JPH0513579B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体
を定量分析するための免疫分析法の改良に関す
る。

（従来の技術） 試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分
析には、例えばラジオイムノアツセイ（以下、
RIAと記す）が用いられる。しかし、RIAでは放
射性元素を用いるため、専用の機器を設置し、資
格を有するオペレータが操作を行わなければなら
ず、しかも廃棄物の処理等にも注意を要するとい
う問題がある。

また、その他の分析方法として、例えば免疫電
気泳動が知られている。しかし、免疫電気泳動で
は測定に長時間を要するうえ、感度が低く、被検
物質がごく微量しか含まれていない場合には適用
することができないという問題がある。

そこで、本発明者らは先に特開昭60−117159号
において、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化
し、内部に親水性の標識物質を封入したりポソー
ム試薬を開示した。この試薬を用いた免疫分析方
法は以下のようなものである。すなわち、抗原又
は抗体が存在する試料中に前記リポソーム試薬を
加え、これと別に補体を加えると、抗原−抗体反
応及びそれに伴う補体及び第２抗体の作用によつ
てリポソームが破壊され、封入されていた標識物
質（例えば蛍光性化学物）が流出する。この流出
した標識物質の量と、試料中の被検物質の量との
間には相関関係があるので、流出した標識物質を
所定の分析方法（例えば蛍光分析）によつて定量
することにより、被検物質を定量することができ
る。以下この免疫分析法をマイクロカプセルイム
ノアツセイ（MCIA）と称する。この試薬を用い
れば、RIAのような問題が生じることはなく、免
疫分析の簡便化が期待できる。

このMCIAにおいてリポソーム膜の溶解量を決
定するのは、リポソーム量を一定とすると試料
（血清等）中の抗原濃度、第２抗体濃度及び補体
濃度である。また試料中の抗原濃度が第２抗体濃
度及び補体濃度に比べて十分に低い場合には、試
料中の抗原量に応じてリポソーム膜の溶解が増加
してより多くの標識物質が流出するようになる。

（発明が解決しようとする問題点） ところでこのようなMCIAにおいて、試料中の
抗原濃度が大過剰になつた場合には、リポソーム
膜の溶解量が減少するプロゾーン現象が生ずると
いう問題がある。

第４図はこの様子を示すグラフで縦軸はリポソ
ーム膜の溶解量、横軸は抗原量（抗原濃度）を表
わしている。領域イにおいては抗原量の増加に比
例して溶解量が増加する関係にあるが、溶解量が
ピーク点を越えた領域ロにおいては抗原量の増加
に反比例して溶解量が減少するいわゆるプロゾー
ン現象が発生する。このため異なつた抗原量X₁，
X₂に対して同一量の溶解量Ｙが示されることに
なるので、リポソーム膜の溶解量の測定を正確に
行うことができなくなる。このようなプロゾーン
現象は以下のような理由によつて発生する。

すなわち、試料中の抗原濃度が領域イを越える
ような過剰になると、抗原はリポソーム膜上の抗
体を飽和するが、なお余つて反応液中で遊離した
状態で存在するようになる。この状態で第２抗体
及び補体を添加すると、過剰の抗原はこの第２抗
体と結合して可溶性の抗原抗体結合物を形成する
ようになる。一方、補体はこの可溶性抗原抗体結
合物によつて消費されるようになり、この結果本
来のリポソーム膜上で活性化される補体量が減少
するので、見掛け上測定対象の抗原が少ない場合
のように、リポソーム膜の溶解量が減少すること
になり、領域ロのようなプロゾーン現象が発生す
る。このプロゾーン現象はリポソーム膜の溶解量
の経時変化からは検出することができない。

本発明は以上のような事情に対処して成された
もので、MCIAにおける抗原過剰域を検出するこ
とができる免疫分析法を提供することを目的とす
るものである。

［発明の構成］ （問題点を解決するための手段） 上記目的を達成するために本発明は、リン脂質
及び糖脂質のうち少なくともいずれか一方を組成
とするリポソームと、該リポソーム中に封入され
た標識物質と、前記リポソームに固定化された抗
体若しくは抗体の一部とからなる免疫分析試薬を
用いる免疫分析法において、前記リポソームの膜
表面における抗原−抗体反応によるリポソームの
凝集の経時変化を測定することにより抗原過剰域
を検出することを特徴とするものである。

