CN116990503A - 在胶体金表面固定抗体的方法及试纸条制备方法及试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在胶体金表面固定抗体的方法，包括如下制备步骤：s1，将标记抗体加入到胶体金标记物混悬液A中，混匀；s2，将混匀后的胶体金溶液加入到偶联加速剂B中，震荡混匀后离心处理；s3，离心后弃去偶联加速剂B，加超纯水后离心处理；s4，将步骤s3中离心后的产物弃去上清，加洗脱液C，离心处理后弃除上清，用重悬液D对沉淀重悬。本发明还公开了基于该方法的试纸条制备方法及试纸条。本发明的优点在于：能够检测到抗原分子最低检测不超过0.1ng/mL，以新冠病毒的N蛋白为例，整体优于基于传统的金纳米粒子与蛋白偶联的免疫层析试纸条的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及免疫层析检测领域，尤其涉及一种在胶体金表面固定抗体的方法及试纸条制备方法及试纸条。
背景技术
常见胶体金是指金微小粒子(1-100nm)分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶。胶体金标记抗体溶液是指用蛋白质(抗原、抗体)标记胶体金后得到的溶液。基于胶体金的免疫层析试纸条用于抗原物质的半定量或定性检测，具有检测速度快、灵敏度高、成本低廉的优点，因而备受关注。
在制备胶体金免疫层析试纸条过程中，胶体金标记抗体是关键的步骤。现有的胶体金标记抗体技术是通过吸附法，但是，全流程下来需要10h以上，效率低，且形成的复合物不稳定，易聚沉，从而造成标记失败。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何快速高效且能保持胶体金标记抗体复合物稳定，针对上述要解决的技术问题，现提出在胶体金表面固定抗体的方法及试纸条制备方法及试纸条。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种在胶体金表面固定抗体的方法，包括如下制备步骤：
s1，将标记抗体加入到胶体金标记物混悬液A中，混匀；
s2，将混匀后的胶体金溶液加入到偶联加速剂B中，震荡混匀后离心处理；
s3，离心后弃去偶联加速剂B，加超纯水后离心处理；
s4，将步骤s3中离心后的产物弃去上清，加洗脱液C，离心处理后弃除上清，用重悬液D对沉淀重悬。
进一步的，所述偶联加速剂B为丁醇。
进一步的，所述洗脱液C为含有1％质量分数的BSA的1x磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述重悬液D的配比按照每10mL含有22.7μL的Tween-20、0.5gBSA、1g蔗糖和0.076gNa3PO4·12H2O配制。
进一步的，所述胶体金标记物为浓度为10OD平均粒径为20nm的胶体金溶液。
本发明的另一个目的是提供一种基于上述胶体金表面固定抗体的方法的免疫层析试纸条制备方法，包括下列步骤：
a1，在反应膜上分别固定识别目标病毒的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，形成检测区和质控区；
a2，制备被金纳米粒子偶联标记的目标病毒的包被抗体，并喷涂在结合垫上，烘干备用；
a3，将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上；
a4，在PVC底板上依次固定样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；
a5，在结合垫上吸附检测探针与抗体的偶联物，在硝酸纤维素膜的检测线喷涂捕获探针，在质控线喷涂质控探针，得到所述目标病毒抗原的免疫层析试纸条。
进一步的，所述捕获探针的喷涂量为1.0-2.0μL/cm；所述质控探针的喷涂量为1.0-3.0μL/cm；所述检测探针与抗体的偶联物的吸附量为6-10μL/cm。
本发明还提供一种基于上述免疫层析试纸条制备方法制备的免疫层析试纸条，其包括底板和顺次连接在底板上的样品垫、结合垫、测试垫和吸收垫，所述结合垫上喷涂有检测探针与金纳米粒子负载的抗体偶联物；所述检测探针为特异性抗体；所述检测探针与待检测蛋白抗原分子能够进行特异性结合；所述检测垫上设置有检测线和质控线；所述检测线上喷涂有捕获探针抗体；所述捕获探针为与偶联抗体有不同抗原结合位点的抗体；所述质控线上喷涂有羊抗鼠抗体IgG。
