JPH0491797A - グアニジノ酢酸の定量用試薬及びその定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、例えば尿、血液などのグアニジノ酢酸含有試
料中のグアニジノ酢酸の定量用試薬及びその定量法に関
するものである。

［従来の技術］ グアニジノ酢酸は、クレアチンの前駆物質であり、その
大部分が腎臓で生成されることが知られていて、尿中に
比較的多量排泄される物質である。

腎臓の代謝機能が低下すると、尿中のグアニジノ酢酸量
が減少する傾向が見られ、これを臨床的に応用すれば、
腎臓障害の診断のための指標とすることができる。また
腎臓移植患者の尿中や血液中などのグアニジノ酢酸量を
測定することによって、腎移植後の症状を推察すること
ができる。このように、尿中や血液中などのグアニジノ
酢酸の定量を行なうことは、例えば腎臓機能、尿毒症な
どを診断する上で重要な意義を有している。

従来、グアニジノ酢酸含有試料中のグアニジノ酢酸を定
量する方法としては、例えば該試料中のグアニジノ酢酸
をＮ−トリフルオロアセチル−α−ブチルエステル誘導
体とした後、ガスクロマトグラフィーにより分析する方
法［クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２１巻、第８３８頁、１９７５
年］、該試料中のグアニジノ酢酸をイオン交換クロマト
グラフィーを用いて分画し、これを定量する方法［最新
医学、第３１巻、９号、第１６９５頁、昭和５１年９月
発行；バイオケミカル・メディシン（Ｂｉｏｃｈｅ　ｍ
１ｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第１０巻、第８頁、１
９７４年；ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー　（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
）、第１６２巻、第３２７頁、　１９７９年；同、第２
２６巻、第４３頁、１９８１年コなどが知られている。

しかしながら、これらの方法は操作が非常に煩雑で、し
かも定量に時間を要し、また大掛かりな装置を必要とし
、さらに定量費用も嵩む大きな欠点を有している。

また、尿や血液などの試料に予めウレアーゼを加えて該
試料中にすでに存在する尿素を分解消費させ、次いで残
存するウレアーゼを失活又は除去した後、グアニジノ酢
酸分解酵素を作用させ、新たに生成する尿素を比色定量
することにより、該試料中のグアニジノ酢酸を定量する
方法（酵素法）（特開昭５９−２０６００）も知られて
いる。

しかしながら、この方法においても、簡便ではあるが、
酵素反応時間や発色までに要する時間が長いなと、必ず
しも満足すべきものでない。

［発明が解決しようとする課８］ 本発明は、このような従来のグアニジノ酢酸の定量法が
有する欠点を克服し、グアニジノ酢酸含有試料中のグア
ニジノ酢酸を極めて簡易な操作で迅速に、しかも精度よ
く定量する方法及びその定量用試薬を提供することを目
的としてなされたものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重
ねた結果、特定の酵素と基質を組合せた定量法によれば
、前記した欠点を克服し得ることを見出し、この知見に
基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、 （ア）グアニジノ酢酸分解酵素 （イ）グルタチオン合成酵素 （つ）γ−グルタミル誘導体、アミノ酪酸誘導体及びシ
スティン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種 （１）アデノシン−５′−三リン酸及びその塩からなる
群より選ばれる少なくとも１種 （オ）金属イオン、及び （力）生成するアデノシン−５′−二リン酸、オルトリ
ン酸又はグリシン誘導体を検出するための試薬 を含有してなるグアニジノ酢酸の定量用試薬であり、ま
た本発明は、 グアニジノ酢酸含有試料に、 （ア）グアニジノ酢酸分解酵素 （イ）グルタチオン合成酵素 （つ）γ−グルタミル誘導体、アミノ酪酸誘導体及びシ
スティン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種 （１）アデノ）シー５′二リン酸酸（以下ＡＴＰという
）及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種、
及び （オ）金属イオン を反応させ、生成するアデノシン−５′−二リン酸（以
下ＡＤＰという）、オルトリン酸又はグリシン誘導体を
測定することにより該試料中のグアニジノ酢酸を定量す
ることを特徴とするグアニジノ酢酸の定量法 である。

以下本発明について詳細に説明する。

先ず、本発明におけるグアニンノ酢酸含有試料としては
、グアニジノ酢酸を含有するものであれば、いかなるも
のでもよく、例えば尿、血液、血清、糞便などが挙げら
れる。

