JPH05211859A - 食品の保存方法 - Google Patents
食品の保存方法Info
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- JPH05211859A JPH05211859A JP3262455A JP26245591A JPH05211859A JP H05211859 A JPH05211859 A JP H05211859A JP 3262455 A JP3262455 A JP 3262455A JP 26245591 A JP26245591 A JP 26245591A JP H05211859 A JPH05211859 A JP H05211859A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/195—Antibiotics
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
- A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
- A23L13/45—Addition of, or treatment with, microorganisms
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 生鮮食品または発酵食品にナイシン生産性の
細菌を混合することによって食品を保存する方法、およ
びそのためのナイシン産生をコードしている外来ＤＮＡ
を含む誘導細菌の提供。 【構成】 ナイシン産生をコードしており、ナイシン生
産性供与菌から得られ受容菌に伝達された外来ＤＮＡを
含有するナイシン生産性誘導細菌の存在下で食品を冷蔵
温度に維持することからなっており、供与菌が、ショ糖
利用能およびナイシン産生をコードしている２９ Mdal
プラスミド由来のプラスミドＤＮＡを含有する生物学的
に純粋な Streptococcus 属の菌種であり、受容菌が、
ナイシンに感受性の生物学的に純粋な Streptococcus
属の菌種であり、これよりナイシンにより抑制されない
ナイシン生産性誘導細菌を選抜する方法。
細菌を混合することによって食品を保存する方法、およ
びそのためのナイシン産生をコードしている外来ＤＮＡ
を含む誘導細菌の提供。 【構成】 ナイシン産生をコードしており、ナイシン生
産性供与菌から得られ受容菌に伝達された外来ＤＮＡを
含有するナイシン生産性誘導細菌の存在下で食品を冷蔵
温度に維持することからなっており、供与菌が、ショ糖
利用能およびナイシン産生をコードしている２９ Mdal
プラスミド由来のプラスミドＤＮＡを含有する生物学的
に純粋な Streptococcus 属の菌種であり、受容菌が、
ナイシンに感受性の生物学的に純粋な Streptococcus
属の菌種であり、これよりナイシンにより抑制されない
ナイシン生産性誘導細菌を選抜する方法。
Description
【０００１】産業上の利用分野 本発明は、ナイシン産生をコードしている外来ＤＮＡを
含む新規な誘導微生物とその製法に関するものである。
本発明は特に、ナイシン産生をコードしている外来ＤＮ
Ａを含む誘導細菌に関する。
含む新規な誘導微生物とその製法に関するものである。
本発明は特に、ナイシン産生をコードしている外来ＤＮ
Ａを含む誘導細菌に関する。
【０００２】さらに本発明は、誘導されたナイシン生産
性微生物の使用法に関する。
性微生物の使用法に関する。
【０００３】従来技術 ナイシン Merck Index （第８版）はその第6375頁において、Matt
ick and Hirsch，Nature 154, 551 (1944)、Lancet
250, 417 (1946)及び 253, 5 (1947)、Berridge et a
l. ，Biochem. J. 52, 529 (1952)、米国特許第2,935,5
03 号（1960年）を含む種々の文献を引用して、ナイシ
ンをStreptococcus lactisによって産生されるポリペプ
チド抗生物質として広く定義している。その化学構造は
Gross, J.Am. Chem. Soc., 93, 4634 (1971) に記載さ
れているように、３４個のアミノ酸残基を含み、そのう
ちの８個はランチオニン（β炭素でイオウに結合した２
個のアラニン）及びβ−メチルランチオニンを始めとす
る天然にほとんど見出せないアミノ酸残基であるとされ
ている。ナイシンはエチルアルコールから晶出し、希酸
に可溶性であるとされている。また、酸溶液中での煮沸
に対し安定である。上記した Merck Indexによると、ナ
イシンは食品加工において保存料として、特にチーズ及
び缶詰の果物及び野菜用に使用されるとなっている。
ick and Hirsch，Nature 154, 551 (1944)、Lancet
250, 417 (1946)及び 253, 5 (1947)、Berridge et a
l. ，Biochem. J. 52, 529 (1952)、米国特許第2,935,5
03 号（1960年）を含む種々の文献を引用して、ナイシ
ンをStreptococcus lactisによって産生されるポリペプ
チド抗生物質として広く定義している。その化学構造は
Gross, J.Am. Chem. Soc., 93, 4634 (1971) に記載さ
れているように、３４個のアミノ酸残基を含み、そのう
ちの８個はランチオニン（β炭素でイオウに結合した２
個のアラニン）及びβ−メチルランチオニンを始めとす
る天然にほとんど見出せないアミノ酸残基であるとされ
ている。ナイシンはエチルアルコールから晶出し、希酸
に可溶性であるとされている。また、酸溶液中での煮沸
に対し安定である。上記した Merck Indexによると、ナ
イシンは食品加工において保存料として、特にチーズ及
び缶詰の果物及び野菜用に使用されるとなっている。
【０００４】ひとつの形態のナイシンの化学構造は、Na
tional Institute of HealthのGross 及び Morrellによ
りChem. and Eng. News 第１８頁（１９７３年９月２４
日）に記載されている。その構造は末端のアミノ基と酸
基の付近のアミノ酸中にα−β不飽和を含む。ナイシン
の活性は、微生物中で不飽和アミノ酸が酵素のスルフヒ
ドリル基と反応することに関係していると推測されてい
る。一般にナイシンは、約6800から7500の範囲の分子量
を有すると公表されている。ナイシンはＮ群の乳酸生産
性 Streptococcusによって産生される抗生物質として分
類されている。本明細書では、ナイシンが食品自体の中
で微生物、特に細菌によりin situ で生成する場合、
「抗生物質」という用語よりも「抑制性物質」なる用語
の方をよく用いる。
tional Institute of HealthのGross 及び Morrellによ
りChem. and Eng. News 第１８頁（１９７３年９月２４
日）に記載されている。その構造は末端のアミノ基と酸
基の付近のアミノ酸中にα−β不飽和を含む。ナイシン
の活性は、微生物中で不飽和アミノ酸が酵素のスルフヒ
ドリル基と反応することに関係していると推測されてい
る。一般にナイシンは、約6800から7500の範囲の分子量
を有すると公表されている。ナイシンはＮ群の乳酸生産
性 Streptococcusによって産生される抗生物質として分
類されている。本明細書では、ナイシンが食品自体の中
で微生物、特に細菌によりin situ で生成する場合、
「抗生物質」という用語よりも「抑制性物質」なる用語
の方をよく用いる。
【０００５】食品中での使用 食品中でナイシンは、食品の貯蔵時に発生する主要な問
題であるクロストリジウム腐敗（変敗）を抑制する。ま
たナイシンは、冷凍食品で特に問題となる低温菌を抑制
する。すなわちナイシンはＡ，Ｂ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｋ，Ｍ
及びＮ群のStreptococci、Staphylococci 、Micrococcu
s 、Bacillus（いくつかの種）、Clostridium 、Mycoba
cterium 、Lactobacillus 、Octinomyces 及びErysipel
othrixを抑制する。食品が部分的に熱処理されたもので
あるとき、ナイシンは特に有効となる。食品が含む血清
或いは乳類の存在によっては影響されない。したがって
これらの物質がかなりの量で存在する場合に有用であ
る。現時点で米国においてはナイシンを食品中に添加す
ることはできないが、世界の数多くの国では既に利用さ
れている。米国においても認可される方向にある。Stre
ptococcus lactisのナイシン生産株が存在する発酵食
品、特に乳製品中ではナイシンが自然に生成することに
留意されたい。食品中での使用については Reddy et a
l., J. of Food Science 35, 787-791 (1970)及び Redd
y et al., J. of Food Science 40, 314-318 (1975)に
述べられている。食品中での分析法は、Trainer, J. et
al., J. Sci. Fd. Agriculture 15, 522-528 (1964)、
及び Fowler, G. G.；Garvis, B.；Tramer, J.による論
文「The Assay of Nisin In Foods 」（Aplin & Barret
Ltd.,Yeovil, Somerset, U.K.Technical Series. Soci
ety for Applied Bacteriology, 1975, No.8, pp91-105
）に記載されている。
題であるクロストリジウム腐敗（変敗）を抑制する。ま
たナイシンは、冷凍食品で特に問題となる低温菌を抑制
する。すなわちナイシンはＡ，Ｂ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｋ，Ｍ
及びＮ群のStreptococci、Staphylococci 、Micrococcu
s 、Bacillus（いくつかの種）、Clostridium 、Mycoba
cterium 、Lactobacillus 、Octinomyces 及びErysipel
othrixを抑制する。食品が部分的に熱処理されたもので
あるとき、ナイシンは特に有効となる。食品が含む血清
或いは乳類の存在によっては影響されない。したがって
これらの物質がかなりの量で存在する場合に有用であ
る。現時点で米国においてはナイシンを食品中に添加す
ることはできないが、世界の数多くの国では既に利用さ
れている。米国においても認可される方向にある。Stre
ptococcus lactisのナイシン生産株が存在する発酵食
品、特に乳製品中ではナイシンが自然に生成することに
留意されたい。食品中での使用については Reddy et a
l., J. of Food Science 35, 787-791 (1970)及び Redd
y et al., J. of Food Science 40, 314-318 (1975)に
述べられている。食品中での分析法は、Trainer, J. et
al., J. Sci. Fd. Agriculture 15, 522-528 (1964)、
及び Fowler, G. G.；Garvis, B.；Tramer, J.による論
文「The Assay of Nisin In Foods 」（Aplin & Barret
Ltd.,Yeovil, Somerset, U.K.Technical Series. Soci
ety for Applied Bacteriology, 1975, No.8, pp91-105
）に記載されている。
【０００６】菌 株 Streptococcus lactis の種々の株がナイシンを産生する
ことが知られているが、S. cremoris とS. lactis の亜
種diacetilactis はナイシンを産生しない。この種の菌
株についてはMcClintok, H. et al., J. Dairy Researc
h 19, 187-193(1952)、Campbell, L. L. et al., Food
Tech.13, 462-464 (1959)、Hurst, J.Gen. Microbiolog
y 44, 209-220 (1966)、Mattick and Hirsch, 12th I
ntern.Dairy Congress 2 （Sect. 3 ）, 546-550 (194
9)、Campbell et al. 著「FoodPreservation by Use of
Chemicals 」（1960年頃発行）、McClintok et al.,J.