进一步的，所述金纳米粒子的粒径为10-50nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过利用胶体金标记，丁醇脱水，大幅度提高偶联的时间，比传统的吸附法更加稳定，不易聚沉，应用后的检测准确性得到大大提升；相比较于传统吸附法技术，该技术方案可大幅度缩短检测时间；相比于ELISA检测方法，成本低廉，检测过程简单。
附图说明
图1为本发明中的胶体金表面固定抗体的方法的流程图；
图2为本发明实施例1中的新冠基于丁醇脱水固定抗体在胶体金表面的免疫层析快速试纸条的检测结果示意图；
图3为本发明实施例2中的CEA基于丁醇脱水固定抗体在胶体金表面的免疫层析快速试纸条的检测结果示意图；
图4为本发明实施例3中的AFP基于丁醇脱水固定抗体在胶体金表面的免疫层析快速试纸条的检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本具体实施例披露了胶体金-新冠病毒N蛋白抗体偶联物的制备及基于该偶联物制备的新冠病毒N蛋白检测免疫层析试纸条的过程以及新冠病毒N蛋白抗原的检测过程。
1、胶体金-新冠病毒N蛋白抗体偶联物的制备
(1)将1.5μL标记抗体(新冠病毒N蛋白抗体)加入到100μL胶体金标记物混悬液(A)中，混匀。其中胶体金标记物为浓度为10OD平均粒径为20nm的胶体金溶液；
(2)将混匀后的100μL胶体金溶液加入到700μL偶联加速剂(B)中，震荡混匀5s，然后8000rpm离心10s；
(3)弃去偶联加速剂(B)，加100μL超纯水，8000rpm离心10min。其中偶联加速剂为丁醇)；
(4)弃去上清，加100μL洗脱液(C)，8000rpm离心10min，去上清，用100μL重悬液(D)对沉淀重悬。其中洗脱液为含有1％(质量分数)BSA的1x磷酸盐(PBS)缓冲液，重悬液母液为10mL含有22.7μLTween-20、0.5gBSA、1g蔗糖、和0.076gNa3PO4·12H2O。
2、新冠病毒N蛋白检测免疫层析试纸条制备
在结合垫上喷5μL上述制备的胶体金-新冠病毒N蛋白抗体偶联物，烘干。在测试垫上的检测线和质控线分别依次包被新冠病毒N蛋白的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，新冠病毒N蛋白的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体的终浓度均为2mg/mL。将吸水垫、样品垫按顺序粘贴在测试垫的PVC底板上，相邻部位连接处重合部分长度0.28cm，组装好的试纸条用切条机切割成0.29cm。
3、新冠病毒N蛋白抗原的检测
用缓冲液稀释新冠病毒N蛋白标品，浓度分别为0ng/mL、0.1ng/mL、0.27ng/mL、0.54ng/mL、1ng/mL、5.4ng/mL、54ng/mL、540ng/mL、5400ng/mL，然后用上述制备的新冠病毒N蛋白检测免疫层析试纸条进行检测，15min后查看检测结果。结果表明(图3)，其最低检测限为0.54ng/mL。其中稀释液为含有1％(质量分数)BSA的1x磷酸盐(PBS)缓冲液。
可行的，上述制备的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的免疫层析快速检测试纸条，其中，试纸条在支撑底板上面依次固定有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫；所述的结合垫上固定有被胶体金偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体；所述的反应膜上依次是检测线和质控线；所述的反应膜为结合聚合物的硝酸纤维素膜，所述的支撑底板为PVC底板，所述的该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区；所测样本为待测者咽拭子分泌物及其稀释液、胃肠道分泌物及其稀释液、粪便及其稀释液。
其中，包被抗体偶联的胶体金，其发射波长在500nm-550nm，粒径在10nm-50nm。
所述的结合垫上固定有被胶体金偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体，所述的偶联标记的SARS-CoV-2的抗体的终浓度为0.03-0.1mg/ml。
可行的，反应膜上的检测线和质控线分别依次包被新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体的终浓度分别为1-2mg/ml和0.5-1.0mg/ml，在所述反应膜上的包被量为0.9-1.1ml/cm。