そして、該試料は、そのまま或いは濾過して定量に供し
てもよく、また例えば水、緩衝液などで適宜の濃度とな
るように希釈して供してもよい。

定量に際しては、これらの試料のｐ１、（は無調整でも
よいか、適宜のｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫酸、硝酸、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどにより　ｐＨ４
〜１２、好ましくはｐＨ６〜９に調整するのが望ましい
。

次に、本発明におけるグアニジノ酢酸の定量法を反応式
と共に示すと次の通りである。

先ず、グアニジノ酢酸含有試料中のグアニジノ酢酸にグ
アニジノ酢酸分解酵素（式中ＧＡＨと示す）を作用させ
てグリシンと尿素を生成させる（第１反応）。

ＡＨ 次いで、第１反応で生成したグリシンに、γ−グルタミ
ル誘導体、アミノ酪酸誘導体及び／又はシスティン誘導
体（式中γ−グルタミル誘導体等と示す）、ＡＴＰ及び
金属イオンの共存下、グルタチオン合成酵素（式中ＧＳ
と示す）を作用させて、ＡＤＰ、オルトリン酸及びグリ
シン誘導体を生成させる（第２反応）。

グリシン＋γ−グルタミル誘導体等＋ＡＴＰ第２反応で
生成したＡＤＰ、オルトリン酸又はグリシン誘導体を測
定すれば、該試料中のグアニジノ酢酸の含有量を定量す
ることができる。

本発明において用いられるグアニジノ酢酸分解酵素とし
ては、例えば微生物、動物、植物など、いかなる起源の
ものでもよい。そして、例えばコリネバクテリウム（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　ｓｐ、　Ｎ−１９−
１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５０６）　（菌学的性質及びこの
微生物により生産される酵素の理化学的性質については
、特開昭６０−２０３１８９号に記載されている）、ア
ースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）　ｓｐ、
　Ｎ−１２−１（ＦＥＲＭＢＰ−５０５）　（同上）、
シュードモナス　（Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ、
　ＡＴＣＣ１４６７６［アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、第４１巻、第９５９頁、１９７７年］などが挙げら
れるが、特にコリネバクテリウム属及びアースロバフタ
−属の細菌により生産されるグアニジノ酢酸分解酵素が
好ましい。

また本発明において用いられるグルタチオン合成酵素と
しては、例えば微生物、動物、植物など、いかなる起源
のものを用いてもよい。そして、例えば鳩の肝臓、小麦
の胚、ラットの腎臓、赤血球、酵母、大腸菌なとが挙げ
られる。

なお、該グルタチオン合成酵素は、例えば■工イチ・グ
シマ等（Ｈ，Ｇｕｓｈｉｍａ　ａｔ　ａｌ、）　：ジャ
ーナル・オブ・アプライド・バイオケミストリー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、第５巻、第２１０頁、１９８３年、■エル
・オツペンハイマー等（Ｌ、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ　
ｅｔ　ａｌ、）　ニジエイ・パイオル・ケム（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第２５４巻、第５１８４頁、１９
７９年、■イー・デイ・ムーズ等（Ｅ、Ｄ、Ｍｏｏｚ　
ｅｔ　ａｌ、）：バイオケミストリー　（Ｂｉｏｃｈｅ
＋＋＋１ｓｔｒｙ）、第６巻、第１７２２頁、１９６７
年、■エム・ワイ・ロー等（ＭＹ、Ｌａｗ　ｅｔ　ａｌ
、）　ニブラント・サイエンス　（ＰｌａｎｔＳｃｉｅ
ｎｃｅ）、第４３巻、第１８５頁、１９８６年などに記
載された方法により容易に調製することができる。