Dairy Res. 19, 187-193 (1952)、Rayman, Applied an
d Environmental Tech. 41, 375, 380 (1981) 、Scott
et al., Journal of Food Science 40, 115-126 (198
1)、並びに米国特許第2,935,503 号、第3,093,551 号、
第2,785,108 号及び第3,295,989 号に記載されている。
ことが知られているが、S. cremoris とS. lactis の亜
種diacetilactis はナイシンを産生しない。この種の菌
株についてはMcClintok, H. et al., J. Dairy Researc
h 19, 187-193(1952)、Campbell, L. L. et al., Food
Tech.13, 462-464 (1959)、Hurst, J.Gen. Microbiolog
y 44, 209-220 (1966)、Mattick and Hirsch, 12th I
ntern.Dairy Congress 2 （Sect. 3 ）, 546-550 (194
9)、Campbell et al. 著「FoodPreservation by Use of
Chemicals 」（1960年頃発行）、McClintok et al.,J.
Dairy Res. 19, 187-193 (1952)、Rayman, Applied an
d Environmental Tech. 41, 375, 380 (1981) 、Scott
et al., Journal of Food Science 40, 115-126 (198
1)、並びに米国特許第2,935,503 号、第3,093,551 号、
第2,785,108 号及び第3,295,989 号に記載されている。
【０００７】種々の技術文献がナイシンを産生するStre
ptococcus lactis株について記載している。これらの文
献を例示すると、Geis, A. et al., Applied Environme
ntalMicrobiology 45, 205-211 (1983)、Kozak et al.,
J. of Gen. Microbiology83, 295-302 (1974)、Pack e
t al., J. Bacteriology 149, 420-425 (1982)、McKa
y, L. et al., Applied and Environmental Microbiolo
gy 40, 84-91(1980) 、Hurst A. J., Gen. Microbiolo
gy 44, 209-220 (1966)、Scherwitz, K. etal., Appli
ed and Environmental Microbiology 45, 1506-1512
(1983)、LeBlanc, D. et al., J. of Bacteriology 1
37, 878-884 (1979)、及び LeBlanc,D. et al. 著「Pla
smids and Transposons, Environmental Effects and M
aintenance Mechanisms」（Academic Press−1980年発
行、Colin Stuttard and Kenneth R. Rozee 編集）の第
３１−４１頁がある。これらの文献の中には、ナイシン
産生をコードしている可能性のあるStreptococcus lact
is中のプラスミド、特に２８Ｍｄａｌ（メガダルトン）
のプラスミドについて記載しているものがあるが、これ
らの文献の何れも、ナイシン産生をコードしているプラ
スミドをナイシン非生産性の受容菌或いは他の微生物中
に伝達することについては記載していない。
ptococcus lactis株について記載している。これらの文
献を例示すると、Geis, A. et al., Applied Environme
ntalMicrobiology 45, 205-211 (1983)、Kozak et al.,
J. of Gen. Microbiology83, 295-302 (1974)、Pack e
t al., J. Bacteriology 149, 420-425 (1982)、McKa
y, L. et al., Applied and Environmental Microbiolo
gy 40, 84-91(1980) 、Hurst A. J., Gen. Microbiolo
gy 44, 209-220 (1966)、Scherwitz, K. etal., Appli
ed and Environmental Microbiology 45, 1506-1512
(1983)、LeBlanc, D. et al., J. of Bacteriology 1
37, 878-884 (1979)、及び LeBlanc,D. et al. 著「Pla
smids and Transposons, Environmental Effects and M
aintenance Mechanisms」（Academic Press−1980年発
行、Colin Stuttard and Kenneth R. Rozee 編集）の第
３１−４１頁がある。これらの文献の中には、ナイシン
産生をコードしている可能性のあるStreptococcus lact
is中のプラスミド、特に２８Ｍｄａｌ（メガダルトン）
のプラスミドについて記載しているものがあるが、これ
らの文献の何れも、ナイシン産生をコードしているプラ
スミドをナイシン非生産性の受容菌或いは他の微生物中
に伝達することについては記載していない。
【０００８】Hurst, A., Advances Applied Microbiolo
gy 27, 85-123 (1981) には、ナイシンについての総説
が記載されている。この文献は、ナイシンについて一般
に知られていることを述べている。
gy 27, 85-123 (1981) には、ナイシンについての総説
が記載されている。この文献は、ナイシンについて一般
に知られていることを述べている。
【０００９】公知文献に記載されている主要な問題は、
ナイシンを産生するStreptococcuslactis株がファージ
感受性であるということである。別のもうひとつの問題
は、天然のStreptococcus lactis株中ではナイシンがか
なり低いレベルで発現し、しかもその菌株は増殖させる
のが困難であるということである。さらに別の問題は、
ナイシン単独では食品を腐敗させる微生物に対する抑制
活性に一定の制限があることである。
ナイシンを産生するStreptococcuslactis株がファージ
感受性であるということである。別のもうひとつの問題
は、天然のStreptococcus lactis株中ではナイシンがか
なり低いレベルで発現し、しかもその菌株は増殖させる
のが困難であるということである。さらに別の問題は、
ナイシン単独では食品を腐敗させる微生物に対する抑制
活性に一定の制限があることである。
【００１０】目 的 したがって本発明の一つの目的は、ナイシン産生をコー
ドしている外来ＤＮＡを含むナイシン生産性の誘導され
た微生物を提供することである。本発明の他の目的は、
ファージ感受性がなくて、比較的多量のナイシンを産生
するナイシン生産性誘導微生物を多量に収集することで
ある。また本発明は、所望の機能特性、特にナイシン生
産性を失なうことなく、ファージによる直接攻撃で不感
受性のクローンを選別することによってファージに不感
受性の誘導体となることが可能であるナイシン生産性誘
導微生物を提供する。さらに、本発明の別の目的は、他
の抑制物質を産生する微生物と組合せることができるナ
イシン生産性誘導微生物を提供することである。これら
の目的とその他の目的は、以下の説明から明確に理解さ
れよう。
ドしている外来ＤＮＡを含むナイシン生産性の誘導され
た微生物を提供することである。本発明の他の目的は、
ファージ感受性がなくて、比較的多量のナイシンを産生
するナイシン生産性誘導微生物を多量に収集することで
ある。また本発明は、所望の機能特性、特にナイシン生
産性を失なうことなく、ファージによる直接攻撃で不感
受性のクローンを選別することによってファージに不感
受性の誘導体となることが可能であるナイシン生産性誘
導微生物を提供する。さらに、本発明の別の目的は、他
の抑制物質を産生する微生物と組合せることができるナ
イシン生産性誘導微生物を提供することである。これら
の目的とその他の目的は、以下の説明から明確に理解さ
れよう。
【００１１】一般的な説明 本発明は、広い意味で、ナイシン産生をコードしている
染色体由来または染色体外の外来ＤＮＡを含有する新規
なナイシン生産性誘導微生物に係る。前記外来ＤＮＡ
は、ナイシン生産性の供与体微生物から得られ受容体微
生物中に伝達されており、その結果ナイシン生産性で、
通常はナイシン耐性の誘導微生物が生成している。本発
明は特に、誘導された細菌、酵母または真菌類（fungi
）から選択された新規なナイシン生産性誘導微生物に
関する。
染色体由来または染色体外の外来ＤＮＡを含有する新規
なナイシン生産性誘導微生物に係る。前記外来ＤＮＡ
は、ナイシン生産性の供与体微生物から得られ受容体微
生物中に伝達されており、その結果ナイシン生産性で、
通常はナイシン耐性の誘導微生物が生成している。本発
明は特に、誘導された細菌、酵母または真菌類（fungi
）から選択された新規なナイシン生産性誘導微生物に
関する。
【００１２】本明細書では用語を次のように定義して使
用する。
用する。
【００１３】(1) 「供与体微生物(donor microorganis
m) または供与菌」……ナイシン産生をコードしている
伝達可能なＤＮＡを含む親株、好ましくは天然でナイシ
ンを産生するStreptococcus lactisの菌株。
m) または供与菌」……ナイシン産生をコードしている
伝達可能なＤＮＡを含む親株、好ましくは天然でナイシ
ンを産生するStreptococcus lactisの菌株。
【００１４】(2) 「受容体微生物(recipient microorg
anism) または受容菌」……天然ではナイシンを産生し
ないか生産したとしても比較的少量しか産生しない親
株、好ましくは細菌。ナイシン感受性を有する（ナイシ
ンにより抑制される）かどうかは問わない。
anism) または受容菌」……天然ではナイシンを産生し
ないか生産したとしても比較的少量しか産生しない親
株、好ましくは細菌。ナイシン感受性を有する（ナイシ
ンにより抑制される）かどうかは問わない。
【００１５】(3) 「誘導微生物(derived microorganis
m) 」……外来ＤＮＡを受容体微生物に導入することに
よって得られるナイシン産生株。好ましくはナイシン生
産性の供与体微生物をナイシン非生産性またはナイシン
低生産性の受容体微生物と交配することによって得られ
るナイシン産生能の高まったナイシン生産株、特に細
菌。
m) 」……外来ＤＮＡを受容体微生物に導入することに
よって得られるナイシン産生株。好ましくはナイシン生
産性の供与体微生物をナイシン非生産性またはナイシン
低生産性の受容体微生物と交配することによって得られ
るナイシン産生能の高まったナイシン生産株、特に細
菌。
【００１６】(4) 「外来ＤＮＡ (foreign DNA)」……
受容菌中に天然には存在しないＤＮＡ。この外来ＤＮＡ
は本発明の方法により受容菌中に導入される。
受容菌中に天然には存在しないＤＮＡ。この外来ＤＮＡ
は本発明の方法により受容菌中に導入される。
【００１７】(5) 「抑制性物質(inhibitory substanc
e)」……微生物により産生されるナイシンを始めとす
る、他の微生物の成育を阻止する殺菌剤。
e)」……微生物により産生されるナイシンを始めとす
る、他の微生物の成育を阻止する殺菌剤。
【００１８】本発明は特に Streptococcus種、Pediococ
cus 種、Lactobacillus 種、Propionibacterium 種、Mi
crococcus 種、Leuconostoc 種、Staphylococcus種、Cl
ostridium 種、Flavobacterium種、Brevibacterium種、
E. coli 及Pseudomonas 種から選択されたナイシン生産
性誘導細菌に関する。
cus 種、Lactobacillus 種、Propionibacterium 種、Mi
crococcus 種、Leuconostoc 種、Staphylococcus種、Cl
ostridium 種、Flavobacterium種、Brevibacterium種、
E. coli 及Pseudomonas 種から選択されたナイシン生産
性誘導細菌に関する。
【００１９】本発明はまた、Saccharomyces 種、特にS.
