JPH0511192A - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ピンホールを用いなくても、試料面からのピ
ントの合った情報のみを検出し、鮮明な試料の画像を形
成することのできるレーザ走査顕微鏡を得ること。 【構成】 コンフォーカル型レーザ走査顕微鏡におい
て、試料面からの戻り光の結像位置に複屈折性と２次以
上の非線形光学定数を有する光学媒質を配置し、該光学
媒質から発生する高調波を検出して画像を形成する検出
手段を備える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えば生体試料等の観
察に用いるレーザ走査顕微鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】現在、生物試料の観察や、微細な機械構
造物の検査等に用いる図２に示すようなコンフォーカル
型レーザ走査顕微鏡（以下、ＣＬＳＭと記す）が注目さ
れている。

【０００３】図において、レーザ光源１１からのレーザ
光は、コリメータレンズ１２で略平行光となってハーフ
ミラー１３に入射し、ハーフミラー１３によって反射さ
れた後、スキャニングデバイス１４，対物レンズ１５を
介して試料１６表面上にスポット状に照射される。

【０００４】このレーザスポットは、スキャニングデバ
イス１４によって試料１６表面上をＸーＹ方向に走査す
る。試料面１６上で反射した戻り光束は、再び対物レン
ズ１５，スキャニングデバイス１４とハーフミラー１３
を透過した後、集光レンズ１７によって結像され検出器
１９に達する。

【０００５】このようなＣＬＳＭの特徴は、戻り光の結
像点にピンホール１８を設け、試料表面上の走査点の周
囲からの戻り光や、ピントのズレた所からの戻り光を遮
蔽することによって、走査点の像に周りのボケた像が重
なることを回避していることである。

【０００６】従って、一定距離にある試料部分の、入射
光軸に対して垂直な平面の像のみが得られ、その平面よ
り高低差のある部分のボケた像が重なって見えることは
ない。例えば、生物観察用の落射型蛍光顕微鏡で細胞を
観察する場合、細胞の任意の位置の鮮明な断面図が得ら
れるのである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】このようなＣＬＳＭで
は、試料面上の走査点から戻ってくる戻り光のスポット
がすべてピンホール位置にこなければ試料の鮮明な画像
を得ることはできない。しかしながら、従来のＣＬＳＭ
ではそれは非常に困難であった。

【０００８】例えば蛍光顕微鏡の場合、行きの励起光と
戻り光である蛍光との波長が異なるため、対物レンズに
よる色収差が生じてしまい、結像点が常に一定ではなく
少なからず移動してしい、この移動範囲が望ましいピン
ホールのサイズより大きいという問題がある。もし前記
移動範囲に合せた大きいピンホールにしてしまうと、前
述したようなＣＬＳＭの特徴である効果はなくなってし
まう。

【０００９】また、たとえ戻り光が行きの光と同じ波長
であるとしても、従来のＣＬＳＭでは、戻り光のスポッ
トをピンホールに導くため、戻り光が再び走査手段を通
る構成にしなければならなかった。

【００１０】ミラーの振動を利用してレーザ光を振るこ
とによりレーザスポットを走査させる方法では、戻り光
のスポットを再びミラーを介してピンホール位置へ導く
ことは可能であるが、ビデオレート（１画面を１／３０
sec で形成）での像形成を考慮した場合、この振動スピ
ードは遅すぎるため、現在では高速走査に不可欠な音響
光学素子（以下、ＡＯＤと記す）を用いた光学系が検討
されている。

【００１１】しかしながら、従来のＣＬＳＭ光学系での
実際の使用にあたって、ＡＯＤは偏光等の選択性を有し
ているため、ＡＯＤを介して往復してきた戻り光のスポ
ットを常にピンホール上へ正確に導くにはやはり不都合
な点が多かった。また、蛍光顕微鏡において色収差の大
きいＡＯＤが走査手段として使用できないことは言うま
でもない。

【００１２】このように、従来のＣＬＳＭの構成におけ
る問題点は、全ての戻り光のスポットが所定の位置に設
けられたピンホールを通過せねばならないという点に起
因する。本発明は、ＣＬＳＭ光学系においてピンホール
を用いることなく、戻り光のスポットがどこに移動しよ
うともその情報をあたかもピンホールを通して検出した
如く検出することができるレーザ走査顕微鏡を得ること
を目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、請求項１に記載の発明に係るレーザ走査顕微鏡で
は、レーザ光源と、該レーザ光源からの光を試料面状に
スポット状に絞り込む光学系と、該レーザスポットによ
って試料面上を走査するための走査手段とを備えたコン
フォーカル型レーザ走査顕微鏡において、前記試料面か
らの戻り光の結像位置に配置された複屈折性と２次以上
の非線形光学定数を有する光学媒体と、該光学媒体から
発生する高調波を検出して画像を形成する検出手段とを
備えた。

【００１４】

【作用】本発明は、コンフォーカル型レーザ走査顕微鏡
の光学系において、試料面からの戻り光の結像位置に複
屈折性と２次以上の非線形光学定数を有する光学媒体を
配置するものである。

【００１５】ここで、２次の非線形光学効果を例にとっ
て本発明で用いられる光学媒体の作用を説明する。入射
光（基本波）の非線形光学媒質による第２高調波への変
換効率ηは入射光（基本波）強度に比例し、発生する第
２高調波の強度は入射強度の２乗に比例する。

