JPH05176772A - 新規プラスミド、微生物、抗アレルギーキメラ蛋白及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、抗アレルギーキメラ蛋白を提供す
ることを目的とする。 【構成】 （ａ）ヒトＩｇＥ Ｆｃ領域遺伝子及びＩｇ
Ｇ Ｆｃ領域遺伝子を連結した、抗アレルギーキメラ蛋
白をコードするＤＮＡ、（ｂ）プロモーターＤＮＡ、
（ｃ）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、（ｄ）菌
体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与えるＤＮＡ及び
（ｅ）プロモーターＤＮＡよりなるプラスミド、該プラ
スミドにより形質転換された組換え微生物細胞、該微生
物細胞を培養し抗アレルギーキメラ蛋白の製造方法及び
該方法により製造された抗アレルギーキメラ蛋白。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗アレルギーキメラ蛋白
をコードするＤＮＡ領域を含む新規組換えプラスミド、
該プラスミドにより形質転換された新規組換え微生物細
胞、該微生物を用いた抗アレルギーキメラ蛋白の菌体外
分泌による製造方法及び分泌された抗アレルギーキメラ
蛋白に関する。

【０００２】本明細書において、アミノ酸，ポリペプチ
ドはＩＵＰＡＣ―ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用
された方法により略記するものとし、たとえば下記の略
号を用いる。

【０００３】Ａｌａ Ｌ―アラニン Ａｒｇ Ｌ―アルギニン Ａｓｎ Ｌ―アスパラギン Ａｓｐ Ｌ―アスパラギン酸 Ｃｙｓ Ｌ―システイン Ｇｌｎ Ｌ―グルタミン Ｇｌｕ Ｌ―グルタミン酸 Ｇｌｙ グリシン Ｈｉｓ Ｌ―ヒスチジン Ｉｌｅ Ｌ―イソロイシン Ｌｅｕ Ｌ―ロイシン Ｌｙｓ Ｌ―リジン Ｍｅｔ Ｌ―メチオニン Ｐｈｅ Ｌ―フェニルアラニン Ｐｒｏ Ｌ―プロリン Ｓｅｒ Ｌ―セリン Ｔｈｒ Ｌ―スレオニン Ｔｒｐ Ｌ―トリプトファン Ｔｙｒ Ｌ―チロシン Ｖａｌ Ｌ―バリン

【０００４】また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デ
オキシリボヌクレオチドに含まれる塩基の種類で略記す
るものとし、たとえば下記の略号を用いる。 Ａ アデニン（デオキシアデニル酸を示す。） Ｃ シトシン（デオキシシチジル酸を示す。） Ｇ グアニン（デオキシグアニル酸を示す。） Ｔ チミン （デオキシチミジル酸を示す。）

【０００５】さらに、（Ｈ₂ Ｎ）―及び―（ＣＯＯＨ）
はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボキシ
末端側を示すものであり、（５′）―及び（３′）はそ
れぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を示すも
のである。

【０００６】

【従来の技術】すべての脊椎動物の体液中に存在し、抗
原と特異的に結合する能力を有する蛋白質が抗体であ
り、抗体蛋白質と構造的、機能的関連をもつ蛋白質は総
称して免疫グロブリンといわれている。免疫グロブリン
（以下“Ｉｇ”と略すことがある）は、物理化学的ある
いは免疫学的な性状から、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＤの５つのクラスに分類される。

【０００７】Ｉｇの基本構造は同じであり、２本のＨ鎖
と２本のＬ鎖がジスルフィド結合により結ばれた形をと
る。また、例えばＩｇにパパインなどの蛋白質分解酵素
を作用させると分子中央で切断され、抗原結合活性のあ
る断片（Ｆａｂ領域蛋白質）と、抗原結合活性はなく条
件により結晶化しやすい断片（Ｆｃ領域蛋白質）とに分
かれる。

【０００８】ＩｇＧでは、Ｈ鎖のカルボキシル末端側の
半分であるＦｃ領域蛋白質は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３
の３つの部分よりなるが、ＩｇＥにおいては、ＣＨ３は
ＩｇＧのＣＨ２に、ＩｇＥのＣＨ４はＩｇＧのＣＨ３に
構造がそれぞれ似ているといわれている（W.C. Barker
ら、J. Mol. Evol.,１５，１１３（１９８０））。従っ
て、例えばＩｇＥのＣＨ３の一部をＩｇＧのＣＨ２の相
互に構造が似ている部分と分子を交換しても構造は大き
く変化されないと考えられる。

【０００９】ＩｇＥは、いわゆるＩ型アレルギーにおい
て重要な役割を演じている。すなわち、ＩｇＥは、生体
の血液中に存在する好塩基球や組織に存在する肥満細胞
の細胞膜上に存在する受容体に強い親和力で結合する。
次いで、ダニ抗原やスギ花粉のようなアレルギーの原因
となる物質（アレルゲン）が抗原抗体反応により、先の
ＩｇＥに結合し受容体間の架橋が起こると、好塩基球や
肥満細胞中の顆粒に蓄えられたヒスタミン等が放出さ
れ、いわゆるアレルギー反応が惹起される。