cerevisiae 、Debaryomyces種、特にD. hansenii 、To
rulopsis種、Brettanomyces 種、Candida 種、Cryptoco
ccus種、Kloeckera 種、Kluyveromyces 種及びSchizosa
ccharomyces 種から選択されたナイシン生産性誘導酵母
に関する。
cerevisiae 、Debaryomyces種、特にD. hansenii 、To
rulopsis種、Brettanomyces 種、Candida 種、Cryptoco
ccus種、Kloeckera 種、Kluyveromyces 種及びSchizosa
ccharomyces 種から選択されたナイシン生産性誘導酵母
に関する。
【００２０】本発明はさらに、Penicillium 種、Mucor
種、Rhizopus種、Aspergillus 種、Deuteromycetes種、
Ascomycetes 種、Geotrichum種及びMonascus種から選択
されたナイシン生産性誘導真菌類に関する。
種、Rhizopus種、Aspergillus 種、Deuteromycetes種、
Ascomycetes 種、Geotrichum種及びMonascus種から選択
されたナイシン生産性誘導真菌類に関する。
【００２１】外来ＤＮＡは、Cohen 及びBoyer に付与さ
れた米国特許第4,237,224 号及び関連する特許に記載さ
れているように、クローニングベクター中のナイシンを
コードしているＤＮＡをスプライシングする形質転換技
術によって受容体微生物に伝達することができる。Rona
ld H. Olsen に付与された米国特許第4,374,200 号及び
類似の特許に記載されているクローニングベクターが有
用である。より簡便な方法として供与体微生物と受容体
微生物との接合交配（conjugal mating ）が伝達のため
に利用でき、この伝達法が好ましい。ナイシンをコード
しているＤＮＡのウイルス（ファージ）を用いた形質導
入も可能である。
れた米国特許第4,237,224 号及び関連する特許に記載さ
れているように、クローニングベクター中のナイシンを
コードしているＤＮＡをスプライシングする形質転換技
術によって受容体微生物に伝達することができる。Rona
ld H. Olsen に付与された米国特許第4,374,200 号及び
類似の特許に記載されているクローニングベクターが有
用である。より簡便な方法として供与体微生物と受容体
微生物との接合交配（conjugal mating ）が伝達のため
に利用でき、この伝達法が好ましい。ナイシンをコード
しているＤＮＡのウイルス（ファージ）を用いた形質導
入も可能である。
【００２２】本発明はまた、ナイシン生産性誘導微生物
を工学的処理により製造する方法にも関し、同方法は、
供与体微生物中でナイシン産生をコードしているＤＮＡ
を受容体微生物中に伝達して、ナイシン生産性の誘導微
生物を得、次いで外来ＤＮＡを有するナイシン生産性の
誘導微生物を単離することからなる。ここで、前記ＤＮ
Ａは受容体微生物に対して外来性であり、前記誘導微生
物中でナイシン産生を指令する。
を工学的処理により製造する方法にも関し、同方法は、
供与体微生物中でナイシン産生をコードしているＤＮＡ
を受容体微生物中に伝達して、ナイシン生産性の誘導微
生物を得、次いで外来ＤＮＡを有するナイシン生産性の
誘導微生物を単離することからなる。ここで、前記ＤＮ
Ａは受容体微生物に対して外来性であり、前記誘導微生
物中でナイシン産生を指令する。
【００２３】本発明はさらに、外来ＤＮＡを有するナイ
シン生産性誘導微生物により作成されたナイシン含有製
品に係る。このナイシン含有製品はさらに他の抑制性物
質を含んでいることができ、この抑制性物質はナイシン
生産性誘導微生物によって同時に産生されるものが望ま
しい。本発明は、純粋な化学品またはナイシン含有粗抽
出物としてのナイシンと、ナイシン非生産性のStreptoc
occus lactisの亜種diacetilactis またはナイシン耐性
に関して選択されたナイシン生産性誘導微生物との混合
物にも係る。
シン生産性誘導微生物により作成されたナイシン含有製
品に係る。このナイシン含有製品はさらに他の抑制性物
質を含んでいることができ、この抑制性物質はナイシン
生産性誘導微生物によって同時に産生されるものが望ま
しい。本発明は、純粋な化学品またはナイシン含有粗抽
出物としてのナイシンと、ナイシン非生産性のStreptoc
occus lactisの亜種diacetilactis またはナイシン耐性
に関して選択されたナイシン生産性誘導微生物との混合
物にも係る。
【００２４】本発明はさらに、外来ＤＮＡを含む２つ以
上のナイシン生産性誘導微生物株の混合物に係り、これ
らの株は、バクテリオファージに抗する厳格な予防策を
講じることなくナイシンの産生を確保できるように互い
に異なったファージ感受性を有している。これらの菌株
は混合した形でも分離した形でも包装できる。
上のナイシン生産性誘導微生物株の混合物に係り、これ
らの株は、バクテリオファージに抗する厳格な予防策を
講じることなくナイシンの産生を確保できるように互い
に異なったファージ感受性を有している。これらの菌株
は混合した形でも分離した形でも包装できる。
【００２５】最後に本発明は、外来ＤＮＡを含むナイシ
ン生産性微生物を単独或いは他の微生物との混合物の形
で動物に給餌することからなる動物の処理方法にも係
る。
ン生産性微生物を単独或いは他の微生物との混合物の形
で動物に給餌することからなる動物の処理方法にも係
る。
【００２６】本発明は、供与体微生物中でナイシン産生
をコードしているＤＮＡを外来ＤＮＡとして受容体微生
物中に導入して新たなナイシン生産性誘導微生物を得る
ことができるという事実に基づいている。得られるナイ
シン生産性誘導微生物は、食品とか他の物質の保存に使
用することができ、また特に鳥類とか哺乳動物といった
動物に抑制性物質を提供してその健康を維持或いは増進
することができる。外来ＤＮＡを含むナイシン生産性誘
導微生物は、ナイシン非生産性細菌、ナイシン不感受性
細菌或いは他の微生物、好ましくはナイシンと構造的に
異なる他の抑制性物質を産生可能な細菌或いは他の微生
物と組合せることができる。
をコードしているＤＮＡを外来ＤＮＡとして受容体微生
物中に導入して新たなナイシン生産性誘導微生物を得る
ことができるという事実に基づいている。得られるナイ
シン生産性誘導微生物は、食品とか他の物質の保存に使
用することができ、また特に鳥類とか哺乳動物といった
動物に抑制性物質を提供してその健康を維持或いは増進
することができる。外来ＤＮＡを含むナイシン生産性誘
導微生物は、ナイシン非生産性細菌、ナイシン不感受性
細菌或いは他の微生物、好ましくはナイシンと構造的に
異なる他の抑制性物質を産生可能な細菌或いは他の微生
物と組合せることができる。
【００２７】時として、ナイシンは、天然のナイシン生
産性Streptococcus lactis中でプラスミドによってコー
ドされている。またナイシンをコードしているプラスミ
ドＤＮＡは、天然の連結過程により受容菌の染色体中へ
組込まれることができ、これにより誘導微生物の特性の
消失が起こり難くなる。したがって本発明において伝達
後の外来ＤＮＡは誘導微生物中で染色体内或いは染色体
外の何れかであることができる。
産性Streptococcus lactis中でプラスミドによってコー
ドされている。またナイシンをコードしているプラスミ
ドＤＮＡは、天然の連結過程により受容菌の染色体中へ
組込まれることができ、これにより誘導微生物の特性の
消失が起こり難くなる。したがって本発明において伝達
後の外来ＤＮＡは誘導微生物中で染色体内或いは染色体
外の何れかであることができる。
【００２８】ナイシンをコードしているＤＮＡは天然の
ナイシン生産性Streptococcus lactisから切断フラグメ
ント或いはプラスミドの形で分離することができる。こ
のフラグメントはナイシンをコードしているＤＮＡの再
消化によって得ることができる。このフラグメントは次
いで、適当なクローニングベクター中へ挿入してクロー
ン化し、挿入ＤＮＡと共に受容体微生物中に伝達するこ
とができる。この導入される外来ＤＮＡはまた、ウイル
スを用いて染色体ＤＮＡ或いはプラスミドＤＮＡを形質
導入することでも伝達できる。プラスミドはまた、関連
のある（related ）或いは関連のない（unrelated ）属
及び種の接合交配によっても伝達することができる。本
明細書では「伝達（転移、transfer）」なる用語をその
最も広い意義で、ナイシン産生をコードしているＤＮＡ
を外来ＤＮＡとして受容体微生物中に移すための如何な
る手段をも指すものとして用いる。得られるナイシン生
産性誘導微生物は各細胞中に外来ＤＮＡの多数のコピー
を有し得、それはナイシンの濃度に関して細胞的な制限
を受け得る細胞当たりで生産されるナイシンの量を大き
く増加させ得る。
ナイシン生産性Streptococcus lactisから切断フラグメ
ント或いはプラスミドの形で分離することができる。こ
のフラグメントはナイシンをコードしているＤＮＡの再
消化によって得ることができる。このフラグメントは次
いで、適当なクローニングベクター中へ挿入してクロー
ン化し、挿入ＤＮＡと共に受容体微生物中に伝達するこ
とができる。この導入される外来ＤＮＡはまた、ウイル
スを用いて染色体ＤＮＡ或いはプラスミドＤＮＡを形質
導入することでも伝達できる。プラスミドはまた、関連
のある（related ）或いは関連のない（unrelated ）属
及び種の接合交配によっても伝達することができる。本
明細書では「伝達（転移、transfer）」なる用語をその
最も広い意義で、ナイシン産生をコードしているＤＮＡ
を外来ＤＮＡとして受容体微生物中に移すための如何な
る手段をも指すものとして用いる。得られるナイシン生
産性誘導微生物は各細胞中に外来ＤＮＡの多数のコピー
を有し得、それはナイシンの濃度に関して細胞的な制限
を受け得る細胞当たりで生産されるナイシンの量を大き
く増加させ得る。
【００２９】当業界で知られているように、誘導された
微生物は、貯蔵及び輸送中の生存性を高める種々の保存
形態とすることができる。かかる形態には非濃縮または
濃縮培養液、凍結または非凍結培養物及び安定化された
乾燥または凍結乾燥培養物が含まれる。培養物は通常、
生物学的に純粋な形態の誘導微生物を含んでいる。保存
形態における微生物の量は１グラム当り細胞約１０6 個
以上であり、１グラム当り約１×１０9 個以上の細胞が
望ましい。一般に１グラム当り１０9 個以上の細胞濃度
を得るには、通常遠心法または逆浸透法によって細胞か
ら液体培地を除去する手段が必要である。冷凍及び凍結
乾燥のためにはグリセリンとか粉乳（ドライミルク）等
のような各種の安定剤を使用する。誘導微生物の細胞は
通常、炭素源、チッ素源及び必須ミネラルを含む生育培
地中で増殖させる。これらのことは全て、膨大な量の特
許情報からも明らかであるように当業者に周知である。
微生物は、貯蔵及び輸送中の生存性を高める種々の保存
形態とすることができる。かかる形態には非濃縮または
濃縮培養液、凍結または非凍結培養物及び安定化された
乾燥または凍結乾燥培養物が含まれる。培養物は通常、
生物学的に純粋な形態の誘導微生物を含んでいる。保存
形態における微生物の量は１グラム当り細胞約１０6 個
以上であり、１グラム当り約１×１０9 個以上の細胞が
望ましい。一般に１グラム当り１０9 個以上の細胞濃度
を得るには、通常遠心法または逆浸透法によって細胞か
ら液体培地を除去する手段が必要である。冷凍及び凍結
乾燥のためにはグリセリンとか粉乳（ドライミルク）等
のような各種の安定剤を使用する。誘導微生物の細胞は
通常、炭素源、チッ素源及び必須ミネラルを含む生育培
地中で増殖させる。これらのことは全て、膨大な量の特
許情報からも明らかであるように当業者に周知である。
【００３０】詳細な説明 本発明は特に、生物学的に純粋なナイシン及び乳酸生産
性誘導細菌に係り、この細菌は、ナイシンに対して不感
受性であり、ナイシン生産性の供与体Streptococcus la
ctisから得たナイシン産生をコードしているプラスミド
由来のＤＮＡを含んでいる。またこのＤＮＡはナイシン
感受性の受容菌に伝達されており、その結果ナイシン及
び乳酸生産性誘導細菌が生成している。受容菌は、Stre
ptococcus lactisの亜種diacetilactis が好ましい。供
与菌のS. lactis として好ましいのはStreptococcus la
ctis ＡＴＣＣ11,454であり、この菌株は後記第１表か
