JPH0519655B2 - - Google Patents
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- JPH0519655B2 JPH0519655B2 JP59256669A JP25666984A JPH0519655B2 JP H0519655 B2 JPH0519655 B2 JP H0519655B2 JP 59256669 A JP59256669 A JP 59256669A JP 25666984 A JP25666984 A JP 25666984A JP H0519655 B2 JPH0519655 B2 JP H0519655B2
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Description
（産業上の利用分野）
本発明は試料溶液中の複数化学物質濃度を同時
に感度よく検出する複合型酵素電極に関する。 （従来技術とその問題点） 酵素を分析分野に応用する試みは古くから行な
われている。これらの中でも酵素固定化膜と各種
電気化学デバイスを用いた酵素電極は迅速、簡便
かつ高感度な分析手段である。さらに近年これら
の酵素電極の微小化の要望が高まり、中でもイオ
ン感受性電界効果型トランジスタ（Ion
Sensitive Field Effect Transistor、以下
ISFETと略す。）を用いた酵素電極はシリコンIC
の製造技術をそのまま利用してつくることができ
る点で注目されている。ISFETを用いた酵素電
極では、飽和甘こう電極、銀−塩化銀電極などの
参照電極を用いて溶液の電位を定める必要があ
る。 参照電極をもシリコンIC製造技術を用いて形
成し、微小化した酵素電極としてサフアイア基板
上にエピタキシヤル成長された島状のシリコン層
を用いて形成された２個のISFET（Silicon on
Sapphire／ISFET：SOS／ISFET）を用い、こ
れらのISFETのイオン感応膜の表面にウレアー
ゼ固定化膜を形成し、このうち一方のISFET上
の酵素を失活させ、基板の裏面に蒸着された金層
を凝似参照電極として２つのISFETの出力の差
を測定する尿素センサが発表されている（’84年
電気化学合同秋季大会第３回化学センサー研究発
表会要旨集P.3）がこれは単一物質の測定しか行
なうことができない。また、チツプ上に形成する
ISFETの数を増やし複数の酵素を固定化するこ
とにより測定項目を増やす試みも行なわれている
（1984年電気化学合同秋季大会講演要旨集P.45）
がいづれもPH変化を測定する形式であるためプロ
トンの拡散等により近接したセンサに干渉を生じ
るなどの問題があり、微小化に限界がある。また
この方法は反応前後のPH変化が小さい場合には原
理的に測定が困難である。 ISFETを用いない微小酵素電極として絶縁基
板上の２個の金電極の表面にグルコースオキシダ
ーゼ固定化膜を形成し、グルコースが分解される
際に生じる過酸化水素を定電位電解により検知す
る形式のグルコースセンサがある。（’84年電気
化学合同秋季大会第３回化学センサー研究発表会
要旨集P.11）が、これも単一物質の測定にしか行
なうことができないという欠点があつた。 （発明の目的） 本発明の目的は複数の化学物質が同時に選択的
に測定でき、かつ微小な酵素電極を提供すること
にある。 （発明の構成） 本発明の複合型酵素電極は絶縁基板と、前記絶
縁基板の一主面上に形成された第１の電界効果型
イオンセンサと、イオン感応膜上にさらに第１の
酵素固定化膜を有する第２の電界効果型イオンセ
ンサと、前記絶縁基板の他の主面上に形成された
２個の貴金属電極と、この電極の少なくとも一方
に形成された第２の酵素固定化膜とを含んで構成
される。 （構成の詳細な説明） 本発明の複合型酵素電極は、酵素反応の前後の
PH変化を、電界効果型イオンセンサで検知する第
１の酵素電極と酵素反応の結果生成あるいは消費
される物質を定電位電解で検知する第２の酵素電
極を絶縁基板の表面、裏面に形成し、２種類の化