【００１０】したがって、例えばアレルゲンが結合でき
ず且つ受容体に結合できるようなＩｇＥを予め生体内に
加えておくと、アレルゲンが存在しても架橋は起こら
ず、したがってアレルギー反応は惹起されないと考えら
れる。最近、ＩｇＥ分子内の、受容体との結合に必要な
領域が解明されてきた。Ｈｅｌｍらは、Ｈ鎖のアミノ末
端から３０１〜３７６番目のアミノ酸が受容体結合に必
要な領域であると発表した（B.Helmら、Nature (Londo
n),３３１，１８０（１９８８））。この領域は、Ｉｇ
ＥのＣＨ２とＣＨ３にまたがる領域に相当する。

【００１１】近年の遺伝子操作技術の発達により、種々
の有用蛋白質を微生物により生産することが可能となっ
た。とりわけ所望の有用蛋白質を微生物の菌体外に生産
することは、宿主菌に有害な蛋白質でも生産が可能、
精製工程の簡略化が期待できる、など産業上の利用性
は極めて大きい。加えて、得た有用蛋白質の構造が天然
に存在するものの構造と極めて近いという新たな長所も
明らかとなった（H.Matsuda ら、Mol. Immunol.,２７，
５７（１９９０））。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
アレルゲンと結合しないが受容体とは結合可能であり且
つ構造が保持される可能性が大きい有用蛋白質を生産さ
せるべく鋭意検討した結果、ＩｇＥのＦｃ領域蛋白とＩ
ｇＧのＦｃ領域蛋白を融合させた抗アレルギーキメラ蛋
白を大腸菌の菌体外に分泌させることに成功し、本発明
に至った。

【００１３】すなわち、本発明の目的は、抗アレルギー
キメラ蛋白を大腸菌等で生産するに当り、菌体外に分泌
させて生産することにあり、しかして抗アレルギーキメ
ラ蛋白をコードするＤＮＡ配列を含む菌体外分泌を可能
とするＤＮＡ領域及びその領域が組み込まれた新規組換
えプラスミドを提供することにある。

【００１４】本発明の他の目的は、上記新規組換えプラ
スミドによって形質転換され、目的とする抗アレルギー
キメラ蛋白を、菌体外に産生し得る新規組換え微生物細
胞を提供することにある。本発明の更に他の目的は、該
微生物細胞を用いて抗アレルギーキメラ蛋白を菌体外分
泌生産させる方法及び該方法によって製造された抗アレ
ルギーキメラ蛋白を提供することにある。本発明の更に
他の目的は、以下の説明により一層明らかになるであろ
う。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）配列番
号１のアミノ酸配列で表わされる抗アレルギーキメラ蛋
白をコードするＤＮＡ配列、（ｂ）プロモーター機能を
有するＤＮＡ配列ならびに（ｃ）シグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列からなる第１のＤＮＡ領域、及び
（ｄ）菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与えるＤ
ＮＡ配列ならびに（ｅ）プロモーター機能を有するＤＮ
Ａ配列からなる第２のＤＮＡ領域、を含むプラスミド、
そのプラスミドによって形質転換された微生物細胞、そ
の微生物細胞を用いて抗アレルギーキメラ蛋白を菌体外
分泌生産させる方法、及びその微生物細胞から分泌され
た抗アレルギーキメラ蛋白に関するものである。

【００１６】本発明におけるプラスミドは抗アレルギー
キメラ蛋白の発現を行う第１のＤＮＡ領域及び該抗アレ
ルギーキメラ蛋白の菌体外分泌作用を行う第２のＤＮＡ
領域とからなる。

【００１７】抗アレルギーキメラ蛋白の発現を行う第１
のＤＮＡ領域は、抗アレルギーキメラ蛋白の発現調節を
行う適当な（ｂ）プロモーター機能を有するＤＮＡ配
列、適当な（ｃ）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列及び（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で表わされる
抗アレルギーキメラ蛋白をコードするＤＮＡ配列がこの
順序に連結された形のプラスミドが最も好ましい。また
適当な（ｃ）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
と（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で表わされる抗腫瘍
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とがその読み取り
フレームを一致させた形で連結されることが、とりわけ
好ましい。

【００１８】抗アレルギーキメラ蛋白の発現調節を行う
（ｂ）プロモーター機能を有するＤＮＡ配列を有する遺
伝子としては、大腸菌β―ラクタマーゼ遺伝子、大腸菌
アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、大腸菌リポプロテイ
ン遺伝子、枯草菌ペニシリナーゼ遺伝子、枯草菌プロテ
アーゼ遺伝子、酵母α因子遺伝子、好アルカリ性バチル
スＮｏ．１７０株ペニシリナーゼ遺伝子、好アルカリ性
エアロモナス（Aeromonas ）Ｎｏ．２１２株キシラナー
ゼ遺伝子、好アルカリ性バチルスＮｏ．Ｎ―４株セルラ
ーゼ遺伝子、好アルカリ性バチルスＮｏ．１１３９株セ
ルラーゼ遺伝子等があげられる。これらの中で、好まし
くは好アルカリ性バチルスＮｏ．１７０株ペニシリナー
ゼ遺伝子が用いられる。かかる遺伝子として、Journal
of General Microbiology （１９８５），１３１，３３
１９頁に示された―１３４番のＴから―１番のＣまでの
核酸を挙げることができる。