ら分かるように、同質遺伝子型の株（isogenic strain
s）に対してのみナイシン生産能（nisin trait ）を伝
達する。ナイシン生産能と一緒にショ糖利用能も伝達さ
れる。近縁の公知のナイシン生産菌株としてＮＲＲＬ−
Ｂ−15,470（ＮＩＲＤ1404）があり、これも使用できる
であろう。誘導された供与体はS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ
−15,459及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,460であり、これらはナ
イシン生産能及びショ糖利用能を属内で伝達可能であ
る。接合体（トランスコンジュガント）であるナイシン
生産性誘導微生物は全てナイシン生産能の供与体として
利用できる可能性がある。その理由は、ナイシン生産能
及びショ糖利用能をコードしているプラスミドが一次伝
達で修飾されてしまっているかもしれないためである。
属内受容菌として好ましいものは、Streptococcus lact
isの亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,005、ＮＲ
ＲＬ−Ｂ−15,006、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,018、ＮＲＲＬ−
Ｂ−12,070（ＤＲＣ３，ｃｉｔ- ，ｌａｃ+ ）及びＮＲ
ＲＬ−Ｂ−12071 （ＤＲＣ３，ｌａｃ+ ，ｃｉｔ- ）、
並びにS. lactis 亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−
15,454、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,45
5、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,456及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,457で
ある。伝達の結果得られる外来ＤＮＡを有するナイシン
生産性誘導細菌は、Streptococcus lactisの亜種diacet
ilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464（及び類似の交配から得
られた同系の接合体ＮＲＲＬ−Ｂ−15,465、15,466、1
5,467）、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,468及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,
469とこれらの同質遺伝子型の細菌誘導体であって適当
な抗生物質耐性マーカーが選択によって除去された細菌
誘導体（これについては後に詳述する）から選択するの
が好ましい。
性誘導細菌に係り、この細菌は、ナイシンに対して不感
受性であり、ナイシン生産性の供与体Streptococcus la
ctisから得たナイシン産生をコードしているプラスミド
由来のＤＮＡを含んでいる。またこのＤＮＡはナイシン
感受性の受容菌に伝達されており、その結果ナイシン及
び乳酸生産性誘導細菌が生成している。受容菌は、Stre
ptococcus lactisの亜種diacetilactis が好ましい。供
与菌のS. lactis として好ましいのはStreptococcus la
ctis ＡＴＣＣ11,454であり、この菌株は後記第１表か
ら分かるように、同質遺伝子型の株（isogenic strain
s）に対してのみナイシン生産能（nisin trait ）を伝
達する。ナイシン生産能と一緒にショ糖利用能も伝達さ
れる。近縁の公知のナイシン生産菌株としてＮＲＲＬ−
Ｂ−15,470（ＮＩＲＤ1404）があり、これも使用できる
であろう。誘導された供与体はS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ
−15,459及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,460であり、これらはナ
イシン生産能及びショ糖利用能を属内で伝達可能であ
る。接合体（トランスコンジュガント）であるナイシン
生産性誘導微生物は全てナイシン生産能の供与体として
利用できる可能性がある。その理由は、ナイシン生産能
及びショ糖利用能をコードしているプラスミドが一次伝
達で修飾されてしまっているかもしれないためである。
属内受容菌として好ましいものは、Streptococcus lact
isの亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,005、ＮＲ
ＲＬ−Ｂ−15,006、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,018、ＮＲＲＬ−
Ｂ−12,070（ＤＲＣ３，ｃｉｔ- ，ｌａｃ+ ）及びＮＲ
ＲＬ−Ｂ−12071 （ＤＲＣ３，ｌａｃ+ ，ｃｉｔ- ）、
並びにS. lactis 亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−
15,454、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,45
5、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,456及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,457で
ある。伝達の結果得られる外来ＤＮＡを有するナイシン
生産性誘導細菌は、Streptococcus lactisの亜種diacet
ilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464（及び類似の交配から得
られた同系の接合体ＮＲＲＬ−Ｂ−15,465、15,466、1
5,467）、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,468及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,
469とこれらの同質遺伝子型の細菌誘導体であって適当
な抗生物質耐性マーカーが選択によって除去された細菌
誘導体（これについては後に詳述する）から選択するの
が好ましい。
【００３１】本発明は特に、ナイシンに対して感受性を
もたない生物学的に純粋なナイシン及び乳酸生産性細菌
に係り、これは、供与菌中でナイシン産生をコードして
いるプラスミドを含むナイシン生産性Streptococcus la
ctis供与菌と、ナイシン非生産性でナイシン感受性の乳
酸生産性受容菌とを接合交配させることで誘導される。
接合交配によってナイシン及び乳酸生産性誘導細菌が得
られるが、場合によっては、ナイシン産生をコードして
いる供与体由来の原プラスミドが、受容菌の宿主染色体
と組換えを起こすためにナイシン及び乳酸生産性誘導細
菌からプラスミドとして失われることがないという場合
がある。受容菌は伝達前はナイシンにより抑制すること
ができる。供与菌に由来するナイシン産生（及びショ糖
発酵）をコードしているプラスミドは約２９Mdalである
のが好ましく、誘導細菌中で２９Mdalの形もしくは変化
した形（すなわち、２９Mdalより長いものや短いも
の）、または宿主染色体ＤＮＡと組換えられた形で存在
しうる。
もたない生物学的に純粋なナイシン及び乳酸生産性細菌
に係り、これは、供与菌中でナイシン産生をコードして
いるプラスミドを含むナイシン生産性Streptococcus la
ctis供与菌と、ナイシン非生産性でナイシン感受性の乳
酸生産性受容菌とを接合交配させることで誘導される。
接合交配によってナイシン及び乳酸生産性誘導細菌が得
られるが、場合によっては、ナイシン産生をコードして
いる供与体由来の原プラスミドが、受容菌の宿主染色体
と組換えを起こすためにナイシン及び乳酸生産性誘導細
菌からプラスミドとして失われることがないという場合
がある。受容菌は伝達前はナイシンにより抑制すること
ができる。供与菌に由来するナイシン産生（及びショ糖
発酵）をコードしているプラスミドは約２９Mdalである
のが好ましく、誘導細菌中で２９Mdalの形もしくは変化
した形（すなわち、２９Mdalより長いものや短いも
の）、または宿主染色体ＤＮＡと組換えられた形で存在
しうる。
【００３２】本発明は特に、ナイシンに対し感受性でな
いナイシン及び乳酸生産性誘導細菌を製造する方法に係
り、この方法は、供与菌中でナイシン産生をコードして
いるプラスミドを含むナイシン生産性のStreptococcus
lactis供与菌を、ナイシン非生産性でナイシン感受性の
乳酸生産性受容菌と接合交配させ、同交配により生成し
たナイシン及び乳酸生産性誘導細菌を単離することから
なる。
いナイシン及び乳酸生産性誘導細菌を製造する方法に係
り、この方法は、供与菌中でナイシン産生をコードして
いるプラスミドを含むナイシン生産性のStreptococcus
lactis供与菌を、ナイシン非生産性でナイシン感受性の
乳酸生産性受容菌と接合交配させ、同交配により生成し
たナイシン及び乳酸生産性誘導細菌を単離することから
なる。
【００３３】さらに本発明は、乳酸生産性誘導細菌を食
品のような物質中に混入して該物質を保存する方法の改
良に係り、その改良点は、ナイシン生産性供与体Strept
ococcus lactisに由来するナイシン産生をコードしてい
るプラスミドであってナイシン及び乳酸生産性誘導細菌
を生成するようにナイシン感受性の受容菌へと伝達され
ているプラスミドに由来するＤＮＡを含んでおり、ナイ
シンに対し感受性でないナイシン及び乳酸生産性誘導細
菌を上記物質中に混入することからなる。この外来ＤＮ
Ａはナイシン産生をコードしており、前記ナイシン生産
性誘導細菌中で染色体中に組み込まれているかまたは染
色体外にある。被保存物質としては、サイロ貯蔵飼料、
切削油及び食品を始めとする農業上、工業上、食品上及
び他の用途のための全ゆる種類の、微生物にて劣化せし
められる産物がある。食品には生鮮肉、鳥肉、魚、牛乳
及び他の乳製品、市販のサラダ、野菜、ドレッシング、
ソース、及び冷凍貯蔵中に腐敗し易いあらゆる食品が含
まれる。
品のような物質中に混入して該物質を保存する方法の改
良に係り、その改良点は、ナイシン生産性供与体Strept
ococcus lactisに由来するナイシン産生をコードしてい
るプラスミドであってナイシン及び乳酸生産性誘導細菌
を生成するようにナイシン感受性の受容菌へと伝達され
ているプラスミドに由来するＤＮＡを含んでおり、ナイ
シンに対し感受性でないナイシン及び乳酸生産性誘導細
菌を上記物質中に混入することからなる。この外来ＤＮ
Ａはナイシン産生をコードしており、前記ナイシン生産
性誘導細菌中で染色体中に組み込まれているかまたは染
色体外にある。被保存物質としては、サイロ貯蔵飼料、
切削油及び食品を始めとする農業上、工業上、食品上及
び他の用途のための全ゆる種類の、微生物にて劣化せし
められる産物がある。食品には生鮮肉、鳥肉、魚、牛乳
及び他の乳製品、市販のサラダ、野菜、ドレッシング、
ソース、及び冷凍貯蔵中に腐敗し易いあらゆる食品が含
まれる。
【００３４】本発明はまた特に、乳酸生産性誘導細菌ま
たは該誘導細菌により産生された産物を混入することに
よって製造される改良された保存製品に係る。たとえ
ば、（１）ナイシン生産性Streptococcus lactis供与菌
から得られナイシン感受性の受容菌中に伝達されている
ナイシン産生をコードしているプラスミドに由来するＤ
ＮＡを含みナイシンに対し感受性でないナイシン及び乳
酸生産性誘導細菌を含有する製品、または（２）上記し
たナイシン及び乳酸生産性誘導細菌から得られたナイシ
ン含有産物を混入してある製品、または（３）上記した
ナイシン含有産物を、他の抑制性物質を産生するがナイ
シンは産生しない微生物と共に混入してある製品、また
は（４）上記したナイシン含有産物を、ナイシンのほか
に他の抑制性物質も産生する微生物と共に混入してある
製品に係る。
たは該誘導細菌により産生された産物を混入することに
よって製造される改良された保存製品に係る。たとえ
ば、（１）ナイシン生産性Streptococcus lactis供与菌
から得られナイシン感受性の受容菌中に伝達されている
ナイシン産生をコードしているプラスミドに由来するＤ
ＮＡを含みナイシンに対し感受性でないナイシン及び乳
酸生産性誘導細菌を含有する製品、または（２）上記し