次に、本発明において用いられるγ−グルタミル誘導体
としては、Ｌ体あるいはＤ体いずれでもよい。そして、
例えばＬ−γ−グルタミルーＬ−システィン、Ｄ−γ−
グルタミルーし一システィン、Ｌ−γ−グルタミルーＤ
−システィン、Ｌ−γ−グルタミルーＬ−α−アミノ酪
酸、Ｄ−γ−グルタミルーＬ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ
−グルタミルーＤ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−グルタミ
ルーＬ　−（Ｓ−メチル）システィン、Ｄ−γ−グルタ
ミルーＬ−（Ｓ−メチル）システィン、Ｌ−γ−グルタ
ミルーＬ−β−アミノ酪酸、Ｌ−γ−グルタミルーし一
セリン、Ｄ−γ−グルタミルーＬ−セリン、Ｌ−γ−グ
ルタミルーＤ−セリン、Ｌ−γ−グルタミルーグリシン
、Ｄ−γ−グルタミルーグリシン、Ｌ−γ−グルタミル
ーＬ−アラニン、Ｄ−γ−グルタミルーＬ−アラニン、
Ｌ−γ−グルタミルーＤ−アラニン、Ｌ−γ−グルタミ
ルーＬ−／ルバリン、Ｌ−γ−グルタミルーＬ−ノルロ
イシン、Ｌ−γ〜（α−メチル）グルタミル−Ｌ−α−
アミノ酪酸、Ｄ−γ−（α−メチル）グルタミル−Ｌ−
α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−（Ｎ−メチル）グルタミル−
Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｄ−γ−（Ｎ−メチル）グルタミ
ル−Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−（β−メチル）グル
タミル−Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｄ−γ−（β−メチル）
グルタミル−Ｌ〜α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−（γ−メチ
ル）グルタミル−し−α−アミノ酪酸、Ｄ−γ−（γ−
メチル）グルタミル−Ｌ−α−アミノ酪酸などか挙げら
れる。

また、アミノ酪酸誘導体としては、Ｌ一体あるいはＤ一
体のいずれを用いてもよく、例えばβ−アミノグルタリ
ル−Ｌ−α−アミノ酪酸、グルタリル−Ｌ−α−アミノ
酪酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−α−アミノ酪酸などが挙げら
れる。

そしてまた、システィン誘導体としては、Ｌ−体あるい
はＤ一体のいずれを用いてもよく、例えばＮ−アセチル
−Ｌ−システィン、β−アミノグルタリル−Ｌ−システ
ィン、グルタリル−し−システィンなどが挙げられる。

なお、γ−グルタミル誘導体、アミノ酪酸誘導体又はシ
スティン誘導体は、単独又は組合せて用いられる。そし
て、中でも特にＬ−γ−グルタミルーし一システィン、
Ｌ−γ−グルタミルーし一α−アミノ酪酸を用いるのが
好ましい。

さらに、ＡＴＰ又はその塩としては、例えばＡＴＰ、Ａ
ＴＰニカリウム塩、ＡＴＰニナトリウム塩、ＡＴＰ　ト
リス塩、ＡＴＰマグネシウム塩、ＡＴＰカルシウム塩、
ＡＴＰニモノエタノールアンモニウム塩などが挙げられ
、これらは単独又は組合せて用いられる。

また、金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン
、マンガンイオン、コバルトイオン、鉄イオン、銅イオ
ン、カルシウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイ
オン、リチウムイオンなどが挙げられ、これらは単独又
は組合せて用いられる。そして中でもマグネシウムイオ
ン、マンガンイオンなどが特に好ましい。そしてまたこ
れらのイオンは、有機酸塩及び／又は無機酸塩のかたち
で添加される。

なお、本発明において、グアニジノ酢酸含有試料に、グ
アニジノ酢酸分解酵素及びグルタチオン合成酵素を作用
させるに際し、該酵素の添加量は、試料に含まれるグア
ニジノ酢酸量、酵素反応条件などにより適宜選択される
。

次に、前記酵素反応により生成するＡＤ、Ｐ、オルトリ
ン酸またはＣ末端がグリシンであるいわゆるグリシン誘
導体の含有量を、公知の方法で測定することにより、試
料中のグアニジノ酢酸を定量することができる。そして
、特にＡＤＰ又はオルトリン酸を測定するのか、操作上
簡便であり、好ましい。

