JPH05168495A - 酵素的測定方法 - Google Patents
酵素的測定方法Info
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- JPH05168495A JPH05168495A JP34290891A JP34290891A JPH05168495A JP H05168495 A JPH05168495 A JP H05168495A JP 34290891 A JP34290891 A JP 34290891A JP 34290891 A JP34290891 A JP 34290891A JP H05168495 A JPH05168495 A JP H05168495A
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- enzymatic
- glycerol
- sulfopropyl
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Abstract
(57)【要約】
【目的】被検液中に存在するホスファチジルグリセロー
ルを酵素的定量反応を用いて測定する場合に、被検液中
に存在して反応に関与するために測定結果に誤差を生じ
させる物質がある。このような測定の妨害となる物質を
消去して測定を正確にかつ簡単な操作で行うことを目的
とする。 【構成】被検液中に存在するホスファチジルグリセロー
ル（ＰＧ）をグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）−ジ
ヒドロキシアセトンリン酸（ＤＡＰ）のサイクリング反
応を用いて酵素的に定量する酵素的定量反応系による方
法において、被検液中に混在するＰＧ酵素的反応系の妨
害因子を少なくともアルカリホスファターゼ含有消去試
薬にて前処理してなる被検液中のＰＧの酵素的測定方
法。
ルを酵素的定量反応を用いて測定する場合に、被検液中
に存在して反応に関与するために測定結果に誤差を生じ
させる物質がある。このような測定の妨害となる物質を
消去して測定を正確にかつ簡単な操作で行うことを目的
とする。 【構成】被検液中に存在するホスファチジルグリセロー
ル（ＰＧ）をグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）−ジ
ヒドロキシアセトンリン酸（ＤＡＰ）のサイクリング反
応を用いて酵素的に定量する酵素的定量反応系による方
法において、被検液中に混在するＰＧ酵素的反応系の妨
害因子を少なくともアルカリホスファターゼ含有消去試
薬にて前処理してなる被検液中のＰＧの酵素的測定方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、被検液中に存在するホ
スファチジルグリセロール（ＰＧ）を酵素的に定量する
ＰＧ酵素的定量反応系において、被検液中に存在する測
定の妨害となる物質を消去して測定を正確に行うＰＧの
酵素的測定方法に関する。
スファチジルグリセロール（ＰＧ）を酵素的に定量する
ＰＧ酵素的定量反応系において、被検液中に存在する測
定の妨害となる物質を消去して測定を正確に行うＰＧの
酵素的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より酵素的サイクリング反応として
いくつかの系が知られているが、その一つに、グリセロ
ール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を基質としてＯ2 を消費し
てＨ2 Ｏ2 およびジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＡ
Ｐ）を生成するグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（ＧＰＯ）と、ＤＡＰを基質として還元型ニコチンアミ
ド・アデニン・ジヌクレオチド（還元型ＮＡＤ）を消費
してＮＡＤおよびＧ３Ｐを生成するグリセロール−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）とを用いて形成
するＧ３Ｐ−ＤＡＰサイクリング反応が知られている
（特公平２−２０２３９号公報）。これを以下に示す。
いくつかの系が知られているが、その一つに、グリセロ
ール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を基質としてＯ2 を消費し
てＨ2 Ｏ2 およびジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＡ
Ｐ）を生成するグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（ＧＰＯ）と、ＤＡＰを基質として還元型ニコチンアミ
ド・アデニン・ジヌクレオチド（還元型ＮＡＤ）を消費
してＮＡＤおよびＧ３Ｐを生成するグリセロール−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）とを用いて形成
するＧ３Ｐ−ＤＡＰサイクリング反応が知られている
（特公平２−２０２３９号公報）。これを以下に示す。
【０００３】
【化１】
【０００４】上記［１］式のサイクリング反応は、周産
期の胎児呼吸機能検査における羊水被検体中のホスファ
チジルグリセロール（ＰＧ）の定量に応用できる。すな
わち、羊水などのＰＧ含有被検液中にホスフォリパーゼ
−Ｄ（ＰＬ−Ｄ）（EC3.1.4.4 ）を作用させて、ホスフ
ァチジン酸とグリセロールを遊離させる。このグリセロ
ールを基質としてグリセロキナーゼ（ＧＫ）−アデノシ
ントリホスフェート（ＡＴＰ）−Ｍｇ2+によりＧ３Ｐを
生成させ、このＧ３Ｐを上記サイクリング反応により定
量するものである。あるいは、ＰＧ含有被検液にホスフ
ォリパーゼＣ（EC3.1.4.3)を作用させてジグリセライド