【００１９】（ｃ）シグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を有する遺伝子としては、大腸菌β―ラクタマー
ゼ遺伝子，大腸菌アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、大
腸菌リポプロテイン遺伝子、枯草菌ペニシリナーゼ遺伝
子、枯草菌プロテアーゼ遺伝子、酵母α因子遺伝子、好
アルカリ性バチルスＮｏ．１７０株ペニシリナーゼ遺伝
子、好アルカリ性エアロモナス（Aeromonas ）Ｎｏ．２
１２株キシラナーゼ遺伝子、好アルカリ性バチルスＮ
ｏ．Ｎ―４株セルラーゼ遺伝子、好アルカリ性バチルス
Ｎｏ．１１３９株セルラーゼ遺伝子等があげられる。こ
れらの中で、好ましくは好アルカリ性バチルスＮｏ．１
７０株ペニシリナーゼ遺伝子が用いられる。かかる遺伝
子として、Journal of General Microbiology （１９８
５）１３１巻、３３１９頁に示された１番のＡから９０
番のＡまでの核酸を挙げることができる。

【００２０】本発明において、抗アレルギーキメラ蛋白
は配列番号１のアミノ酸配列で表わされる。それをコー
ドする遺伝子の具体例として配列番号１１の核酸が挙げ
られる。

【００２１】また、配列番号１のアミノ酸において菌体
外への分泌を阻害せず、なおかつ抗アレルギー活性を失
活しないあるいは向上させる範囲の改変体も、本発明の
中に包含されるのは言うまでもない。したがって、かか
る改変体をコードするＤＮＡも本発明を構成するもので
ある。

【００２２】さらに菌体外分泌が効率よく行なわれるた
めには、シグナルペプチドの領域の後ろに融合させる成
熟蛋白質のアミノ末端のアミノ酸が中性又は疎水性アミ
ノ酸であることが好ましく、該アミノ酸がＳｅｒである
ことが最も好ましい。

【００２３】該抗アレルギーキメラ蛋白の菌体外分泌作
用を行う第２のＤＮＡ領域は（ｄ）菌体外分泌を促進す
る作用を宿主細胞に与えるＤＮＡ配列とその発現調節を
行う（ｅ）プロモーター機能を有するＤＮＡ配列とから
なる。

【００２４】実際的に（ｄ）菌体外分泌を促進する作用
を宿主細胞に与えるＤＮＡ配列としては、公知のｐＭＢ
９プラスミド由来のＫｉｌ遺伝子があげられるが同じ蛋
白質をコードするものであればそれ以外のものも使用可
能である。これらの具体例として、 Journal of Bacter
idogy, June １９８６，７３１頁のＦｉｇ．４に示され
る１番目のＡから１３８晩目のＧまでの配列が挙げられ
る。

【００２５】実際的に（ｄ）菌体外分泌を促進する作用
を宿主細胞に与えるＤＮＡ配列の発現調節を行う（ｅ）
プロモーター機能を有するＤＮＡ配列としては、トリプ
トファン・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモータ
ー）、ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプ
ロモーター）、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモータ
ー、ｌｐｐプロモーター、好アルカリ性バチルスＮｏ．
１７０株染色体由来のＥｘプロモーター等があげられる
が、なかでも宿主の対数増殖後期で機能する性質を有す
る好アルカリバチルスＮｏ．１７０株染色体ＤＮＡ由来
のＥｘプロモーターがとりわけ好ましい。この具体例と
して、Journal ofBacteriology, June １９８６，７３
０頁の右欄の塩基配列において１番目のＧから８４番目
のＡまでの配列が挙げられる。

【００２６】これらの菌体外分泌発現型プラスミドの具
体例としてはｐＥＧ２があげられる。

【００２７】このプラスミドはシグナルペプチドとその
うしろに融合させた抗アレルギーキメラ蛋白との切り離
しが分泌に際して容易に行なわれ、分泌効率の点から見
てもすぐれている。

【００２８】上記プラスミドを常法により適当な宿主に
導入して形質転換された微生物を得る。この場合の適当
な宿主としてはエシェリヒア（Escherichia ）属に属す
る微生物を有利に使用することができる。宿主として
は、前記のエシェリヒア・コリＨＢ１０１株、同Ｃ６０
０株（ＡＴＣＣ２３７２４）、同Ｃ６００ｒ―ｍ―株
（ＡＴＣＣ３３５２５）、同χ１７７６株（ＡＴＣＣ３
１２４４）、同ＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ３３５７２）
等、通常のこの種の技術分野で用いられる微生物が有利
に用いられる。なかでも、エシェリヒア・コリＨＢ１０
１株がとりわけ好ましい。

【００２９】本発明は上記の形質転換された微生物を用
い、抗アレルギーキメラ蛋白を菌体外へ分泌させる方
法、及びその微生物から分泌された配列番号１のアミノ
酸配列で示される抗アレルギーキメラ蛋白を包含する。

