JPH04505552A - 哺乳動物宿主細胞における組み込み部位非存性遺伝子発現用のベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２６、請求の範囲第２１項から第２４項までのいずれか１項に記載のベクターで 形質転換されたヒトまたは動物の宿主細胞を培養することよりなる、ポリペプチ ドの産生方法。

浄書（内容に変更なし） 明　細　書 哺乳動物宿主細胞における組み込み 部位非存性遺伝子発現用のベクター 発明の分野 本発明は組換えＤＮＡ法に関し、特に目的の構造遺伝子を発現させるためのイン ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）およびインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で哺乳動物の 細胞をトランスフェクションするのに有用なベクターに関する。本発明はまた遺 伝子療法や異種遺伝子発現への該ベクターの使用に関高レベルの発現をする改良 された発現ベクターに対するニーズが引続き存在する。特に目的のポリペプチド の工業生産や遺伝疾患の治療法の開発のために、哺乳動物細胞株に使用できる発 現ベクターの重要性が増加している。

性状解析された構造遺伝子は既に多く存在し、それらは適当な調節配列とともに 適当なベクターに挿入されて宿主細胞を形質転換するのに使用される。このよう な構造遺伝子と調節領域を哺乳動物細胞のゲノムへ組み込む場合の大きな問題は 、その発現がゲノム中の挿入された配列の位置に大きく依存するということであ る。このため発現レベルは大きく変化し、高レベルの発現があることはまれであ る。この組み込み部位依存性の問題は本特許により解決され、これは免疫グロブ リンの遺伝子から得られた特異的な配列（以後、優性調節領域（ｄｏｍｉｎａｎ ｔｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎｓ　、　Ｄ　ＣＲｓ　）と呼ぶ）の発見による 。

これは結合した遺伝子系に対して、細胞型に制限される、組み込み部位非存性の 、コピー数依存性の発現性質を与える。

２つの哺乳動物の遺伝子系がＤＣＲを有していることが示されている：すなわち β一様グロビン遺伝子（エフ・ジー、グロスベルト（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ、　Ｆ、 　Ｇ、　）ら、セル（Ｃｅｌｌ）　、第５１巻、（１９８７年）、９７５頁；国 際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００６５５号）と、ヒトＣＤ２Ｔ細胞マーカー 遺伝子（ジー、ラング（Ｌａｎｇ　Ｇ、）ら、イーエムビーオージエイ（ＥＭＢ ＯＪ）　、第７巻、（１９８８年）、１６７５頁：国際特許出願Ｐ　ＣＴ／ＧＢ 　８８１００６５５号）である。

通常のすべての調節領域を含むβ−グロビンのような哺乳動物遺伝子が形質転換 （ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）マウスに導入される時、この遺伝子はマウスのβ−グ ロビン遺伝子と同じレベルでは発現されず、組み込み位置の影響を受ける。この 特徴は注入された遺伝子のマウスのゲノム中でのコピー数とは相関しない、発現 レベルが非常に変化しやすい形質転換遺伝子Ｃｔｒａｎｓｇｅｎｅ　）であるこ とである。

同様の現象は形質転換マウスについてこれまで研究されているほとんどすべての 遺伝子について見いだされている（バルミ９−（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）ら、アン・ レブ・ジエニト（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、）、（１９８６年）、第２ ０巻、４６５−４９９頁）。さらにβ−グロビンの場合注入された各遺伝子の発 現レベルは、多くても内因性のマウス遺伝子のそれより１オーダー小さい（マグ ラム（Ｍａｇ−ｒａｍ　）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、（１９８５年）、 第３１５巻、３３８−３４０頁；トウネス（Ｔｏｗｎｅｓ）ら、イーエムビーオ ージエイ（ＥＭＢＯＪ、）、（１９８５年）、第４巻、１７１５−１７２３頁： コリアス（Ｋｏｌｌｉａｓ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、（１９８６年）、第４６巻 、８９−９４頁）。β−グロビンまたは他の遺伝子をトランスフェクションまた はレトロウィルス感染により培養細胞に導入した時も類似の問題が観察される。

これは幹細胞の遺伝子付加による遺伝子療法を考える時大きな問題となる。これ はまた組換えＤＮＡ産物の培養細胞中での発現に対しても大きな問題となる。ベ クターの発現が最適である細胞株を同定するには、産生能の高いクローンの広範 囲のスクリーニングが必要であり、天然に存在する遺伝子（例えば赤白血球病細 胞株中でのβ−グロビン）の発現に匹敵する発現レベルを達成するためには、ベ クター増幅の選択または多コピーのウィルスベクターの使用か一般的に必要であ る。

染色体中で遺伝物質はクロマチンと呼ばれるＤＮＡ／蛋白複合体中に詰め込まれ ており、その１つのの影響は機能の目的のためのＤＮＡの利用が限られることで ある。

多くの遺伝子系（β−グロビン系を含む）は、いわゆるＤＮａｓｅ　Ｔ高感受性 部位（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　５ｉｔｅｓ）を有していることは既に確 立されている。このような部位は制御領域と推定され、例えば制御蛋白との相互 作用によりまたはこのような相互作用を起こすために、正常のクロマチン構造か 変化している。

い（つかの「超」高感受性部位を育するβ一様グロビン遺伝子ローカスの横にあ る（　ｆ　１ａｎｋ　ｉｎｇ）領域が同定されている。これらの部位は、発現さ れる時に各遺伝子の中や回りに見られる部位よりも、ＤＮａｓｅ　Ｉ消化に対す る感受性が高い（ファン（Ｔｕａｎ）ら、ピーエヌエーエスユーエスエー、（Ｐ ＮＡＳ　ＵＳＡ）、（１９８５年）、第３２巻、６３８４−６３８８頁；グロウ ダイン（Ｇｒｏｕｄｉｎｅ）ら、ビーエヌエーエス　ニーニスニー、（ＰＮＡＳ 　ＵＳＡ）、（１９８３年）、第８０巻、７５５１−７５５５頁）。

さらにこれらは赤芽球細胞に特異的であり、いずれかのグロビン遺伝子が発現さ れる時に存在する。

ファン（Ｔｕａｎ）ら「β一様」グロビン遺伝子の５′境界領域の４つの主要な りＮａ５ｅ　Ｉ高感受性部位のおおまかなマツピングについて記載している。わ れわれはこれらの部位のいくつかの配列は多くの転写エンハンサ−にも見いださ れることに注目しており、これはこの部位がエンハンサ−機能を育しており赤芽 球特異細胞性因子により認識されるかも知れないことを示唆している。

無傷の（ｉｎｔａｃｔ）　５’　と３′境界領域を有する完全なβ−グロビン遺 伝子は、組み込み部位依存性を示さないことは発見されている（同時出願国際特 許出願第ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００６５５号を参照）。この重要な特徴に関与す るローカスの領域は決定されており、ＤＮａｓｅ　１超高感受性部位に関連して いることが証明されている。

これらの優位調節領域はエンハンサ−とはきわめて異なり、既知のエンハンサ− が示さない組み込み部位非依存性をしめす。この優性調節領域は既知のプロモー ター／エンハンサ−成分とともに使用されると、天然の遺伝子の完全な転写速度 を再構成する。

遺伝子発現を制御する配列を同定するため、免疫グロブリン遺伝子は広範囲に研 究されてきた。免疫グロブリン分子は２つの同一の重いポリペプチド鎖と２つの 同一の軽いポリペプチド鎖からなる。軽鎖はに壓かまたはλ型である。重鎖、に 軽鎖そしてλ軽鎖をコードする遺伝子は、マウスやヒトでそれぞれ別々の染色体 上に存在する。

連続的なゲノムＤＮＡ配列から転写される多くの遺伝子とは異なり、免疫グロブ リン遺伝子は生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）中で広く分離している遺伝子切片か ら形成される。

機能的には重鎮遺伝子は、分子の可変領域（Ｖ）、多様性領域（Ｄ）、結合領域 （Ｊ）／定常領域（Ｃ）をコードする３つのゲノム切片の組換えにより形成され る（図Ｉ）。機能性軽鎖遺伝子は２つの切片の結合により形成され、１つはＶ領 域をコードし他はＪ／Ｃ領域をコードする。重鎖およびに軽鎖のローカスとも１ ０００ｋｂは充分越えると予想される多くのＶ遺伝子切片（１００から１０００ の間で変化すると予想される）を含む（図１）。これに対してλローカスははる かに小さく、最近マウスの第１６染色体上で約３００ｋｂにわたっていることが 証明された。これは４つの結合／定常領域遺伝子切片と２つの可変遺伝子切片か らなる（第１図）。機能性遺伝子に至る組換えは主としてｖｌとＪ、／Ｃ，また はＪ　ｓ　／　Ｃ−成分の間、まりＩｔ　Ｖ　ｔとＪ、／Ｃ，成分（Ｊ４／Ｃ４ は擬遺伝子である）の間で起きるか、ｖ２とＪ、／Ｃ，またはＪ、／Ｃ，どの間 の組換えもまれに見られる。