とＧ３Ｐを遊離させ、このＧ３Ｐを上記サイクリング反
応により定量するものである。
期の胎児呼吸機能検査における羊水被検体中のホスファ
チジルグリセロール（ＰＧ）の定量に応用できる。すな
わち、羊水などのＰＧ含有被検液中にホスフォリパーゼ
−Ｄ（ＰＬ−Ｄ）（EC3.1.4.4 ）を作用させて、ホスフ
ァチジン酸とグリセロールを遊離させる。このグリセロ
ールを基質としてグリセロキナーゼ（ＧＫ）−アデノシ
ントリホスフェート（ＡＴＰ）−Ｍｇ2+によりＧ３Ｐを
生成させ、このＧ３Ｐを上記サイクリング反応により定
量するものである。あるいは、ＰＧ含有被検液にホスフ
ォリパーゼＣ（EC3.1.4.3)を作用させてジグリセライド
とＧ３Ｐを遊離させ、このＧ３Ｐを上記サイクリング反
応により定量するものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、実際の
羊水被検液中のＰＧの定量では、被検液中に既に存在す
るＧ３Ｐ，ＤＡＰあるいはグリセロールが反応して正確
な定量を妨害することになる。したがって、被検液中の
Ｇ３Ｐ，ＤＡＰあるいはグリセロールを予め除去してお
かなければならない。
羊水被検液中のＰＧの定量では、被検液中に既に存在す
るＧ３Ｐ，ＤＡＰあるいはグリセロールが反応して正確
な定量を妨害することになる。したがって、被検液中の
Ｇ３Ｐ，ＤＡＰあるいはグリセロールを予め除去してお
かなければならない。
【０００６】このような被検液中に内在する成分の除去
は、従来の酵素的定量方法においてもなされていた。例
えば、従来の生体液などの被検液中の成分の酵素的な定
量測定においては、検出しようとする目的物質を過酸化
水素に導き、この過酸化水素にＰＯＤ−４ＡＡＰ（ペル
オキシダーゼ−４アミノアンチピリン）とトリンダー試
薬を反応させてキノン色素を生成させ、これを比色定量
していた。この場合、目的物質から過酸化水素に至る生
成過程の中間物質と同じ物質がもともとの被検液中に存
在して定量測定を妨害することがあるが、目的物質から
過酸化水素へ導く２つ以上の酵素からなる系では、ま
ず、中間物質に働く酵素により内在する中間物質を過酸
化水素に導き、これをカタラーゼで水にするか、もしく
はＰＯＤ−４ＡＡＰにより無色物質にして、比色定量の
対象から除去していた（特開昭６２−２１５３９８号参
照）。
は、従来の酵素的定量方法においてもなされていた。例
えば、従来の生体液などの被検液中の成分の酵素的な定
量測定においては、検出しようとする目的物質を過酸化
水素に導き、この過酸化水素にＰＯＤ−４ＡＡＰ（ペル
オキシダーゼ−４アミノアンチピリン）とトリンダー試
薬を反応させてキノン色素を生成させ、これを比色定量
していた。この場合、目的物質から過酸化水素に至る生
成過程の中間物質と同じ物質がもともとの被検液中に存
在して定量測定を妨害することがあるが、目的物質から
過酸化水素へ導く２つ以上の酵素からなる系では、ま
ず、中間物質に働く酵素により内在する中間物質を過酸
化水素に導き、これをカタラーゼで水にするか、もしく
はＰＯＤ−４ＡＡＰにより無色物質にして、比色定量の
対象から除去していた（特開昭６２−２１５３９８号参
照）。
【０００７】これを例示すると、次のようになる。例え
ば、ＰＧを過酸化水素に導く非サイクリング反応系で
は、
ば、ＰＧを過酸化水素に導く非サイクリング反応系で
は、
【化２】 で示される反応により、目的物質であるＰＧを最終的に
色素に導いて比色定量するが、被検液中にもともと存在
するグリセロールまたはＧ３Ｐが定量に正の誤差を生じ
させるので、これを除去しなければならない。その場
合、まず、以下の反応式で示すように、ＧＫおよびＧＰ
Ｏの作用でこの内因性グリセロールおよびＧ３ＰをＨ2
Ｏ2 に導き、このＨ2 Ｏ2 をカタラーゼにより水にする
かもしくはＰＯＤ−４ＡＡＰにより無色物質とする。
色素に導いて比色定量するが、被検液中にもともと存在
するグリセロールまたはＧ３Ｐが定量に正の誤差を生じ
させるので、これを除去しなければならない。その場
合、まず、以下の反応式で示すように、ＧＫおよびＧＰ
Ｏの作用でこの内因性グリセロールおよびＧ３ＰをＨ2
Ｏ2 に導き、このＨ2 Ｏ2 をカタラーゼにより水にする
かもしくはＰＯＤ−４ＡＡＰにより無色物質とする。
【０００８】
【化３】 その後、上記［２］式により目的物質であるＰＧをＨ2
Ｏ2 に導いて定量する。しかしながら、従来のこの方法
をサイクリング反応に適用すると、［１］式に示すよう
に、Ｇ３Ｐ−ＤＡＰ間にサイクリング反応があるので、
生成したＤＡＰは再びＧ３Ｐに戻り、その全てをＨ2 Ｏ
2 にまで導いて水または無色物質に変化させることが不
可能になる。したがって、サイクリング反応を用いた生
体液中の成分の定量では、上記従来の手法により内因性
の妨害物質を除去することができない。
Ｏ2 に導いて定量する。しかしながら、従来のこの方法
をサイクリング反応に適用すると、［１］式に示すよう
に、Ｇ３Ｐ−ＤＡＰ間にサイクリング反応があるので、
生成したＤＡＰは再びＧ３Ｐに戻り、その全てをＨ2 Ｏ
2 にまで導いて水または無色物質に変化させることが不
可能になる。したがって、サイクリング反応を用いた生
体液中の成分の定量では、上記従来の手法により内因性
の妨害物質を除去することができない。
【０００９】また、被検液中の妨害物質を除去する他の
方法としては、上記の例で述べると、ＰＧを反応させな
いで（すなわち、［２］式においてＰＬ−Ｄを除いた系
とし、ＰＧからグリセロールへの反応を生じさせないよ
うにする）、検体ブランクのみを反応させ、それによっ
て得た測定値Ｎを［２］式で測定した値Ｓから差し引く
という方法が考えられる。しかしながら、この方法で
は、２つの測定を行うということと、さらにその差を求
めるという繁雑な手間を必要とし、またＳとＮの比が小
さければそれだけ誤差要因も多くなるという欠点があ
る。
方法としては、上記の例で述べると、ＰＧを反応させな
いで（すなわち、［２］式においてＰＬ−Ｄを除いた系