【００３０】以下、本発明をさらに詳細に説明する。 （抗アレルギーキメラ蛋白遺伝子のクローン化）抗アレ
ルギーキメラ蛋白遺伝子は、化学合成したヒトＩｇＥ
Ｆｃ領域遺伝子とクローン化したＩｇＧ Ｆｃ領域遺伝
子（特開昭６２―２０１５８２号公報第１図記載）を適
当な制限酵素による切断部位を用いて連結することによ
り取得できる。化学合成する遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主細胞に最も的したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行える
ように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を設
けることが望ましい。このような抗アレルギーキメラ蛋
白遺伝子のうち化学合成した領域の塩基配列の例を配列
番号２に示した。

【００３１】上記のように設計したヒトＩｇＥ Ｆｃ領
域遺伝子の取得は、上側の鎖、下側の鎖のそれぞれにつ
いて、たとえば図１のＥＦ１〜ＥＦ８（それぞれ配列番
号３〜１０で表わされる）に示したような何本かのオリ
ゴヌクレオチドに分けて、それらを化学合成し、各々の
オリゴヌクレオチドを連結する方法をとるのが望まし
い。

【００３２】各オリゴヌクレオチドの合成法としてはジ
エステル法［H.G.Khorana, "Some Recent Developments
in Chemistry of Phosphate Esters ofBiological Int
erest", John Wiley and Sons, Inc., New York （１
９６１）］、トリエステル法［R.L.Letsinger ら、J. A
m. Chem. Soc.,８９，４８０１（１９６７）］及びホス
ファイト法［M.D. Matteucciら、Tetrahedron Lett.,２
１，７１９（１９８０）］があるが、合成時間、収率、
操作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いた
ホスファイト法による合成が好ましい。

【００３３】合成したオリゴヌクレオチドの精製は、ゲ
ル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳
動、逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー等
を、適宜単独もしくは組合せて用いることができる。

【００３４】こうして得られた合成オリゴヌクレオチド
の５′末端側の水酸基は、たとえばＴ４―ポリヌクレオ
チドキナーゼを用いてリン酸化した後、アニーリングさ
せ、たとえばＴ４―ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。

【００３５】このようにして得られたＤＮＡ断片を、適
当なプロモーター領域・シグナルペプチド領域・ＩｇＧ
Ｆｃ領域及び、抗アルカリ性バチルスＮｏ．１７０株
由来のＥｘプロモーター領域とｐＭＢ９プラスミド由来
のＫｉｌ遺伝子からなる菌体外分泌生産に関与する情報
を担うＤＮＡ領域を合わせ持つようなプラスミドに直接
挿入すれば、上記のプラスミドが、より簡便に得られ
る。

【００３６】このようなプロモーター領域・シグナルペ
プチド領域を有する遺伝子としては、大腸菌β―ラクタ
マーゼ遺伝子、大腸菌アルカリ性ホスファターゼ遺伝
子、大腸菌リポプロテイン遺伝子、枯草菌ペニシリナー
ゼ遺伝子、枯草菌プロチアーゼ遺伝子、酵母α因子遺伝
子、好アルカリ性バチルスＮｏ．１７０株ペニシリナー
ゼ遺伝子、好アルカリ性エアロモナス（Aeromonas)Ｎ
ｏ．２１２株キシラナーゼ遺伝子、好アルカリ性バチル
スＮｏ．Ｎ―４セルラーゼ遺伝子、好アルカリ性バチル
スＮｏ．１１３９株セルラーゼ遺伝子等があげられる
が、好ましくは好アルカリ性バチルスＮｏ．１７０株ペ
ニシリナーゼ遺伝子が用いられる（Journal ofgeneral
Microbiology （１９８５），１３１，３３１７頁記
載）。

【００３７】前記の各遺伝子内のプロモーター領域は、
各々独立して他の遺伝子のシグナルペプチド領域と組合
せることもできる。

【００３８】適当なプロモーター領域、適当なシグナル
ペプチド領域及び抗アレルギーキメラ蛋白をコードする
ＤＮＡ領域が、この順序に連結された形のプラスミドが
最も好ましく、適当なシグナルペプチド領域と抗アレル
ギーキメラ蛋白をコードするＤＮＡ領域とがその読み取
りフレームを一致させた形で連結されることが、とりわ
け好ましい。

【００３９】このような菌体外分泌発現型プラスミドと
して、好ましくはｐＥＧ２が用いられる。

【００４０】なお、本発明において適当なプロモーター
領域，シグナルペプチド領域，抗アレルギーキメラ蛋白
をコードするＤＮＡ領域、Ｅｘプロモーター領域及びＫ
ｉｌ遺伝子は、これらと生物学的機能において同等なＤ
ＮＡ領域、すなわち該ＤＮＡ領域に対してヌクレオチド
の置換、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの挿入及び
ヌクレオチド配列の逆位その他の突然変位によって関連
づけられているＤＮＡ領域でもよいことはいうまでもな
い。

【００４１】（抗アレルギーキメラ蛋白の生産）かくし
て得られた、抗アレルギーキメラ蛋白遺伝子菌体外分泌
発現型プラスミドを常法により適当な宿主に導入して組
換え微生物を得、これを培養することにより、抗アレル
ギーキメラ蛋白を生産させることができる。

