＮＵＭおよびスペクトル変化の指定量Ｃ
をそれぞれ１００および０.５ に設定し、処理２でスペ
クトルの足算の変数ＳＰＡＤＤと測定回数カウント変数
ｎを０に設定する。つぎに処理３で測定回数カウント変
数ｎに１を代入し（１回目の測定）、測定を開始する。
一回の測定を終了した後（処理４）、測定結果すなわち
スペクトルデータをＳＰに代入し（処理５）、測定回数
が一回目の時スペクトルの最大ピークをＰＥＡＫ１に代
入する（処理６０２）。このＰＥＡＫ１が二回目以降の
スペクトルを比較する基準となる。処理７０１で測定結
果ＳＰをＳＰＡＤＤに代入し、測定回数カウント変数ｎ
が測定回数ＮＵＭでないとき（すなわち積算がＮＵＭ回
終了していないとき）処理３に戻る。

【００１９】測定が二回目以降の場合、まず上記と同様
に測定を行った後（処理４）、測定結果をＳＰに代入す
る（処理５）。つぎにｎ回目測定のスペクトルの最大ピ
ークをＰＥＡＫｎに代入し、ＰＥＡＫ１に対するＰＥＡ
Ｋｎの変化量と指定量Ｃを比較する(処理７)。変化量が
指定量Ｃよりも小さい（サンプルが退色していない）場
合、測定結果ＳＰをＳＰＡＤＤに代入して（処理７０
１）スペクトルの足算を行う。この後、測定回数カウン
ト変数ｎが測定回数ＮＵＭでないとき（すなわち積算が
ＮＵＭ回終了していないとき）処理３に戻る。測定回数
カウント変数ｎが測定回数ＮＵＭと等しい場合（すなわ
ち積算がＮＵＭ回終了したとき）、処理９で積算平均を
行い処理１０で測定結果および測定回数ｎを表示して一
連の作業を終了する。

【００２０】処理７でＰＥＡＫ１に対するＰＥＡＫｎの
変化量が指定量Ｃよりも大きい（サンプルが退色してい
る）場合は、測定したスペクトルの加算は行わず、処理
702で励起光シャッターを閉じて励起光の照射を中止し
た後、処理７０３を経て処理９で積算平均を行い測定回
数カウント変数ｎが測定回数ＮＵＭと等しくなっていな
くても（積算の途中でも）処理１０で測定結果および実
際の繰返し測定回数ｎを表示して一連の作業を終了す
る。

【００２１】上記実施例において、処理１における測定
回数ＮＵＭおよびスペクトル変化の指定量Ｃの値は、設
定変更可能としてもよい。

【００２２】また、ＰＥＡＫ１およびＰＥＡＫｎはスペ
クトルの最大ピーク強度である必要はなく、特定の一波
長または複数波長における値やスペクトルの全波長域の
データから計算される強度（面積など）でも良い。

【００２３】ＰＥＡＫ１に対するＰＥＡＫｎの変化量の
算出は、処理７に示す式でなくほかの式の式を用いても
良い。例えば

【００２４】

【数１】

【００２５】の式で表される二乗誤差が一定値に達した
時点で打ち切るようにしても良い。

【００２６】処理１０で表示する測定回数は、測定した
回数ｎでなく測定を開始してから中止するまでの時間な
ど、どの時点で測定を中止したかの情報が得られるもの
を用いても良い。

【００２７】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明に係る顕微
分光光度計よれば、測定の途中で物質の変化により蛍光
強度やスペクトルの形状が変化しても、変化が大きくな
った時点で測定を中止するため正常なスペクトルを得る
ことができる。そこで、従来よりも高い信頼性をもって
蛍光測定による未知試料の同定を行うことが可能であ
る。

【００２８】また、測定時以外は試料に照射する光のエ
ネルギーを弱くするとともに、測定時は測定領域以外に
は励起光を照射するのを防止し、さらにスペクトルの変
化を検知した時点で試料への励起光の照射を中止するた
め、励起光照射による試料への影響を最小限におさえ試
料の退色を防ぐことが出来る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例を示すもので、各測定ごとにス
ペクトル波形の変化を検出し、変化量が一定の大きさに
達すると繰返し測定を中止しそこまでの測定データにつ
いて積算平均を行う作業のフローチャートである。

【図２】本発明の機能を表す簡略的な図である。

【図３】顕微分光光度計の構成図である。

【図４】蛍光測定における試料の退色の様子をスペクト
ルで示した図である。

【図５】退色し時間とともにスペクトル波形が変化する
サンプルについて、退色する前のスペクトルと退色後の
スペクトルの比較を示した図である。

【符号の説明】

１…励起光光源、２…顕微鏡、３…試料、４…分光器、
５…検知器、６…データ処理部、７…表示部、Ａ…サン
プルが退色する前の蛍光スペクトル、Ｂ…サンプルが退
色した後の蛍光スペクトル。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】複数回の測定で得られたスペクトルデータ
   の積算平均機能を持つ顕微分光光度計において各測定ご
   とにスペクトル波形の変化を検出し、変化量が一定の大
   きさに達すると繰返し測定を中止しそこまでの測定デー
   タについて積算平均を行う機能を備えたことを特徴とす
   る顕微分光光度計。
2. 【請求項２】請求項１において、スペクトル波形の変化
   の検出により繰返し測定を中止するとき、同時に励起光
   の照射も自動的に中止する機能を備えたことを特徴とす
   る顕微分光光度計。
3. 【請求項３】請求項１または２において、繰返し測定を
   中止し積算平均を行って結果を表示するとき、積算した
   回数を表示し、実際に測定した量の情報を与えることを
   特徴とする顕微分光光度計。
4. 【請求項４】蛍光スペクトル測定時、励起光を試料上の
   測定領域のみに照射することを特徴とする顕微分光光度
   計。
5. 【請求項５】励起光により試料を観察するときや測定領
   域の確認をするときなど、測定時以外は励起光の光量を
   小さくする機能を備えたことを特徴とする顕微分光光度
   計。
6. 【請求項６】ピント合わせや測定領域の位置確認など、
   測定時以外に試料を観察するときはエネルギーが小さく
   試料に与える影響の少ない光源を別に設けたことを特徴
   とする顕微分光光度計。