前記ＡＤＰの測定法としては、いかなる測定法を用いて
もよい。そして、例えば■ＡＤＰにホスホエノールピル
ビン酸の共存下、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸デヒドロ
ゲナーゼを作用させて、この際の共役反応、還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオタイド（ＮＡＤＨ）→酸
化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド（ＮＡＤ
”）で生成したＮＡＤ“の生成量を３４０　ｎｍで測定
する方法（メソッヅ・オブ・エンザイマチック・アナリ
シス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ）、第３版、第７巻、第３６５頁、１９
８５年発行）、■ＡＤＰにホスホエノールピルビン酸の
共存下、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダー
ゼを作用させて、生成した過酸化水素を酵素的に比色定
量する方法（特開昭５５−１３０６８）、■ＡＤＰ　に
ホスホエノールピルビン酸の共存下、ピルビン酸キナー
ゼを作用させて、生成したＡＴＰをルシフェリンの存在
下、ルシフェラーゼを作用させる発光法で測定する方法
（メソッヅ・オブ・エンブイマチック・アナリシス　（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ）、第３版、第７巻、第３７０頁、１９８５年
発行）などが挙げられる。

またオルトリン酸の測定法としては、いかなる測定法を
用いてもよい。そして、例えば■オルトリン酸にモリブ
デン酸アンモニウムを加えてリンモリブデン酸塩とし、
これを１．２．４−アミノナフトールスルホン酸で還元
し、この還元物を比色定置する方法［ブイスケ・サバロ
ー（Ｆｉｓｋｅ−８ｕｂｂ−ａｒｏｗ）法］、前記ブイ
スケ・サバロー法において、１．２４−アミノナフトー
ルスルホン酸で還元する代りに、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｐ
−フ二二レンジアミンで還元する以外は全く同様に処理
するブイスケ・サバロー変法、オルトリン酸にモリブデ
ン酸アンモニウムを加えてリンモリブデン酸塩とし、こ
れを硫酸第一鉄で還元し、この還元物を比色定置する方
法［トウスキー（Ｔａｕｓｓｋｙ）法］　（分析ライブ
ラリー３、臨床化学分析Ｖ、第１１６頁、１９６７年、
東京化学同人出版）、■オルトリン酸にイノシンの共存
下、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びキサンチン
オキシダーゼを作用させて生成した過酸化水素を酵素的
に比色定量する方法（越智正昭ら：最新検査、第２、第
７頁、１９８４年）、■オルトリン酸にシュークロース
の共存下、シュークロースホスホリラーゼ、ホスホグル
コムターゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼを作用させて、この際の共役反応、酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオタイドホスフェート（ＮＡＤＰ
”）−還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド
ホスフェート　（ＮＡＤＰＨ）で生成したＮＡＤＰＨの
生成量を３４０　ｎｍで測定する方法（特開昭６３−ｓ
９１００）などが挙げられる。

また、グリシン誘導体の測定法としては、いかなる方法
を用いてもよい。その中のグルタチオンの測定法につき
例示すると、■グルタチオンを５５′　−ジチオビス−
２−二トロ安息香酸と反応させて、生成した酸化型グル
タチオンを、ＮＡＤＰ）ｌの存在下、グルタチオン還元
酵素でグルタチオンに再生させ、最終的に生成した２−
ニトロ−５チオ安息香酸を比色定量する方法［メソッヅ
・オブ・エンブイマチック・アナリシス　（Ｍｅｔｈｏ
ｃｌｓ　ｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）
、第３版、第８巻、第５２１頁、１９８５年発行］、■
グルタチオンをＯ−フタルアルデヒドと反応させて蛍光
法で測定する方法［ブイ・エイチ・コーン　（Ｖ、Ｈ，
Ｃｏｈｎ）　ニアナル・バイオケム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、）、第１４巻、第４３４頁、１９６６年コ、
■グルタチオンをモノブロムバイメインと反応させて、
その誘導体を逆相クロマトグラフィーを用いて分画し、
これを定量する方法［ジー・エル・ニュートン（Ｇ、Ｌ
、Ｎｅｗｔｏｎ）　ニアナル・バイオケム（Ａｎａ　１
　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　）、第１１４巻、第３８３
頁、１９８１年］、■グルタチオンに、メチルグリオキ
サルの共存下、Ｓ−ラクトイルグルタチオンメチルグリ
オキサルリアーゼを作用させ、生成したＳ−ラクトイル
グルタチオンを測定する方法［メソッヅ・オブ・エンブ
イマチック・アナリシス　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅ
ｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）、第２版、第４
巻、第１６４３頁、１９７４年発行］などが挙げられる
。そしてまた、その他のグリシン誘導体の場合は、公知
の方法を適宜組合せて測定すればよい。

