JPH0489897A

JPH0489897A - アルカリ性リパーゼを含む洗剤配合物

Info

Publication number: JPH0489897A
Application number: JP20231690A
Authority: JP
Inventors: L Beicroft Nancy; ナンシー　エル　バイクロフト; G Bing Graham; グレイアム　ジー　ビング
Original assignee: Solvay Enzymes Products Inc
Current assignee: Genencor International Indiana Inc
Priority date: 1990-07-30
Filing date: 1990-07-30
Publication date: 1992-03-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（発明の産業上の利用分野）本発明は、アルカリ性リパーゼを含む洗剤配合物に関す
る。

（従来の技術及び発明か解決しようとする課題）米国特
許第４．７０７．２９１号には、シュードモナス・フル
オレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｓ）ＩＡＭ１０５７により生産されるリパーゼの
抗体、詳細には種シュードモナス・フルオレセンス、シ
ュードモナス・フラジオリ（Ｐ、　ｇｌａｄｉｏｌｉ）
またはクロモバクター・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａ
ｃｔｅｒｖｉｓｃｏｓｕｍ）の微生物により生産される
リパーゼの抗体と陽性の免疫交差反応を示すリパーゼと
組合せた、アニオン性洗剤活性化合物とノニオン性洗剤
活性化合物との混合物を含む洗剤組成物か開示されてい
る。これらの生物は、米国特許第４．７０７．２９１号
として特許された特許出願か出願された時に脂肪分解活
性を有することか知られていたか、特許性は洗剤を含む
配合物中のこれらの酵素の安定性に基づいていた。

欧州特許出願公開第０２７１１５３号には、ノニオン性
洗剤、プロテアーゼ及びクロモバクター・ビスコスム、
即ち変異型リボリチヵム（１＋ｐｏｌｙｔ＋ｃｕｍ）Ｎ
ＲＲＬ−Ｂ３６７３により生産されるリパーゼの抗体に
陽性の免疫応答を示すリパーゼを含む組成物が開示され
ている。シュードモナス種の７二−ドモナス・フルオレ
センス、シュードモナス・フラジ（Ｐ、　ｆｒａｇｉ）
　、シュードモナス・ニトロレシュセンス（ｐ、　ｎ１
ｔｒＯｒｅ（］ｕＳＣｅｎＳ）変異型リポリチカム、シ
ュードモナス・セパシア（Ｐ、　ｃｅｐａｃｉａ）及び
シュードモナス・フラジオリから誘導されたリパーゼが
詳しく開示されている。

バクテリアのシュードモナス属は、実際には四つの亜属
から構成される。シュードモナス・セパンア及びシュー
ドモナス・フラジオリ（はシュードモナス亜型Ｈに属し
、一方、シュードモナス・フラジ及びおそらくシュード
モナス・ニトロレジュセンスは亜型Ｉに属する。

アゼガミ　＜Ａｚｅｇａｍ　ｉ）らは、Ｉｎｔ、　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ
＋ｏｌｏｇｙ、　　１９８７年４月号、１４４〜１５２
頁にシュードモナスの新種、即ちシュードモナス・プラ
ンタリイ（Ｐ、　ｐｌａｎｔａｒｉｉ）を報告している
。この文献は、種シュードモナス・プランタリイからの
リパーゼ、並びにシュードモナス・グラジオりからのリ
パーゼに関して、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０加水分
解法を用いて、リパーゼに対する陽性応答を示している
。シュードモナス・プランタリイの全てのその他の菌株
か、記載された分類試験で同等に挙動するとアゼガミに
より報告されており、これは非常に緊密な相同種である
ことを示唆する。その他に、全ての２１の試験菌株中の
リパーゼが、トウビーン８ｏ加水分解及び綿実油加水分
解の両方を触媒作用すると報告されている。これらの例
に使用される菌株、即ちＡＴＣＣ４３７３３はタイプ菌
株であり１、その名称はそれが新種を最も良く表わす典
型であることを意味する。シュードモナスのグラジオリ
種及びブランクリイ種は関連するか、それらは、例えば
、シュードモナス・プランタリイが増殖にり、ラモース
（Ｒｈａｍｏｓｅ）を利用でき（一方、シュードモナス
・フラジオリは利用できない）、シュードモナス・プラ
ンタリイが増殖にトレハロース、アドニトール、β−ア
ラニン、ラクトース、ベンゾエート、レブリネート（１
ｅｖｕｌｉｎａｔｅ）を利用できなイ（−方、シュード
モナス・グラジオりは利用できる）というような明白な
分類上の相違を有する。シュードモナス・ブランタリイ
は４ｏ″Ｃて増殖てきないか、一方、シュードモナス・
グラジオりは増殖できる。更に、シュードモナス・プラ
ンタリイは、米の芽生えに病原性であると報告されてい
るが、一方、シュードモナス・フラジオリは病原性であ
ると報告されていない。