学物質を異なる形式で検知する。サフアイア・石
英等の絶縁基板の一主面上にエピタキシヤル成長
等の手段を用いて島状に形成された２個の半導体
層を用いて２個のプロトン感受性のISFETを製
作する。このうちの１個のイオン感応膜の表面に
は、第１の測定対象化合物の反応を触媒し、かつ
反応の前後にPH変化を生じさせるような酵素を固
定化した第１の酵素固定化膜を形成させる。固定
化する酵素は測定対象化合物により１種類でも良
いし、２種以上でも良い。絶縁基板の地の主面上
には２個の貴金属電極が設けられ、この表面に
は、第２の測定対象化合物の反応を触媒し、かつ
この反応の結果酸素、過酸化水素、補酵素等の電
極活性物質が生成あるいは消費されるような酵素
を固定化した第２の酵素固定化膜を形成させる。 測定溶液中に含有する第１の測定物質は、
ISFET上の第１の酵素固定化膜中で反応し、膜
中にPH変化を生じさせる。このPH変化は、
ISFETのイオン感応膜上の界面電位変化を引き
起こすが、この値は、裏面に形成された１個の貴
金属電極を擬似参照電極として他方のISFETと
の出力の差として得られる。また、第２の測定対
象物質は貴金属電極上の第２の酵素固定化膜中で
反応し、ここで電極活性物質が生成、あるいは消
費される。これらの電極活物質量の変化は、２個
の貴金属電極間に特定の電位差を与えることによ
り電極表面で酸化あるいは還元により生じる電流
値の変化により検知される。本発明の複合型酵素
電極では、定電位電解用の貴金属電極の１本が同
時に２本のISFETの凝似参照電極として用いら
れる。 本発明で使用する酵素固定化膜は、酵素を外部
に流出させることなく且つ低分子量の基質を内部
に拡散せしめる様なものでよく、透析膜の様な均
一膜又は限外過膜の様な多孔性膜のいずれでも
良い。また、酵素自体をイオン感応膜に結合させ
たものあるいは酵素自体を多官能試薬で架橋させ
た膜でも良い。また、他方のISFETのイオン感
応膜表面はそのままでも良いが、酵素を含まない
で素成を酵素固定化膜と同様にした膜を形成して
も、また酵素の代わりにアルブミン等のタンパク
質やアミノ酸を固定化した膜を形成しても良い。
さらに２個のISFETのイオン感応膜の表面に均
一に酵素固定化膜を形成しておき、一方の
ISFETのイオン感応膜の表面の酵素を失活させ
ても良い。 また本発明における貴金属電極は、金、白金な
どが適しているが、他の金属でも測定対象物質に
より可能である。 （実施例） 本発明の実施例について図面を参照して説明す
る。第１図および第２図は本発明の一実施例を示
す上面図および下面図である。第１図および第２
図に示す複合型酵素電極は絶縁体であるサフアイ
ア基板の上面に設けられた２個の島状のシリコン
で形成されたISFETと下面に設けられた２個の
貴金属電極と、２種類の酵素固定化膜で構成され
る。第３図、第４図および第５図はそれぞれ第１
図に示すＡ−A′、Ｂ−B′、Ｃ−C′における断面
図である。 電解効果型イオンセンサはｐ形シリコン基板層
２と、ｎ形高不純物濃度ソース領域３とｎ形高不
純物濃度ドレイン領域４とｐ形高不純物濃度アー
ス領域５とシリコン酸化膜６と窒化シリコン膜７
とイオン感応膜８とで構成される。前記ｐ形高不
純物濃度アース領域５はｐ形シリコン基板層２と
電気的に接続されている。ソース電極１１はｎ形
高不純物濃度ソース領域３に接続され、ドレイン
電極にはｎ形高不純物濃度ドレイン領域４に接続
されている。一方のISFETのイオン感応膜８の
表面には、第１の酵素固定化膜９が形成されてい
る。 サフアイア基板１の下面には２個の貴金属電極
１０，１１が設けられ、一方の貴金属電極１１の
表面には第２の酵素固定化膜１４が形成されてい
る。 本発明の複合型酵素電極を尿素・グルコース測
定用電極とした場合についてさらに詳細に説明す
る。この場合には、第１の酵素固定化膜としてウ
レアーゼ固定化膜を用いた。尿素は膜中で以下の
ように反応し、膜中のPHが上昇する。 CO（NH2）2＋2H2O＋H+ →2NH4 +＋HCO3 - ISFETのイオン感応膜として窒化シリコンを