再配列した重鎮とに軽鎖の遺伝子の転写の調節は、■領域の上流にある組織特異 的プロモーターの活性（ジェイ・オー、メーソン（Ｍａｓｏｎ、Ｊ、　Ｏ，）ら 、セル（Ｃｅｌｌ）、（１９８５年）、第４１巻、４７９頁：ワイ、バーブマン （Ｂｅｒｇｍａｎ、　Ｙ　）ら、ビーエヌエーエス　ニーニスニー（ＰＮＡＳ　 ＵＳＡ）、（１９８４年）、第８１巻、７０４Ｉ頁）とＪ−Ｃイントロン中にあ る組織特異的エンハンサ−（ニス・ディー、ギリーズ（Ｇｉｌｌｉｅｓ。

Ｓ、Ｄ、）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、（１９８３年）、第３３巻、７１７頁ニジエ イ、バネルジ（Ｂａｎｅｒｊｉ、　Ｊ　）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、（１９８３年 ）、第３３巻、７２９頁；ディー・ビカード（Ｐｉｃａｒｄ、Ｄ、）ら、オーチ ャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、第３０７巻、８０頁）の活性に依存する。

これらの成分は共同的に働く（ジェイ・ブイ、ガルシア（Ｇａｒｃｉａ、Ｊ、　 Ｖ、　）ら、オーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、（１９８６年）、第３２２巻、３ ８３頁）。最近２番目のＢ細胞特異的エンハンサ−がに軽鎖のローカス中で同定 された（ケー・ビー、マイアー（Ｍｅｙｅｒ、に、Ｂ、　）ら、イーエムビーオ ー・ジエイ（ＥＭＢＯＪ、）、（１９８９年）、第８巻、第７号、１９５９−１ ９６４頁）。このエンハンサ−はＣｋの９ｋｂ下流に存在している。

最近ビック−ライとクイーン（Ｒｉｃｈ−Ｔｈｕｙ　ａｎｄ　Ｑｕｅｅｎ）（１ ９８９エヌエーアール（ＮＡＲ）第１７巻：　５３０７頁）は再配列したλ、遺 伝子のすぐ下流にエンハンサ−活性があることを報告している。λ、遺伝子の下 流にある配列は、λ軽鎖を作るミエローマ細胞株（Ｊ５５８Ｌ）中にλ１プロモ ーターに結合したタロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） レポーター遺伝子の発現を増加させたが、に軽鎖を作るミエローマ細胞株中のそ れは増加させなかった。

このエンハンサ−活性はいくつかの点で重鎮とλ軽鎖のエンハンサ−活性とは異 なる。まず第一に、これは方向に対して著しい選択性がある。第２にこれは、独 立に転写を刺激しλ１コード配列のすぐ下流にある約４ｋｂのＤＮＡ上に広がっ ている数個の切片からなる。第３に、これは明らかにλ鎖産生ミエローマ細胞中 でのみ発現され、に軽鎖を産生ずる細胞中では発現されない。

スパンディトスとアンダーソン（Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ　ａｎｄＡｎｄｅｒｓｏｎ ）　（１９８４年　エフエフイービーニス（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　）第１７５ 巻：１５２頁）は、ミエローマ細胞をアミノグリコシド−ホスフォトランスフェ ラーゼ（ａｐｈ）遺伝子に結合した８ｋｂ断片を含有するプラスミツドで、ε− グロビンプロモーターの調節下にトランスフェクションすることにより得られた 、Ｇ４１８耐性コロニーを数を増加させるヒトスローカスから８ｋｂ断片（２つ の定常領域遺伝子切片を含む）を記載している。この作成体（ｃｏｎｓｔｕｃｔ ）を一時的にトランスフェクションさせると、８ｋｂ配列の欠如した作成体と比 較すると、ａｐｈ特異ｍＲＮＡのレベルが増加したと報告されている。しかしこ の一時的測定法ではトランスフェクション効率について対照は含まれておらず、 ヒトスローカス中のエンハンサ−活性についても何も報告も発表されていない。

再配列された重鎮またはに軽鎖を有するＤＮＡ断片は、リンパ球中にトランスフ ェクションされると発現するが、一般的に内因性免疫グロブリン遺伝子より少な くとも１０倍以上効率は低い（ブイ・ティー、オイ（Ｏｉ、　Ｖ、　Ｔ。

）ら、ピーエヌエーエス・ニーニスニー（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ）、（１９８３年） 、第８０巻、８２５頁：エム・ニス、ノイバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、 　Ｓ、　）　、イーエムビーオー・ジエイ（ＥＭＢＯＪ）、（１９８３年）、第 ２巻、１３７３頁）。しかし再配列されたλ１遺伝子を育する類似のＤＮＡＷｒ 片の発現は、トランスフェクションされたリンパ球中では検出されず、ＳＶ４０ エンハンサーが添加された時のみ発現が観察される（ディー、ピカード（Ｐｉｃ ａｒｄ、Ｄ　、　）ら、ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、（１９８４年）、第３ ０７巻、８０頁；アール・ディー、コーン（Ｃｏｎｅ、Ｒ，Ｄ、　）ら、サイエ ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）、（１９８７年）、第２３６巻、９５４頁）。これは 、に遺伝子のＪ−Ｃイントロン中に存在するような機能性エンハンサ−が欠如し ていることが原因と思われる。

に軽鎖や重鎮遺伝子に関連するプロモーターやエンハンサ−成分は、抗体遺伝子 のリンパ球特異的発現をさせるのに充分であるが、内因性抗体遺伝子の発現に比 較して発現レベルは低下しており、遺伝子は位置の影響を受け、発現レベルと導 入された遺伝子のコピー数のあいだには明瞭な関係が存在しない（ブイ・ティー 、才イ（Ｏｌ。

Ｖ、Ｔ、　）ら、ピーエヌエーエス・ニーニスニー（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ）、（１ ９８３年）、第８０巻、８２５頁：エム・ニス、ノイバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇ ｅｒ、Ｍ、Ｓ、　）、イーエムビーオー・ジエイ（ＥＭＢＯＪ）、（１９８３年 ）、第２巻、１３７３頁）。に軽鎖遺伝子と重鎮遺伝子か形質転換マウスに導入 された時、同様の結果か得られている（ニー、ストーブ（５ｔｏｒｂ　Ｕ、　） ら、アニュフルレビューオンイムノロジー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　［ｍｍｕｎｏ ｌ）、第５巻、（１９８７年）、１５１頁）。

従って抗体遺伝子の発現を完全に制御するのに必要な配列は、今日まで発現実験 に使用された作成体から、は欠如している（アール、グロシェドル（Ｇｒｏｓｓ ｃｈｅｄｌ、　Ｒ，）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、（１９８５年）、第５５巻、６４ ５頁）。

これまでλ１遺伝子の発現に関与すると示唆されてきた領域の外の再配列された λ、マウス免疫グロブリン遺伝子中に超高感受性部位を、われわれは同定した。

われわれの発見が強く意味するところは、免疫グロブリン遺伝子の発現は、β− グロビンやＣＤ２発現と共通の特徴があり、それは優性調節領域か存在するとい うことである。

多くの活性遺伝子はそれらのプロモーターに関連した高感受性部位を有している 。例えば、組織特異的ＤＮａｓｅＩ高感受性部位は、再配列したに免疫グロブリ ン遺伝子のコード領域の開始点から３００ｂｐ上流に観察される（エスーワイ、 チャン（Ｃｈｕｎｇ、　Ｓ　−Ｙ　）ら、ビーエヌエーエス・ニーニスニー（Ｐ ＮＡＳ　ＵＳＡ）　、第８０巻、２４２７頁）。本研究で研究された再配列され たλ１遺伝子中ではこのような部位は同定されず、また重鎮遺伝子（エフ・ミル ズ（Ｍｉｌｌｓ、　Ｆ　、　）ら、（１９８４年）、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ ）　、第３０６巻、８０７頁）とに軽鎖遺伝子（エスーワイ、チャン（Ｃｈｕｎ ｇ、　Ｓ　−Ｙ　）ら、ビーエヌエーエス・ニーニスニー（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ） 、第８０巻、２４２７頁）；ティー・ジー、バースロー（Ｐａｒｓｌｏｗ、Ｔ、 Ｇ、）　ら、エヌエーアール（ＮＡＲ）、（１９８３年）、第１１巻、４７７５ 頁；ワイシェット（Ｗｅｉｃｈｅｔ　）　ら、エヌエーアール（ＮＡＲ）、（１ ９８２年）、第１０巻、３６２７頁）の両方で免疫グロブリンエンハンサ−に関 連する高感受性部位が同定された場合も、Ｊ−Ｃイントロンにそのような部位は 同定されなかった。

グロスベルドら（エフ・ジー、グロスベルド（Ｇｒｏｓ　−ｖｅｌｄ、　Ｆ、　 Ｇ、　）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、（１９８７年）、第５１巻、９５７−９７５頁 ）により同定されたβ−グロビンローカスの優性調節領域に特徴的な高感受性部 位はｒ超高感受性ｊと呼ばれる。「超」高感受性とは、これらの部位が、β−グ ロビンプロモーターに関連した「通常のｊ高感受性部位よりはるかに感受性が高 いことを意味する（グロウダイン（Ｇｒｏｕｄｉｎｅ）ら、ビーエヌエーエス　 ニーニスニー、（１９８３年）、第８０巻、７５５２３（）。マウスのλローカ スではプロモーター高感受性部位は検出されず、唯一のＤＮａｓｅ　Ｉ高感受性 部位はその遺伝子から非常に遠いところに存在する。

