JPH04507003A

JPH04507003A - 非イオン界面活性剤の存在下酸性ｐＨにおいて固相ヘビールス抗原を被覆する方法

Info

Publication number: JPH04507003A
Application number: JP50267491A
Authority: JP
Inventors: フランシス，ブライアン
Original assignee: バクスター、ダイアグノスティックス、インコーポレイテッド
Priority date: 1989-11-29
Filing date: 1990-11-28
Publication date: 1992-12-03
Also published as: EP0455807A1; CA2045682A1; AU7160491A; EP0455807A4; WO1991008311A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】非イオン界面活性剤の存在下酸性ｐＨにおいて固相ヘビールス抗原を被覆する方法本光里坐宣量１、本発明の分野本発明は、結合ビールス抗原の活性を増強するため、非イオン界面活性剤の存在下酸性ｐＨにおいて固相ヘビールス抗原を被覆する方法に関する。

２、先行技術の説明抗体は、研究および診断アッセイのため、マイクロタイタープレートおよびラテックスビーズのような固相へ固定化される。しかしながら、膜関連タンパクに対するモノクローナル抗体の検出は、膜抗原を可溶化するために使用する非イオン界面活性剤がラテックスマイクロタイターウェルへのタンパクの結合を阻害もしくは阻止するので問題を提供する。Ｇ、Ｄｒｅｘｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

９５　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、Ｍｅｔｈ、１１７　（１９８６）’界面活性剤の存在下抗原の低い量を用いるマイクロタイタープレートの効率的被覆のためのすばやい簡単な方法」およびＧａｒｄａｓ　ｅｔａｌ、１０６　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、Ｍｅｔｈ、２５１　（１９８８）「界面活性剤の存在下タンパクの被覆」参照。この問題は過去において種々の解決法を提供した。ある研究者は、界面活性剤の存在下抗原を固定化するためグルタルアルデヒドの使用を提案した。Ｇ。

Ｅｖａｎｓ、７３　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、４２７　（１９８４）参照。

他の研究者は、非イオン界面活性剤で可溶化した抗原の結合を増大するためブーアン液の使用を提案した。Ｎｏｔｅｂｏｏｍ　ｅｔａｌ、、７５　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、Ｍｅｔｈ、１４１　（１９８４）参照。さらに別の研究者は、残存非イオン界面活性剤を吸着するビーズを使用する、マイクロタイタープレートへの抗原の結合を増大する方法を開示した。前出Ｄｒｅｘｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、参照。しかしながら−人の著者は、高い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）、すなわちミセルの形成を許容する界面活性剤の濃度で界面活性剤を使用する限り、タンパクをラテックス表面へ効率的に結合できることを提案した。前出Ｇａｒｄａｓ参照。この研究者は、他の界面活性剤のうち非イオン界面活性剤トリトンＸ−１００を０．２または０．　５％の濃度およびｐＨ９゜６においてテストした。この実験から、この分野の当業者はこの非イオン界面活性剤、すなわちトリトンＸ−１００は最低濃度の一つにおいて結合を阻止し、そしてイムノアッセイに使用するためにはまずい選択に見えると結論するであろう。

主光ユ■塁！本発明は、トリトンＸ−１００またはＮＰ４０のような非イオン界面活性剤の存在下、酸性ＰＨにおいて、固相をビールス抗原で被覆することにより、固相上のビールス抗原の濃度を増大する方法に間する。

日の−　な量■ 抗原は被覆緩衝液中に希釈され、そして粒子へ添加された。この被覆緩衝液は好ましくは５％ＮＰ４０を加えた０、１Ｍ酢酸塩、　ｐＨ５，０よりなるが、しかしトリトンｘ−ｉｏｏのような他の非イオン界面活性剤も使用することができる。しかしながら、一種の非イオン界面活性剤トウイーンはイムノアッセイを実施するのに十分に高い抗原濃度をもたらさないことが観察された。界面活性剤の濃度は０．２％ないし１０％の範囲内であることができ、最適濃度は約１％ないし約ｌＯ％の間である。ｐＨは４．０ないし６．０の範囲内であることができ、最適ｐｉ−１は５．０であることが観察された。

実施例ＩＮＰ４０および゛　ＨるＨｒＶ−■」３〜４ミクロンのカルボキシル化した磁性粒子４Ｘ１０”粒子／酸液１〆をペレット化し、そして上清を注意深く除去し、捨てた。

粒１−５％ＮＰ４０およびＨＩＶ抗原２５０ｐｇ／ｄを含む、０゜１Ｍ＃酸塩緩衝液、ｐＨ５，０の１７へ再懸濁した。粒子をペレット化し、上清を捨てた。粒子をＰＢＳの１ｄへ再懸濁し、ペレット化し、上清を捨てた。これを２回くり返した。粒子を希釈剤（０゜１Ｍ酢酸塩、ｐＨ５，ｏ、ｏ、５Ｍ　ＮａＣｌ２，１％　ＮａＮ５）ｌ／Ｒｆｌに再懸濁し、２〜８°Ｃで貯蔵した。