とし、ＰＧからグリセロールへの反応を生じさせないよ
うにする）、検体ブランクのみを反応させ、それによっ
て得た測定値Ｎを［２］式で測定した値Ｓから差し引く
という方法が考えられる。しかしながら、この方法で
は、２つの測定を行うということと、さらにその差を求
めるという繁雑な手間を必要とし、またＳとＮの比が小
さければそれだけ誤差要因も多くなるという欠点があ
る。
【００１０】本発明は上記状況に鑑みてなされたもの
で、被検液中に存在するＰＧを酵素的に定量するＰＧ酵
素的定量反応系による方法において、被検液中に存在す
る測定の妨害となる物質を除去して測定を正確に行う方
法を提供することを目的とするものである。
で、被検液中に存在するＰＧを酵素的に定量するＰＧ酵
素的定量反応系による方法において、被検液中に存在す
る測定の妨害となる物質を除去して測定を正確に行う方
法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、被
検液中に存在するＰＧを酵素的に定量する酵素的定量反
応系による方法において、被検液中に混在するＰＧ酵素
的定量反応系の妨害因子を少なくともアルカリホスファ
ターゼ含有消去試薬にて前処理することを特徴とするＰ
Ｇの酵素的測定方法に関する。特に、被検液中に存在す
るＰＧをＧ３Ｐ−ＤＡＰの酵素的サイクリング反応を用
いて定量する酵素的測定方法において、被検液中に存在
するＧ３ＰまたはＤＡＰをあらかじめアルカリホスファ
ターゼ（ＡＬＰ）含有消去試薬により消去することから
なる被検液中のＰＧの定量方法に関する。
検液中に存在するＰＧを酵素的に定量する酵素的定量反
応系による方法において、被検液中に混在するＰＧ酵素
的定量反応系の妨害因子を少なくともアルカリホスファ
ターゼ含有消去試薬にて前処理することを特徴とするＰ
Ｇの酵素的測定方法に関する。特に、被検液中に存在す
るＰＧをＧ３Ｐ−ＤＡＰの酵素的サイクリング反応を用
いて定量する酵素的測定方法において、被検液中に存在
するＧ３ＰまたはＤＡＰをあらかじめアルカリホスファ
ターゼ（ＡＬＰ）含有消去試薬により消去することから
なる被検液中のＰＧの定量方法に関する。
【００１２】まず、本発明の対象とする被検液として
は、好ましくはＰＧを含有する羊水が挙げられる。この
羊水中には測定対象たるＰＧのほかに妨害因子となるＧ
３Ｐ、ＤＨＡやグリセロールを含むものであって、ＰＧ
測定における被検液に混在するＰＧ酵素的定量反応系の
妨害因子としてこれらの因子が挙げられる。
は、好ましくはＰＧを含有する羊水が挙げられる。この
羊水中には測定対象たるＰＧのほかに妨害因子となるＧ
３Ｐ、ＤＨＡやグリセロールを含むものであって、ＰＧ
測定における被検液に混在するＰＧ酵素的定量反応系の
妨害因子としてこれらの因子が挙げられる。
【００１３】またこのＰＧ酵素的定量反応系としては、
Ｇ３Ｐ−ＤＡＰの酵素的サイクリング反応が挙げられ、
その主たる酵素としてはＧＰＯとＧ３ＰＤＨとが挙げら
れ、その試薬組成物としては、特公平２−２０２３９号
公報を参照すればよい。より詳しくは、例えば被検液中
のＰＧをホスホリパーゼＤによりグリセロールを遊離せ
しめ、次いで遊離されたグリセロールをグリセロキナー
ゼとＡＴＰ，マグネシウムイオンの存在下にＧ３Ｐとな
す。または被検液中のＰＧをホスホリパーゼＣにてＧ３
Ｐを遊離せしめる。この遊離、生成したＧ３Ｐについて
Ｇ３Ｐ−ＤＡＰの酵素的サイクリング反応を用いて定量
する。
Ｇ３Ｐ−ＤＡＰの酵素的サイクリング反応が挙げられ、
その主たる酵素としてはＧＰＯとＧ３ＰＤＨとが挙げら
れ、その試薬組成物としては、特公平２−２０２３９号
公報を参照すればよい。より詳しくは、例えば被検液中
のＰＧをホスホリパーゼＤによりグリセロールを遊離せ
しめ、次いで遊離されたグリセロールをグリセロキナー
ゼとＡＴＰ，マグネシウムイオンの存在下にＧ３Ｐとな
す。または被検液中のＰＧをホスホリパーゼＣにてＧ３
Ｐを遊離せしめる。この遊離、生成したＧ３Ｐについて
Ｇ３Ｐ−ＤＡＰの酵素的サイクリング反応を用いて定量
する。
【００１４】次いで本発明におけるＡＬＰ含有消去試薬
としては、例えば少なくともＡＬＰ，グリセロールオキ
シダーゼ（ＧＯ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）を含有し
た試薬や少なくともＡＬＰ，ＧＯ，ＰＯＤおよび４ＡＡ
Ｐを含有した試薬が挙げられる。
としては、例えば少なくともＡＬＰ，グリセロールオキ
シダーゼ（ＧＯ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）を含有し
た試薬や少なくともＡＬＰ，ＧＯ，ＰＯＤおよび４ＡＡ
Ｐを含有した試薬が挙げられる。
【００１５】本発明においては、被検液の一定量を、ま
ず例えば37℃にて上記ＡＬＰ含有消去試薬にて一定時
間、例えば２分〜10分間前処理し、被検液中の妨害因子
を消去する。次いで前処理を終了した後ＡＬＰ含有消去
試薬の活性を止めるため反応停止剤を添加する。この反
応停止剤としては、少なくともＡＬＰ，ＧＯおよびＣＡ
Ｔを含有した試薬のＡＬＰ含有消去試薬の場合にはアジ
化ナトリウム，ＡＴＰが用いられ、また少なくともＡＬ
Ｐ，ＧＯ，ＰＯＤおよび４ＡＡＰを含有した試薬のＡＬ
Ｐ含有消去試薬の場合には水素供与体、例えばフェノー
ル、 3,5−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン
酸、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン
（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）− 3,5−ジメチルアニリン（ＭＡＯ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル
−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）− 3,5−
ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−
エチル−Ｎ−スルホプロピル− 3,5−ジメトキシアニリ
ン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ
−トルイジン（ＴＯＰＳ）が挙げられる。これらの反応
停止剤は、前処理した後単独にて前処理した被検液に添
加してもよく、またはＰＧを酵素的に定量するＰＧ酵素
的定量反応系の試薬組成とともに用いてもよく、反応停
止は30秒〜５分にて行われる。
ず例えば37℃にて上記ＡＬＰ含有消去試薬にて一定時
間、例えば２分〜10分間前処理し、被検液中の妨害因子
を消去する。次いで前処理を終了した後ＡＬＰ含有消去
試薬の活性を止めるため反応停止剤を添加する。この反
応停止剤としては、少なくともＡＬＰ，ＧＯおよびＣＡ
Ｔを含有した試薬のＡＬＰ含有消去試薬の場合にはアジ
化ナトリウム，ＡＴＰが用いられ、また少なくともＡＬ
Ｐ，ＧＯ，ＰＯＤおよび４ＡＡＰを含有した試薬のＡＬ
Ｐ含有消去試薬の場合には水素供与体、例えばフェノー
ル、 3,5−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン
酸、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン
（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）− 3,5−ジメチルアニリン（ＭＡＯ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル
−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）− 3,5−
ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−
エチル−Ｎ−スルホプロピル− 3,5−ジメトキシアニリ
ン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ
−トルイジン（ＴＯＰＳ）が挙げられる。これらの反応
停止剤は、前処理した後単独にて前処理した被検液に添
加してもよく、またはＰＧを酵素的に定量するＰＧ酵素
的定量反応系の試薬組成とともに用いてもよく、反応停
止は30秒〜５分にて行われる。
【００１６】次いで前処理した被検液について、ＰＧを
定量するもので、上記したＰＧ酵素的定量反応系による
方法を実施するものであって、特にＧ３Ｐ−ＤＡＰの酵
素的サイクリング反応を行うことが好適である。
定量するもので、上記したＰＧ酵素的定量反応系による
方法を実施するものであって、特にＧ３Ｐ−ＤＡＰの酵
素的サイクリング反応を行うことが好適である。
【００１７】
【作用】本発明者らは、検討を重ねた結果、従来とまっ
たく異なった観点から、被検液中に内在するＧ３Ｐおよ
びＤＡＰを予め消去し、ＰＧの定量を正確に行う方法を
見出した。
たく異なった観点から、被検液中に内在するＧ３Ｐおよ
びＤＡＰを予め消去し、ＰＧの定量を正確に行う方法を
見出した。
【００１８】すなわち、本発明は被検液にＡＬＰ，Ｇ
Ｏ，ＣＡＴを含有するＡＬＰ含有消去試薬を添加して被
検液中のＧ３Ｐをグリセロールに、またＤＡＰをジヒド
ロキシアセトンに変化させ、このグリセロールおよびジ
ヒドロキシアセトンをそれぞれＧＯおよびＣＡＴによっ
て［１］式の反応に関与しないグリセルアルデヒドおよ
びＨ2 Ｏ，Ｏ2 に導くものである。この反応を以下に示
す。
Ｏ，ＣＡＴを含有するＡＬＰ含有消去試薬を添加して被
検液中のＧ３Ｐをグリセロールに、またＤＡＰをジヒド
ロキシアセトンに変化させ、このグリセロールおよびジ
ヒドロキシアセトンをそれぞれＧＯおよびＣＡＴによっ
て［１］式の反応に関与しないグリセルアルデヒドおよ
びＨ2 Ｏ，Ｏ2 に導くものである。この反応を以下に示
す。
【００１９】
【化４】
【００２０】また本発明は被検液にＡＬＰ，ＧＯ，ＰＯ
Ｄ，４ＡＡＰを含有するＡＬＰ含有消去試薬を添加して
被検液中のＧ３ＰやＤＡＰを消去するに、上記反応にて
生成したＨ2 Ｏ2 をＰＯＤおよび４ＡＡＰにて無色物質
として反応に関与しないものとして反応系から消去する
ものである。この場合、目的とするＰＧの定量に当って
は、すでに添加したＰＯＤ，４ＡＡＰに上記した水素供
与体を加えることにより、ＰＧに応じて生成されたＨ2
Ｏ2 について発色反応をなし得、ＰＧの定量をなし得る
ものである。
Ｄ，４ＡＡＰを含有するＡＬＰ含有消去試薬を添加して
被検液中のＧ３ＰやＤＡＰを消去するに、上記反応にて
生成したＨ2 Ｏ2 をＰＯＤおよび４ＡＡＰにて無色物質
として反応に関与しないものとして反応系から消去する
ものである。この場合、目的とするＰＧの定量に当って
は、すでに添加したＰＯＤ，４ＡＡＰに上記した水素供
与体を加えることにより、ＰＧに応じて生成されたＨ2
Ｏ2 について発色反応をなし得、ＰＧの定量をなし得る
ものである。
【００２１】かかる方法により、被検液中のＧ３ＰやＤ
ＡＰはこのサイクリング反応に関与しない物質に変化
し、反応系外のものとなるので、目的物質であるＰＧを
サイクリング反応を用いて高感度に直接測定することが
できる。
ＡＰはこのサイクリング反応に関与しない物質に変化
し、反応系外のものとなるので、目的物質であるＰＧを
サイクリング反応を用いて高感度に直接測定することが
できる。
【００２２】本発明の方法は、被検液中のＧ３Ｐおよび
ＤＡＰを予め消去した後、そのまま引き続いてサイクリ
ング反応を用いて定量測定を行うことができるので、従
来、検体ブランクをとるために１検体で２回以上の測定
が必要であったのに比べて操作が簡単になり、しかも測
定結果が正確である。したがって、本発明の方法は特に
自動分析に極めて適している。
ＤＡＰを予め消去した後、そのまま引き続いてサイクリ
ング反応を用いて定量測定を行うことができるので、従