たナイシン及び乳酸生産性誘導細菌から得られたナイシ
ン含有産物を混入してある製品、または（３）上記した
ナイシン含有産物を、他の抑制性物質を産生するがナイ
シンは産生しない微生物と共に混入してある製品、また
は（４）上記したナイシン含有産物を、ナイシンのほか
に他の抑制性物質も産生する微生物と共に混入してある
製品に係る。
【００３５】最後に本発明は、上記した誘導細菌によっ
て産生されるナイシン含有産物であってさらに、Strept
ococcus lactisの亜種diacetilactis 由来の抑制性物質
も含むナイシン含有産物にも係る。
て産生されるナイシン含有産物であってさらに、Strept
ococcus lactisの亜種diacetilactis 由来の抑制性物質
も含むナイシン含有産物にも係る。
【００３６】
【実施例】実施例１ ショ糖利用能及びナイシン生産性が接合により伝達され
うるかどうかをみるために、S. lactis ＡＴＣＣ−1
1,454（ショ糖を利用すると共にナイシンを生産する）
を供与株とし、S. lactis の亜種diacetilactis 及びS.
lactis （何れの株もショ糖を利用せず、ナイシンを生
産しない）を受容株として交配実験を行なった。交配条
件は Gonzalez, Carlos F. and Blair S. Kunka, Appl.
Environ.Microbiol.46, 128-132 (1983)に従った。但
し、交配用フィルターを寒天で被覆する代わりに、細胞
を寒天表面に対面させたフイルターを、ＣＯ2 ／Ｈ2 雰
囲気のＢＢＬ（登録商標）Anaerobic Jar 中に３〜４時
間入れた。接合体は、受容体の染色体耐性（chromosoma
l resistance）及びショ糖利用能またはナイシン（1000
単位／ml）耐性に関して選択した。
うるかどうかをみるために、S. lactis ＡＴＣＣ−1
1,454（ショ糖を利用すると共にナイシンを生産する）
を供与株とし、S. lactis の亜種diacetilactis 及びS.
lactis （何れの株もショ糖を利用せず、ナイシンを生
産しない）を受容株として交配実験を行なった。交配条
件は Gonzalez, Carlos F. and Blair S. Kunka, Appl.
Environ.Microbiol.46, 128-132 (1983)に従った。但
し、交配用フィルターを寒天で被覆する代わりに、細胞
を寒天表面に対面させたフイルターを、ＣＯ2 ／Ｈ2 雰
囲気のＢＢＬ（登録商標）Anaerobic Jar 中に３〜４時
間入れた。接合体は、受容体の染色体耐性（chromosoma
l resistance）及びショ糖利用能またはナイシン（1000
単位／ml）耐性に関して選択した。
【００３７】S. lactis ＡＴＣＣ11,454の同質遺伝子
型株（isogenic strain ）を構築した。S. lactis Ａ
ＴＣＣ11,454株（乳糖及びショ糖を利用し、ナイシンを
生産する）を加温した生育温度（４０℃）にさらすこと
で定住性の２９Mdalプラスミドを熱除去した。この熱除
去した株は、乳糖は利用するがショ糖は利用せず、ナイ
シンを生産しなかった。次いで該株を４０℃でさらに熱
処理して、別の定住性３２Mdalプラスミドを除去した。
こうしてS. lactis ＡＴＣＣ11,454の構築株を得た。
この株は乳糖を利用せず（Ｌａｃ- ）、ショ糖を利用せ
ず（Ｓｕｃ- ）、ナイシンを生産しなかった（Ｎｉ
ｓ- ）。この構築株をS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,453
（Ｌａｃ- ，Ｓｕｃ- ，Ｎｉｓ- ）と名付けた。このＮ
ＲＲＬ−Ｂ−15,453を次いで、高濃度のストレプトマイ
シンにさらして、1000μｇ／mlの濃度の同抗生物質に対
して染色体突然変異を起こさせた。このＮＲＲＬ−Ｂ−
15,453Ｓｍr （ストレプトマイシン耐性）株を、ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−15,454と名付けた。この株ＮＲＲＬ−Ｂ−15,4
54を次いで、接合交配実験で受容体として用いた。
型株（isogenic strain ）を構築した。S. lactis Ａ
ＴＣＣ11,454株（乳糖及びショ糖を利用し、ナイシンを
生産する）を加温した生育温度（４０℃）にさらすこと
で定住性の２９Mdalプラスミドを熱除去した。この熱除
去した株は、乳糖は利用するがショ糖は利用せず、ナイ
シンを生産しなかった。次いで該株を４０℃でさらに熱
処理して、別の定住性３２Mdalプラスミドを除去した。
こうしてS. lactis ＡＴＣＣ11,454の構築株を得た。
この株は乳糖を利用せず（Ｌａｃ- ）、ショ糖を利用せ
ず（Ｓｕｃ- ）、ナイシンを生産しなかった（Ｎｉ
ｓ- ）。この構築株をS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,453
（Ｌａｃ- ，Ｓｕｃ- ，Ｎｉｓ- ）と名付けた。このＮ
ＲＲＬ−Ｂ−15,453を次いで、高濃度のストレプトマイ
シンにさらして、1000μｇ／mlの濃度の同抗生物質に対
して染色体突然変異を起こさせた。このＮＲＲＬ−Ｂ−
15,453Ｓｍr （ストレプトマイシン耐性）株を、ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−15,454と名付けた。この株ＮＲＲＬ−Ｂ−15,4
54を次いで、接合交配実験で受容体として用いた。
【００３８】
【表１】
【００３９】第１表に実験とその結果を示す。これらの
実験で、ショ糖利用能およびナイシン生産能の両者の伝
達は、同質遺伝子型受容体S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,454についてのみ認められた。S. lactis ＡＴＣＣ1
1,454からS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452及びS. lact
is の亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,006−Ｓｍ
r へのショ糖利用能及びナイシン生産能の属内伝達は、
認められなかった。
実験で、ショ糖利用能およびナイシン生産能の両者の伝
達は、同質遺伝子型受容体S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,454についてのみ認められた。S. lactis ＡＴＣＣ1
1,454からS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452及びS. lact
is の亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,006−Ｓｍ
r へのショ糖利用能及びナイシン生産能の属内伝達は、
認められなかった。
【００４０】第１表において伝達頻度は、供与体のコロ
ニー形成単位（ＣＦＵ）当りのナイシン耐性及びナイシ
ン生産性コロニーの個数で表わされている。供与体のＣ
ＦＵは交配前に測定した。接合体は、受容体の染色体耐
性とショ糖利用能またはナイシン（1000単位／ml）耐性
に関して選択した。
ニー形成単位（ＣＦＵ）当りのナイシン耐性及びナイシ
ン生産性コロニーの個数で表わされている。供与体のＣ
ＦＵは交配前に測定した。接合体は、受容体の染色体耐
性とショ糖利用能またはナイシン（1000単位／ml）耐性
に関して選択した。
【００４１】実施例２ S. lactis ＡＴＣＣ11,454を高濃度のリファマイシン
にさらして、リファマイシン耐性（Ｒｉｆr ）の突然変
異体（濃度 400μｇ／mlに対する耐性）を得た。この突
然変異体を受容体とし、接合性プラスミドｐＩＰ501 を
含むS. sanguisＶ683 株との接合交配実験を行なった。
得られた接合体S. lactis ＡＴＣＣ11,454Ｒｉｆr (pIP
501)を単離し、この菌株をS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,458と命名した。このS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,45
8をS. lactis ＡＴＣＣ11,454と共に供与体として用
いて、ナイシン遺伝子の接合伝達をみるために同質遺伝
子型交配及び属内交配実験を行なった。本実験のための
交配条件は、実施例１について前述したのと同様とし
た。
にさらして、リファマイシン耐性（Ｒｉｆr ）の突然変
異体（濃度 400μｇ／mlに対する耐性）を得た。この突
然変異体を受容体とし、接合性プラスミドｐＩＰ501 を
含むS. sanguisＶ683 株との接合交配実験を行なった。
得られた接合体S. lactis ＡＴＣＣ11,454Ｒｉｆr (pIP
501)を単離し、この菌株をS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,458と命名した。このS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,45
8をS. lactis ＡＴＣＣ11,454と共に供与体として用
いて、ナイシン遺伝子の接合伝達をみるために同質遺伝
子型交配及び属内交配実験を行なった。本実験のための
交配条件は、実施例１について前述したのと同様とし
た。
【００４２】第２表は、S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,4
58株を供与体として用い、S.lactisＮＲＲＬ−Ｂ−15,4
52、S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,454（S. lactis Ａ
ＴＣＣ11,454の同質遺伝子型株）及びS. lactis 亜種di
acetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,006Ｓｍr を受容体とし
て用いた交配実験の結果を示している。プラスミドｐＩ
Ｐ501 の伝達は２つのS. lactis 株において認められた
が、S. lactis の亜種diacetilactis では検出されなか
った。ショ糖利用能及びナイシン生産能の伝達は同質遺
伝子型株S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,454に対してのみ
認められ、その頻度は 1.4×10-3であった。
58株を供与体として用い、S.lactisＮＲＲＬ−Ｂ−15,4
52、S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,454（S. lactis Ａ
ＴＣＣ11,454の同質遺伝子型株）及びS. lactis 亜種di
acetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,006Ｓｍr を受容体とし
て用いた交配実験の結果を示している。プラスミドｐＩ
Ｐ501 の伝達は２つのS. lactis 株において認められた
が、S. lactis の亜種diacetilactis では検出されなか
った。ショ糖利用能及びナイシン生産能の伝達は同質遺
伝子型株S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,454に対してのみ
認められ、その頻度は 1.4×10-3であった。
【００４３】
【表２】
【００４４】S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,458をS. lac
tis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,454（同質遺伝子型株）と交配さ
せたとき、２つの異なる表現型の接合体が得られた。一
つの表現型は乳糖マイナス（Ｌａｃ- ）、ショ糖プラス
（Ｓｕｃ+ ）であり、ナイシンを生産（Ｎｉｓ+ ）し
た。この単離体をS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,459と命
名した。他の表現型の接合体は乳糖マイナス（Ｌａ
ｃ- ）、ショ糖プラス（Ｓｕｃ+ ）であり、ナイシンを
生産し（Ｎｉｓ+ ）、プラスミドｐＩＰ501 を含んでい
た。この単離体はS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,460と命