（課題を解決するための手段）本発明は、ノニオン性洗剤及び／またはアニオン性洗剤
及び種シュードモナス・プランタリイの生物から誘導さ
れた細菌性リパーゼを含む組成物である。

（発明の説明）本発明は、シュードモナス・プランタリイがらりパーゼ
かノニオン性洗剤及び／またはアニオン性洗剤の存在下
で予想外にも安定であるという発見に基づく。それは、
従来技術が洗剤安定性であると認めるシュードモナス・
グラジオリからのリパーゼよりも著しく安定である。

布から脂肪のよごれを除去するのに適した典型的な配合
物は、ノニオン性表面活性剤〔例えば、アルキルポリ〔
エチレングリセロールエーテル及びノニルフェニルポリ
（エチレングリセロール）エーテル〕、アニオン性表面
活性剤（例えば、アルキルベンゼンスルホネート、脂肪
アルコールエーテルスルフェートまたはα−オレフィン
スルホネート）の如き、一種以上の洗剤表面活性剤及び
典型的に１ｍｇ当り約０．１〜１００リパーゼ単位の量
の粉末リパーゼ単位を含む。任意成分は、カリウムジホ
スフェート、ナトリウムトリポリホスフェート、クエン
酸ナトリウム、ナトリウムニトリロトリアセテートまた
はケイ酸ナトリウムの如き洗剤ビルダー、発泡促進剤（
ｆｏａｍ　ｂｏｏｓｔｅｒｓ）　（例えば、脂肪酸アル
カノールアミド）、アルカリ物質（例えば、炭酸ナトリ
ウム）、蛍光増白剤（例えば、スチルベン誘導体）、安
定剤（例えば、トリエタノールアミン）、布軟化剤（例
えば、四級アンモニウム塩）を漂白剤及び漂白系（例え
ば、過ホウ酸ナトリウム及びエチレンジアミンテトラア
セテート）と−緒に含む。付加的な成分は、香料、染料
、泡立て増進剤、発泡抑制剤及び腐蝕防止剤、配合用の
酸（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　ａｃｉｄｓ）を含んでも
よい。

その他に、プロテアーゼ、アミラーゼまたはセルラーゼ
の如き、その他の酵素か存在してもよい。

栄養寒天平板からのシュードモナス・プランタリイまた
はシュードモナス・グラジオリのコロニーか、記載され
た種培地５０ｍｆを接種するのに使用された。種フラス
コか２４時間増殖され、その後、それは無菌の２０％グ
リセロール溶液でｌｌに希釈され、１．０ｍｌを１．５
ｍｊ７のフリーサーバイアル中でアリコートとされ、将
来の使用のため一７０°Ｃで貯蔵された。シュードモナ
ス・グラジオり、ＡＴＣＣ１０２４８及びシュードモナ
ス・プランタリイ、ＡＴＣＣ４３７３３の種培養液が、
下記のＰＹ８０培地５培地５登凍結保存培養液０．１−で接種することにより増殖され
た。

ペ　ブ　　ト　　ン　　　　　　　１．０酵母エキス　
　　０．１トウィーン８０　　　　１．０　　　　　　　　５ｍｌ
！”蒸　留　水　　　　　　　　　５０ｒｎｌ（最終容
量）＊　１０％の保存溶液は、１２１℃で２０分間オー
トクレーブで処理することにより調製され、室温に冷却
した後、三枚のじゃま板付の長い口の３００−のクレッ
ト（Ｋｌｅｔｔ）フラスコに無菌添加された。

接種されたＰＹ８０種培地は、２　５　Ｏｒｐｍ　にセ
ットされたニュー・プランスウィック　（Ｎｅｗ　Ｂｒ
ｕｎ−ｓｗｉｃｋ）　Ｇ　−　２　５−Ｒ振とう器を用
５１て、２８℃で１６時間保温された。