【００４２】このような宿主としてはエシェリヒア（Es
cherichia)属に属する微生物を有利に使用することがで
きる。宿主としては、前記のエシェリヒア・コリＨＢ１
０１株，同Ｃ６００株（ＡＴＣＣ２３７２４）、同Ｃ６
００ｒ―ｍ―株（ＡＴＣＣ３３５２５）、同χ１７７６
株（ＡＴＣＣ３１２４４）、同ＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ
３３５７２）等、通常のこの種の技術分野で用いられる
微生物が有利に用いられる。なかでも、エシェリヒア・
コリＨＢ１０１株がとりわけ好ましい。

【００４３】このようにして得られた組換え微生物を、
それ自体は公知の方法で培養する。培地としては、抗ア
レルギーキメラ蛋白の生産に適した培地であって、かつ
宿主微生物の生育に適した培地を用い得るが、たとえば
Ｍ９培地［T.Miniatisら編、Molecular Cloning P440
(Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９８
２）］、ＬＢ培地［T. Maniatis ら編、Molecular Clon
ing P440 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York
１９８２）］、ＢＰＢ培地（Ｄｉｆｃｏ製）、Nutrient
寒天培地等を基本培地として調製したものを用いればよ
い。

【００４４】その他、必要に応じて、炭素源、酸素源の
他にアミノ酸、ビタミン等の栄養素を添加してもよい
し、発現型プラスミドの宿主内安定かのために適当料の
抗生物質等を添加してもよい。

【００４５】培養は、ｐＨ、温度、酸素供給量を目的の
組換え微生物に適した条件で行なう。菌体外分泌発現型
プラスミドを有する組換え微生物の培養においては、該
微生物が生育してその菌体量が最大に達したとき、すな
わち対数増殖後期から培地中に抗アレルギーキメラ蛋白
が生成、蓄積するまでの時間中、同一培地で培養をその
まま継続するのがよい。

【００４６】たとえばエシェリヒア属の微生物の前記菌
体量が最大に達したときから培地中に抗アレルギーキメ
ラ蛋白の生成，蓄積が停止するまでの時間は、ほぼ１２
〜４８時間の範囲である。なおｐＨ条件は特に影響され
ないが、ｐＨ５〜８の範囲、特にｐＨ７．２が適当であ
る。

【００４７】（抗アレルギーキメラ蛋白の活性評価）菌
体外分泌発現型プラスミドを有する組換え微生物を培養
した後、たとえば遠心分離により微生物を除去する。得
られた抗アレルギーキメラ蛋白を含有する培養上清につ
いて、直接あるいは常法による濃縮操作によって濃縮し
た後、活性の評価を行なう。

【００４８】（抗アレルギーキメラ蛋白の分離・精製）
菌体外分泌発現型プラスミドを有する組換え微生物培養
上清からの抗アレルギーキメラ蛋白の分離・精製は、公
知の通常知られている蛋白質の分離・精製法に従えばよ
いが、プロテインＡを用いたアフィニティー・カラム・
クロマトグラフィーが有利である。

【００４９】こうして得られた抗アレルギーキメラ蛋白
精製品について、ＳＤＳ―ポリアクリルアミド・ゲル電
気泳動［U.K.Laemmli, Nature,２２７，６８０（１９７
０）］による分子量解析、アミノ末端のアミノ酸配列解
析及びアミノ酸組成分析を行なうことにより、シグナル
ペプチドが正しく切断された抗アレルギーキメラ蛋白の
分泌が確認できる。

【００５０】

【発明の効果】本発明の菌体外分泌発現型プラスミドに
よって本発明の対象とする抗アレルギーキメラ蛋白の菌
体外への分泌が可能となった。このポリペプチドは菌体
内へ蓄積することによって悪影響を受けることの少ない
ポリペプチドでその抗アレルギー活性の応用が期待され
る。

【００５１】

【実施例】以下、実施例を掲げて本発明について詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。

【００５２】

【実施例１】 （ヒトＩｇＥ Ｆｃ領域遺伝子の設計）配列番号２に示
した塩基配列のヒトＩｇＥ Ｆｃ領域の遺伝子を設計し
た。設計に際しては、ヒトＩｇＥ Ｆｃ領域のアミノ末
端側に、アミノ酸Ｓｅｒと制限酵素Ｈｉｎｄ IIIによる
切断部位を含むようにし、シグナルペプチドとの連結を
容易にした。また、カルボキシ末端側に、ＩｇＧ Ｆｃ
領域の必要な領域の一部と制限酵素Ｓｓｔ II による切
断部位を含みＩｇＧ Ｆｃ領域との連結を容易にした。

【００５３】

【実施例２】 （オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で設計した
ヒトＩｇＥ Ｆｃ領域遺伝子は、図１に示したように配
列番号３〜１０で示される８本のオリゴヌクレオチドＥ
Ｆ１〜ＥＦ８に分けて合成する。この場合、オリゴヌク
レオチドＥＦ１は配列番号３、ＥＦ２は配列番号４、Ｅ
Ｆ３は配列番号５、ＥＦ４は配列番号６、ＥＦ５は配列
番号７、ＥＦ６は配列番号８、ＥＦ７は配列番号９、Ｅ
Ｆ８は配列番号１０に対応する。