名した。
tis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,454（同質遺伝子型株）と交配さ
せたとき、２つの異なる表現型の接合体が得られた。一
つの表現型は乳糖マイナス（Ｌａｃ- ）、ショ糖プラス
（Ｓｕｃ+ ）であり、ナイシンを生産（Ｎｉｓ+ ）し
た。この単離体をS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,459と命
名した。他の表現型の接合体は乳糖マイナス（Ｌａ
ｃ- ）、ショ糖プラス（Ｓｕｃ+ ）であり、ナイシンを
生産し（Ｎｉｓ+ ）、プラスミドｐＩＰ501 を含んでい
た。この単離体はS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,460と命
名した。
【００４５】これらの誘導株は供与体株と異なり、スト
レプトマイシン耐性でリファマイシン感受性であって、
乳糖から酸を生産しなかった。しかし受容体である親株
と異なり、ナイシン生産菌であり、炭素源としてショ糖
を利用して酸を生産可能であった。すなわち、S. lacti
s ＡＴＣＣ 11,454株とそのｐＩＰ501 誘導体S. lac
tis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,458で、ショ糖利用能及びナイシ
ン産生の同質遺伝子型内での伝達のみが認められた。
レプトマイシン耐性でリファマイシン感受性であって、
乳糖から酸を生産しなかった。しかし受容体である親株
と異なり、ナイシン生産菌であり、炭素源としてショ糖
を利用して酸を生産可能であった。すなわち、S. lacti
s ＡＴＣＣ 11,454株とそのｐＩＰ501 誘導体S. lac
tis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,458で、ショ糖利用能及びナイシ
ン産生の同質遺伝子型内での伝達のみが認められた。
【００４６】実施例３ S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,459からS. lactis ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−15,452へのナイシン産生伝達能を試験した。受
容体であるＮＲＲＬ−Ｂ−15,452株はナイシン生産性を
有せず、ナイシンに感受性で、酸を生産するための炭素
源としてショ糖を利用できない。交配条件は実施例１に
おけると同様であり、結果は第３表に示されている。
Ｌ−Ｂ−15,452へのナイシン産生伝達能を試験した。受
容体であるＮＲＲＬ−Ｂ−15,452株はナイシン生産性を
有せず、ナイシンに感受性で、酸を生産するための炭素
源としてショ糖を利用できない。交配条件は実施例１に
おけると同様であり、結果は第３表に示されている。
【００４７】
【表３】
【００４８】S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,459は同質遺
伝子型でない株S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452に対
し、ナイシン産生及びナイシン耐性とショ糖利用能を伝
達可能であった。
伝子型でない株S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452に対
し、ナイシン産生及びナイシン耐性とショ糖利用能を伝
達可能であった。
【００４９】実施例４ S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,460について、S. lactis
ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452とS. lactis 亜種diacetilactis
ＮＲＲＬ−Ｂ−15,455及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,456に対し
てナイシン産生を伝達する能力があるかどうかを試験し
た。受容体株であるＮＲＲＬ−Ｂ−15,452、ＮＲＲＬ−
Ｂ−15,455及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,456は何れも、ナイシ
ン生産性を有せず、ナイシンに対し感受性であり、酸を
生産するために炭素源としてショ糖を利用できない。
ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452とS. lactis 亜種diacetilactis
ＮＲＲＬ−Ｂ−15,455及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,456に対し
てナイシン産生を伝達する能力があるかどうかを試験し
た。受容体株であるＮＲＲＬ−Ｂ−15,452、ＮＲＲＬ−
Ｂ−15,455及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,456は何れも、ナイシ
ン生産性を有せず、ナイシンに対し感受性であり、酸を
生産するために炭素源としてショ糖を利用できない。
【００５０】交配条件及び選択法は実施例１におけると
同様であり、結果は第４表に示されている。
同様であり、結果は第４表に示されている。
【００５１】
【表４】
【００５２】S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,460は、同質
遺伝子型でない株S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452に対
し、またS. lactis 亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−
15,455に対し、ナイシン生産性、ナイシン耐性及びショ
糖利用能を伝達することができた。
遺伝子型でない株S. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452に対
し、またS. lactis 亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−
15,455に対し、ナイシン生産性、ナイシン耐性及びショ
糖利用能を伝達することができた。
【００５３】実施例３及び実施例４に記載した接合交配
によって、数多くの接合体、すなわち誘導株が単離され
た。誘導されたS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,461は、S.
lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452の接合体の典型例であ
る。誘導されたS. lactis 亜種diacetilactis ＮＲＲＬ
−Ｂ−15,469は、S. lactis 亜種diacetilactis ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−15,456の接合体の典型例である。
によって、数多くの接合体、すなわち誘導株が単離され
た。誘導されたS. lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,461は、S.
lactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452の接合体の典型例であ
る。誘導されたS. lactis 亜種diacetilactis ＮＲＲＬ
−Ｂ−15,469は、S. lactis 亜種diacetilactis ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−15,456の接合体の典型例である。
【００５４】第５表は、実施例４に記載の交配から得ら
れた接合体菌株の表現型特性をまとめたものである。各
交配から得られた接合体を選択マーカー及び非選択マー
カーに関して分析した。接合体のプラスミド含有量の分
析により、接合体が受容菌型であることを確認した。ま
た接合体について、そのそれぞれの受容体の同質特異性
ファージ（homospecific phages ）に対する感受性を試
験した。接合体はファージによって溶解したが、供与体
対照は感受性を示さなかった。
れた接合体菌株の表現型特性をまとめたものである。各
交配から得られた接合体を選択マーカー及び非選択マー
カーに関して分析した。接合体のプラスミド含有量の分
析により、接合体が受容菌型であることを確認した。ま
た接合体について、そのそれぞれの受容体の同質特異性
ファージ（homospecific phages ）に対する感受性を試
験した。接合体はファージによって溶解したが、供与体
対照は感受性を示さなかった。
【００５５】
【表５】
【００５６】実施例５ 第１回目の交配により誘導された接合体S. lactis 亜種
diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464株を供与体とし
て、S. lactis の亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,018−Ｓｍr （ストレプトマイシン耐性）及びS. lact
is 亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,005−Ｆｕｓ
r （フシジン酸耐性）との同質遺伝子型交配に用いた。
diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464株を供与体とし
て、S. lactis の亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,018−Ｓｍr （ストレプトマイシン耐性）及びS. lact
is 亜種diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,005−Ｆｕｓ
r （フシジン酸耐性）との同質遺伝子型交配に用いた。
【００５７】この交配実験の結果は、第６表に掲げられ
ている。これらの２つの同質遺伝子型受容体株でショ糖
利用能及びナイシン産生能の伝達が認められた。各交配
で得られた接合体のプラスミド含有量をしらべた。さら
に非選択形質について分析を行なった。接合体は受容体
型であることが確認された。
ている。これらの２つの同質遺伝子型受容体株でショ糖
利用能及びナイシン産生能の伝達が認められた。各交配
で得られた接合体のプラスミド含有量をしらべた。さら
に非選択形質について分析を行なった。接合体は受容体
型であることが確認された。
【００５８】
【表６】
【００５９】実施例６ １０℃に維持したひき肉におけるS. lactis 亜種diacet
ilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464株によるナイシンの産生
実験 試験株の個々のコロニーによるナイシンの産生を確認す
るために、１８時間培養したS. cremoris ＡＴＣＣ14,3
65を予め満たしたペプトン化牛乳寒天を含むペトリ皿中
でコロニーを複製した。ＡＴＣＣ14,365株は、ナイシン
産生を検定するために使用されるナイシン感受性株であ
る（J. Gen. Microbiol. 4, 71 (1950)）。１８時間イ
ンキュベーションした後、抑制ゾーンの出現がナイシン
産生を示す。この方法はKozak et al., J. Gen. Microb
iol. 83, 295-302 (1974) に記載されたものである。
ilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464株によるナイシンの産生
実験 試験株の個々のコロニーによるナイシンの産生を確認す
るために、１８時間培養したS. cremoris ＡＴＣＣ14,3
65を予め満たしたペプトン化牛乳寒天を含むペトリ皿中
でコロニーを複製した。ＡＴＣＣ14,365株は、ナイシン
産生を検定するために使用されるナイシン感受性株であ
る（J. Gen. Microbiol. 4, 71 (1950)）。１８時間イ
ンキュベーションした後、抑制ゾーンの出現がナイシン
産生を示す。この方法はKozak et al., J. Gen. Microb
iol. 83, 295-302 (1974) に記載されたものである。
【００６０】肉中のナイシン含有量は、Fowler et al.