所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的免疫层析快速检测试纸条，其特征在于所述样本垫与结合垫重合，重合部分长度约0.2-0.4cm；所述结合垫与反应膜有部分重合，重合部分长度约0.2-0.4cm；所述反应膜与吸水垫有部分重合，重合部分长度约0.2-0.4cm；所述底板的宽度是0.3-0.5cm。
所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的免疫层析试纸条，其特征在于所述的反应膜为结合聚合物的硝酸纤维素膜，所述的支撑底板为PVC底板，所述的该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区。
可行的，上述长度范围和浓度范围等均表示在所设置范围内，试纸均可以发挥有效作用。
可行的，上述试纸条的制备过程包括下列步骤：
1)在反应膜上分别固定识别新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，形成检测区和质控区；
2)制备被胶体金偶联标记的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的包被抗体，并喷涂在结合垫上，并烘干备用；
3)在底板上依次固定有样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫，得到所述快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的免疫层析试纸条。
经过试验测试，上述试纸条的检出率不低于现有核酸检测方法检出率的80％。
实施例2
1、胶体金-癌胚抗原(CEA)抗体的制备
(1)将1.0μL标记抗体(癌胚抗原抗体)加入到100μL胶体金标记物混悬液(A)中，混匀；
(2)将混匀后的100μL胶体金溶液加入到600μL偶联加速剂(B)中，震荡混匀7s，然后8000rpm离心15s；
(3)弃去偶联加速剂(B)，加100μL超纯水，8000rpm离心15min；
(4)弃去上清，加100μL洗脱液(C)，8000rpm离心15min，去上清，用100μL重悬液(D)对沉淀重悬。
2、癌胚抗原免疫层析试纸条的制备
在结合垫上喷5μL上述制备的胶体金-癌胚抗原抗体偶联物，烘干。在测试垫上的检测线和质控线分别依次包被癌胚抗原的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，癌胚抗原的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体的终浓度均为2mg/mL。将吸水垫、样品垫按顺序粘贴在测试垫的PVC底板上，相邻部位连接处重合部分长度0.28cm，组装好的试纸条用切条机切割成0.29cm。
3、癌胚抗原的检测：
用缓冲液稀释癌胚抗原标品，浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL，然后用上述制备的癌胚抗原检测免疫层析试纸条进行检测，15min后查看检测结果。结果表明(图4)，其最低检测限为5ng/mL。
可行的，针对癌胚抗原(CEA)的试纸条制备方法和试纸条的结构，整体步骤将实施1中的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体替换为CEA识别抗体即可实现。
具体概括步骤如下：
a1，在反应膜上分别固定识别目标病毒的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，形成检测区和质
控区；
a2，制备被金纳米粒子偶联标记的目标病毒的包被抗体，并喷涂在结合垫上，烘干备用；
a3，将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上；
a4，在PVC底板上依次固定样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；
a5，在结合垫上吸附检测探针与抗体的偶联物，在硝酸纤维素膜的检测线喷涂捕获探针，在质控线喷涂质控探针，得到所述目标病毒抗原的免疫层析试纸条。
其中，捕获探针的喷涂量为1.0-2.0μL/cm；所述质控探针的喷涂量为1.0-3.0μL/cm；所述检测探针与抗体的偶联物的吸附量为6-10μL/cm。