マウスのλローカス中の高感受性部位は、本発明によれば、免疫グロブリンの優 性調節を与える配列の位置を意味する。このマツピングを基礎としてＪ５５８Ｌ 中の再配列された遺伝子の横のＤＮＡ配列がクローン化された。

本発明は、形質転換動物の産主に適用され、その産生方法は広く公知である。総 説として、ジェーニッシュ（Ｊａｅｎｉｓｃｈ）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ　）、（１９８８年）、第２４０巻、１４６８−１４７４頁かある。

本発明は、インビトロとインビボのいずれにおいても哺乳動物ゲノムへの機能的 に活性な遺伝子系の挿入を可能にする、発現の組み込み部位依存性の問題に対す る解決法を与える。具体的には本発明は、同種遺伝子や異種遺伝子が免疫グロブ リン産生細胞に導入された後に、インビボであろうとインビトロであろうと組み 込み部位非依存性の細胞特異的な方法で、発現を可能にするベクターを与える。

われわれはまた、マウスのλローカス中の高感受性部位のいくつかは、新しい有 用なλ免疫グロブリンエンハンサー成分に対応することを見いだした。本発明は また、異種遺伝子の発現に有用な、新しいエンハンサ−成分とこれらの成分を含 むベクターを与える。

発明の要約 本発明の第一の面によれば、哺乳動物の宿主細胞により遺伝子が発現されるよう に、哺乳動物の宿主細胞の遺伝物質に遺伝子を組み込むためのベクターであって 、ベクターはプロモーターと該遺伝子よりなり、このベクターは宿主の細胞型に 制限され、組み込み部位非依存性で、コピー数に依存性の該遺伝子の発現を誘導 することが可能な、免疫グロブリン遺伝子優性調節領域を含むことを特徴とする 。

本発明において使用される「優性調節領域（ｄｏｍｉｎａｎｔｃｏｎｔｒｏｌ　 ｒｅｇｉｏｎ）　Ｊとは、優性調節領域に融和性の宿主細胞のゲノムに組み込ま れる時、宿主の細胞型に制限され、組み込み部位非依存性で、コピー数に依存性 の発現性を、結合した遺伝子系に与えることかできるＤＮＡ配列を意味する。こ のような優性調節領域は、宿主細胞の染色体内で充分に再構成された時この性質 を保持している。効率的な宿主細胞型に制限される発現を指示する能力は、異種 染色体中の位置で充分に再生された時にも保持される。

本発明の優性調節領域はＤＮＡのクロマチン構造を開いて、ＤＮＡをより利用し やすくしてローカスのオーガナイザーとして作用すると、仮説することができる 。

優性調節領域は、天然に存在する遺伝子系に対応するか、または誘導される単一 の隣接する配列であるか、あるいは仲介するポリヌクレオチドが結合しているか または結合していない２つまたはそれ以上の配列から構成される。

この優性調節領域は天然に存在する遺伝子系からの組換えＤＮＡ法により得られ るか、または天然に存在する遺伝子系に関する配列データからの公知のポリヌク レオチド合成技術を使用して製造されるという意味で天然に存在する遺伝子系に 対応する。優性調節領域の機能を変化させることなくこの配列を変更することが できる。

優性調節領域は免疫グロブリン遺伝子の１つまたはそれ以上のＤＮａｓｅ　Ｉ超 高感受性部位よりなるか、それを含むか、それに由来するか、それに対応するか 、またはそれに関連する。

優性調節領域は例えば、本発明で具体的に同定される１つまたはそれ以上のＤＮ ａｓｅ　Ｉ超高感受性部位よりなる。

しかし池の配列は優性調節領域の機能的特徴に寄与するか、またはその特徴を示 す。

いくつかのＤＮａｓｅ超高感受性部位か同定されている：ｌ）再配列されたλ１ 遺伝子のＣＡＰ部位の約２．４　ｋｂ上流、 ２）ゲノムＶλ２切片の約２．５ｋｂ上流、そして３）以下のようなＣ１０、お よび／′またはＣλ４の３゛に位置する追加の部位ニ ーＣλ４の約１７ｋｂ３’ −Ｃλ＋２８ｋｂと４８ｋｂ（すなわち約３０　ｋｂ）３’　。

上記に同定した超高感受性部位はそれ自身で優性調節領域であるか、または優性 調節領域の一部を構成する。

これらの超高感受性部位を同定するのに使用される方法は、機能性優性調節領域 を同定するのに使用することができる。

または機能の発現の測定法は、機能性優性調節領域を同定するのに使用すること もできる。例えば適当なレポーター遺伝子（例えば免疫グロブリン遺伝子）を使 用する発現測定法を使用することができる（ここでは優性調節領域は、宿主の細 胞型に制限され、組み込み部位非依存性で、コピー数に依存性のレポーター遺伝 子の発現を誘導することができる能力により同定される。

天然に存在する優性調節領域が、介在する１つまたはそれ以上のポリヌクレオチ ド配列により分離されている２つまたはそれ以上のサブ配列よりなる時、この優 性調節領域は１つまたはそれ以上の介在配列のすべてまたは一部の欠如下で結合 された２つまたはそれ以上のサブ配列よりなる。すなわち免疫グロブリン優性調 節領域が介在する非機能性の配列により分離されている２つまたはそれ以上の不 連続的のサブ配列（例えば２つまたはそれ以上の超高感受性部位）よりなる時、 本発明のベクターは、介在配列のすべてまたは一部が除去されて結合している２ つまたはそれ以上のサブ配列よりなる。

１つまたはそれ以上の超高感受性部位は単独でまたは集団で、マウスλ免疫グロ ブリンローカス由来の有用なエンハンサ−成分を構成する。

組み込み部位非依存性を示さない超高感受性部位またはこのような部位は、エン ハンサ−であっても優性調節領域ではないと理解すべきである。

エンハンサ−とは転写を活性化する配列である。これは遺伝子の転写領域の上流 （例えば、ＳＶ４０初期領域エンハンサ−、バネルジ（Ｂａｎｅｒｊｉ　）ら、 １９８１年、セル（Ｃｅｌｌ）　、第２７巻、２９９頁）、下流（例えばβ−グ ロビンエンハンサ−、チョイとエンジェル（Ｃｈｉａｎｄ　Ｅｎｇｅｌ　）　、 １９８６年、ネーチ−ｔ−−（Ｎａｔｕｒｅ）　、第３２３巻、７３１頁）、ま たはその中（例えば免疫グロブリン重鎮エンハンサ−、ギリス（Ｇｉｌｌｉｓ） ら、１９８３年、セル（Ｃｅｌｌ）　、第３３巻、７１７頁：バネルジ（Ｂａｎ ｅｒ−ｊｉ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、（１９８３年）、第３３巻、７２９頁）に 存在する。

エンハンサ−は遺伝子の距離から比較的関係なく、そしてその遺伝子に対する配 向に比較的関係なく、転写を活性化し、プロモーター特異的ではない。例えば免 疫グロブリン重鎮のエンハンサ−はβ−グロビンプロモーターから転写を活性化 することができる（ピカードとシャフナ−（Ｐｉｃａｒｄ　ａｎｄ　５ｈａｆｆ ｎｅｒ　）　、ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８４年、第３０７巻、８０−８ ２頁）。

あるエンハンサ−は種々の異なる細胞型の中で活性を有する（例えば、ＳＶ４０ とラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）のエンハンサ−）。他のエンハンサ−は細胞型 に特異性がある（例えば免疫グロブリンエンハンサ−はリンパ球中でのみ活性が ある、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　） 、（１９８７年）、第２３６巻、１２３７−１２４５頁の総説を参照）。このエ ンハンサ−活性の細胞型特異性は、培養細胞と形質転換マウスの両方に見られる （パルミターとプリンスター（Ｐａ１ｍ１　ｔｅｒａｎｄ　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ） ら、アン・レブ・ジエニ）　ＣＡｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、）　（１９８６年）、第２０巻、４６５−４９９頁の総説の形質転 換マウスを参照）。

本発明の第２の面に従えば、マウスλ免疫グロブリンローカス由来の機能性エン ハンサ−成分が与えられる。

このマウスλ免疫グロブリンエンハンサ−成分は、マウスλ免疫グロブリンロー カス内の１つまたはそれ以上の超高感受性部位または別々の領域よりなる。

本発明の第２の面は本発明の第２の面のエンハンサ−を含むベクターを含む。発 現ベクターの場合は、エンハンサ−は機能的にプロモーター（免疫グロブリンプ ロモーターか適当）と関連しており、このエンハンサ−はプロモーターの下流の 遺伝子の転写を活性化する。

このようなエンハンサ−配列は、優性調節領域の機能的特徴に寄与するか、また はその特徴を示す。

われわれは、エンハンサ−活性を有し、本発明の第１の面の超高感受性部位と一 緒にさらに優性調節領域であるかまたはその一部かも知れない。マウスＣλ１遺 伝子切片の下流にある領域を同定した。

この領域は、再配列したλ、遺伝子のＣλ１遺伝子切片中のＸｈｏ　［部位の３ ．８ｋｂ下流のＥｃｏＲ［部位と、このＸｈｏ　［部位の１ＯｋｂＴ流の５ｎａ Ｂ　ｒ部位との間のＤＮＡ配列のすべてまたはその機能性部分よりなるＤＮＡ配 列よりなる。