により「The Quantitative Agar Diffusion Assay used
for the estimation and differentiation of nisin i
n food」（The Assay of Nisin in Foods. Fowler, G.
G., Jarvis, B., Tramer, J.；Aplin & Barret Ltd., Y
eovil, Somerset, UK （英国），Technical Series,Soc
iety for Applied Bacteriology, 1975, No.8, pp.91-1
05 ）に記載されている方法によって測定した。
により「The Quantitative Agar Diffusion Assay used
for the estimation and differentiation of nisin i
n food」（The Assay of Nisin in Foods. Fowler, G.
G., Jarvis, B., Tramer, J.；Aplin & Barret Ltd., Y
eovil, Somerset, UK （英国），Technical Series,Soc
iety for Applied Bacteriology, 1975, No.8, pp.91-1
05 ）に記載されている方法によって測定した。
【００６１】標準曲線は、既知濃度の精製ナイシンを肉
に添加することで作成した。次いで肉試料を、Tramer e
t al. の方法によって処理した。肉抽出物を寒天拡散法
で分析し、ナイシン濃度の対数をゾーン直径寸法に対し
てプロットした。S.cremorisＡＴＣＣ14,365を、インジ
ケーター微生物として用いた。また、ナイシンを産生
し、したがってナイシンに対して不感受性のS. lactis
ＡＴＣＣ11,454株もインジケーター微生物として用い
た。
に添加することで作成した。次いで肉試料を、Tramer e
t al. の方法によって処理した。肉抽出物を寒天拡散法
で分析し、ナイシン濃度の対数をゾーン直径寸法に対し
てプロットした。S.cremorisＡＴＣＣ14,365を、インジ
ケーター微生物として用いた。また、ナイシンを産生
し、したがってナイシンに対して不感受性のS. lactis
ＡＴＣＣ11,454株もインジケーター微生物として用い
た。
【００６２】高度に精製したナイシン（Aplin & Barret
t, Ltd. より入手）を試料肉に加え、標準曲線を用いて
ナイシン濃度を算出した。
t, Ltd. より入手）を試料肉に加え、標準曲線を用いて
ナイシン濃度を算出した。
【００６３】試験微生物の接種材料を作成するために、
500mlのＭ１７ブロス（Terzaghi and Sandine, Appl.
Microbiol.29, 807-813 (1975)）中でＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,464を１８時間増殖させた。得られた細胞を１０℃で
１０分間、10,000 rpmでの遠心により２回洗浄し、標準
法リン酸緩衝液（E. H. Marth, (Ed.) Standard Method
s for Examination of Dairy Products, 14th ed. p.6
2, Amer. Public HealthAssoc., Washington, D. C. ）
中に再懸濁させた。細胞懸濁物を分光光度測定法で、約
1.5×１０9 コロニー形成単位（ＣＦＵ）／mlに調整し
た。実際の濃度を測定したところ 1.7×１０9 ＣＦＵ／
mlであった。新鮮なブタ肩肉（骨、皮つき）を、地元の
食肉供給会社から購入した。無菌状態で皮を取除き、肉
を殺菌したひき肉機中で粉砕した。この肉を次いで50〜
100 ｇずつに分け、無菌容器中に入れた。これらの容器
について、次のような調整を行なった。
500mlのＭ１７ブロス（Terzaghi and Sandine, Appl.
Microbiol.29, 807-813 (1975)）中でＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,464を１８時間増殖させた。得られた細胞を１０℃で
１０分間、10,000 rpmでの遠心により２回洗浄し、標準
法リン酸緩衝液（E. H. Marth, (Ed.) Standard Method
s for Examination of Dairy Products, 14th ed. p.6
2, Amer. Public HealthAssoc., Washington, D. C. ）
中に再懸濁させた。細胞懸濁物を分光光度測定法で、約
1.5×１０9 コロニー形成単位（ＣＦＵ）／mlに調整し
た。実際の濃度を測定したところ 1.7×１０9 ＣＦＵ／
mlであった。新鮮なブタ肩肉（骨、皮つき）を、地元の
食肉供給会社から購入した。無菌状態で皮を取除き、肉
を殺菌したひき肉機中で粉砕した。この肉を次いで50〜
100 ｇずつに分け、無菌容器中に入れた。これらの容器
について、次のような調整を行なった。
【００６４】Ａ．１１個の容器については、 100ｇの肉
にブドウ糖を 0.5重量％の最終濃度まで添加した。分析
のためにこれらの試料を２群に分けた。一つの群の試料
は、さらに処理することなく分析した。他の群の試料
は、既知量の精製ナイシン（100 〜200 単位／食肉１
ｇ）を添加して、標準曲線を作成するのに用いた。
にブドウ糖を 0.5重量％の最終濃度まで添加した。分析
のためにこれらの試料を２群に分けた。一つの群の試料
は、さらに処理することなく分析した。他の群の試料
は、既知量の精製ナイシン（100 〜200 単位／食肉１
ｇ）を添加して、標準曲線を作成するのに用いた。
【００６５】Ｂ．３個の容器については、５０ｇの肉に
ブドウ糖を 0.5重量％の最終濃度まで、またナイシンを
肉１ｇ当たり100 単位だけ、それぞれ添加した。本試料
については毎日ナイシンを分析した。
ブドウ糖を 0.5重量％の最終濃度まで、またナイシンを
肉１ｇ当たり100 単位だけ、それぞれ添加した。本試料
については毎日ナイシンを分析した。
【００６６】Ｃ．１１個の容器については、 100ｇの肉
にブドウ糖を 0.5重量％の最終濃度まで、またS. lacti
s ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464株を 1.7×１０7 ＣＦＵ／肉１
ｇの最終濃度まで、それぞれ添加した。
にブドウ糖を 0.5重量％の最終濃度まで、またS. lacti
s ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464株を 1.7×１０7 ＣＦＵ／肉１
ｇの最終濃度まで、それぞれ添加した。
【００６７】結果を第７表に示す。同表において、「Ｎ
Ｄ」は測定しなかったことを示し、また肉質評価値は次
の通りである。
Ｄ」は測定しなかったことを示し、また肉質評価値は次
の通りである。
【００６８】０ …… 新鮮、純肉芳香、真の赤色 １ …… 僅かに芳香を損失、真の赤色 ２ …… 僅かに芳香を損失、はっきりした赤色 ３ …… 芳香損失、僅かの赤色 ４ …… 腐臭、ぬるぬるした外観、赤色なし
【００６９】
【表７】
【００７０】実施例７ 牛乳中のナイシン含有量を、実施例６で肉について利用
したのと同様の方法で測定した。
したのと同様の方法で測定した。
【００７１】試験微生物の接種材料を作成するために、
Ｍ１７ブロス中で１８時間微生物を増殖させた。得られ
た細胞を１０℃で１０分間、10,000 rpmでの遠心により
２回洗浄し、ｐＨ７．２の標準法リン酸緩衝液中に再懸
濁させた。懸濁物を分光光度測定法で、 1.5×１０8 コ
ロニー形成単位／mlに調整した。脱脂ドライミルク（１
０％ｗ／ｖ）を３０分間蒸気処理した上で冷却し、ブド
ウ糖を最終濃度 0.5重量％まで添加した。この牛乳とブ
ドウ糖との混合物５０mlを約１０6 ＣＦＵ／mlの割合で
接種し、３２℃で培養した。試料の分析は毎日行なっ
た。
Ｍ１７ブロス中で１８時間微生物を増殖させた。得られ
た細胞を１０℃で１０分間、10,000 rpmでの遠心により
２回洗浄し、ｐＨ７．２の標準法リン酸緩衝液中に再懸
濁させた。懸濁物を分光光度測定法で、 1.5×１０8 コ
ロニー形成単位／mlに調整した。脱脂ドライミルク（１
０％ｗ／ｖ）を３０分間蒸気処理した上で冷却し、ブド
ウ糖を最終濃度 0.5重量％まで添加した。この牛乳とブ
ドウ糖との混合物５０mlを約１０6 ＣＦＵ／mlの割合で
接種し、３２℃で培養した。試料の分析は毎日行なっ
た。
【００７２】ナイシンの分析手順は、次の通りである。
（１）試料３０mlを採取、（２）５Ｎ ＨＣｌを用いて
ｐＨを２に調整、（３）試料を５分間煮沸、（４）冷
却、（５）試料を１０℃で１０分間、10,000 rpmで遠
心、（６）上澄みを前述の定量的寒天拡散法で分析し
た。検定微生物は、ナイシンに対して感受性であるＡＴ
ＣＣ14,365とした。ＡＴＣＣ11,454は、ナイシン及びナ
イシン生産株に対し不感受性である。標準曲線は、牛乳
試料にナイシンを１００単位／mlの割合で添加して毎日
作成した。結果を第８表に掲げる。
（１）試料３０mlを採取、（２）５Ｎ ＨＣｌを用いて
ｐＨを２に調整、（３）試料を５分間煮沸、（４）冷
却、（５）試料を１０℃で１０分間、10,000 rpmで遠
心、（６）上澄みを前述の定量的寒天拡散法で分析し
た。検定微生物は、ナイシンに対して感受性であるＡＴ
ＣＣ14,365とした。ＡＴＣＣ11,454は、ナイシン及びナ
イシン生産株に対し不感受性である。標準曲線は、牛乳
試料にナイシンを１００単位／mlの割合で添加して毎日
作成した。結果を第８表に掲げる。
【００７３】第８表において株ＮＲＲＬ−Ｂ−15,455、
ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,456は親型
の株の代表的なものであり、株ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464、
ＮＲＲＬ−Ｂ−15,461及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,469はそれ
ぞれ、その誘導株の代表的なものである。
ＮＲＲＬ−Ｂ−15,452及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,456は親型
の株の代表的なものであり、株ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464、
ＮＲＲＬ−Ｂ−15,461及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,469はそれ
ぞれ、その誘導株の代表的なものである。
【００７４】
【表８】
【００７５】本発明に係る誘導微生物、特に誘導細菌は
冷蔵温度でナイシン（及び可能性として微生物を抑制す
る他の物質）を生産でき、このことは食品の保存上で極
めて有利な点である。これは第７表に掲げた結果により
示されており、誘導微生物を添加した肉が１０日目に至
るまでいたみ始めなかったのに対して、誘導微生物を添
加しなかった対照の肉は３日目でいたみ始め、７日目ま
でに腐敗してしまった。
冷蔵温度でナイシン（及び可能性として微生物を抑制す
る他の物質）を生産でき、このことは食品の保存上で極
めて有利な点である。これは第７表に掲げた結果により
示されており、誘導微生物を添加した肉が１０日目に至
るまでいたみ始めなかったのに対して、誘導微生物を添
加しなかった対照の肉は３日目でいたみ始め、７日目ま
でに腐敗してしまった。
【００７６】好ましいStreptococcus. lactis 亜種diac
etilactis は、選択により除去されるフシジン酸耐性マ
ーカーをもつＮＲＲＬ−Ｂ−15,469と、選択により除去
されるリファマイシン耐性マーカーをもつＮＲＲＬ−Ｂ
−15,464である。これらの誘導株の何れも、乳糖利用能
を有しない。
etilactis は、選択により除去されるフシジン酸耐性マ
ーカーをもつＮＲＲＬ−Ｂ−15,469と、選択により除去
されるリファマイシン耐性マーカーをもつＮＲＲＬ−Ｂ
−15,464である。これらの誘導株の何れも、乳糖利用能
を有しない。
【００７７】尚、本発明により誘導されたS. lactis の
亜種diacetilactis の株の炭水化物利用特性をまとめて
下記表に挙げる。
亜種diacetilactis の株の炭水化物利用特性をまとめて
下記表に挙げる。
【００７８】
【表９】
【００７９】本発明の誘導株はｎｉｓ+ である。ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−15,464〜467 はｓｕｃ+ であることを除いてＮ
ＲＲＬ−Ｂ−15,006と同じである。ＮＲＲＬ−Ｂ−15,4
68はショ糖利用能を除いてＮＲＲＬ−Ｂ−15,006と同じ
である。ＮＲＲＬ−Ｂ−15,469はｓｕｃ+ であることを
除いてＮＲＲＬ−Ｂ−15,018と同じである。
Ｌ−Ｂ−15,464〜467 はｓｕｃ+ であることを除いてＮ
ＲＲＬ−Ｂ−15,006と同じである。ＮＲＲＬ−Ｂ−15,4
68はショ糖利用能を除いてＮＲＲＬ−Ｂ−15,006と同じ
である。ＮＲＲＬ−Ｂ−15,469はｓｕｃ+ であることを
除いてＮＲＲＬ−Ｂ−15,018と同じである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/31 15/74
Claims (8)
- 【請求項１】 物質中に細菌を混入することによって物
質を保存する方法であって、 ナイシン産生をコードしており、ナイシン生産性供与菌
から得られ受容菌に伝達された外来ＤＮＡを含有するナ
イシン生産性誘導細菌を物質中に混入することからなっ
ており、供与菌が、ショ糖利用能およびナイシン産生を
コードしている２９ Mdal プラスミド由来のプラスミド
ＤＮＡを含有する生物学的に純粋なStreptococcus 種で
あり、受容菌が、ナイシンに感受性の生物学的に純粋な
Streptococcus 種であることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 受容菌がナイシンにより抑制され、ナイ
シン生産性誘導細菌がナイシンにより抑制されないこと
を特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 供与菌が、Streptococcus lactis ＡＴ