实施例3
1、胶体金-甲胎蛋白(AFP)抗体偶联物的制备
(1)将2.5μL标记抗体(甲胎蛋白抗体)加入到100μL胶体金标记物混悬液(A)中，混匀；
(2)将混匀后的100μL胶体金溶液加入到800μL偶联加速剂(B)中，震荡混匀10s，然后8000rpm离心20s；
(3)弃去偶联加速剂(B)，加100μL超纯水，8000rpm离心20min；
(4)弃去上清，加100μL洗脱液(C)，8000rpm离心15min，去上清，用100μL重悬液(D)对沉淀重悬。
2、甲胎蛋白(AFP)免疫层析试纸条的制备
在结合垫上喷5μL上述制备的胶体金-甲胎蛋白抗体偶联物，烘干。在测试垫上的检测线和质控线分别依次包被甲胎蛋白的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，甲胎蛋白的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体的终浓度均为2mg/mL。将吸水垫、样品垫按顺序粘贴在测试垫的PVC底板上，相邻部位连接处重合部分长度0.28cm，组装好的试纸条用切条机切割成0.29cm。
3、甲胎蛋白(AFP)的检测
用缓冲液稀释甲胎蛋白标品，浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL，然后用上述制备的甲胎蛋白检测免疫层析试纸条进行检测，15min后查看检测结果。其最低检测限为1ng/mL。
可行的，针对癌胚抗原(CEA)的试纸条制备方法和试纸条的结构，整体步骤将实施1中的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体替换为CEA识别抗体即可实现。
具体概括步骤如下：
a1，在反应膜上分别固定识别目标病毒的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，形成检测区和质
控区；
a2，制备被金纳米粒子偶联标记的目标病毒的包被抗体，并喷涂在结合垫上，烘干备用；
a3，将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上；
a4，在PVC底板上依次固定样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；
a5，在结合垫上吸附检测探针与抗体的偶联物，在硝酸纤维素膜的检测线喷涂捕获探针，在质控线喷涂质控探针，得到所述目标病毒抗原的免疫层析试纸条。
其中，捕获探针的喷涂量为1.0-2.0μL/cm；所述质控探针的喷涂量为1.0-3.0μL/cm；所述检测探针与抗体的偶联物的吸附量为6-10μL/cm。
对本发明实施例1-3中制备的胶体金-抗体偶联物与传统的室温孵育法制备的胶体金-抗体偶联物进行了稳定性对比，发现本发明制备的胶体金标记抗体稳定性好，不会发生聚沉。
实施例4
本具体实施例披露了一种用于快速胶体金标记抗体的试剂盒，其基于上述实施例1-3中所披露的方法制备，其包含以下组分：
胶体金标记物混悬液(A)、偶联加速剂(B)、洗脱液(C)和重悬液(D)。
其中，胶体金标记物混悬液(A)包含磷酸缓冲液(PBS)、牛血清白蛋白(BSA)和胶体金。
偶联加速剂(B)可以乙醇、丁醇、戊醇中的一种或多种，在本具体实施例中优选采用丁醇。
此外，所述洗脱液(C)为磷酸缓冲液(PBS)，重悬液(D)包含磷酸三钠、牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖和Tween-20，作为本实施例中的优选方式，重悬液(D)包含0.6-0.8％磷酸三钠，3-6％牛血清白蛋白(BSA)，10-15％蔗糖和0.1-0.3％Tween-20，余量为超纯水，以质量分数计。
其中，胶体金标记物混悬液(A)包含75-85％磷酸缓冲液(PBS)、10-15％牛血清白蛋白(BSA)和5-10％胶体金，以质量分数计。
偶联加速剂(B)的用量为胶体金标记物混悬液(A)质量的6-8倍。
洗脱液(C)为浓度0.01-0.1mol/L的磷酸缓冲液(PBS)。
此外，上述试剂盒制备胶体金标记抗体的方法，将待标记的抗体加入胶体金标记物混悬液(A)中，快速摇匀后立即加入偶联加速剂(B)，轻微震荡后离心，弃去偶联加速剂(B)；然后加入超纯水并离心，离心结束后弃上清液，加入洗脱液(C)重悬沉淀物并二次离心；离心结束后弃上清液，加入重悬液(D)混匀，得到胶体金标记抗体。