本明細書中、エンハンサ−に適用される「機能性」という表現は、遺伝子からの 距離と遺伝子に対する配向に依存せず、プロモーター特異性のない方法で、プロ モーターからの転写を活性化することができるＤＮＡ配列を意味する。

本明細書中、「下流」という表現は転写の方向を意味熱に存在するマウス免疫グ ロブリンλ、遺伝子系に対応するか、またはこれに由来する単一の隣接する配列 であるか、または介在するヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが結合している かまたは結合していない２つまたはそれ以上の配列からなる。

マウス免疫グロブリンス１遺伝子エンハンサ−は、天然に存在する遺伝子系から の組換えＤＮＡ法により得られるか、または天然に存在する遺伝子系に関する配 列データからの公知のポリヌクレオチド合成技術を使用して製造されるという意 味で天然に存在する遺伝子系に対応する。マウス免疫グロブリンス１遺伝子エン ハンサ−の機能を変更することなく、配列の変更をすることができる。

再配列したマウスλ１遺伝子の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲ［部（これらは独立に Ｓ　Ｐ　２１０ＪＩ胞のλ１遺伝子の発現を増加させる）を含有するかまたは重 複している。

本発明のエンハンサ−は、再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈａ　１部位の３． ８　ｋｂ上下流εｃｏＲ１部位の下流の、最初の１．３　ｋｂの旧ｎｄ　ＩＩＩ からＨｉｎｄ　ＩＩＩまでのＤＮＡ断片のすべてまたは機能性部分よりなる。

第】１図で再配列したマウスλ、遺伝子の３．５　ｋｂ上下流ＥｃｏＲ１部位の 下流の上記の１．３　ｋｂの旧ｎｄ　ＩＩＩから旧ｎｄＩＩ＋断片はｒＨＩＩ［ Ａ　Ｊと記載しであるものである。

本発明のエンハンサ−は、再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｏ１部位の３．８ 　ｋｂ上下流ＥｃｏＲ［部位の下流の３．３　ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩからＨｉ ｎｄ　ＩＩＩ　ＤＮＡ断片のすべてまたは一部よりなり、再配列したマウスλ、 遺伝子のＸｈｏ　［部位の１０ｋｂ下流の５ｎａＢ　ｌに及んでいる。

第１１図に関して、再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｏ　１部位の３．８　ｋ ｂ上下流ＥｃｏＲ［部位の下流の３．３　ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩから旧ｎｄ　 Ｉｌｌまでの断片で、再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｃ　［部位の１０ｋｂ Ｔ流の５ｎａＢ［に及ぶ断片は「旧１１ＣＪと記載しである。

本明細書中で使用する「ベクターｊという用語は、最も広い意味において、１つ の細胞から別の細胞にＤＮＡを移行させることができる任意の組換えＤＮＡ法物 質を意味する。

このベクターは線状または環状のＤＮＡの単一物であり、本発明の基本的な機能 性成分に加えて、特別の応用の必要に応じ他の配列を含むことができる。例えば ベクターは、翻訳またはクローン化産物の産生の他の面を助ける選択的マーカー 遺伝子、および／または特徴を含有することかできる。

組み込みに適切なベクターは、免疫グロブリン優性調ｊｌｌｆｆ領域またはエン ハンサ−そして独立の構造遺伝子発現系よりなる単離されたＤＮＡ配列よりなる 。このＤＮＡ配列はいずれの端も他の実質的なりＮＡ配列に結合していない。し かしこの単離されたＤＮＡ配列は、複製目的のベクター中への結合のためのリン カ−を備えていてもよいし、片方の端または両端でゲノム中への組み込みを助け るための配列を備えていてもよい。

優性調節領域を有するベクターは、通常免疫グロブリン発現か可能な哺乳動物宿 主細胞中へ組み込んだ後、同種または異種ローカスを、組み込み部位非依存性、 コピー数依存性の様式で発現することができる独立のローカスを規定する。

本発明はまた、免疫グロブリン優性調節領域または本発明の第２の面のエンハン サ−よりなる、トランスファーベクターを適切にはプラスミツドの形で与える。

このトランスファーベクターは、以下から選択される単離された機能性マウス免 疫グロブリンス遺伝子エンハンサ−よりなる： １）再配列されたマウスλ、遺伝子中のＸｈｏ１部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏ ＲＥ部位と、再配列されたマウスλ１遺伝子中のＸｈｏ　１部位の１０ｋｂＴ流 の５ｎａＢ［との間の配列、２）再配列されたマウスλ１遺伝子中のＸｈｏ　［ 部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲ１部位の下流の、１．３　ｋｂの最初の旧ｎｄ 　ＩＩＩから旧ｎｄ　ＩＩＩまでのＤＮＡ断片のすべてまたは機能性部分（図１ １　：　ｒＨＩ［［Ａ　Ｊと記載されたもの）、３）再配列したマウスλ１遺伝 子のＸｈｏ［部位の３．８　ｋｂ上下流ＥｃｏＲ［部位の下流の３．３　ｋｂの 旧ｎｄ　ＩＩＩから旧ｎｄ　ＤＮＡＩＩＩまでの断片で、再配列したマウスλ、 遺伝子のＸｈｏ　（部位の１ｏｋｂＴ流の５ｎａＢＩに及ぶ断片のすべてまたは 機能性部分（第１１図：　ｒＨｌ［［ｃ」と記載されたもの）。

本明細書中で「遺伝子」という用語は、好ましくはポリペプチドをコードする構 造遺伝子である、ＤＮＡ配列を意味する。このポリペプチドは商業的に有用なポ リペプチドであり、例えば薬剤（例えばプラスミノーゲンアクチベーター、リン ホカインまたは強化因子または刺激因子）、または免疫グロブリンポリペプチド （キメラ、ヒト化または修飾した免疫グロブリンポリペプチド）がある。このポ リペプチドは宿主細胞に対して完全に異種のこともある。または遺伝子は、宿主 細胞に欠損、または存在しないか、または変化したポリペプチドをコードするこ ともある。

哺乳動物の宿主細胞は、本発明のベクターを取り込むことができ、免疫グロブリ ン遺伝子を発現することかできる任意の哺乳動物の宿主細胞である。このベクタ ーＤＮＡは、トランスフェクション、感染、微量注入（ｍｉｃｒ。

１ｎｊｅｃｔｉｏｎ　）　、細胞融合、またはプロトプラスト（原形質）融合に より、哺乳動物宿主細胞に移行させられる。

宿主細胞は、生きているヒトまたは動物の細胞てもよい。特に、宿主細胞は形質 転換性（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）の動物（例えばマウス）がよい。宿主細胞は、 優性調節領域が機能性の組織由来でもよく、例えばＢ細胞またはその前駆体（こ こては優性調節領域は機能性でないかも知れない）（例えば幹細胞）でもよい。

細胞はミエローマまたはハイブリドーマのようなリンパ球でもよい。

プロモーターは宿主細胞の中で機能することかできる任意のプロモーターであり 、例えば哺乳動物またはウィルスのプロモーターでもよい。随時プロモーターは 優性調節領域の遺伝子ローカスと同−源であり、別のプロモーター（例えばウィ ルスｔｋ）または他のウィルスプロモーターと縦に並んで存在しており、１つま たはそれ以上のエンハンサ−成分を含んでいてもよい。適当なウィルスプロモー ターの例としては、ＳＶ４０レー）　（ｌａｔｅ）、Ｍｏ　ＭＬＶ　ＬＴＲ，Ｒ ３Ｖ　ＬＴＲ、ソしテｈｃＭＶ　ＭＩＥプロモーター　すどがある。

免疫グロブリン優性調節領域は、λ鎖、に鎖または重鎮のローカスまたは他の遺 伝子（具体的にはＢ細胞に発現されるもの）からのものでもよい。

本発明の別の面では、本発明のベクターで形質転換した宿主細胞を培養すること よりなる、ポリペプチドの産生方法が与えられる。

本発明はインビトロで目的のポリペプチドを産生ずるために適用してもよい。さ らに本発明は、動物に対して治療的効果がないポリペプチドを産生ずるのにイン ビボで適用することができる。ポリペプチドを産生ずるこのような方法は、ヒト または動物の体を治療する方法とは考えられない。

本発明のさらに別の面では、このベクターは欠陥のある哺乳動物の遺伝子を代替 または補足することによるヒトまたは動物の体の治療法に使用される。

ヒトまたは動物の体の疾患の多くは、いくつかの遺伝子産物の産生が欠如するこ とにより起きる。本発明のベクターはその特徴により、インビボの遺伝子療法に より欠損の治療をするのに適している。

ヒトまたは動物の体から幹細胞を取り出し、随時体に残存している幹細胞を殺し 、哺乳動物に欠損しているかまたは存在しない遺伝子を含む本発明のベクターに より、取り出した幹細胞を形質転換して、ヒトまたは動物の体に形質転換した幹 細胞を戻すことよりなる、遺伝子療法の方法が与えられる。

この方法は、ヒトまたは動物に欠損している遺伝子を代替または補足するのに使 用される。例えばある個体がアデノシンデアミナーゼ欠損（重症の複合免疫不全 （ＳＣＩＤ）すなわちｈｇｐｒｔ欠損症）を煩っている。従ってこの方法は、具 体的にＢ細胞遺伝子疾患の治療に使用されるが、遺伝産物の細胞源がそれほど重 要でない場合一般的代謝性遺伝疾患の治療にも使用される。