来、検体ブランクをとるために１検体で２回以上の測定
が必要であったのに比べて操作が簡単になり、しかも測
定結果が正確である。したがって、本発明の方法は特に
自動分析に極めて適している。
【００２３】
【実施例】本発明を実施例により説明する。 （実施例 １）下記の組成を有する測定用試薬を調製し
た。第１試薬 30mM ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 2mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 1mM コール酸 0.2% ミオイノシトール 0.1% 牛血清アルブミン 1.5mM ４アミノアンチピリン 0.1mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型 40単位／ml グリセロールオキシダーゼ 1000単位／ml カタラーゼ 200単位／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ 40単位／ml アルカリホスファターゼ ｐＨ 8.0
た。第１試薬 30mM ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 2mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 1mM コール酸 0.2% ミオイノシトール 0.1% 牛血清アルブミン 1.5mM ４アミノアンチピリン 0.1mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型 40単位／ml グリセロールオキシダーゼ 1000単位／ml カタラーゼ 200単位／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ 40単位／ml アルカリホスファターゼ ｐＨ 8.0
【００２４】第２試薬 80mM ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 1mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 4mM 塩化カルシウム 0.1% ポリオキシエチレンオクチルフェニルエ
ーテル 0.1% アジ化ナトリウム 1.5mM Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン 3mM アデノシン−５′−三リン酸 8単位／ml ペルオキシダーゼ 100単位／ml Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダ
ーゼ 8単位／ml ホスホリパーゼＤ 0.6単位／ml グリセロキナーゼ 2単位／ml 12−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ
スルホン酸） 1mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 4mM 塩化カルシウム 0.1% ポリオキシエチレンオクチルフェニルエ
ーテル 0.1% アジ化ナトリウム 1.5mM Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン 3mM アデノシン−５′−三リン酸 8単位／ml ペルオキシダーゼ 100単位／ml Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダ
ーゼ 8単位／ml ホスホリパーゼＤ 0.6単位／ml グリセロキナーゼ 2単位／ml 12−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ
【００２５】試料として２μＭのＰＧ水溶液に０〜 500
μＭのＧ３Ｐを添加したものを用い、各試料中のＰＧの
測定を行って、Ｇ３Ｐが存在することによるＰＧ測定値
への影響を調べた。測定は下記の方法により行った。す
なわち、試料50μｌに上記第１試薬 0.5mlを加え、37℃
で５分間加温した後、上記第２試薬を加え、さらに37℃
で５分間加温し、試薬盲検を対照として570nm での吸光
度を測定した。なお、試薬盲検は、試料として精製水50
μｌを用いて同様の操作を行った。
μＭのＧ３Ｐを添加したものを用い、各試料中のＰＧの
測定を行って、Ｇ３Ｐが存在することによるＰＧ測定値
への影響を調べた。測定は下記の方法により行った。す
なわち、試料50μｌに上記第１試薬 0.5mlを加え、37℃
で５分間加温した後、上記第２試薬を加え、さらに37℃
で５分間加温し、試薬盲検を対照として570nm での吸光
度を測定した。なお、試薬盲検は、試料として精製水50
μｌを用いて同様の操作を行った。
【００２６】（比較例１）下記の組成を有する測定用試
薬を調製した。 第１試薬（ＰＧ測定用） 30mM ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 7mM 塩化カルシウム 3mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 1mM コール酸 1mM 塩化マグネシウム 5mM 硫酸アンモニウム 0.1% ミオイノシトール 1.5mM ４アミノアンチピリン 13mM アデノシン−５′−三リン酸 1mM エチレンジアミン四酢酸 0.1mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型 25単位／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ 第１試薬（検体ブランク用） 上記第１試薬（ＰＧ測定用）から７mMの塩化カルシウム
を除いたもの。