用いることにより、PH変化を検出した。第２の酵
素固定化膜としてグルコースオキシダーゼ固定化
膜を用いた。グルコースは膜中で以下のように反
応し、過酸化水素を生成する。 グルコース＋O2―――→グルコン酸＋H2O2 貴金属電極として金電極を使用し、２個の電極
間の電位差を1.1Vとして定電位電解することに
より過酸化水素を検出した。 以下に複合型酵素電極の製造方法を示す。 (1) サフアイア基板の上面にエピタキシヤル成長
されたシリコン層を島状にエツチングする。 (2) ボロン(B)イオンをシリコン層に拡散させる。 (3) リン(P)をソース・ドレイン領域に拡散させ
る。 (4) ゲート表面を酸化させる（SiO21000Å） (5) 窒化シリコン層をCVD（Chemical vapor
deposition）により形成させる。 (6) 基板の裏面に金を蒸着し、リフトオフにより
金電極を形成させる。 (7) 酵素固定化膜を形成させる。 第１の酵素固定化膜は以下のようにして調製し
た。ウレアーゼ５mgを、0.2MPH7.0トリス塩酸緩
衝液で調整した15％牛血清アルブミン溶液50μ
に溶解し、この5μに25％グルタルデヒド水溶
液3μを混合し、イオン感応膜表面に塗付し、
15分間放置した後、水洗し、さらに0.1Mグリシ
ン溶液に15分間浸漬した。第２の酵素固定化膜は
グルコースオキシダーゼを用い、同様の方法で調
製した。 この様にして製作した尿素・グリコース測定用
複合型酵素電極を0.01Mトリス塩酸緩衝溶液中に
浸漬し、尿素溶液、グルコース溶液、尿素・グル
コース混合溶液を添加してセンサーの応答を測定
した。応答はISFETを用いた尿素電極では差動
電位変化△Ｅ（ｍＶ）として、金電極を用いたグ
ルコース電極では電流値ｉ（nA）として30秒後の
値を得た。結果を表に示す。
に感度よく検出する複合型酵素電極に関する。 （従来技術とその問題点） 酵素を分析分野に応用する試みは古くから行な
われている。これらの中でも酵素固定化膜と各種
電気化学デバイスを用いた酵素電極は迅速、簡便
かつ高感度な分析手段である。さらに近年これら
の酵素電極の微小化の要望が高まり、中でもイオ
ン感受性電界効果型トランジスタ（Ion
Sensitive Field Effect Transistor、以下
ISFETと略す。）を用いた酵素電極はシリコンIC
の製造技術をそのまま利用してつくることができ
る点で注目されている。ISFETを用いた酵素電
極では、飽和甘こう電極、銀−塩化銀電極などの
参照電極を用いて溶液の電位を定める必要があ
る。 参照電極をもシリコンIC製造技術を用いて形
成し、微小化した酵素電極としてサフアイア基板
上にエピタキシヤル成長された島状のシリコン層
を用いて形成された２個のISFET（Silicon on
Sapphire／ISFET：SOS／ISFET）を用い、こ
れらのISFETのイオン感応膜の表面にウレアー
ゼ固定化膜を形成し、このうち一方のISFET上
の酵素を失活させ、基板の裏面に蒸着された金層
を凝似参照電極として２つのISFETの出力の差
を測定する尿素センサが発表されている（’84年
電気化学合同秋季大会第３回化学センサー研究発
表会要旨集P.3）がこれは単一物質の測定しか行
なうことができない。また、チツプ上に形成する
ISFETの数を増やし複数の酵素を固定化するこ
とにより測定項目を増やす試みも行なわれている
（1984年電気化学合同秋季大会講演要旨集P.45）
がいづれもPH変化を測定する形式であるためプロ
トンの拡散等により近接したセンサに干渉を生じ
るなどの問題があり、微小化に限界がある。また
この方法は反応前後のPH変化が小さい場合には原
理的に測定が困難である。 ISFETを用いない微小酵素電極として絶縁基
板上の２個の金電極の表面にグルコースオキシダ
ーゼ固定化膜を形成し、グルコースが分解される
際に生じる過酸化水素を定電位電解により検知す
る形式のグルコースセンサがある。（’84年電気
化学合同秋季大会第３回化学センサー研究発表会
要旨集P.11）が、これも単一物質の測定にしか行