添付の図面を参考にして、本発明を実施例により説明第１図は、マウス免疫グロ ブリンλ鎖、に鎖、および重鎮のローカスの構造を示す。

第２図は、各マウスの第１６染色体上の、ミエローマ細胞株Ｊ５５８Ｌ中のλロ ーカスの再配列を示す。

第３図は、ミエローマ細胞株Ｊ５５８Ｌ中の再配列されたマウスλ１遺伝子を示 す。

第４図は、ａ）　ＡｐａＬＩ（Ａ）そしてＡｐａＬ［とＸｈｏ［（Ｂ）で切って Ｃλ１プローブで検出し、ｂ）　Ｓｐｈ［（Ａ）と５ｐｈｔとＸｈｏ　［（Ｂ） で切ってＶλ１プローブで検出したミエローマ細胞株Ｊ５５８Ｌの核のＤＮａｓ ｅ　Ｔフェードアウト（ｆａｄｅｏｕｔｓ）を示す。

第５図は、それぞれＫｐｎ　［で消化してＶλ、プローブで検出したＪ５５８Ｌ の核とＭＥＬの核のＤＮａｓｅ　Ｉフェードアウト（ｆａｄｅｏｕｔｓ）を示す 。

第６図は、Ｊ５５８Ｌゲノム中で同定されたＤＮａｓｅ　Ｉ高感受性部位（３′ 高感受性部位は括弧内に示しである）のマツピングを示す。

第７図は、ｐＬＴＣコスミッドクローニングベクター（ａ）とｐｃ、ＴｃのＢａ ｍＨＩ部位でクローン化したＪ５５８ＬＤＮＡの断片の制限地図である。（ｂ） λ１遺伝子を有する７、５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の位置が示しである（明瞭にす るため他のすべてのＥｃｏＲ（部位は省いである）。ｃｏｓ４ＮとＣＯ５３′、 ３中のλ、遺伝子の３′をマツピングしているＡｐａＬ［部位が示されており、 一方ｃｏｓ２Ｂではλ１遺伝子のＡｐａＬＩ部位５′のみが示されている。この 部位のさらに上流に位置するＡｐａＬ（部位は描かれてない。

第８図は、λ、　ｍＲＮＡ特異的プローブを用いての５Ｐ２１０中の種々の作成 体からのＲＮＡのＳｌ保護解析の結果を示す（レーンｌ−１μｇ　Ｊ５５８Ｌ　 ＲＮＡ：レーン２−１０μｇ　５Ｐ２１０　ＲＮＡ：レーン３−ｌ０１１ｇ　５ Ｐ２１０−ｃｏｓ２Ｂ　ＲＮＡ：レーン４−１０ｕｇ　５Ｐ２１０−ｃｏｓ４Ｎ 　ＲＮＡ：レーン５−１０ａｇ　Ｓ　Ｐ　２／　０−ｐＬＴＣλ、ＲＮＡ：レー ン６−１０ａｇ　Ｓ　Ｐ　２／　Ｏ−ｐＳＶ　ｎｅｏ　λｌ　ＲＮＡ）。

第９図は、塩濃度勾配で調製し、Ｓ　Ｐ　２１０をトランスフェクションするの に使用されるｃｏｓ４Ｎの断片の制限地図を示す。

第１Ｏ図は、λ＋　ｍＲＮＡ特異的プローブを用いての５Ｐ２１０中の、第９図 に示す断片からのＲＮＡのＳ１保護解析の結果を示す（レーン１−１０ａｇ　５ Ｐ２１０ＲＮＡ　：レーン２−１μｇ　Ｊ５５８Ｌ　ＲＮＡ：レーン３と４−１ Ｏμｇ　５Ｐ２１０−ｃｏｓ　４Ｎ　ＲＮＡ　：レーン５から９−１０ａｇ　５ Ｐ２１０〜ｃｏｓ４ＮＡｐａＬ［２４，５ｋｂ断片ＲＮＡ：レーン１Ｏ−ｐＢＲ ３２２Ｈｉｎｆｔ　７−カー：レーンＩＩから１４−１０ａｇ　ＳＦ３　／　Ｏ −ｃｏｓ　４　Ｎ　ＡｐａＬ［／５ｎａＢｒ　Ｉ　９　ｋｂ断片ＲＮＡ）。

第１１図は、マウスλ、遺伝子のエンハンサ−領域の制限地図であり、エンハン サ−活性を示すその２つのＨｉｎｄ　［目新片を含む。

第１２図は、５Ｐ２１０の安定なトランスフェクションによる転写の活性化のた めの、推定上のエンハンサ−断片を試験するのに使用されるプラスミツド、ｐｔ 、’ｒｃλ１の制限地図を示す。

第１３図は、λ＋　ｍＲＮＡ特異的プローブを用いての５Ｐ２１０中の第１２図 （ａ）に一般的に示すベクターからのＲＮＡの８１保護解析の結果を示す（レー ン１−１０ａｇ　５Ｐ２１０　ＲＮＡ：レーン２−１ａｇ　Ｊ５５８Ｌ　ＲＮＡ ：レーン３−１０ａｇ　５Ｐ２１０−ｃｏｓ４Ｎ　ＲＮＡ：レ−：／４と５−Ｓ 　Ｐ　２１０−ｐＬＴＣａ　ｒ　Ｈ［［［Ａα　１０ａｇ　ＲＮＡ：レーン６と ７−３Ｐ２１０−ｐＬＴＣλ、　ＨＩ［ＩＡβ　１０ａｇ　ＲＮＡ：レーン８と ９−３　Ｐ　２／　０−ｐＬＴｃλ、１０ａｇ　ＲＮＡ：レーン１０と１　１− ３Ｐ２１０−ρＬＴＣλ、ｌ（Ｉ［Ｃα　１０ａｇ　ＲＮＡニレーンＩ２と１３ −５Ｐ２１０−ｆｌＬＴｃλ１旧１１Ｃβ１０ａｇ　ＲＮＡ）　。

第１４図は、マウス株２０７１の形質転換（３６，３７、そして３８）と非形質 転換（３９と４０）の同腹子の組織のｍＲＮＡのＳｔヌクレアーゼ保護解析を示 す。

Ｔ＝胸腺 Ｓ＝牌肺 臓＝肝臓 Ｂ＝脳 各トラックは、５′　λ、ｃＤＮＡプローブと５′　βアクチンｃＤＮＡプロー ブでハイブリダイゼーションした１０ａｇのＲＮＡを含有する。■μｇのＪ５５ ８Ｌ　ＲＮＡを陽性対照として同じプローブとハイブリダイゼーションさせた。

保護された断片の移動位置は矢印で示しである。

免疫グロブリンローカスから長い距離にわたって、優性調節領域（ＤＣＲｓ）に 関連した高感受性部位（Ｈ３Ｓａ）を捜した。再配列したλ１遺伝子を有する大 きな断片を産生ずる酵素を同定するために、種々の６塩基切断制限酵素て切った ミエローマ細胞株Ｊ５５８Ｌ　ＤＮＡのサザンプロットを行った。このような２ つの酵素はＡｐａＬＩと５ｐｈｒであり、これらはλ１遺伝子を有するそれぞれ ３５ｋｂと５０ｋｂ断片を産生じた。Ｊ５５８Ｌ核についてＤＮａｓｅ　Ｉフェ ードアウト（ｆａｄｑｏｕｔｓ）を行い、これらの核から抽出したＤＮＡをＡｐ ａＬＩまたは５ｐｈｒで消化して断片パターンを種々のプローブを用いてサザン プロットにより解析した。ＤＮａｓｅ　Ｉフェードアウトを、エンバー（Ｅｎｖ ｅｒ　）らの方法（ティー、エンバー（巳ｎｖｅｒ、　Ｔ　）ら、ネーチャー　 （Ｎａｔｕｒｅ）、（１９８５年）、第３１８巻、６８０−６８３頁）に、グロ スベルド（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ）らの修飾（エフ・ジー、グロスベルド（Ｇｒｏｓ ｖｅｌｄ）ら、セル（Ｃｅ１１）、（１９８７年）、第５１巻、９７５−９８５ 頁）を行い実施した。ラスター（Ｌｕｓｔｅｒ）らの方法（ラスクー（Ｌｕｓｔ ｅｒ）ら、モル・セル・ビオル（Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）　、第７巻、３７２３頁）を用いてＤＮａｓｅＩ− 処理咳からＤＮＡを調製した。

