JPS61133853A - 複合型酵素電極 - Google Patents

複合型酵素電極

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JPS61133853A
JPS61133853A JP59256669A JP25666984A JPS61133853A JP S61133853 A JPS61133853 A JP S61133853A JP 59256669 A JP59256669 A JP 59256669A JP 25666984 A JP25666984 A JP 25666984A JP S61133853 A JPS61133853 A JP S61133853A
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川名 美江
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純 木村
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001Enzyme electrodes
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4145Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は試料溶液中の複数化学物質濃度を同時に感度よ
く検出する複合型酵素電極に関する。
(従来技術とその問題点) 酵素を分析分野に応用する試みは古くから行なわれてい
る。これらの中でも酵素固定化膜と各種電気化学デバイ
スを用いた酵素電極は迅速、簡便かつ高感度な分析手段
である。さらに近年これらの酵素電極の微小化の要望が
高スリ、中でもイγ/感受性電界効果型トランジスタ(
Ion 8er1xi tiveField 、h;f
fect Transistor 、以下l5FETと
略す。)を用いた酵素電極はシリコ/fCの製造技術を
そのまま利用してつくることができる点で注目されてい
る。ISI;”ETを用いた酵素電極では、飛和せこう
電極、・−一塩化銀電極などの参照電極f!:用いて溶
液の電位を定める必要がある。
参照電極ともシリコ/IC製造技術金用いて形成し、微
小化した酵素電極として丈ファイア基板上にエピタキ7
ヤル成長された島状のシリコン層を用いて形成gnた2
1t5のLSFi!JT (Silicon 0nSa
pphire/IS1’E’f’ : SO8/l8F
ET)f用い、これらのl5FBTのイオン感応膜の表
面K +7 vアーゼ固定化膜を形成し、このうち一方
のI、5FET上の酵素を失活させ、基板の裏面に蒸着
さルた金層を疑似参照電極として)つのLSFETの出
力の差を測定する尿素センナが発表されている(′84
年電気化学合同秋季大会第3回化学センサー研究発表会
要旨集P、3)がこれは単一物質の測定しか行なうこと
ができない。また、チップ上に形成するl5le’ET
の数を増やし複数の酵素を固定化することにより測定項
目を増やす試みも行なわれている(1984年電気化学
合同秋季大会講演要旨集)’、45)が、いづれもpH
変化を測定する形式であるためプロトンの拡散等によシ
近接したセンナ(干渉を生じるなどの問題があり、微小
化に限界がある。
またこの方法は反応前後のpH変化が小さい場合には原
理的に測定が固型である。
l5FETを用いない微小酵素電極として絶縁基板上の
2個の金電極の表面にグルコースオキシダーゼ固定化膜
を形成し、グルコースが分解される際に生じる過酸化水
素を定電位電解により検知すル形式のグルコースセンナ
がある。(′84年電気化学合同秋季大会第3回化学セ
ンサー研究発表会要旨集P、11)が、これも単一物質
の測定にしか行なうことができないという欠点があった
(発明の目的) 本発明の目的は複数の化学物質が同時に選択的に測定ご
砧、かつ微小な酵素電極を提供することKめる。
(発明の構成) 本発明の複合型酵素電極は絶縁基板と、前記絶縁基板の
一主面上に形成された241の電界効果型イオンセンサ
と、イオン感応膜上にさらに第1の酵素固定化膜を有す
る第2の電界効果型イオンセンサと、前記絶縁基板の他
の主面上に形成された2個の貴金属電極と、この電極の
少なくとも一方に形成された第2の酵素固定化膜とを含
んで4成される。
(構成の詳細な説明) 本発明の複合型酵素電極は、酵素反応の前後のpH変化
を電界効果型イオンセンサで検知する第1の酵素電極と
酵素反応の結果生成あるいは消費される物質を定電位電
解で検知する第2の酵素電極を絶縁基板の表面、裏面に
形成し、2種類の化学物質を異なる形式で検知する。サ
ファイア・石英等の絶縁基板の一主面上〈エピタキシャ
ル成長等の手段を用いて島状に形成された2個の半導体
層を用いて2個のプロとブ感受性の18FETを製作す
る。このうちの1個のイオン感応膜の表面には、Mlの
測定対象化合物の反応を触媒し、かつ反応の前後にpH
変化を生じさせるような酵素を固定化した第1の酵素固
定化膜を形成させる。固定化する酵素は測定対象化合物
により1種類でも良いし、2種以上でも良い。絶縁基板
の他の主面上には2個の貴金属電極が設けられ、この表
面には、第2の測定対象化合物の反応を触媒し、かつこ
の反応の結果酸素、過酸化水素、補酵素等の電極活物質
が生成あるいは消費されるような酵素を固定化した第2
の酵素固定化膜を形成させる。
測定溶液中に含有する縞1の測定物質は、l5FE’f
’上の第1の酵素固定化膜中で反応し、膜中にpH変化
を生じさせる。このp)I変化は、l5FETのイオン
感応膜上の界面電位変化を引き起こすが、この値は、裏
面に形成された1個の貴金属電極を擬似参照電極として
他方のl8FETとの出力の差として得られる。また、
第2の測定対象物質は賃金igt極上の端2の酵素固定
化膜中で反応し、ここで電極活物質が生成、あるいは消
費される。これらの電極活物質量の変化は、2個の賞金
ノ真電極間に特定の電位差を与えることにより戒甑弐面
で酸化あるいは環元により生じる成流値の変化により検