（作 用） リポソームの膜表面における抗原−抗体反応に
よるリポソームの凝集の経時変化は、抗原濃度が
比較的小さい場合と、適性である場合と、過剰で
ある場合とでは、互いに異なつたものとなる。従
つて、この凝集パターンに基いて抗原過剰域を検
出することが可能となる。

（実施例） 実施例の説明に先立ち本発明の原理について説
明する。

試料中の被検物質としての抗原が高分子（分子
量が10000以上）の場合、一般にそれ自身の表面
にある抗原決定部位は複数存在する。リポソーム
膜表面に感作された前記抗原に対する抗体がポリ
クロナールであるとすると、このリポソームと抗
原が接触した際両者間で凝集反応が生じ、この凝
集速度は抗原量に比例する。一方、リポソーム膜
表面に感作された抗体がモノクロナールである場
合には、前記のような凝集反応は生じないが、ポ
リクロナールな第２抗体を反応液に添加すること
により凝集反応を生じさせることができる。すな
わち、ポリクロナールである第２抗体は、抗原の
表面に存在する複数の抗原決定部位にそれぞれ結
合する各抗体の混合物であるため、抗原−抗体反
応により第２抗体に複数の抗原が結合して凝集反
応が生ずる。この第２抗体は本来次の補体による
膜溶解のために添加されるものであるが、同時に
凝集反応にも寄与させることができる。

従つて前記のようにリポソームと抗原との間の
凝集反応を利用し、リポソームの凝集の度合を測
定し凝集のパターンを得ることにより抗原過剰域
を検出することが可能となる。この場合凝集速度
の測定は周知の散乱測定法又は比濁法（吸光度測
定法）等を利用することにより容易に行うことが
できる。リポソームに封入する標識物質として蛍
光性物質［例えばローダミンＢ（又はカルボキシ
フルオレツセイン）］を用いた場合、リポソーム
膜の溶解量はこの蛍光物質の流出量に基いて測定
することができる。このように抗原量に対する標
識物質（例えば蛍光性物質）の流出量の測定及び
凝集速度（例えば散乱の度合）の測定は同時に、
又は別々に行うことができる。

第５図はこのようにして、第４図のグラフの領
域を抗体過剰域、適正測定域、抗原過剰域
の３つの領域に区別した結果を示すものである。
すなわち、前記に基き(A)蛍光測定及び(B)散乱測定
の各タイムコースを設定し、測定によつて明瞭に
区別できる３つの領域を得たものである。第５図
から明らかなように、抗体過剰域においては蛍
光物質の流出量は少なくなつている（応答性は
小）と共に散乱の度合も少なくなつている（応答
性は小）。また適正測定域においては蛍光測定
の応答性は大きくなり、一方散乱測定の応答性は
一旦増加するが溶解によつて急速に減少してい
る。さらに抗原過剰域においては蛍光測定の応
答性は小さくなつており、一方散乱測定の応答性
は急激に大きくなつた後溶解によつて徐々に小さ
くなつている。すなわち散乱測定によつて得られ
た３つの凝集パターンB₁，B₂，B₃のうち、B₃の
ように凝集速度が急激に増加した後、徐々に減少
するパターンを得ることより、抗原過剰域である
プロゾーン現象を検出することができる。すなわ
ちこのパターンB₃はB₂に比べ、蛍光測定の応答
性が小の基で凝集速度が増加した後徐々に減少す
る点で異なつており、プロゾーン現象の特徴を示
している。

以下、本発明の実施例を説明する。

本実施例において用いた試薬のうち、ジパルミ
トイルホスフアチジルエタノールアミン
（DPPE）、ジパルミトイルホスフアチジルコリン
（DPPC）、コレステロール及びジチオスレイトー
ル（DTT）はシグマ社製のものを用いた。又、
Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオネート（SPDP）及びセフアデツクスＧ
−25フアインはフアルマシア社製のものを用い
た。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに使用
した。尚、水は全てイオン交換水を用いた。