使用したプローブは： ■、　高度に保存されているＶλ１とＶλ２の両方にハイブリダイゼーシヨンす る、Ｖλ１遺伝子領域（０，８ｋｂＸｂａ　［断片）からのプローブ。

２、Ｃλ１とＣλ４にハイブリダイゼーションするλ１のＣ領域（１ｋｂ　Ｂａ ｍＨｒ−Ｋｐｎ［）からのプローブ。

３、　単一の配列であり、Ｃλ１関連配列のみを認識するＣλ１の３′領域（２ ｋｂ　Ｋｐｎｌ　−Ｘｂａ［）からのプローブ。

（第３図） ＡｐａＬＩ　またはＳｐｈ［プロットをこれらの３つのプローブのおのおのとブ ロービングさせると、いくつかの高感受性のサブバンドが得られた（第４ａ図と ４ｂ）。これらの部位をさらに詳しくマツピングするために、ＡｐａＬ［または Ｓｐ旧消化試料を、Ｘｈｏ［（Ｃλ、配列で切断する）でも消化した。■領域プ ローブでプロービングすると、５ｐｈｒ／ＸｈｏｌとＡｐａＬ［／Ｘｈｏｌプロ ットで４．３　ｋｂと３ｋｂのバンドが見られた。４．３　ｋｂのバンドはＣλ １によっても見られ、λ１遺伝子はＣＡＰ部位の２．４　ｋｂ上流に高感受性部 位を有することを示していた。３ｋｂサブバンドはゲノム性Ｖλ２切片の２．５ 　ｋｂ上流に位置していた。これらの位置はいくつかの他の酵素に関してマツピ ングすることより、確認された（結果は示してない）。

これらのマツピングされた部位以外に、われわれはｖｌＣおよび３′プローブを 用いて、いくつかの他の高感受性部位を検出した（第４ａ図と４ｂ）。これらの すべてはλローカスに関連があったが、正確に位置を決めることはできなかった 。明らかなことはこれらのいくつかは、種々の定常領域の３°偏に位置している ことである。

従ってわれわれは、これらの高感受性部位を含む配列を単離するために、λ１遺 伝子かあら始めて、λ遺伝子の横にある配列をクローン化することに決定した。

対照としてＭＥＬ細胞の核についてＤＮａｓｅ　Ｉフェードアウトを実施した。

これらをＫｐｎ　［て消化して、Ｖλ、プローブでプローヒングした。Ｊ５５８ ＬＫｐ口］プロットで高感受性部位（２，６ｋｂ）か見られたか、ＭＥＬプロッ トでは何も見られなかった（第５図）。

２、Ｊ５５８Ｌコスミッドライブラリーの作成再配列したλ遺伝子の横にある大 きい断片をクローン化するために、Ｊ５５８Ｌ細胞から調製したＤ　Ｎ　Ａから コスミッドライブラリーを調製した。ベクターのアーム（ａｒｍ）の調製用にＨ ｐａ　Ｉの代わりに使用したＸｈｏ［部位によりＨｐａ［部位か置換されている 以外は、ｐＴＣＦ（エフ・ジー、グロスベルド（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ、Ｆ、　Ｇ、 　）ら、エヌエーアール（ＮＡＲ）、（１９８２年）、第１Ｏ巻、６７１５頁） と同一であるベクターｐＬＴＣのＢａｍＨ［部位て、Ｊ５５８Ｌ　ＤＮＡのＭｂ ｏ　Ｉ部分消化物をクローン化した。

グロスベルド（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ）ら（エフ・ジー、グロスベルド（Ｇｒｏｓｖ ｅｌｄ、Ｆ、Ｇ、）　ら、エヌエーアール（ＮＡＲ）、（１９８２年）、第１Ｏ 巻　６７１５頁）の記載した方法に従い、コスミッドライブラリーを調製した。

ストラタジェンギガパックゴールド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｇｉｇａ　−ｐａ ｃｋ　Ｇｏｌｄ）パッケージング抽出物を、製造業者の指示に従い使用し、パワ ケージされたコスミッドを大腸菌ＭＣｌ　０６１ｒｅｃＡ中に導入した。このラ イブラリーを４つの２０Ｘ２０ｃｍのＮＥＮゲナスクリーンプラス（ＮＥＮＧｅ ｎａｓｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ）ハイブリダイゼーション膜の上に広げ、グロスベ ルト（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ）ら（シーン（Ｇｅｎｅ）　、（１９８１年）、第１３ 巻、２２７頁）の方法によりスクリーニングした。ＮＥＮの勧める条件を用いて ハイブリダイゼーションを行った。

このライブラリー（４ｘｌ□ｇ個の各クローンからなる）を、Ｃλｌ（１ｋｂ　 ＢａｍＨＩ−Ｋｐｎ［）プローブてスクリーニングして、ハイブリダイゼーショ ンしたクローンを精製した。得られたコスミッドを、５′　と３′の隣接配列の 長さを決めるために、Ｖλ１と３′プローブを用いてサザンプロットにより解析 した。こうして約２０ｋｂの５′隣接配列と２０ｋｂの３′隣接配列か単離され た。

Ｃｏ５２Ｂはλ１遺伝子を含有する７、　５　ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含み、ｃ ｏｓ４Ｎはλ１遺伝子のＡｐａＬ［部位３′を含む約２０ｋｂの３′隣接配列（ 第７図）を有する７、　５　ｋｂのＥｃｏＲ［断片を含む。

発現の制御に重要なマウススローカスの５′部分の横にある配列をクローン化す るために、このライブラリーをさらにＶ領域プローブ（０，５ＫＢ　５ｓｔＥＶ λ２領域切片）てスクリーニングした。

マウスのλローカスの３′部分をさらにクローン化するために、このライブラリ ーをさらにｃｏｓ４Ｎの３′末端からのプローブ（０，５Ｋ　Ｂ　ＡｐａＬＩ／ ５ａｌｔ断片）てスクリーニングした。Ｃｏ５３’、３はこのプローブで同定さ れた。Ｃｏ５３’、３はさらに１９ｋｂの３“配列とともに、ｃｏｓ４Ｎの３° 領域と重複する約１４ｋｂの配列を育している。Ｃｏｓ　３′、３の地図を第７ 図にしめしである。

λ１遺伝子と隣接配列を有するコスミツドを、ミエローマ細胞株中にトランスフ ェクションさせて直接試験した。このコスミッドベクターはｔｋ−ｎｅｏ遺伝子 を存し、Ｇ４１８中のクローンの選択を可能にする。次にこれらをＳｌヌクレア ーゼ解析（λ＋　ｍＲＮＡ用）とＥＬＩＳＡ（λ１蛋白用）によりλ１遺伝子の 発現について解析した。このコスミッドを細胞株５ｐ２１０．　Ａｇ１４（シュ ルマン（Ｓｃｈｕｌ　−ｍａｎ）ら、ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ）、（１’９７８ 年）、第２７６巻、２６９頁）（抗体を産生じない突然変異／’ｔイブリドーマ 細胞株）と、ＭＯ’Ｐ　Ｃ３１５，２６重鎖欠損突然変異体（ホズミ（Ｈｏｚｕ ｍｉ）ら、ジエイ・イムツル（Ｊ。

［ｍｍｕｎｏｌ、　）、（１９８２年）、第１２９巻、２６０頁）（λ２軽鎖を 作る）中にトラスフエクションさせた。

５ｐ２１０．　Ａｇ１４細胞を、バイオラッドシーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ 　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ）を用いてエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏ ｐｏｒａｔｉｏｎ）でトランスフェクションさせた。

５μｇの線状プラスミツドＤＮＡをＰＢＳ　（リン酸緩衝化生理食塩水）中の１ ０７個の細胞中に添加した。静電容量９６０μＦ、２５０Ｖで細胞にショックを 与えた。

ソヨック後細胞を室温で１０分間インキュベートしてから、培地（αＭＥＭ、１ ０％牛脂児血清）を加えた。ショック後２４時間口に０４１８　（ｌ　ｍｇ／ｍ ｌ）を加えた。

アントニオウ（Ａｕｔｏ口１ｏｕ）らの方法に従いＳｔマツピングを行なった（ エム、アンド二オウ（Ａｕｔｏｎｉｏｕｔ、　Ｍ、　）ら、ヒトの遺伝疾患−実 際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　−ｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ−Ａ　Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　、ケー・イー、デービーズ（Ｄａｖｉ ｅｓ　、　Ｋ、Ｅ、　）編、アイアールエルプレス（Ｔ　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、 オックスホード）。

ヤギ抗マウスλ軽鎖特異的抗体調製物とそのビオチン化誘導体を用いるＥＬ［Ｓ Ａにより、λ１抗体を測定した（サザンパイオテクノロジー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。

アビジンに結合した西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｃｈ　ｐ ｅｒｏｘｉｄａｓｅ）と基質として２，２′アジノビス（３−エチルベンズチア ゾリン−６−スルホン酸）を使用して発色させた。

５′隣接配列（ｅｏｓｌｌと２Ｂ）３’配列のみ（ｃｏｓ　４Ｊと４Ｎ）の効果 を試験してから、５′　と３′隣接配列の両方を含む作成体を、λ１遺伝子の定 常領域中のＸｈｏ　ｒ部位で結合させて調製した（第３図）。

すべてのコスミッド作成体の発現レベルを、ｐＬＴＣでクローン化したλ１遺伝 子を含有する７、　５　ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の発現レベル、そしてＳＡ４０エ ンハンサ−を含むベクターｐＳＶｎｅｏ中でクローン化した同じ断片の発現レベ ルと比較した。細胞株Ｊ５５８Ｌは、λ、ｍＲＮＡと蛋白の充分な内因性発現の 陽性対照となる。

ｐｔ、Ｔｃλ１とｐＳＶｎｅｏλｌ（いずれもλ、遺伝子を含有する７、　５　 ｋｂ　ＥｃｏＲ［断片を含む）を５ｐ２１０．　Ａｇ１４細胞中にトランスフェ クションし、Ｇ４１８耐性クローンの集団についてλ１特異的ｍＲＮＡと蛋白の 発現について分析した。