知される。本発明の複合M酵素電極では、定電位電解用
の貴金属電極の1本が同時に2本のl5FETの疑似参
照電極として用いらルる。
本発明で使用する酵素固定化膜は、酵素を外部また、酵
素自体をイオン感応膜に結合させ念ものあるいは酵素自
体を多官能試薬で架橋させた膜でも良い。また、他方・
I)ISP11!i′11のイオン感応膜表面はそのま
までも良いが、酵素を含まないで素成fc#l固定化膜
と同様にした膜を形成しても、また酵素の代わりにアル
プミ7専のタンバク質やアミノ酸を固定化した膜を形成
しても艮い。さらに2個のl5FETのイオン感応膜の
表面に均一に酵素固定化膜を形成しておき、一方のl5
FETのイオノ感応膜の表面の酵素を失挿させても良い
また本発明における責金、!ji電極は、金、白金など
が適しているが、他の金属でも測定対象物質により可能
である。
(実施例) 本発明の実施例について図面を参照して説明する。第1
図および第2図は本発明の一実施例を示す上面図および
下面図である。第1図および第2図に示す複合型酵素電
極はP33層であるサファイア基板の上直に設けられた
21固の島状のシリコンで形成されたl5FETと下面
に設けられた2個の貴金属電極と、2m類の酵素固定化
膜で構成される。第3図、第4図および第5図はそれぞ
れ第1図に示すA −A’、B −B’、c −c’に
おける断面図である。
電解効果型イオンセンサはp形シリコン基板層2と、n
形高不純物濃度ノース領域3とn形高不純物濃度ドレイ
ン領域4とp形高不純物濃度Y−ス領域5とシリコン酸
化膜6と窒化シリコン模7とイオン感L6膜8とで構成
される。前記p形高不純物嬢度アース領域ダはp形シリ
コン基板層2と電気的に接続されている。ノース電極1
1はn形高不純物濃度ノース領域3に接続され、ドレイ
ン電極にはn形高不純物a度ドレイン領域4に接続され
ている。一方のI SFF、Tのイオン感応膜8の表面
には、第1の酵素!司定化膜9が形成されている。
サファイア基板1の下面には2個の貴金属電極10.1
1が設けられ、一方の黄金p14を極11の表面にjd
第2の酵素固定化膜14が形成されている。
本発明の複合型酵素電極を尿素・グルコース測定用電極
とした場合についてさらに詳細に説明する。この場合に
は、第1の酵素固定化膜としてウレアーゼ固定化膜を用
いた。尿素は膜中で以下のように反応し、膜中のpHが
上昇する。
Co(Nl(、)+2H,O+H−2N)(、+HC(
J、−ISFETのイオノ感応膜として窒化シリコンを
用いることによジ、p)i変化を検出した。第2の酵素
固定化膜とじてグルコースオキ7ダーゼ固定化膜を用い
友。グルコースは膜中で以下のように反応し、過は化水
素を生成する。
グルコース十〇、□グルコン酸+H1O。
貴金属電極として金電極t−使用し、2個の電極間の電
位差を1.1vとして定電位電解することにより過酸化
水素を検出した。
以下に複合型酵素電極の裏道方法を示す。
1)サファイア基板の上面にエビタキンヤル成長された
シリコン層を島状にエツチングする。
2)ボロン(B)イオンをシリコン層に拡散させる。
3) リ/(P)をソース・ドレイン領域に拡散させる
4)ゲート表面を酸化させる (S:0.1000λ)
5)窒化シリコ7層t−CvD (Chemical 
vapordepos i t 1on)により形成さ
辻るう6)基板の裏面に金を蒸着し、す7トオフによシ
金電極を形成させる。
7)#索固定化膜を形成させる。
第1の酵素固定化膜は以下のようにして調製した。ウレ
アーゼ5rnge、0.2MpH7,0トリス塩酸緩衝
液で調至したts%午・血清アルブミン溶液50μノに
溶解し、この5μ!に25%グルタルデヒド水溶漱3μ
mを混合し、イオン感応膜表面に塗付し、 15分間放
置した後、水洗し、さらに0.1 Mグリシン溶液に1
5分間&潰した。第2の酵素固定化膜はグルコース万キ
シダーゼを用い、同様の方法で調製した。
この様にして製作した尿素・グルコース測定用複合型酵
素電極を0.01Mトリス塩酸緩衝溶液中に浸漬し、尿
素溶液、グルコース溶液、尿素・グルコース混合溶液を
添加し−ごセンサーの応答を測定した。応答はISFE
Tを用いた尿素電極では差動電位変化ΔE (mV )
  として、金電極を用いたグルコース電極では戒流瞳
1(nA)として30秒後の値を得た。結果を表に示す
表 複合型酵素電極の応答 0       0     0.OQ、050   
    0    14.4  0.0100    
   0    21.0  0.0200     
  0    29.0  0.00      50
     0.0   m10     100   
  0.0  4.30     200     0
.0  8.5100     100    21.
1  4.3表でも明らかなように尿素濃度とl5FE
Tの差動電位変化、グルコース濃度とt流値の間にはそ
れぞれ相関関係が認められる。また、2つの出力は完全
に分離して得られており2種の化学物質の定量が同時に
行なえることが明らかになった。
(発明の効果) 本発明によれば、測定方式の異なる2個の酵素を極を1
つのチップ上に容易に形成することが可能である。
また、本発明の複合型酵素電極はシリコンIC製造プロ
セスを用いで容易に微小化できる。
さらに、定電位!解用の貴金属電極の1個をIs士’E
Tの擬似参照電極として利用でき、さらに微小化に有利
でるる。
2個の酵素固定化膜を容易に分離した形で形成でき、互
いに応答に干渉を与えないといワ効釆を有する。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の一実施例を示す上面図、第2図は下面
図、第3図、第4図および第5図は、それぞれ第1図の
A −A’、B −B’、C−C’における断面図であ
る。 1・・・丈ファイア基板、2・・−p形シリコン基板層
、ス領域、6・・・シリコン酸化膜、7・・・窒化シリ
コン膜、8・・・イオン感応膜、9・・・第1の酵素固
定化膜、10.11・・・貴金属’tt@、12・・・
ソース電極、13・・・第1 図 第2図 第3 図 第4図 第5図