官能性リン脂質：DPPE−ジチオピリジルプ
ロピオン酸アミド（DPPE−DTP）の調整 密栓付三角フラスコにDPPE70mgを分取し、
クロロホルム／メタノール（５：１）混合溶媒
25mlに溶解した。次に、トリエタノールアミン
60μ及びSPDP50mgを添加し、窒素置換した
後、室温で１時間反応させてジチオピリジルプ
ロピオン酸アミド（DTP）を導入した。続い
て、ロータリーエバポレータにより溶媒を除去
した。次いで、乾燥物をクロロホルム／メタノ
ール（10：１）混合溶媒に溶解した後、シリカ
ゲルカラムを用いて精製し、DPPE−DTPの
分画を回収した。更に、ロータリーエバポレー
タにより約５mlまで濃縮した。DPPE−DTP
の収率は80乃至95％であつた。これを窒素封入
下−20℃で保存した。

この反応によりDPPEの導入されたジチオピ
リジル基が固定化用官能基となる。

リポソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロ
ホルム／メタノール（２／１）混合溶媒に溶解
した。

５ｍＭのDPPC200μ、10ｍＭのコレステロ
ール100μ及び１ｍＭのDPPE−DTP（で得
られた官能性リン脂質）50μを10ml容量のナ
ス型フラスコに入れ、更に、クロロホルム２ml
を加えてよく混合した。次に、約40℃の水浴中
でロータリーエバポレータにより溶媒を除去し
た。再びクロロホルム２mlを加えて充分に撹拌
した後、再度ロータリーエバポレータにより溶
媒を除去した。この操作を数回繰り返すと、フ
ラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。続いて、
フラスコをデシケータ中に移して真空ポンプで
約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。

次いで、0.2MのローダミンＢ（シグマ社製、
PH7.4、浸透圧280ｍOs mol：以下RBと記す） 100μを添加し、フラスコ内部を窒素で置
換した後、密栓して約60℃の水浴中に約１分間
浸漬した。続いて、Vortexミキサーを用い、
フラスコ壁面の脂質薄膜が完全に消失するまで
フラスコを激しく振とうした。この操作により
リポソーム懸濁液が調製された。更に、リポソ
ーム懸濁液に0.01MのHEPES緩衝液（0.85％
NaCl含有、PH7.45：以下、HBSと記す）を少
量添加した後、全て遠心チユーブに移し、４℃
において27000×ｇで20分間遠心する操作を数
回繰り返した。最後に１mlのHBSに懸濁させ
た。

抗ヒトAFP抗体の修飾 １mg／mlの抗ヒトAFP抗体２mlをHBSで希
釈し、10ｍＭのSPDPエタノール溶液10μを
添加して窒素置換した後、室温で30分間反応さ
せ、抗ヒトAFP抗体にジチオピリジル基を導
入した。次に、予め0.1Mの酢酸緩衝液（0.85
％NaCl含有、PH4.5で平衡化したセフアデツク
スＧ−25フアインカラム（ゲル体積約15ml）を
用いたゲル濾過により未反応のSPDPを除去し
て精製し、タンパク質分画のみを回収した。

次いで、この分画にDTT約20mgを加え、窒
素置換後、室温で20分間反応させ、ジオピリジ
ル基をSH基と置換して修飾した。続いて、
HBSで平衡化したセフアデツクスＧ−25フア
インカラムを用いたゲル濾過によりDTTを除
去して精製し、タンマク質分画のみを回収し
た。

抗ヒトAFP抗体固定化リポソームの調製 で得られたリポソーム懸濁液１mlを４℃に
おいて27000×ｇで20分間遠心したリポソーム
沈査と、で得られた0.1ｇタンパク質／mlの
修飾された抗ヒトAFP抗体溶液２mlとを混合
し、窒素置換した後、密栓して20℃でゆつくり
振とうしながら、１晩反応させた。次に、
HBSで遠心洗浄して未反応の抗体を除去した。

更に、27000×ｇで20分間遠心したリポソー
ム沈査の占める質重量を測定し、１質重量％濃
度になるようにGVB⁺（GVB^-に0.5ｍＭの
MgCl₂水溶液及び0.15ｍＭのCaCl₂水溶液を含
有したもの）で希釈した。そして、0.05％濃度
となるようにアジ化ナトリウムを添加し、４℃
で保存した。

免疫分析試薬によるヒトAFP濃度の検量線
作成遊離のウサギ抗ヒトAFP抗体を用いたサ
ンドイツチアツセイにより以下のようにしてヒ
トAFP濃度を定量し、検査線を作成した。