実施例２被覆条止ｑ止較ＨＩ　Ｖ抗原を含む溶液５ｄをＯ，１Ｍ酢酸塩ＰＨ５の４１の３回交換に対して透析した。３種の異なる被覆緩衝液を評価した。緩衝液Ａは０．１Ｍ酢酸塩をｐＨ５，０において含んでいた。１１ｋ衝液Ｂは０．１Ｍ酢酸塩、ＯｌＬＭ　ＮａＣｊ！をＰＨ５，０において含んでいた。緩衝液ＣはＯ，１Ｍ酢酸塩、０．　ＩＭ　ＮａＣｊ！、０．　２ＮＰ４０をｐＨ５，０において含んでいた。

ＨＴＶ陰性血清を°′６１７”と命名し、陽性を”°６１８”と命名し、そして高度に陽性の血清を′″Ｒ−Ｊ　１８２５”と命名した。

これら血清はサンプル希釈緩衝液（３２％子ウシ血清、０．０２Ｍリン酸塩、ｐＨ７，４，０，５Ｍ　ＮａＣＱ、１％ＮＰ４０および０．１％　ＮａＮ、）中に１／１００に希釈した。

透析した調製品を被覆緩衝液Ａ、ＢおよびＣで１／２希釈し、２゜５％カルボキシル化常磁性粒子（３，５μｍ）の１ｍ上に被覆した。

粒子を２〜８　”Ｃで一夜インキユベートした。粒子をペレット化し、上清を捨て、粒子を０．１Ｍ酢酸塩、ｐＨ５，０中１％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中に再懸濁した。

被覆した粒子を室温で２時間インキュベートし、ｌｄ等張緩衝化食塩水（ＩＢＳ）で３回洗った。

粒子の２０μ！（１×１０？粒子／ｄ）をサンプル（ＳＢＤ中１／１００）５０ μｌへ加えた。この混合物を３７°Ｃで３０分間インキュベートした。未結合物質を除去するため固相を洗った。β−グルコダーゼで標識したヤギ抗ヒト抗体５０μ２を混合物へ加えた。

この混合物を次に３７°Ｃで１５分間インキュベートした。未結合抗体を除去するため混合物を洗い、基質（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）５０μ２を加えた。

Ｐａｎｄｅｘ　ＦＣＡ機器を使用して２分および１４分において螢光を読んだ。

結果を以下に報告する。

（以下余白）緩衝液Ａ　Ｏ，５６０１，３±１１１．７　４３２９　（７，２）　１６１９１（２６，９）緩衝液８　３　７５０．３＋９８．５　４２８７　（５，７）　１９０５９（２５，４）緩衝液Ｃ０４７３±３６．３　４０９６．３（１１，７）　１２６６９（２６，８）チャンネル報告　４０ｆ）／４５０利得設定　１０読み時間　１００１ｌｓｌＩ！街液Ａ　８　７８１．’３土１４５．５　５４４９．７（７，０＞　１９７３８Ｃ２５，３）緩衝液Ｂ　７．５　９７０．７±１３０．６　５２８７．７（５，４）　２３４８４（２４，２）緩衝液Ｃ０６１１，７±５９．５　５１３６．７（８，４）　１５４３４（２５，２）チャンネル報告　４００／４５０利得設定　１０読み時間　１００削Ｓ緩衝液Ａ　７．５　１８０　１１２０．７（６，２）　３５１７（１９，７）緩衝液Ｂ　４．５　２２０．４　１０００．７（４，５）　４４２５（２０，１）緩衝液ＣＯ１３Ｂ、７　１０４０．４（７，５）　２７６５（１，９，９）デルタ読み（表２−表１）級渣被覆緩衝液ＣはＯ，１Ｍ酢酸塩、Ｏ，ＬＭ　ＮａＣｐ、、および０゜２％ＮＰ４０を含んでおり、そして固相上にビールス抗原のより大きい濃度をもたらした。

非イオン界面活性剤の存在下および酸性ｐｌ（において被覆したエイズ抗原は、他の緩衝液を用いて被覆した粒子を上廻る増強された活性を有するビールス被覆粒子をもたらした。

田恣１ｆｆｉ杏槁失

Claims

【特許請求の範囲】

１．固相を、非イオン界面活性剤の酸性懸濁液中のビールス抗原と緩衝液で被覆することよりなる方法によって製造された、ビールス抗原で被覆した活性固相。
２．前記界面活性剤の濃度は０．２ないし１０％の範囲内である請求項１の活性固相。
３．前記固相は常磁性微粒子である請求項１の活性固相。
４．前記界面活性剤はＮＰ４０またはトリトンＸ−１００である請求項１の活性固相。
５．前記懸濁液のｐＨは約４．０ないし６．０の範囲内である請求項１の活性固相。
６．前記ｐＨは約５．０である請求項１の活性固相。