なうことができないという欠点があつた。 （発明の目的） 本発明の目的は複数の化学物質が同時に選択的
に測定でき、かつ微小な酵素電極を提供すること
にある。 （発明の構成） 本発明の複合型酵素電極は絶縁基板と、前記絶
縁基板の一主面上に形成された第１の電界効果型
イオンセンサと、イオン感応膜上にさらに第１の
酵素固定化膜を有する第２の電界効果型イオンセ
ンサと、前記絶縁基板の他の主面上に形成された
２個の貴金属電極と、この電極の少なくとも一方
に形成された第２の酵素固定化膜とを含んで構成
される。 （構成の詳細な説明） 本発明の複合型酵素電極は、酵素反応の前後の
PH変化を、電界効果型イオンセンサで検知する第
１の酵素電極と酵素反応の結果生成あるいは消費
される物質を定電位電解で検知する第２の酵素電
極を絶縁基板の表面、裏面に形成し、２種類の化
学物質を異なる形式で検知する。サフアイア・石
英等の絶縁基板の一主面上にエピタキシヤル成長
等の手段を用いて島状に形成された２個の半導体
層を用いて２個のプロトン感受性のISFETを製
作する。このうちの１個のイオン感応膜の表面に
は、第１の測定対象化合物の反応を触媒し、かつ
反応の前後にPH変化を生じさせるような酵素を固
定化した第１の酵素固定化膜を形成させる。固定
化する酵素は測定対象化合物により１種類でも良
いし、２種以上でも良い。絶縁基板の地の主面上
には２個の貴金属電極が設けられ、この表面に
は、第２の測定対象化合物の反応を触媒し、かつ
この反応の結果酸素、過酸化水素、補酵素等の電
極活性物質が生成あるいは消費されるような酵素
を固定化した第２の酵素固定化膜を形成させる。 測定溶液中に含有する第１の測定物質は、
ISFET上の第１の酵素固定化膜中で反応し、膜
中にPH変化を生じさせる。このPH変化は、
ISFETのイオン感応膜上の界面電位変化を引き
起こすが、この値は、裏面に形成された１個の貴
金属電極を擬似参照電極として他方のISFETと
の出力の差として得られる。また、第２の測定対
象物質は貴金属電極上の第２の酵素固定化膜中で
反応し、ここで電極活性物質が生成、あるいは消
費される。これらの電極活物質量の変化は、２個
の貴金属電極間に特定の電位差を与えることによ
り電極表面で酸化あるいは還元により生じる電流
値の変化により検知される。本発明の複合型酵素
電極では、定電位電解用の貴金属電極の１本が同
時に２本のISFETの凝似参照電極として用いら
れる。 本発明で使用する酵素固定化膜は、酵素を外部
に流出させることなく且つ低分子量の基質を内部
に拡散せしめる様なものでよく、透析膜の様な均
一膜又は限外過膜の様な多孔性膜のいずれでも
良い。また、酵素自体をイオン感応膜に結合させ
たものあるいは酵素自体を多官能試薬で架橋させ
た膜でも良い。また、他方のISFETのイオン感
応膜表面はそのままでも良いが、酵素を含まない
で素成を酵素固定化膜と同様にした膜を形成して
も、また酵素の代わりにアルブミン等のタンパク
質やアミノ酸を固定化した膜を形成しても良い。
さらに２個のISFETのイオン感応膜の表面に均
一に酵素固定化膜を形成しておき、一方の
ISFETのイオン感応膜の表面の酵素を失活させ
ても良い。 また本発明における貴金属電極は、金、白金な
どが適しているが、他の金属でも測定対象物質に
より可能である。 （実施例） 本発明の実施例について図面を参照して説明す
る。第１図および第２図は本発明の一実施例を示
す上面図および下面図である。第１図および第２
図に示す複合型酵素電極は絶縁体であるサフアイ
ア基板の上面に設けられた２個の島状のシリコン
で形成されたISFETと下面に設けられた２個の
貴金属電極と、２種類の酵素固定化膜で構成され
る。第３図、第４図および第５図はそれぞれ第１
図に示すＡ−A′、Ｂ−B′、Ｃ−C′における断面
図である。 電解効果型イオンセンサはｐ形シリコン基板層
２と、ｎ形高不純物濃度ソース領域３とｎ形高不
純物濃度ドレイン領域４とｐ形高不純物濃度アー
ス領域５とシリコン酸化膜６と窒化シリコン膜７