次に、グアニジノ酢酸を定量するための有利な系として
は、例えば反応試薬として、グアニジノ酢酸分解酵素を
好ましくは１〜５０単位／ｍｌ、特に好ましくは５〜３
０単位／ｍｌ、グルタチオン合成酵素を好ましくは１〜
５０単位／ｍｌ、特に好ましくは５〜２０単位／ｍｌ、
γ−グルタミル誘導体、アミノ酪酸誘導体及び／又はシ
スティン誘導体を好ましくは　１〜１００　ｍＭ、特に
好ましくは２〜２０ｍＭ、ＡＴＰ及び／又はその塩を好
ましくは１〜５０ｍＭ、特に好ましくは２〜２０　ｍｉ
ｓ金属イオンを好ましくは１〜１００　！ＩＩＭ、特に
好ましくは２〜２０ｍＭ。

緩衝剤を１０−２００ｍＭ含有するｐＨ５〜１０の系、
検出試薬として、前記例示のごと＜ＡＤＰ、オルトリン
酸又はグリシン誘導体を測定するに必要とする試薬、緩
衝剤を１０〜２００　ｍＭ金含有るｐＨ５〜１０の系な
どが挙げられる。この系に用いられる緩衝剤としては、
例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス−塩酸塩など
が挙げられる。

該測定系には、必要に応じ溶解補助剤、安定化剤として
、例えば界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００、ブリ
ッジ３５、ツイーン８０、コール酸塩など）、還元剤（
例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ
−システィンなど）、牛血清アルブミン、糖類（例えば
グリセリン、マンニトール、シュークロースなど）など
を添加することもできる。

本発明の試薬は、乾燥物又は溶解した形で用いてもよい
し、薄膜状の担体、例えばシート含浸性の紙などに含浸
させて用いてもよい。

また、使用酵素は、常法により固定化させて反復使用し
てもよい。

次に、本発明のグアニジノ酢酸の定量法の好適な１例に
ついて説明する。

先ず、グアニノ酢酸を含有する試料に、グアニジノ酢酸
分解酵素を好ましくは１〜５０単位／ｍｌ、特に好まし
くは５〜３０単位／ｍｌ、グルタチオン合成酵素を好ま
しくは１〜５０単位／ｎｔｆ！、特に好ましくは５〜２
０単位／ｍ！！、γ−グルタミル誘導体、アミノ酪酸誘
導体及び／又はシスティン誘導体を好ましくは１〜１．
００　ｍＭ、特に好ましくは２〜２０ｍＭ５ＡＴＰ及び
／又はその塩を好ましくは１〜５０　ｍＭ、特に好まし
くは２〜２０　ｍＭ、金属イオンを好ましくは１〜１０
０　ｍＭ、特に好ましくは２〜２０１１１Ｌ　Ｍ面側を
１０〜２００ｍＭとなるように加え、ｐＨ５〜１０、温
度８０℃以下、好ましくは２０〜６０℃で酵素反応させ
る。このときの反応時間はグアニジノ酢酸を分解するに
十分な時間であればよく、好ましくは１〜６０分間、特
に好ましくは２〜２０分間である。

次いで生成するＡＤＰ、オルトリン酸又はグリシン誘導
体を前記したような方法によって測定し、予め同方法で
測定して作成したグアニジノ酢酸の検量線を用いて、試
料中のグアニジノ酢酸の定量値を算出する。

［発明の効果コ 本発明は、従来法に比較して操作が極めて簡便であり、
１試料当りの測定時間も従来法に比し著しく短縮され、
また精度（感度）も極めて優れ、さらに多量の試料を同
時に測定できるので、産業上極めて有意義である。

［実施例コ 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ 〈グアニジノ酢酸の定量用試薬の調製〉精製水に以下の
成分を以下の濃度で溶解することにより、反応試薬及び
ＡＤＰの検出試薬からなるグアニジノ酢酸の定量用試薬
を調製した。