薬を調製した。 第１試薬（ＰＧ測定用） 30mM ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 7mM 塩化カルシウム 3mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 1mM コール酸 1mM 塩化マグネシウム 5mM 硫酸アンモニウム 0.1% ミオイノシトール 1.5mM ４アミノアンチピリン 13mM アデノシン−５′−三リン酸 1mM エチレンジアミン四酢酸 0.1mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型 25単位／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ 第１試薬（検体ブランク用） 上記第１試薬（ＰＧ測定用）から７mMの塩化カルシウム
を除いたもの。
【００２７】第２試薬 50mM ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 0.1% アジ化ナトリウム 4mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 0.3mM 塩化カルシウム 0.1% ポリオキシエチレンオクチルフェニルエ
ーテル 1.5mM Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン 0.1mM 塩化カリウム 8単位／ml ペルオキシダーゼ 0.6単位／ml グリセロキナーゼ 8単位／ml ホスホリパーゼＤ 2単位／ml 12−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ 100単位／ml Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダ
ーゼ
スルホン酸） 0.1% アジ化ナトリウム 4mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 0.3mM 塩化カルシウム 0.1% ポリオキシエチレンオクチルフェニルエ
ーテル 1.5mM Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン 0.1mM 塩化カリウム 8単位／ml ペルオキシダーゼ 0.6単位／ml グリセロキナーゼ 8単位／ml ホスホリパーゼＤ 2単位／ml 12−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ 100単位／ml Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダ
ーゼ
【００２８】実施例１と同じ試料を用い、上記従来試薬
により各試料中のＰＧの測定を行って、Ｇ３ＰのＰＧ測
定値への影響を調べた。測定は次のようにして行った。
実施例１と同様に試料50μｌに上記第１試薬（ＰＧ測定
用） 0.5mlを加え、37℃で５分間加温した後、上記第２
試薬を加え、さらに37℃で５分間加温し、試薬盲検を対
照として 570nmでの吸光度を測定した。また、第１試薬
（ＰＧ測定用）を第１試薬（検体ブランク用）に替えて
まったく同様に行い、吸光度を測定した。両測定値の差
（ＰＧ測定値−検体ブランク値）からＰＧ値を求めた。
により各試料中のＰＧの測定を行って、Ｇ３ＰのＰＧ測
定値への影響を調べた。測定は次のようにして行った。
実施例１と同様に試料50μｌに上記第１試薬（ＰＧ測定
用） 0.5mlを加え、37℃で５分間加温した後、上記第２
試薬を加え、さらに37℃で５分間加温し、試薬盲検を対
照として 570nmでの吸光度を測定した。また、第１試薬
（ＰＧ測定用）を第１試薬（検体ブランク用）に替えて
まったく同様に行い、吸光度を測定した。両測定値の差
（ＰＧ測定値−検体ブランク値）からＰＧ値を求めた。
【００２９】上記実施例１および比較例において得られ
た結果を表１に示す。
た結果を表１に示す。
【表１】
【００３０】表１から明らかなように、従来の試薬によ
り測定した場合はＧ３Ｐの影響を大きく受け、ＰＧ測定
に大きな誤差が生ずるが、本発明の試薬を用いて測定し
た場合はＧ３Ｐの影響をほとんど受けていないことが分
かる。
り測定した場合はＧ３Ｐの影響を大きく受け、ＰＧ測定
に大きな誤差が生ずるが、本発明の試薬を用いて測定し
た場合はＧ３Ｐの影響をほとんど受けていないことが分
かる。
【００３１】（実施例 ２）試料としてヒト羊水を用
い、それ以外は実施例１とまったく同様にしてＰＧの測
定を行った。また、比較のためこの試料について、上記
比較例とまったく同様にしてＰＧの測定を行った。結果
を表２に示す。また、この実験における本発明の方法と
従来の方法のそれぞれのＰＧ定量結果の相関図（No. ５
を除く）を図１に示す。
い、それ以外は実施例１とまったく同様にしてＰＧの測
定を行った。また、比較のためこの試料について、上記
比較例とまったく同様にしてＰＧの測定を行った。結果
を表２に示す。また、この実験における本発明の方法と
従来の方法のそれぞれのＰＧ定量結果の相関図（No. ５
を除く）を図１に示す。
【００３２】
【表２】 表２から、従来の方法では検体ブランクの大きな場合
（No. ５）にはＰＧ値が正確に測定されていないことが
分かる。
（No. ５）にはＰＧ値が正確に測定されていないことが
分かる。
【００３３】なお、以上の実施例ではいずれもＰＧの定
量について説明したが、他の酵素的サイクリング反応に
おいても、試料に内在する妨害物質を当該サイクリング
反応系外の物質に酵素を使って変化させればよく、本発
明はＰＧの定量に限らず種々の酵素的サイクリング反応
による測定に適用することができる。
量について説明したが、他の酵素的サイクリング反応に
おいても、試料に内在する妨害物質を当該サイクリング
反応系外の物質に酵素を使って変化させればよく、本発
明はＰＧの定量に限らず種々の酵素的サイクリング反応
による測定に適用することができる。
【００３４】（実施例 ３）下記の組成を有する測定用