ｐｓＰＴｌ　８　（７フー７シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））中でクローン化した λ、　ｃＤＮＡからの５゛プローブ（ベクターの５ｐｈｔ部位からＣλ、のＸｈ Ｏを部位まで延長している）を用いるＳ１解析と、ＥＬ［ＳＡによる蛋白解析の 結果は、ｐｓＶｎｅｏλ１でトランスフェクションさせた集団は、Ｊ５５８Ｌよ りｍＲＮＡと蛋白の発現が１００倍少なく、ｐＬＴＣλ１でトランスフェクショ ンさせた細胞は、ｍＲＮＡ　（第８図）と蛋白（データは示してない）のレベル が検出できなかった。

これは従来報告されている結果と一致する（ディー、ピカード（Ｐｉｃａｒｄ　 、Ｄ、　）ら、ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、（１９８４年）、第３０７巻、 ８０−８２頁ニアール・ディー、コーン（Ｃｏｎｅ　Ｒ，Ｄ、　）ら、サイエン ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、（１９８７年）、第２３６巻、９５４頁）。

ｃｏｓ４ｎでトランスフェクションしたＳＰ２／１１胞の集団（３０ｋｂの隣接 配列とともにλ１遺伝子を含む）もまた、λ１特異的メツセンジャーＲＮＡ　（ Ｓ　１ヌクレアーゼ解析）（第８図：レーン４）を発現し、λ、蛋白（ＥＬｒＳ Ａ）を合成した。

これらの集団の発現レベルは、ｐＳＶｎｅｏλｌでトランスフェクションした集 団（これはＳＶ４０エンハンサ−を含む（第８図：レーン６））比較して、同等 かまたは高かった。

ＣＯ５２Ｂでトランスフェクションした５Ｐ２１０細胞（２２ＫＢの５′隣隣接 列とともにλ、遺伝子を含有する：第８図−レーン３）中ではλ１特異的ｍＲＮ Ａも蛋白も発現されていなかった。ＤＮａｓｅ　Ｉで処理した核中に強い高感受 性部位が位置しているＶλ１の約２．４　ｋｂの５′にある配列がこのコメミツ ド中に存在するにもかかわらずである。

ｍＲＮＡについて解析したすべての集団はまた、Ｃλ、領域の３′部分からのプ ローブを使用して、ＥｃｏＲ［消化ゲノムＤＮＡのサザンプロットにより、トラ ンスフェクションしたλ１遺伝子の存在についてもチェックした（第３図中の２ ｋｂのＫｐｎ［／Ｘｂａｌ　）。

λ、の発現にＣＯ５４Ｎ中のどれだけの３°配列が必要かをめるために、ｔｋ− ｎｅｏ遺伝子を含有するＣＯ３４Ｎの制限断片、λ１遺伝子そして種々の量の３ °配列を塩濃度勾配で調製して、５Ｐ２１０細胞をトランスフェクションした。

０４１８に耐性のクローンの集団について、ＳＬヌクレアーゼ保護法によりλ１ 遺伝子の発現について調べた。これらの断片を第９図に示す。２４．５　ｋｂの ＡｐａＬＩ断片と１９ｋｂのＡｐａｌｊ−３ｎａｉＦ断片とも、λ１特異的ｍＲ ＮＡを発現するＳＰ２／（ｌ胞の集団を与えた（第１０図：レーン５から９とＩ Ｉから１４）。

λ１遺伝子のＸｈｏ　ｒ部位の３．８　ｋｂ下流のＥｃｏＲ１部位と、このＸｈ ｏ　［部位（第１１図）の５ｎａｂＢＩとの間のＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片を、ｐＬ ＴＣλ１のＨｉｎｄ　ＩＮ中にクローン化した（第１２図）。これらのプラスミ ツドを単一のＰｖｕ　［部位で線状化して、Ｓ　Ｐ　２１０細胞をトランスフェ クションするのに使用した。

ＣＴ４１８耐性集団からのＲＮＡを、以前と同じようにλ、特異的ｍＲＮＡの存 在について試験した。１．３　ｋｂの旧ｎｄ［［［断片、Ｈ［［ＩＡを含有する プラスミツドは、３．３　ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片旧［ｔＣを含むプラスミ ツドのようにλ、　ｍＲＮＡを発現した（第１３図）：レーン４から７とｌＯか ら１４）。

結論として、マウスＣλ１遺伝子切片の下流のエンハンサ−が同定された。エン ハンサ−活性はλ１遺伝子中のＸｈａｒ部位の３．８　ｋｂＴ流のＥｃｏＲ１部 位と、このＸｈｏ１部位のｌ０ｋｂ下流の５ｎａＢ　１部位の」にある。この領 域は２つのＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片（）ＩＩＩＩＡ　１．３　Ｋβと旧ＩＩＣ３， ３ｋｂ）を含み、いずれも５Ｐ２１０細胞中のλ、遺伝子の発現を増すべてのク ローン化Ｊ５５８Ｌ　ＤＮＡを含むｃｏｓ　４Ｎと３°、３のＳａｌ［断片を、 塩濃度勾配を使用して精製した。受精させたマウスの卵（Ｃ５７ＢＬ／１０ｘＣ ＢＡ）ＦＩ中にｃｏｓ　４Ｎ　５ａｌｌ断片を単独またはｃｏｓ３’３の５ａｉ ｌ断片と一緒に注入し、種々の３′隣隣接列とともにλ、遺伝子を含有する形質 転換マウスを作成した。

これらのマウス中のλ、遺伝子の発現を、リンパ性および非リンパ性組織からの ｍＲＮＡのＳｌヌクレアーゼ保護解析と、膵臓細胞表面のλ１蛋白発現の蛍光活 性化セルソーター解析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅ ｌｌ　５ｏｒｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ）により、追跡した。

ゲノム中にｃｏｓ４Ｎと３’　、３Ｓａｌ［断片の両方を存するマウス株を作成 した。５ａｌｌ断片の末端からのプローブを使用するサザンプロット解析では、 ｃｏｓ４Ｎと３′。

３Ｓａｌｌ断片がゲノム中の同じ挿入部位で結合していることを示していた（デ ータＨＡ示してない）。

ファウンダ−（ｆｏｕｎｄｅｒ　）動物を（Ｃ５７ＢＬ／１０ＸＣＢＡ）Ｆｌマ ウスと交配させ、その子供を生後５−７日後にλ１の発現を調べた。膵臓、肝臓 、胸腺および脳から調製されたＲＮＡを、λ、ｃＤＮＡの５′末端からのプロー ブを用いてＳＩヌクレアーゼ保護により解析した。細胞表面のλ０発現の分析の ために、牌ｍ細胞をガラスホモゲナイザーでホモゲナイズし、赤血球をトリス− 塩化アンモニウムを用いて溶解させた。約１０６個の細胞を、フィコエリスリン （ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　）結合ヤギ抗マウスλ（サザンバイオテクノロ ジー（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　）　、またはフルオ レセイニソチオシアネート結合ヤギ抗マウスμ（シグマ（Ｓｉｇｍａ　）　）を 用いて染色した。ベツクマンディッキンソン（ＢｅｃｋｍａｎＤｉｃｋｉｎｓｏ ｎ　）　ＦＡＣＳＴＡＲ−ＰＬＵＳフローサイトメーターを用いて蛍光解析を行 った。ｃｏｓ４Ｎとｃｏｓ　３’　、３の両方からのプローブを用いてテイル（ ｔａｉｌ）　ＤＮＡのサザンプロットにより、形質転換マウスを同定した。

２つのマウス株、２０７１と３００２については、形質転換した子供は非形質転 換の同腹子に比べて、細胞表面てラムダ鎖を発現する膵臓細胞の数と膵臓中に検 出されるλｌｍＲＮＡのレベルは上昇していた。第１４図は、２０７１株の２匹 の非形質転換子供マウスと３匹の形質転換子供マウスの種々の組織からのＲＮＡ のＳｌヌクレアーゼ保護解析を示す。３匹の形質転換子供は、膵臓中のλ、特異 的ｍＲＮＡのレベルは約１−１０倍の上昇を示し、胸腺、脳または肝臓では発現 は検出されない。マウス３００２株についても同様の結果が得られている。表１ は、２０７１株と３００２株の５日令の子供の膵臓細胞のＦＡＣ３解析の結果を 示す。いずれの場合も、非形質転換同腹子に比較して形質転換動物では、λ鎖を 発現するＩｇＭ陽性Ｂ細胞の数は約５倍高かった。