とイオン感応膜８とで構成される。前記ｐ形高不
純物濃度アース領域５はｐ形シリコン基板層２と
電気的に接続されている。ソース電極１１はｎ形
高不純物濃度ソース領域３に接続され、ドレイン
電極にはｎ形高不純物濃度ドレイン領域４に接続
されている。一方のISFETのイオン感応膜８の
表面には、第１の酵素固定化膜９が形成されてい
る。 サフアイア基板１の下面には２個の貴金属電極
１０，１１が設けられ、一方の貴金属電極１１の
表面には第２の酵素固定化膜１４が形成されてい
る。 本発明の複合型酵素電極を尿素・グルコース測
定用電極とした場合についてさらに詳細に説明す
る。この場合には、第１の酵素固定化膜としてウ
レアーゼ固定化膜を用いた。尿素は膜中で以下の
ように反応し、膜中のPHが上昇する。 CO（NH2）2＋2H2O＋H+ →2NH4 +＋HCO3 - ISFETのイオン感応膜として窒化シリコンを
用いることにより、PH変化を検出した。第２の酵
素固定化膜としてグルコースオキシダーゼ固定化
膜を用いた。グルコースは膜中で以下のように反
応し、過酸化水素を生成する。 グルコース＋O2―――→グルコン酸＋H2O2 貴金属電極として金電極を使用し、２個の電極
間の電位差を1.1Vとして定電位電解することに
より過酸化水素を検出した。 以下に複合型酵素電極の製造方法を示す。 (1) サフアイア基板の上面にエピタキシヤル成長
されたシリコン層を島状にエツチングする。 (2) ボロン(B)イオンをシリコン層に拡散させる。 (3) リン(P)をソース・ドレイン領域に拡散させ
る。 (4) ゲート表面を酸化させる（SiO21000Å） (5) 窒化シリコン層をCVD（Chemical vapor
deposition）により形成させる。 (6) 基板の裏面に金を蒸着し、リフトオフにより
金電極を形成させる。 (7) 酵素固定化膜を形成させる。 第１の酵素固定化膜は以下のようにして調製し
た。ウレアーゼ５mgを、0.2MPH7.0トリス塩酸緩
衝液で調整した15％牛血清アルブミン溶液50μ
に溶解し、この5μに25％グルタルデヒド水溶
液3μを混合し、イオン感応膜表面に塗付し、
15分間放置した後、水洗し、さらに0.1Mグリシ
ン溶液に15分間浸漬した。第２の酵素固定化膜は
グルコースオキシダーゼを用い、同様の方法で調
製した。 この様にして製作した尿素・グリコース測定用
複合型酵素電極を0.01Mトリス塩酸緩衝溶液中に
浸漬し、尿素溶液、グルコース溶液、尿素・グル
コース混合溶液を添加してセンサーの応答を測定
した。応答はISFETを用いた尿素電極では差動
電位変化△Ｅ（ｍＶ）として、金電極を用いたグ
ルコース電極では電流値ｉ（nA）として30秒後の
値を得た。結果を表に示す。
【表】
表でも明らかなように尿素濃度とISFETの差
動電位変化、グルコース濃度と電流値の間にはそ
れぞれ相関関係が認められる。また、２つの出力
は完全に分離して得られており２種の化学物質の
定量が同時に行なえることが明らかになつた。 （発明の効果） 本発明によれば、測定方式の異なる２個の酵素
電極を１つのチツプ上に容易に形成することが可
能である。 また、本発明の複合型酵素電極はシリコンIC
製造プロセスを用いて容易に微小化できる。 さらに、定電位電解用の貴金属電極の１個を
ISFETの凝似参照電極として利用でき、さらに
微小化に有利である。 ２個の酵素固定化膜を容易に分離した形で形成
でき、互いに応答に干渉を与えないという効果を
有する。
動電位変化、グルコース濃度と電流値の間にはそ
れぞれ相関関係が認められる。また、２つの出力
は完全に分離して得られており２種の化学物質の
定量が同時に行なえることが明らかになつた。 （発明の効果） 本発明によれば、測定方式の異なる２個の酵素
電極を１つのチツプ上に容易に形成することが可
能である。 また、本発明の複合型酵素電極はシリコンIC
製造プロセスを用いて容易に微小化できる。 さらに、定電位電解用の貴金属電極の１個を
ISFETの凝似参照電極として利用でき、さらに
微小化に有利である。 ２個の酵素固定化膜を容易に分離した形で形成