試薬を調製した。 第１試薬 30mM ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 2mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 1mM コール酸 0.2% ミオイノシトール 0.1% 牛血清アルブミン 1.5mM ４アミノアンチピリン 0.1mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型 40単位／ml グリセロールオキシダーゼ 16単位／ml ペルオキシダーゼ 200単位／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ 40単位／ml アルカリホスファターゼ
試薬を調製した。 第１試薬 30mM ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 2mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 1mM コール酸 0.2% ミオイノシトール 0.1% 牛血清アルブミン 1.5mM ４アミノアンチピリン 0.1mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型 40単位／ml グリセロールオキシダーゼ 16単位／ml ペルオキシダーゼ 200単位／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ 40単位／ml アルカリホスファターゼ
【００３５】第２試薬 80mM ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタン
スルホン酸） 1mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 4mM 塩化カルシウム 0.1% ポリオキシエチレンオクチルフェニルエー
テル 0.1% アジ化ナトリウム 1.5mM Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−アニシジン 3mM アデノシン−５′−三リン酸 100単位／ml グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ 8単位／ml ホスホリパーゼＤ 0.6単位／ml グリセロキナーゼ 2単位／ml 12−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ
スルホン酸） 1mM 塩化マグネシウム 0.2mM エチレンジアミン四酢酸 4mM 塩化カルシウム 0.1% ポリオキシエチレンオクチルフェニルエー
テル 0.1% アジ化ナトリウム 1.5mM Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−アニシジン 3mM アデノシン−５′−三リン酸 100単位／ml グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ 8単位／ml ホスホリパーゼＤ 0.6単位／ml グリセロキナーゼ 2単位／ml 12−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ
【００３６】０，１，２，３，４，５μmol ／ｌＰＧ水
溶液、各々50μｌに上記第１試薬を加え37℃にて５分間
加温した後、上記第２試薬 0.5mlを加え、さらに37℃に
て加温して、第２試薬添加後の 542nmにおける３分目と
５分目の吸光度を読み取り、その差を求めた。次に、各
々に 200μmol ／ｌのグリセロール−３−リン酸（Ｇ３
Ｐ）を含む０，１，２，３，４，５μmol ／ｌＰＧ水溶
液についても、同様の操作を行い、吸光度差を求めた。
その結果、図２に示すように、Ｇ３Ｐ含有のＰＧ水溶液
についてもＧ３Ｐの影響を全く受けずに測定されている
ことが示された。
溶液、各々50μｌに上記第１試薬を加え37℃にて５分間
加温した後、上記第２試薬 0.5mlを加え、さらに37℃に
て加温して、第２試薬添加後の 542nmにおける３分目と
５分目の吸光度を読み取り、その差を求めた。次に、各
々に 200μmol ／ｌのグリセロール−３−リン酸（Ｇ３
Ｐ）を含む０，１，２，３，４，５μmol ／ｌＰＧ水溶
液についても、同様の操作を行い、吸光度差を求めた。
その結果、図２に示すように、Ｇ３Ｐ含有のＰＧ水溶液
についてもＧ３Ｐの影響を全く受けずに測定されている
ことが示された。
【００３７】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
酵素的サイクリング反応を利用して生体液中の成分を測
定する場合に、生体液に存在して従来の方法ではサイク
リング反応の故に完全に消去することができなかった測
定の妨害となる物質を、サイクリング反応の系外の物質
に変化させ、そのままサイクリング反応を続けて定量測
定を行うことができる。したがって、検体ブランクのた
めの測定も必要がなくなり、操作が簡単で、特に自動分
析に極めて適している。また測定結果も正確である。
酵素的サイクリング反応を利用して生体液中の成分を測
定する場合に、生体液に存在して従来の方法ではサイク
リング反応の故に完全に消去することができなかった測
定の妨害となる物質を、サイクリング反応の系外の物質
に変化させ、そのままサイクリング反応を続けて定量測
定を行うことができる。したがって、検体ブランクのた
めの測定も必要がなくなり、操作が簡単で、特に自動分
析に極めて適している。また測定結果も正確である。
【図１】本発明の実施例および従来の方法におけるＰＧ
定量結果の相関図。
定量結果の相関図。
【図２】本発明の他の実施例におけるＰＧ水溶液および
Ｇ３Ｐ含有ＰＧ水溶液についてのＰＧ定量結果を示す
図。
Ｇ３Ｐ含有ＰＧ水溶液についてのＰＧ定量結果を示す