【００５４】オリゴヌクレオチドの合成は全自動ＤＮＡ
合成機（アプライド・バイオシステムズ，モデル３８０
Ａ）を用いて、ホスファイト法により行なった。

【００５５】合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプラ
イド・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なっ
た。すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニ
ア水溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の
保護基をはずし、セファデックスＧ―５０ファイン・ゲ
ル（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子
量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。

【００５６】ついで、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度２０％）の後、紫外線シャド
ウイング法により泳動パターンの観察を行なう。目的と
する大きさのバンド部分を切出して、そのポリアクリル
アミドゲル断片を細かく破砕した後、２〜５mlの溶出用
バッファー［５００ｍＭ ＮＨ₄ ＯＡｃ―１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ―０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．５）］を加え、３７℃
で一晩振盪した。

【００５７】遠心分離し、目的のＤＮＡを含む溶液をゲ
ル濾過カラム（セファデックスＧ―５０）にかけること
により、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかっ
た。

【００５８】

【実施例３】 （化学合成ヒトＩｇＥ Ｆｃ領域遺伝子のクローン化）
実施例２で作成した８本の合成オリゴヌクレオチド（Ｅ
Ｆ１〜ＥＦ８）を用いて、クローン化した。

【００５９】０．１〜１．０μｇの合成オリゴヌクレオ
チドＥＦ２〜ＥＦ７の５′末端側を、５〜１５ユニット
のＴ４―ポリヌクレオチドキナーゼ（E.Coli Ｂタイ
プ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々にリン酸化する。
リン酸化反応は１０〜２０μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―
ＨＣｌ（ｐＨ９．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，５ｍＭ
ジチオスレイトール，１０ｍＭ ＡＴＰ水溶液中で、３
７℃で、３０分間行なった。

【００６０】反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオ
チド水溶液をすべて混合し、フェノール抽出、エーテル
抽出によりＴ４―ポリヌクレオチドキナーゼを失活，除
去する。この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに
０．１〜１．０μｇの合成オリゴヌクレオチドＥＦ１及
びＥＦ８加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐冷
して、アニーリングを行なう。次に、これを減圧乾固し
た後に、３０μｌの６６ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭジチオス
レイトール，１ｍＭ ＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００
ユニットのＴ４―ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、
１１℃で１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行な
い、エチジウムブロマイド染色法により泳動パターンの
観察を行なう。目的とする大きさ（約２７０ｂｐ）のバ
ンド部分を切出して、実施例２の方法に従ってポリアク
リルアミドゲルよりＤＮＡを回収する。

【００６１】一方、３μｇのＩｇＧ Ｆｃ領域・菌体外
分泌発現型プラスミドｐＥＸＦＣ１０（約４．４Ｋｂ
ｐ）（特開昭６２―２０１５８２号記載）を３０μｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ
ＮａＣｌ₂ 水溶液に溶解させ、１０ユニットの制限酵
素Ｈｉｎｄ III（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間
切断反応を行なった。

【００６２】制限酵素Ｈｉｎｄ IIIによる切断の後、フ
ェノール抽出、エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収する。このＤＮＡを３０μｌの１０
ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ₄ 、１ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解させ、
１０ユニットの制限酵素Ｓｓｔ II （ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ）を添加して、３７℃で１時間切断
反応を行なった。

【００６３】反応終了後、アガロースゲル電気泳動（ゲ
ル濃度０．８％）を行ない、エチジウムブロマイド染色
法により切断パターンの観察を行なう。

【００６４】プラスミドｐＥＸＦＣ１０の大部分を含む
約５．４ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出
し、そのアガロースゲル断片を３倍量(vol／wt）の８Ｍ
ＮａＣｌＯ₄ 水溶液に溶解させた。Chenらのグラスフ
ィルター法［C.W.Chenら、Anal. Biochem.１０１，３３
９（１９８０）により、約５．４ＫｂｐのＤＮＡ断片
（Ｈｉｎｄ III←→Ｓｓｔ II ）をアガロースゲルより
回収した。

【００６５】先に得られたＩｇＥ Ｆｃ領域遺伝子を含
む約２７０ｂｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準
じて末端のリン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＥ
ＸＦＣ１０の大部分を含む約５．４ＫｂｐのＤＮＡ水溶
液と混合する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じ
て両ＤＮＡ断片の連結反応を行なった。

【００６６】エシェリヒア・コリＨＢ１０１株の形質転
換は、通常のＣａＣｌ₂ 法（M.V.Norgard らの方法）の
改良法で行なった。

【００６７】すなわち、５mlのＬ培地（１％トリプト
ン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．
２）にエシェリヒア・コリＨＢ１０１株の１８時間培養
基を接種し、菌体を含む培養液の６００ｎｍにおける濁
度（ＯＤ₆₀₀ ）が０．３に達するまで生育させる。菌体
を冷たいマグネシウム・バッファー［０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ
（ｐＨ７．６、０℃）］中で２回洗い、２mlの冷やした
カルシウム・バッファー［１００ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、２
５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．６、０℃）］中に再懸濁させ、
０℃で２５分間放置する。次に菌体をこの容量の１／１
０にカルシウム・バッファーの中で濃縮し、連結後のＤ
ＮＡ水溶液と２：１（vol.：vol.) 混合する。