【００１６】これは入射光の全エネルギーが一定であれ
ば、光を微小なスポットに絞り込むほど第２次高調波の
発生が大きくなり、逆に照射面積が大きいほど第２高調
波の発生は小さくなることを意味する。

【００１７】本発明は、このような非線形光学媒質を試
料面と共役な位置に設置し、ピントが合った状態では該
媒質中のレーザスポットが小さくなると共に高調波の発
生が最大となり、ピントが外れた状態ではレーザスポッ
トが大きくなると共に高調波がほとんど発生しないよう
設定したものであり、さらに、該光学媒質より発生した
高調波を検出して画像を形成する検出手段を備えたもの
である。

【００１８】従って該光学媒質から発生した高調波を検
出することによって、戻り光の該媒質上でピントの合っ
た情報をすべて検出することが可能となる。

【００１９】

【実施例】以下に、本発明の一実施例に係るレーザ走査
顕微鏡の光学系を、説明する。図１は、本発明を落射型
顕微鏡に応用したものである。図において、レーザ光源
１から発生した光は、コリメートレンズ２で略平行光と
なった後ＸーＹスキャニングデバイス３を通り、ハーフ
ミラー４を透過して対物レンズ５に入射する。

【００２０】対物レンズ５を出た光は試料面６上にスポ
ットを形成し、ここで反射して再び対物レンズ５を通過
しハーフミラー４で反射して集光レンズ７に入射する。
この集光レンズ７によって戻り光束は再びスポットを形
成する。このスポット形成位置に非線形光学媒質８が設
置されている。

【００２１】非線形光学媒質８を透過した光および非線
形媒質８で発生した高調波は、フィルタ９に入射し、こ
こで第２高調波のみが透過して検出器１０に達する。こ
のあとの信号処理は通常のレーザ走査顕微鏡と同じであ
る。

【００２２】ここで非線形光学媒質８は、高調波発生に
適した位相整合角，偏光面，結晶軸方向等を選定してや
れば良い。また、非線形光学媒質の厚さは、絞り込んだ
レーザスポットの焦点深度，又はその数倍以下程度が望
ましい。また、戻り光スポットの非線形光学媒質８への
入射角が変化すると、位相整合角に影響するため、対物
レンズ５と集光レンズ７はテレセントリックに配置し、
常に一定角度で入射するようにしておく。

【００２３】なお、本実施例のように戻り光束がスキャ
ニングデバイスを介さずに戻ってくる場合、位相整合角
を非線形光学媒質８を傾けることによって選定すると、
像の周辺でピントずれが生じる（図３Ａ）。これを解決
するためには図３Ｂのように回折格子２０を用いればよ
い。回折格子２０により、非線形光学媒質８への入射角
度を垂直から外しながらも、全面にわたってピントを合
わせることが可能となる。

【００２４】また、本実施例では、フィルタ９を設けた
が、検出器１０に第２高調波域にのみに感度を有する検
出器を用いればフィルタ９はなくても良い。さらに、ス
キャニングデバイス３についてはＡＯＤに限らず、ガル
バノミラー、ポリゴンミラー、レゾナントミラー等レー
ザスポットを走査させ得るものであれば広く使用可能で
ある。

【００２５】本発明を、蛍光顕微鏡に用いる場合、戻り
光である蛍光は一般に非偏光であるので、非線形光学媒
質の手前に偏光板等を設置することによって光学媒質へ
の入射光の偏光を揃える必要がある。また、戻り光（蛍
光）の波長は一定ではなく蛍光剤によって異なり、位相
整合角も変化するが、これを利用して位相整合角を可変
にすることで蛍光の分光計測も可能となる。

【００２６】

【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、コンフォ
ーカル型レーザ走査顕微鏡の光学系において、試料面か
らの戻り光の結像位置に複屈折性と２次以上の非線形光
学定数を有する光学媒質を配置し、該光学媒質より発生
した高調波を検出して画像を形成する検出手段を備えた
ものである。

【００２７】従って、前記非線形光学媒質から発生した
高調波を検出することによって、戻り光の該媒質上でピ
ントの合った情報をすべて検出することが可能となる。
よって本発明では、ピンホールなしでコンフォーカル型
レーザ走査顕微鏡が構成できると共に、鮮明な試料の画
像が得られるという効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例に係るレーザ走査顕微鏡の概
略光学系を示す図である。

【図２】従来のコンフォーカル型レーザ走査顕微鏡の概
略光学系を示す図である。

【図３】非線形光学媒質の配置に関する光路図である。

【符号の説明】

１，１１：レーザ光源 ２，１２：コリメータレンズ ３，１４：ＸーＹスキャニングデバイス ４，１３：ハーフミラー ５，１５：対物レンズ ６，１６：試料面 ７，１７：集光レンズ ８：非線形光学媒質 ９：フィルタ １０，１９：検出器 １８：ピンホール

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 レーザ光源と、該レーザ光源からの光を
   試料面上にスポット状に絞り込む光学系と、該レーザス
   ポットによって試料面上を走査するための走査手段とを
   備えたコンフォーカル型レーザ走査顕微鏡において、前
   記試料面からの戻り光の結像位置に配置された複屈折性
   と２次以上の非線形光学定数を有する光学媒体と、該光
   学媒体から発生する高調波を検出して画像を形成する検
   出手段とを備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。