図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 6807−4Ｂ
Claims (10)
- 【請求項１】 被検液中に存在するホスファチジルグリ
セロール（ＰＧ）を酵素的に定量するＰＧ酵素的定量反
応系による方法において、被検液に混在するＰＧ酵素的
定量反応系の妨害因子を少なくともアルカリホスファタ
ーゼ含有消去試薬にて前処理することを特徴とする被検
液のＰＧの酵素的測定方法。 - 【請求項２】 ＰＧ酵素的定量反応系による方法が、グ
リセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）−ジヒドロキシアセ
トンリン酸（ＤＡＰ）の酵素的サイクリング反応である
請求項１記載の酵素的測定方法。 - 【請求項３】 グリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）−
ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＡＰ）の酵素的サイク
リング反応が、ＰＧから遊離されたグリセロールをグリ
セロキナーゼ酵素作用にてＧ３Ｐとなすか、またはＰＧ
からＧ３Ｐを遊離し、このＧ３Ｐをグリセロール−３−
リン酸オキシダーゼおよびグリセロール−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼにてＧ３Ｐ−ＤＡＰの酵素的サイクリン
グ反応である請求項２記載の酵素的測定方法。 - 【請求項４】 被検液に混在するＰＧ酵素的定量反応系
の妨害因子が、少なくともＧ３ＰまたはＤＡＰである請
求項１記載の酵素的測定方法。 - 【請求項５】 アルカリホスファターゼ含有消去試薬
が、少なくともアルカリホスファターゼ、グリセロール
オキシダーゼおよびカタラーゼを含有した試薬である請
求項１記載の酵素的測定方法。 - 【請求項６】 前処理の反応停止剤が、アジ化ナトリウ
ム、アデノシントリホスフェートである請求項１記載の
酵素的測定方法。 - 【請求項７】 アルカリホスファターゼ含有消去試薬
が、少なくともアルカリホスファターゼ、グリセロール
オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび４−アミノアン
チピリンを含有した試薬である請求項ｌ記載の酵素的測
定方法。 - 【請求項８】 前処理の反応停止剤が水素供与体であ
り、かつＰＧの検出がペルオキシダーゼ、４−アミノア
ンチピリン、水素供与体の存在下に過酸化水素の発色反
応によってなされる請求項７記載の酵素的測定方法。 - 【請求項９】 水素供与体が、フェノール、 3,5−ジク
ロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）− 3,5−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ
−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）− 3,5−ジメトキシア
ニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル− 3,5−ジメトキシアニリン（ＤＡＰ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジ
ン（ＴＯＰＳ）からなる群より選ばれたものである請求
項７記載の酵素的測定方法。 - 【請求項１０】 被検液が、羊水である請求項１記載の
酵素的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34290891A JPH05168495A (ja) | 1991-12-25 | 1991-12-25 | 酵素的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34290891A JPH05168495A (ja) | 1991-12-25 | 1991-12-25 | 酵素的測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05168495A true JPH05168495A (ja) | 1993-07-02 |
Family
ID=18357454
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34290891A Withdrawn JPH05168495A (ja) | 1991-12-25 | 1991-12-25 | 酵素的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05168495A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999061657A1 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-02 | Roche Diagnostics Corporation | Liquid reagent set for l-lactate determination |
-
1991
- 1991-12-25 JP JP34290891A patent/JPH05168495A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999061657A1 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-02 | Roche Diagnostics Corporation | Liquid reagent set for l-lactate determination |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990311 |