使用された発酵培地（ＦＧＨ８０）が、以下に記載され
る。

培地　ＦＧＨ８０成　　分　　　％　　ｇまたはｍｌ／ｌ／フラスコ水加
水分解産物．　５　　　　　　−　−　−“Ｇ′ソブロ
ペチェ（Ｓｏｐｒｏｐｅｃｈｅ）大豆かす　　１．　Ｏ
　　　　　Ｏ．　４　ｇ△ トウィーン８０　　　１．０　　　　　　　４ｍｌ”軟
　　　水　　　　　　　４０ｍ１（最終容量）△　ＩＭ
のｐＨ７．０のリン酸カリウム保存液を濾過し、０．２
ミクロンのナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）フィルター単位
装置を用いて滅菌し、または１２１℃で１５分間オート
クレーブ処理により滅菌した。ついで無菌保存液を３個
のミルクフィルターパッドで覆われた夫々の特別の深さ
の（　ｅｘｔｒａ−ｄｅｅｐ）　３枚のじゃま板付の２
５０ｍＡの振どう器フラスコに無菌添加した。

＊　１０％のトウビーン８０保存液をつくり、１２１°
Ｃで２０分間オートクレーブ処理し、冷却し、夫々の特
別の深さの３枚のじゃま板付の２５０ｍｌのフラスコに
無菌添加する。

夫々の発酵フラスコか、種調製に関して記載されたよう
に増殖された種１　　ｍ！！で接種された。接種フラス
コが、二ニー・プランスウィックＧ−２５−Ｒ振とう話
中で４２５　ｒｐｍで攪拌しなから２８℃で７２時間保
温された。

別途、リパーゼが３０１の発酵容器（バイオスタット（
Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｕ　−３００、ブラウン・インストル
メンツ（Ｂｒａｕｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ベス
レヘム、ペンシルバニア州）を用いて生産された。使用
された種培地は、６００　ｍｌの容量かフエルンバッハ
フラスコ中で増殖された以外は、前記のとおりてあった
。１６時間の種培養液６００ｍｆか夫々３０Ｉ！の発酵
槽に移された。３００　ｒｐｍで攪拌し１５１／分で通
気しながら背圧を９０バールて保ち２８°Ｃで７２時間
保温した後、発酵が停止された。

リパーゼ粉末は、最初に発酵槽全体のヒールを６０°Ｃ
に１０分間加熱することにより得られた。

２５〜３０℃に冷却した後、５％Ｗ／Ｖのヘントナイト
が、加熱処理されたビールに添加された。混合しながら
、等容量のインプロパツールが、ベントナイトで処理さ
れたビールに添加された。イソプロパツール／ベントナ
イトビールは、添加された０、７５％のＦＷ−５（濾過
助剤）を有し、つし）でテーブルフィルターを用いてン
ヤークスキン紙で濾過された。インプロパツール濾液が
集められ、減圧濃縮装置を用いてイソプロパツールが除
去された。インプロパツールを含まない試料は、１％−
ハのＦＷ−６濾過助剤を添加し、同一の濾過助剤の微細
な床て濾過することにより仕上げろれた（ｐｏｌｉｓｈ
ｅｄ）。ついで、仕上げ試料が、アミコン（Ａｍｉｃｏ
ｎ）　Ｐ？Ｊ−１０カートリツジを用いて限外濾過する
ことにより約８〜１０倍に濃縮された。

タンパク質の完全な沈殿が、徐々に混合しながらインプ
ロパツールを８０％ｙ／ｖ　まで添加することにより行
なわれた。タンパク質は、テーブルフィルター上で０．
５％ｗ／ｖ　のＦＷ−６濾過助剤を添加することにより
アルコールから分離された。乾燥濾過ケークは、ｌＮ０
：）ＮａＯＨでｐＨ９，３〜９．５に前もって調節され
た水中で１・２の水対ケークの比で再懸濁された。ケー
ク及び水か２０分間混合され、ついで再度濾過された。

そのスラリー法は更に２回繰返され、全ての濾液がため
られ、−７０°Ｃで一夜凍結された。ついで、凍結濾液
か凍結乾燥されて粉末リパーゼ製剤を得た。

上記のようにして調製された粉末リパーゼを含む洗剤配
合物が、配合され、安定性に関して試験された。これら
の実験が、以下の実施例に記載される。

実施例１洗浄系中のシュードモナス・プランタリイ及びシュード
モナス・グラジオリからのリパーゼの安定性を、１．９
６ｍ１の洗剤ベースＷＡと一緒に通常の水道水ＩＩ！当
り３．０００のエステラーゼ単位のリパーゼを添加する
ことにより測定した。