（反応試薬） トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　　　１００　　　
ｍＭＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　１５　　　ｍ
ＭＬ−γ−グルタミルーし一システィン ＭｇＣ１□ グアニジノ酢酸分解酵素 グルタチオン合成酵素 （生成するＡＤＰの検出試薬） トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） １０　　　　　ｍＭ １５　　　　ｍＭ ３０　　Ｕ／ｍＲ １０［１／ｙｎｌ！ １．００　　　　ｍＭ ホスホエノールピルビン酸　　　　１　　　ｍＭ塩化カ
リウム　　　　　　　　　　１０　　　ｍＭＭｇＣ１２
２，７ｍＭ ＮＡＤＨ０，２ｍＭ ピルビン酸キナーゼ　　　　　　　１０　　ｔＪ／ｒｕ
ｆｆ乳酸デヒドロゲナーゼ　　　　　　１０　　Ｕ／ｒ
ｄ実施例２ くグアニジノ酢酸の定量：生成するＡＤＰを測定する方
法〉 グアニジノ酢酸を１００ｍｇ／ｄｆｌ　になるように溶
解した水溶液を希釈して種々の濃度に調整したグアニジ
ノ酢酸含有試料（０，２，５，５，０，７，５，１０、
１５及び２０　ｍｇ／　ｄ　２　）各５０μｆｌｌ：、
Ｆ　記実施例１で調製した反応試薬を１５０μ２添加し
、３０℃で３分間反応させた。次いで、それぞれの反応
液（生成したＡＤＰを含有）に、前記実施例１で調製し
たＡＤＰの検出試薬を２６ｍ１添加し、３０℃で５分間
反応させた後、日立社製三波長分光光度計（５５７形）
により　３４０　ｎｍにおける吸光度の減少量（ΔＯＤ
）を測定した。この測定値とグアニジノ酢酸量との関係
より検量線を作成した。

該検量線の式は ｙ　＝　０．００８２８ｘ　−０，００５８２（相関係
数　ｒ　＝　０．９９９８） 〔但し、ｙ：ΔＯＤ、　ｘ　　グアニジノ酢酸（ｍｇ　
／　ｄ　２　）〕となる。そのグラフを第１図に示す。

これから、ΔＯＤとグアニジノ酢酸量との間には直線的
な相関があり、十分検量線として使用できることがわか
り、しかも試料中のグアニジノ酢酸を迅速かつ正確に定
量できた。

実施例３ 〈生成するオルトリン酸を測定するグアニジノ酢酸の定
量〉 次に示す定量用試薬を用い、グアニジノ酢酸を定量した
。

定量用試薬： （反応試薬） 実施例１と同様に調製した試薬 （生成するオルトリン酸の検出試薬）・・・・・・前記
ブイスヶ・サバロー変法による無機リン測定用試薬セッ
ト（商品名；無機リン測定セット「第一」、第−化学薬
品社販売） （１）反応試液 Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン硫酸塩 （２）呈色試液Ａ モリブデン酸アンモニウム　　２０．２　　ｍＭ（３）
呈色試液Ｂ 炭酸ナトリウム 定量法： グアニジノ酢酸を１００　ｍｇ／ｄｎ　　になるように
溶解した水溶液を希釈して種々の濃度に調整したグアニ
ジノ酢酸含有試料（０，５，１０、２０、３０゜４０及
び５０ｍｇ／ｄ、ｆｌｔ）各５０μ２に、前記反応試薬
ヲ１５０μ２添加し、３０℃で５分間反応させた。次い
で、それぞれの反応液（生成したオルトリン酸を含有）
に、前記検出試薬（１）の反応試液を２．０ｒＮ２、（
２）の呈色試液Ａを０．５ｄ添加し、２５℃で２００分
間反応せ、さらに前記検出試薬（３）の呈色試液Ｂを１
．０ｍｌ！添加し、２５°Ｃで５分間反応させた後、分
光光度計により　６６０　ｎ＋ｎにおける吸光度の増加
量（ΔＯＤ）を測定した。この測定値とグアニジノ酢酸
量との関係より検量線を作成した。該検量線の式は ｙ　＝　０．００３６４ｘ　＋　０．００３７２（相関
係数　ｒ　＝　０．９９９８　）となる。そのグラフを
第２図に示す。これから、ΔＯＤとグアニジノ酢酸量と
の間には直線的な相関があり、十分検量線として使用で
きることがわかり、しかも試料中のグアニジノ酢酸を迅
速がっ正確に定量できた。

実施例４ 〈グアニジノ酢酸の定量用試薬の調製〉（反応試薬） 実施例１と同様に調製した反応試薬 （生成するグルタチオンの検出試薬） リン酸緩衝液（ｐＨ７，１）　　　　　　　５０　　　
ｍＭ５．５′　−ジチオビス−２−二トロ安息香酸０．
４　　　　ｍＭ 炭酸水素ナトリウム　　　　　　　０．７　　ｍＭＮＡ
ＤＰＨ０，１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム ０．５　　ｄ グルタチオン還元酵素　　　　　　０．Ｉ　０７ｍ以上
のような組成の反応試薬及びグルタチオンの検出試薬か
らなるグアニジノ酢酸の定量用試薬を調製した。