【００６８】この混合物を６０分間、０℃で保った後、
１mlのＬＢＧ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス，１％ＮａＣｌ、０．０８％グルコース、ｐＨ７．
２）を添加し、３８℃で１時間振盪培養する。培養液
を、選択培地［クロラムフェニコール（ベーリンガー）
２０μｇ／mlを含むＬ培地プレート］に１００μｌ／プ
レートの割合で接種する。

【００６９】得られたクロラムフェニコール耐性のコロ
ニーより、公知の方法を用いてＤＮＡを調製し、アガロ
ースゲル電気泳動により、目的のプラスミドｐＥＧ２
（約５．７Ｋｂｐ）の取得を確認した。図１に、抗アレ
ルギーキメラ蛋白分泌発現プラスミドｐＥＧ２の作成方
法を示す。

【００７０】こうして得られたプラスミド、ｐＥＧ２
の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計
通りであることは、マキサム・ギルバート法（A.M.Maxa
m ら、Methods Enzymol., ６５，４９９（１９８０））
によって確認した。

【００７１】

【実施例４】 （菌体外分泌発現型プラスミドｐＥＧ２を有する組換え
微生物の培養）抗アレルギーキメラ蛋白遺伝子を有しな
い分泌プラスミドベクターｐＥＡＰ８を有するエシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ―１９０９）
及び実施例３で得られた抗アレルギーキメラ蛋白遺伝子
菌体外分泌発現型プラスミドｐＥＧ２を有するエシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１株を、それぞれＬＢＧ培地［１％
トリプロン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、０．
１％グルコース（ｐＨ７．２）］に接種し、３７℃で２
４時間振盪培養を行なう。

【００７２】培養終了後、遠心分離によって菌体を分離
し、得られた培養上清を評価用試料とした。

【００７３】

【実施例５】 （ｐＥＧ２にコードされるアレルギーキメラ蛋白の検
出）前記実施例４で得られたｐＥＡＰ８を有するエシェ
リヒア・コリＨＢ１０１株及びｐＥＧ２を有するエシェ
リヒア・コリＨＢ１０１株からの培養上清３００μｌ分
に相当する培養上清濃縮物に対して、Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ６．８）とＳＤＳと２―メルカプトエ
タノールとグリセロールとを、それぞれ最終濃度６０ｍ
Ｍ、２％、４％、１０％になるように加え、ＳＤＳ―ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木、遺伝、３１，４
３（１９７７）］を行なった。

【００７４】分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファー
はＳＤＳ―Ｔｒｉｓ・グリシン系［U.K. Laemmli, Natu
re, ２２７，６８０（１９７０）］を用いた。

【００７５】電気泳動終了後、ゲル蛋白質を、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ―１９２ｍＭグリシン（ｐＨ８．３）―２０
％メタノールのバッファー中で、電気泳動的にニトロセ
ルロース・フィルターに吸着させ、ウエスタン・プロッ
ティングを行なった。

【００７６】蛋白質を吸着させたニトロセルロース・フ
ィルターを５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳバッフ
ァー中に６０分間浸した後、一次抗体としてウサギ抗ヒ
トＩｇＧ抗体を含む抗血清（カッペル）およびヤギ抗ヒ
トＩｇＥ抗体を含む抗血清（カッペル）を用いた間接法
で、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いたイミユン・ブロ
ット・アッセイ・キット（バイオ・ラッド）により、培
養上清中の抗アレルギーキメラ蛋白を特異的に染色し
た。そうしたところ、ｐＥＧ２を有する大腸菌の培養上
清中に、抗アレルギーキメラ蛋白に由来するバンドが検
出された。

【００７７】以上の結果より、好アルカリ菌ペニシリナ
ーゼ遺伝子シグナル領域の下流に、アミノ末端にセリン
を有する抗アレルギーキメラ蛋白遺伝子を融合させるこ
とにより、抗アレルギーキメラ蛋白の菌体外分泌が達成
されることがわかる。

【００７８】

【配列番号】

【００７９】配列番号：１ 配列の長さ：２４５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列の特徴： 配列 Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr 1 5 10 15 Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser 20 25 30 Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp 35 40 45 Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu 50 55 60 Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 115 120 125 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Pro Gly Lys 245

【００８０】配列番号：２ 配列の長さ：２７２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 AGCT AGC CAG AAA CAC TGG CTG TCC GAC CGC ACC TAC ACC TGC CAG GTT ACC 52 Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr 1 5 10 15 TAC CAG GGT CAC ACC TTC GAA GAC AGC ACC AAA AAA TGC GCT GAT TCC 100 Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser 20 25 30 AAC CCG CGT GGT GTT AGC GCT TAC CTG AGC CGT CCG AGC CCG TTC GAC 148 Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp 35 40 45 CTG TTC ATC CGC AAA TCC CCG ACT ATC ACC TGC CTG GTT GTT GAC CTG 196 Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu 50 55 60 GCA CCG AGC AAA GGT ACC GTT AAC CTG ACC TGG TCC GTG GAC GGC GTG 244 Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Val Asp Gly Val 65 70 75 80 GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG C 272 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 89

【００８１】配列番号：３ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 AGCTAGCCAG AAACACTGGC TGTCCGACCG CACCTACACC TGCCAGGTTA CCTACCA 57