ＷＡ洗剤（液体）ベースナトリウムキシレンスルホネート　　１２．０トリエタ
ノールアミン（ＴＥＡ）　　　　　２．０クエン酸ナト
リウム　　　　　　　　　１２．０水　　　　　　　　
　　　　　合計で１０ＯＢとする量混合物を４５℃で保温し、ついでｐＨ８，５，４５℃で
トリブチリンのアラビアゴムエマルシミン中で生成され
るブチレートの生成を滴定して残存する酵素活性の比率
（％）を測定することにより０１１０．２０．３０．４
０．５０及び６０分て評価した。また、洗剤及び水を含
むブランクを評価した。洗剤はその評価を妨害しなかっ
た。

結　　　果残存する活性（％）３０　　　　　１　００　　　　　　　　　　　　４０
、８４　０　　　　　　９８、８　　　　　　　　　　
２０．１５　０　　　　　　９０、９　　　　　　　　
　　　　７．９６　０　　　　　　７７、９　　　　　
　　　　　　　４．９上記のデータから、シュードモナ
ス・プランタリイからのリパーゼは、アニオン性表面活
性剤及びノニオン性表面活性剤の混合物を含む模擬洗剤
洗浄条件に対して本来より一層安定であることかわかる
。

実施例２また、シュードモナス・プランタリイ及びシュードモナ
ス・グラジオリのリパーゼの相対安定性を、レバー・ブ
ラザーズ・インコーポレーション（Ｌｅｖｅｒ　Ｂｒｏ
ｔｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、）からのノニオン性洗浄配合物
を含む１ｇ／ｌのオール（ＡＬＬ、商標）洗濯洗剤粉末
を含む洗浄系中で試験した。１１当り３０００工ステラ
ーゼ単位の夫々のリパーゼを４５℃でオール洗浄系に添
加し、ｐＨ８，５及び４５°Ｃてトリブチリンのアラビ
アゴムエマルション中で生成されるブチレートの生成を
滴定して残存する酵素活性の比率（％）を測定すること
により０．１０．２０及び４０分て評価した。また、洗
剤及び水を含むブランクを評価した。洗剤はその評価を
妨害しなかった。

結果８９．２５９．９２４．７シュードモナス・グラジオリリパーゼ（これは同様のｐ
Ｈ最適値及び温度最適値を有する）と比較してシュード
モナス・プランタリイリパーゼの改良された安定性が、
特定の条件下で観察された。

この性質は、レキニラ−洗浄サイクル中の脂肪のよごれ
の増大された除去のために通常の洗剤配合物中に混合す
ることの他に、前浸軟（ｐｒｅ−ｓｏａｋ）用途または
洗浄の前のスポット清浄に有利である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アニオン性洗剤及び／またはノニオン性洗剤と組
合せた、種シュードモナス・プランタリイのバクテリア
から誘導されたリパーゼ。
（２）アルキルポリ（エチレングリセロール）エーテル
及びノニルフェニルポリ（エチレングリセロール）エー
テルからなる群から選ばれたノニオン性洗剤が含まれる
、請求項１記載の配合物。
（３）アルキルベンゼンスルホネート、脂肪アルコール
エーテルスルフェートまたはα−オレフィンスルホネー
トであるアニオン性洗剤を含む、請求項１記載の配合物
。
（４）リパーゼが粉末形態であり、配合物１ｍｇ当り０
．１〜１００リパーゼ単位の量で存在する、請求項１記
載の配合物。
（５）洗剤ビルダーがまた含まれる、請求項１記載の配
合物。
（６）洗剤ビルダーがカリウムジホスフェート、ナトリ
ウムトリポリホスフェート、クエン酸ナトリウム、ナト
リウムニトリロトリアセテートまたはケイ酸ナトリウム
である、請求項５記載の配合物。
（７）シュードモナス・プランタリイがＡＴＣＣ４３７
３３の同定特性を有する、請求項６記載の配合物。
（８）組成物１ｍｇ当り０．１〜１００リパーゼ単位の
、種シュードモナス・プランタリイのバクテリアから誘
導された粉末リパーゼと共にアニオン性洗剤及び／また
はノニオン性洗剤並びに洗剤ビルダーを含むことを特徴
とする、布洗浄組成物。
（９）シュードモナス・プランタリイがＡＴＣＣ４３７
３３の同定特性を有する、請求項８記載の組成物。