上述免疫层析试纸条可以在新冠病毒N蛋白抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白检测中的应用。
本发明提供的基于丁醇脱水固定抗体在胶体金表面的方法及在免疫层析试纸条的应用，检测以蛋白抗原为靶标的免疫层析试纸条，其金纳米粒子负载的抗体偶联物比传统的吸附法更加稳定，并且能快速偶联抗体以及易于进行化学修饰反应等特点。本发明基于丁醇脱水固定抗体在胶体金表面的方法及在免疫层析试纸条的应用。经过试验，基于丁醇脱水固定抗体在胶体金表面的方法用肉眼能够检测到抗原分子最低检测不超过0.1ng/mL(以新冠病毒的N蛋白为例)，整体优于基于传统的金纳米粒子与蛋白偶联的免疫层析试纸条的检测方法。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种在胶体金表面固定抗体的方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
s1，将标记抗体加入到胶体金标记物混悬液A中，混匀；
s2，将混匀后的胶体金溶液加入到偶联加速剂B中，震荡混匀后离心处理；
s3，离心后弃去偶联加速剂B，加超纯水后离心处理；
s4，将步骤s3中离心后的产物弃去上清，加洗脱液C，离心处理后弃除上清，用重悬液D对沉淀重悬，得到固定有抗体的胶体金粒子。
2.根据权利要求1所述的一种胶体金表面固定抗体的方法，其特征在于，所述偶联加速剂B为乙醇、丁醇、戊醇中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的一种胶体金表面固定抗体的方法，其特征在于，所述洗脱液C为含有0.1％-1％质量分数的BSA的1x磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的一种胶体金表面固定抗体的方法，其特征在于，所述重悬液D的配比按照每10mL含有22.7μL的Tween-20、0.5g牛血清白蛋白、1g蔗糖和0.076gNa3PO4·12H2O配制。
5.根据权利要求4所述的一种胶体金表面固定抗体的方法，其特征在于，所述胶体金标记物混悬液A由75-85％质量分数的磷酸缓冲液、10-15％质量分数的牛血清白蛋白和5-10％质量分数的胶体金组成。
6.根据权利要求5所述的一种胶体金表面固定抗体的方法，其特征在于，所述胶体金标记物为浓度为10光密度平均粒径为20nm的胶体金溶液。
7.一种基于权利要求1-6任意一项所述的胶体金表面固定抗体的方法的免疫层析试纸条制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
a1，在反应膜上分别固定识别目标病毒的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，形成检测区和质控区；
a2，制备被金纳米粒子偶联标记的目标病毒的包被抗体，并喷涂在结合垫上，烘干备用；
a3，将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上；
a4，在PVC底板上依次固定样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；
a5，在结合垫上吸附检测探针与抗体的偶联物，在硝酸纤维素膜的检测线喷涂捕获探针，在质控线喷涂质控探针，得到所述目标病毒抗原的免疫层析试纸条。
8.根据权利要求7所述的一种免疫层析试纸条制备方法，其特征在于，所述捕获探针的喷涂量为1.0-2.0μL/cm；所述质控探针的喷涂量为1.0-3.0μL/cm；所述检测探针与抗体的偶联物的吸附量为6-10μL/cm。
9.一种基于权利要求7或8所述的免疫层析试纸条制备方法制备的免疫层析试纸条，包括底板和顺次连接在底板上的样品垫、结合垫、测试垫和吸收垫，其特征在于，所述结合垫上喷涂有检测探针与金纳米粒子负载的抗体偶联物；所述检测探针为特异性抗体；所述检测探针与待检测蛋白抗原分子能够进行特异性结合；所述检测垫上设置有检测线和质控线；所述检测线上喷涂有捕获探针抗体；所述捕获探针为与偶联抗体有不同抗原结合位点的抗体；所述质控线上喷涂有羊抗鼠抗体IgG。
10.根据权利要求9所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述金纳米粒子的粒径为10-50nm。
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