【００８２】配列番号：４ 配列の長さ：６１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 TGTGACCCTG GTAGGTAACC TGGCAGGTGT AGGTGCGGTC GGACAGCCAG TGTTTCTGGC 60 T 61

【００８３】配列番号：５ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 GGGTCACACC TTCGAAGACA GCACCAAAAA ATGCGCTGAT TCCAACCCGC GTGGTGTTAG 60 CGCTTA 66

【００８４】配列番号：６ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 GGCTCAGGTA AGCGCTAACA CCACGCGGGT TGGAATCAGC GCATTTTTTG GTGCTGTCTT 60 CGAAGG 66

【００８５】配列番号：７ 配列の長さ：６１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 CCTGAGCCGT CCGAGCCCGT TCGACCTGTT CATCCGCAAA TCCCCGACTA TCACCTGCCT 60 G 61

【００８６】配列番号：８ 配列の長さ：６１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 TCAACAACCA GGCAGGTGAT AGTCGGGGAT TTGCGGATGA ACAGGTCGAA CGGGCTCGGA 60 C 61

【００８７】配列番号：９ 配列の長さ：８８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 GTTGTTGACC TGGCACCGAG CAAAGGTACC GTTAACCTGA CCTGGTCCGT GGACGGCGTG 60 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGC 88

【００８８】配列番号：１０ 配列の長さ：７８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 GGCTTTGTCT TGGCATTATG CACCTCCACG CCGTCCACGG ACCAGGTCAG GTTAACGGTA 60 CCTTTGCTCG GTGCCAGG 78

【００８９】配列番号：１１ 配列の長さ：７３５ 配列の型：核酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列の特徴： 配列 AGCCAGAAAC ACTGGCTGTC CGACCGCACC TACACCTGCC AGGTTACCTA CCAGGGTCAC 60 ACCTTCGAAG ACAGCACCAA AAAATGCGCT GATTCCAACC CGCGTGGTGT TAGCGCTTAC 120 CTGAGCCGTC CGAGCCCGTT CGACCTGTTC ATCCGCAAAT CCCCGACTAT CACCTGCCTG 180 GTTGTTGACC TGGCACCGAG CAAAGGTACC GTTAACCTGA CCTGGTCCGT GGACGGCGTG 240 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC GTACCGGGTG 300 GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG 360 GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG 420 CCCCGAGAAC CACAGGTGTA CACCCTGCCC CCATCCCGGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG 480 GTCAGCCTGA CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 540 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGCTGGA CTCCGACGGC 600 TCCTTCTTCC TCTATAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA GGTGGCAGCA GGGGAACGTC 660 TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC 720 CTGTCCCCGG GTAAA 735

【図面の簡単な説明】

【図１】抗アレルギーキメラ蛋白遺伝子菌体外発現型プ
ラスミドｐＥＧ２の作製方法を示した図である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１のアミノ酸配列で表わ
   される抗アレルギーキメラ蛋白をコードするＤＮＡ配
   列、（ｂ）プロモーター機能を有するＤＮＡ配列ならび
   に（ｃ）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列から
   なる第１のＤＮＡ領域、及び（ｄ）菌体外分泌を促進す
   る作用を宿主細胞に与えるＤＮＡ配列ならびに（ｅ）プ
   ロモーター機能を有するＤＮＡ配列からなる第２のＤＮ
   Ａ領域、を含むプラスミド。
2. 【請求項２】 第１のＤＮＡ領域における（ｂ）プロモ
   ーター機能を有するＤＮＡ配列が、好アルカリ性バチル
   ス（Bacillus）Ｎｏ．１７０株の染色体ＤＮＡ由来であ
   る請求項１記載のプラスミド。
3. 【請求項３】 （ｃ）シグナルペプチドをコードするＤ
   ＮＡ配列が、好アルカリ性バチルス（Bacillus）Ｎｏ．
   １７０株の染色体ＤＮＡ由来である請求項１記載のプラ
   スミド。
4. 【請求項４】 （ｄ）菌体外分泌を促進する作用を宿主
   細胞に与えるＤＮＡ配列が、プラスミドｐＭＢ９由来で
   ある請求項１記載のプラスミド。
5. 【請求項５】 第２のＤＮＡ領域における（ｅ）プロモ
   ーター機能を有するＤＮＡ配列が、好アルカリ性バチル
   ス（Bacillus）Ｎｏ．１７０株の染色体ＤＮＡ由来であ
   る請求項１記載のプラスミド。
6. 【請求項６】 プラスミドｐＥＧ２である請求項１記載
   のプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項１記載のプラスミドにより形質転
   換された組換え微生物細胞。
8. 【請求項８】 微生物細胞がエシェリヒア（Escherichi
   a ）属に属する請求項７記載の微生物細胞。
9. 【請求項９】 微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Esch
   erichia coli）ＨＢ１０１株である請求項７記載の微生
   物細胞。
10. 【請求項１０】 請求項７に記載の微生物細胞を、菌体
    外に抗アレルギーキメラ蛋白が生成しそして蓄積するま
    で培養し、培養物から抗アレルギーキメラ蛋白を採取す
    ることを特徴とする抗アレルギーキメラ蛋白の製造方
    法。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法により製造さ
    れた抗アレルギーキメラ蛋白。