０乃至100000nｇ／mlの範囲で濃度を変化さ
せたヒトAFP40μに、GVB^-で10倍希釈して
リポソーム試薬の濃度を0.1重量％とした免疫
分析試薬40μを添加し、37℃において10分間
反応させた。

次に予めGVB⁺で0.1mg／mlとなるように希
釈したウサギ抗ヒトAFP抗体（Dako社製）
100μ及びGVB⁺で希釈した補体（12CH₅₀）
100μを添加し、37℃において30分間反応さ
せた。各濃度のヒトAFP溶液について、流出
したRB量を蛍光分光光度計により励起波長
582nｍ、蛍光波長602nｍの条件で測定した。

この測定に基いて、抗体固定化リポソームの
補体に対する安定性の影響を除去するために次
式により相対蛍光強度を測定した。

相対蛍光強度＝Fe−Fo／Fa−Fo×100 ここで、Fe；実測した蛍光強度、Fo：抗原
を除いた時（リポソームが全く破壊されていな
い時）の蛍光強度、Fa：脱イオン水を添加し
リポソームを全て破壊した時の蛍光強度、であ
る。

なお、上記のようにリポソーム試薬の濃度を
0.1質重量％とした場合、リポソームを100％破
壊した時のRB濃度（蛍光強度から換算）は、
５×10^-5Mであつた。

上記のようにして第１図のようにヒトAFP
濃度と相対蛍光強度との関係を示す検査線を得
た。

第１図から明らかなように本システムにおい
てはAFP1.000nｇ／ml以上ではリポソームから
のマーカー溶出率の低下減少（プロゾーン現
象）が認められた。

免疫反応に伴うマーカー溶出及びリポソーム
凝集のタイムコース測定 で得られた抗ヒトAFP抗体感作リポソー
ムを用い、に示した方法によりヒトAFPに
よる免疫反応を試みた。但し、今回は、次の２
つの系につき検討した。すなわち第１の系では
蛍光光度計を用いAFP各濃度におけるマーカ
ー遊出の経時変化を調べ、第２の系では分光光
度計を用い、AFP各濃度におけるリポソーム
凝集の経時変化を調べた。この場合、リポソー
ムの凝集は450nｍにおける透過率の変化でも
つて表示した。反応は測光用キユベツト内で行
わせ、キユベツト自体をそれぞれ37℃に恒温
し、第２抗体及び補体添加後30分間にわたりそ
れぞれの経時変化を調べた。その結果を第２図
及び第３図に示した。

第２図において、マーカー遊出率の経時変化
のみからは、プロゾーン現象は検出不可能であ
つた。しかしながら、第３図から明らかなよう
に、リポソームの凝集を吸光度変化で追跡する
事により抗原であるAFPが過剰にあるか否か
を見分ける事が可能となつた。

［発明の効果］ 以上述べたように本発明によれば、MCIAにお
ける抗原過剰域を検出することができるので、リ
ポソーム膜の溶解量の測定を正確に行え、MCIA
の利点を活かした免疫分析を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図はいずれも本発明実施例によ
つて得られた特性図、第４図は本発明の背景を説
明するための特性図、第５図は本発明の原理を説
明するための特性図である。 ……抗体過剰域、……適正測定域、……
抗原過剰域、B₁，B₂，B₃……凝集の度合を示す
パターン図。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれ
   か一方を組成とするリポソームと、該リポソーム
   中に封入された標識物質と、前記リポソームに固
   定化された抗体若しくは抗体の一部とからなる免
   疫分析試薬を用いる免疫分析法において、前記リ
   ポソームの膜表面における抗原−抗体反応による
   リポソームの凝集の経時変化を測定することによ
   り抗原過剰域を検出することを特徴とする免疫分
   析法。 ２ 疑集の経時変化の測定と同時に、前記リポソ
   ーム中に封入された標準物質の流出量を測定する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免
   疫分析法。 ３ リポソーム膜表面における抗原−抗体反応に
   よる膜溶解が補体活性化に基いて生ずる特許請求
   の範囲第２項記載の免疫分析法。 ４ 抗原−抗体反応の際にリポソーム膜表面に固
   定化した抗体と共に目的抗原と結合可能な第２の
   抗体を反応液中に添加する特許請求の範囲第１項
   又は第２項記載の免疫分析法。