ＣＣ11,454、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,458、ＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,459、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,460、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,46
1、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,462及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,470並
びにこれらStreptococcus lactisの誘導体であって選択
マーカーとしての特定の抗生物質に対する耐性または感
受性に関して単離された誘導体から成る群から選択され
たものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 受容菌が、Streptococcus lactis ＡＴ
ＣＣ11,454、ＮＲＲＬ−Ｂ−15453 及びＮＲＲＬ−Ｂ−
15,454、並びにこれらStreptococcus lactisの誘導体で
あって選択マーカーとしての特定の抗生物質に対する耐
性または感受性に関して単離された誘導体から成る群か
ら選択されたものであることを特徴とする請求項１に記
載の方法。 - 【請求項５】 受容菌が、Streptococcus lactis亜種di
acetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,005、ＮＲＲＬ−Ｂ−1
5,006、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,018、ＮＲＲＬ−Ｂ−12,070
及びＮＲＲＬ−Ｂ−12,071、並びにこれらStreptococcu
s lactisの誘導体であって選択マーカーとしての特定の
抗生物質に対する耐性または感受性に関して単離された
誘導体から成る群から選択されたものであることを特徴
とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 誘導細菌が、Streptococcus lactis亜種
diacetilactis ＮＲＲＬ−Ｂ−15,464、ＮＲＲＬ−Ｂ−
15,465、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,466、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,46
7、ＮＲＲＬ−Ｂ−15,468及びＮＲＲＬ−Ｂ−15,469、
並びにこれらStreptococcus lactisの誘導体であって選
択マーカーとしての特定の抗生物質に対する耐性または
感受性に関して単離された誘導体から成る群から選択さ
れたものであることを特徴とする請求項１に記載の方
法。 - 【請求項７】 物質が農産物、工業製品または食料品で
あることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 生鮮食品または発酵食品に細菌を混合す
ることによって食品を保存する方法であって、 ナイシン産生をコードしており、ナイシン生産性供与菌
から得られ受容菌に伝達された外来ＤＮＡを含有するナ
イシン生産性誘導細菌の存在下で食品を冷蔵温度に維持
することからなっており、供与菌が、ショ糖利用能およ
びナイシン産生をコードしている２９ Mdal プラスミド
由来のプラスミドＤＮＡを含有する生物学的に純粋な S
treptococcus種であり、受容菌が、ナイシンに感受性の
生物学的に純粋な Streptococcus種であることを特徴と
する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52961483A | 1983-09-06 | 1983-09-06 | |
| US529614 | 1983-09-06 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58229028A Division JPS6066976A (ja) | 1983-09-06 | 1983-12-02 | ナイシン生産性誘導微生物とその製法及び使用法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05211859A true JPH05211859A (ja) | 1993-08-24 |
Family
ID=24110623
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58229028A Pending JPS6066976A (ja) | 1983-09-06 | 1983-12-02 | ナイシン生産性誘導微生物とその製法及び使用法 |
| JP3262455A Pending JPH05211859A (ja) | 1983-09-06 | 1991-10-09 | 食品の保存方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58229028A Pending JPS6066976A (ja) | 1983-09-06 | 1983-12-02 | ナイシン生産性誘導微生物とその製法及び使用法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0137869B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6066976A (ja) |
| AT (1) | ATE88215T1 (ja) |
| AU (1) | AU575544B2 (ja) |
| CA (1) | CA1218614A (ja) |
| DE (2) | DE3382675T2 (ja) |
| ES (2) | ES527416A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ206244A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7413740B2 (en) | 1999-07-21 | 2008-08-19 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid production inhibitors and foods and drinks |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4952502A (en) * | 1987-02-24 | 1990-08-28 | Eli Lilly And Company | Carbomycin biosynthetic gene, designated carG, for use in streptomyces and other organisms |
| US5348881A (en) * | 1990-03-13 | 1994-09-20 | Quest International Flavors & Good Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. | Multiple bacteriocin producing lactococcus and compositions |
| DK0579730T3 (da) * | 1991-04-11 | 2003-03-31 | Stichting Nl I Voor Zuivelonde | Nisin A-lignende lantibiotika, mælkesyrebakterie der producerer sådanne lantibiotika, fremgangsmåde til konstruktion af sådanne mælkesyrebakterier og fremgangsmåde til konservering . . . |
| GB9207267D0 (en) * | 1992-04-02 | 1992-05-13 | Agricultural & Food Res | Nisins |
| GB9423404D0 (en) * | 1994-11-19 | 1995-01-11 | Biotech & Biolog Scien Res | Production of nisin |
| GB9512106D0 (en) * | 1995-06-14 | 1995-08-09 | Norsk Naeringsmiddelforskning | Animal feed |
| EP1243180A1 (en) * | 2001-03-23 | 2002-09-25 | NIZO food research | A probiotic, a food product containing a probiotic, a method for preparation of said food product, a pharmaceutical composition and a use of the probiotic strain |
| CN105338819A (zh) | 2013-06-27 | 2016-02-17 | 星巴克公司，贸易用名星巴克咖啡公司 | 用于饮料和其他食品的生物保存方法 |
| US20230051156A1 (en) * | 2020-02-13 | 2023-02-16 | Danmarks Tekniske Universitet | Nisin-permeabilized microbial cell catalysts |
| CN114908114B (zh) * | 2022-04-29 | 2024-03-12 | 深圳大学 | 一种酵母细胞基因改造方法和一种重组酵母及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB713251A (en) * | 1951-03-07 | 1954-08-11 | Nat Res Dev | Improvements in or relating to the manufacture or preservation of cheese |
| DE1180612B (de) * | 1957-07-30 | 1964-10-29 | Fond Emanuele Paterno | Verfahren zum mikrobiologischen Herstellen von Lebensmitteln |
| US4477471A (en) * | 1982-04-15 | 1984-10-16 | Microlife Technics, Inc. | Preservation of foods with non-lactose fermenting Streptococcus Lactis subspecies diacetilactis |
-
1983
- 1983-10-20 EP EP83110479A patent/EP0137869B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-10-20 AT AT83110479T patent/ATE88215T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-10-20 DE DE8383110479T patent/DE3382675T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1983-10-20 DE DE198383110479T patent/DE137869T1/de active Pending
- 1983-10-21 AU AU20460/83A patent/AU575544B2/en not_active Ceased
- 1983-10-31 CA CA000440127A patent/CA1218614A/en not_active Expired
- 1983-11-11 NZ NZ206244A patent/NZ206244A/en unknown
- 1983-11-21 ES ES527416A patent/ES527416A0/es active Granted
- 1983-12-02 JP JP58229028A patent/JPS6066976A/ja active Pending
-
1984
- 1984-05-14 ES ES532479A patent/ES8602125A1/es not_active Expired
-
1991
- 1991-10-09 JP JP3262455A patent/JPH05211859A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7413740B2 (en) | 1999-07-21 | 2008-08-19 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid production inhibitors and foods and drinks |
| US7754204B2 (en) | 1999-07-21 | 2010-07-13 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid production inhibitors and foods and drinks |
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| AU575544B2 (en) | 1988-08-04 |
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| DE3382675T2 (de) | 1993-07-29 |
| CA1218614A (en) | 1987-03-03 |
| EP0137869A2 (en) | 1985-04-24 |
| NZ206244A (en) | 1987-10-30 |
| DE3382675D1 (de) | 1993-05-19 |
| ATE88215T1 (de) | 1993-04-15 |
| EP0137869B1 (en) | 1993-04-14 |
| ES527416A0 (es) | 1985-05-01 |
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