でき、互いに応答に干渉を与えないという効果を
有する。
第１図は本発明の一実施例を示す上面図、第２
図は下面図、第３図、第４図および第５図は、そ
れぞれ第１図のＡ−A′，Ｂ−B′，Ｃ−C′におけ
る断面図である。 １……サフアイア基板、２……ｐ形シリコン基
板層、３……ｎ形高不純物濃度ソース領域、４…
…ｎ形高不純物濃度ドレイン領域、５……ｐ形高
不純物濃度アース領域、６……シリコン酸化膜、
７……窒化シリコン膜、８……イオン感応膜、９
……第１の酵素固定化膜、１０，１１……貴金属
電極、１２……ソース電極、１３……ドレイン電
極、１４……第２の酵素固定化膜。
図は下面図、第３図、第４図および第５図は、そ
れぞれ第１図のＡ−A′，Ｂ−B′，Ｃ−C′におけ
る断面図である。 １……サフアイア基板、２……ｐ形シリコン基
板層、３……ｎ形高不純物濃度ソース領域、４…
…ｎ形高不純物濃度ドレイン領域、５……ｐ形高
不純物濃度アース領域、６……シリコン酸化膜、
７……窒化シリコン膜、８……イオン感応膜、９
……第１の酵素固定化膜、１０，１１……貴金属
電極、１２……ソース電極、１３……ドレイン電
極、１４……第２の酵素固定化膜。
Claims (1)
- １ 絶縁基板と前記絶縁基板の一主面上に形成さ
れた第１の電界効果型イオンセンサと、イオン感
応膜上にさらに第１の酵素固定化膜を有する第２
の電界効果型イオンセンサと前記絶縁基板の他の
主面上に形成された２個の貴金属電極と、この電
極の少なくとも一方の表面に形成された第２の酵
素固定化膜とを有することを特徴とする複合型酵
素電極。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59256669A JPS61133853A (ja) | 1984-12-05 | 1984-12-05 | 複合型酵素電極 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59256669A JPS61133853A (ja) | 1984-12-05 | 1984-12-05 | 複合型酵素電極 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61133853A JPS61133853A (ja) | 1986-06-21 |
| JPH0519655B2 true JPH0519655B2 (ja) | 1993-03-17 |
Family
ID=17295821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59256669A Granted JPS61133853A (ja) | 1984-12-05 | 1984-12-05 | 複合型酵素電極 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61133853A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6457159A (en) * | 1987-08-27 | 1989-03-03 | Tosoh Corp | Biosensor |
| JP5397333B2 (ja) * | 2010-07-01 | 2014-01-22 | セイコーエプソン株式会社 | 半導体装置、並びに、センサ素子及び半導体装置の製造方法 |
| CN114108183B (zh) * | 2021-11-10 | 2022-11-29 | 重庆理工大学 | 一种用于快速检测铁离子的荧光纳米纤维膜及其制备方法 |
-
1984
- 1984-12-05 JP JP59256669A patent/JPS61133853A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61133853A (ja) | 1986-06-21 |
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