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 絶縁基板と前記絶縁基板の一主面上に形成された第1の
    電界効果型イオンセンサと、イオン感応膜上にさらに第
    1の酵素固定化膜を有する第2の電界効果型イオンセン
    サと前記絶縁基板の他の主面上に形成された2個の貴金
    属電極と、この電極の少なくとも一方の表面に形成され
    た第2の酵素固定化膜とを有することを特徴とする複合
    型酵素電極。
JP59256669A 1984-12-05 1984-12-05 複合型酵素電極 Granted JPS61133853A (ja)

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JP59256669A JPS61133853A (ja) 1984-12-05 1984-12-05 複合型酵素電極

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JPS61133853A true JPS61133853A (ja) 1986-06-21
JPH0519655B2 JPH0519655B2 (ja) 1993-03-17

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0304947A2 (en) * 1987-08-27 1989-03-01 Tosoh Corporation Biosensor
JP2012013579A (ja) * 2010-07-01 2012-01-19 Seiko Epson Corp 半導体装置、並びに、センサ素子及び半導体装置の製造方法
CN114108183A (zh) * 2021-11-10 2022-03-01 重庆理工大学 一种用于快速检测铁离子的荧光纳米纤维膜及其制备方法

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JPH0519655B2 (ja) 1993-03-17

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