実施例５ 〈生成するグルタチオンを測定するグアニジノ酢酸の定
量〉 グアニジノ酢酸をｌｏＯｍｇ／ｄ、９　　になるように
溶解した水溶液を希釈して種々の濃度に調整したグアニ
ジノ酢酸含有試料（０、２，５，５，０、７，５及び１
０ｍｇ／ｄＢ）各５０μ２　に、前記実施例４で調製し
た反応試薬を１５０μ２　添加し、３０　’Ｃで５分間
反応させた。次いで、それぞれの反応液（生成したグル
タチオンを含有）がら１ｏμ２を分取して、前記実施例
４で調製したグルタチオンの検出試薬を２７ｍ１添加し
、２５℃で反応を開始後、１分から２分の１分間当りの
４１２　ｒ＋ｎ＋における吸光度の増加量（△ＯＤ）を
分光光度計により測定した。この測定値とグアニジノ酢
酸量との関係より検量線を作成した。該検量線の式はｙ
　＝　０．００６８４ｘ　十０．００３５（相関係数　
ｒ　＝　０．９９７０） となる。そのグラフを第３図に示す。これから、ΔＯＤ
とグアニジノ酢酸量との間には直線的な相関があり、十
分検量線として使用できることがわかり、しかも試料中
のグアニジノ酢酸を迅速かつ正確に定量できた。

実施例６ 〈グアニジノ酢酸の定量〉 反応試薬としての５　ｍＭ　Ｌ−γ−グルタミルーＬ−
α−システィンの代りに５０ｍＭグルタリル−し−α〜
ルアミノ酸を用いる以外は前記実施例２と同様にして吸
光度の減少量（ΔＯＤ）を測定した。この結果、ΔＯＤ
とグアニジノ酢酸量との間には直線的な相関があり、十
分検量線として使用することができた。

実施例７ 〈グアニジノ酢酸の定量〉 反応試薬としての５ＩＩ］ＭＬ−γ−グルタミルーＬ−
α−システィンの代りに５０　ｍＭ　Ｎ−アセチル−し
−システィンを用いる以外は前記実施例２と同様にして
吸光度の減少量（△ＯＤ）を測定した。

この結果、ΔＯＤとグアニジノ酢酸との間には直線的な
相関があり、十分検量線として使用することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は生成するＡＤＰを測定した際のグアニジノ酢酸
の定量に用いる検量線を示すグラフ、第２図は生成する
オルトリン酸を測定した際のグアニジノ酢酸の定量に用
いる検量線を示すグラフ、第３図は生成するグルタチオ
ンを測定した際のグアニジノ酢酸の定量の用いる検量線
を示すグラフである。 特許出願人　　キッコーマン株式会社 芽２）和 １０　２０　　３０　　＋０　　５０ グアニシソ咋戸Ｌ（〆ＶｄＪｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ア）グアニジノ酢酸分解酵素 （イ）グルタチオン合成酵素 （ウ）γ−グルタミル誘導体、アミノ酪酸誘導体及びシ
   ステイン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種 （エ）アデノシン−５′−三リン酸及びその塩からなる
   群より選ばれる少なくとも１種 （オ）金属イオン、及び （カ）生成するアデノシン−５′−二リン酸、オルトリ
   ン酸又はグリシン誘導体を検出するための試薬 を含有してなるグアニジノ酢酸の定量用試薬。 ２、グアニジノ酢酸含有試料に、 （ア）グアニジノ酢酸分解酵素 （イ）グルタチオン合成酵素 （ウ）γ−グルタミル誘導体、アミノ酪酸誘導体及びシ
   ステイン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種 （エ）アデノシン−５′−三リン酸及びその塩からなる
   群より選ばれる少なくとも１種、及び （オ）金属イオン を反応させ、生成するアデノシン−５′−二リン酸、オ
   ルトリン酸又はグリシン誘導体を測定することにより該
   試料中のグアニジノ酢酸を定量することを特徴とするグ
   アニジノ酢酸の定量法。