表１ マウス２０７１株と３００２株の形質転換マウスと非形質転換同腹子からの膵臓 細胞のＦＡＣ３解析 染色された膵臓細胞の％ マウス　形質転換　％λ 遺伝子 ｃｏｓ　４Ｎ　ｃｏｓ　３　・、３　ＰＥ−ＧＡＭ　ａ　ＦｒＴＥ−ＧＡＭ　ｕ 　・１ｔ２０７１／２１　Ｘ　Ｘ　５．０．’５．０　１５．５．　１４．６　 ３３２０７１／２２　Ｘ　Ｘ　３．７，３．３　１３．６．　１２．７　２７２ ０７１／２３　Ｘ　Ｘ　１．４，１．４　２０．９．　１９．４　７２０７１／ ２４　−　１．１．１．０　１４．３．　１５．５　６３００２／Ｉ　Ｘ　Ｘ　 ４．５７，４．３４　７．８９　９．９６　５０３００２／２　Ｘ　Ｘ　３．３ ２．２．５４　６．５６　６．４３　４５３００２／３　Ｘ　Ｘ　Ｏ，３９，０ ，５２６，１６５，８７７，５３００２／４　Ｘ　Ｘ　Ｏ，３９，０，４０４， ３３５，１６８，３３００２１５Ｘ　Ｘ　２．８７．２．９７　７．６２　７． ６４　３８３００２／６　Ｘ　Ｘ　２．３６，２．９１　６．４３　６．８１　 ４０種々のコピー数のｃｏｓ　４Ｎ　５ａｌｔ断片のみを育する６匹のマウス株 も解析した。λ発現Ｂ細胞の数または膵臓中のλ１特異的ｍＲＮＡのレベルは、 形質転換マウスと非形質転換マウスの子供との間に差は認められなかった。

これらのデータかられれわれは、マウスλ１遺伝子の発現を強く上昇させるもの は、ｃｏｓ　３’　、３の３′末端のあたりに存在すると結論した。Ｊ５５８Ｌ の核のＤＮａｓｅ　ＩフェードアウトからのＤＮＡを酵素ＸｈｏｌとＰｖｕ　［ で消化し、サザンプロットをｃｏｓ３’、３の３′末端からの１．９　ｋｂのＥ ｃｏＲｖ−Ｐｖｕ（でブロービングさせて、この領域のＤＮａｓｅ　Ｉ高感受性 部位の存在について調べた。このプローブはＪ５５８Ｌ　ＤＮＡ中の２８ｋｂ断 片とハイブリダイゼーションする。予備実験のデータは、Ｐｖｕｌの約８ｋｂと １２ｋｂの上流に２つの高感受性部位があるかも知れないことを示唆している。

Ｊ５５８ＬフェードアウトをＡｐａＬＩで消化して、サザンプロットをｃｏｓ３ ’、３からのｌｋｂのＥｃｏＲ［／５ｎａＢＩ断片でブロービングさせた（第７ 図ｂ）。これらのプロットの予備的露出の結果は、ＤＮａｓｅ　Ｉ高感受性部位 サブバンドはｃｏｓ３’、３中の最も多い３’　ＡｐａＬ１部位の約５ｋｂ下流 にあることを示唆している。従って再配列したλ１遺伝子中のＸｈｏ　［部位の ２８から４８ｋｂ下流（すなわち約３０ＫＢ）の間にある領域に位置する、２個 または３個の高感受性部位があるかも知れない。

マウス３００２株と２０７１株の両方とも５から８個のｃｏｓ４Ｎと３’　、３ Ｓａｌ［断片を含む。Ｂ細胞の数の約５倍か非形質転換マウスのようにλ１鎖を 発現しており、λ１特異的ｍＲＮＡのレベルが５から１０倍増加しているため、 形質転換遺伝子の発現レベルは内因性λ１アレレ（対立遺伝子）の発現レベルに 近付いているようである。

ｃｏｓ４Ｎとｃｏｓ　３’　、３からの配列を含むもっと多くのマウス株を産生 ずれば、発現レベルが直接コピー数ニ比例しているか否かが確認できるであろう 。

データは高感受性部位がＤＣＲとして働いているＣＯ５３′、３からの配列に一 致している。いずれにしてもこれらは強力なり細胞特異的エンハンサ−として働 いている。おそらく再配列λ１遺伝子のＣＡＰ部位のｋｂ上流にある高感受性部 位を含有する５′発現レベルを注入したＤＮＡに付加すれば、機能的ＤＣＲが完 成するであろう。

ＤＣＲを単離するこのアプローチの１つの変法では、酵母の人工染色体（ＹＡＣ ３）中でクローン化されたマウスラムダローカスの非常に大きい切片を使用する （ムレイとシスタック（Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　５ｚｏｓｔａｋ）、１９８３年 、ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、第３０５巻、１８９−１９３頁）。数１０ ０キロベースのＤＮＡがＹＡＣベクターを使用してクローン化できる。Ｊ５５８ Ｌ　ＤＮＡから調製されたＹＡＣライブラリーが、ラムダ配列を含むクローンに ついてスクリーニングされるであろう。これらのクローンはミエローマ細胞への トランスフェクションかまたは受精したマウス卵に注入することにより、ラムダ の発現について試験されるであろう。コピー数依存性、組織特異的、高レベルの 発現は、ＤＣＲの存在を示し、これに関与する配列はＤＮａｓｅ　Ｉ高感受性部 位マツピングにより同定できるであろう。次にこれらはＹＡＣクローンからサブ クローンされるであろう。

本発明はマウスのラムダ免疫グロブリンローカスに関連する優性調節領域の配列 を、初めて同定するものである。

λ１軽鎖を合成する細胞株Ｊ５５８Ｌにおいて、高感受性部位は再配列されたλ １遺伝子のＣＡＰ部位の２．３−２．４　ｋｂ上流に、ゲノムＶλ２の２．５　 ｋｂ上流に、再配列されたλ、遺伝子の約３０ｋｂ３°に、そしてＣλ４遺伝子 切片の約１７ｋｂ３’　にあることが同定された。これらの部位が位置する配列 がＪ５５８Ｌ細胞株からクローン化され、そのλ１１遺伝子現に対する影響は、 ミエローマ細胞と形質転換マウスで試験された。

「通常の」高感受性部位はλ１免疫グロブリンプロモーターに関連して検出され てはいないため、このＤＮａｓｅＩ高感受性部位は「超Ｊ高感受性部位と言える 。ＤＮａｓｅＩ高感受性部位は（例えばβ−グロビンのローカスで示されたよう に）高感受性部位の塊よりなるため、これは「超」高感受性部位である。高感受 性部位の位置はβ−グロビンやＣＤ２０−カス（すなわちローカスの５°　と３ ′）から類推することによるＤＣＲと考えられる位置と一致する。

本発明は例として記載したものであり、本発明の範囲から逸脱することなく本発 明の詳細部分の変更が可能であることは理解できるであろう。

浄書′内容に変更なし） ｘ：腐仲−−−−−−−−− ）、＋ｏＯｏｋｂ ５４　５Ｊ３ＳＪＴＳの（＆シ ＞　＋ＯＯＯｋｂ ＴＳＬＢｒＴＳＬＢｒ −０−７１、−−＄−４ 「 手続補正書（自発） 平成３年

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の宿主細胞により遺伝子が発現されるように、哺乳動物の宿主細胞 の遺伝物質に遺伝子を組み込むためのベクターであって、ベクターはプロモータ ーと該遺伝子よりなり、ベクターは、宿主の細胞型に制限され、組み込み部位非 依存性で、遺伝子のコピー数に依存性の発現を誘導することが可能な、免疫グロ ブリンの優性調節領域（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎ）を 含むことを特徴とする、上記ベクター。
2. ２．優性調節傾城はマウスのλ免疫グロブリン遺伝子ローカスより得られる、請 求の範囲第１項に記載のベクター。
3. ３．優性調節領域は、再配列されたλ１遺伝子のＣＡＰ部位の約２．３５ｋｂ上 流にあるＤＮａｓｅ　Ｉ超高感受性部位よりなる、請求の範囲第２項に記載のベ クター。
4. ４．優性調節傾城は、ゲノムＶλ２切片の約２．５ｋｂ上流にあるＤＮａｓｅ　 Ｉ超高感受性部位よりなる、請求の範囲第２項に記載のベクター。
5. ５．優性調節領域は、再配列されたλ１遺伝子の約３０ｋｂ下流にあるＤＮａｓ ｅ　Ｉ超高感受性部位よりなる、請求の範囲第２項に記載のベクター。
6. ６．優性調節領域は、Ｃλ４遺伝子の約１７ｋｂ下流にある超高感受性部位より なる、請求の範囲第２項に記載のベクター。
7. ７．優性調節領域は、再配列されたλ１遺伝子のＣＡＰ部位の約２．３５ｋｂ上 流にあるＤＮａｓｅ　Ｉ超高感受性部位と、再配列されたλ１遺伝子の約３０ｋ ｂ３′にあるＤＮａｓｅ　Ｉ高感受性部位と組合わさっている、請求の範囲第２ 項に記載のベクター。
8. ８．上記請求の範囲のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換された哺乳 動物の宿主細胞。
9. ９．請求の範囲第１項から第７項までのいずれか１項に記載のベクターで形質転 換された形質転換哺乳動物。
10. １０．上記請求の範囲のいずれか１項に記載のベクターで形質転換した哺乳動物 宿主細胞を培養することよりなる、ポリペプチドの産生方法。
11. １１．以下の段階よりなる遺伝子療法の方法：１）哺乳動物の体から幹細胞を取 り出し、２）体に残存している幹細胞を殺し、 ３）体に欠損しているかまたは存在しない遺伝子を含有する、請求の範囲第１項 から第７項までのいずれか１項に規定きれたベクターで、取り出した幹細胞を形 質転換させ、 ４）体に形質転換させた幹細胞を戻す。
12. １２．以下の段階よりなる遺伝子療法の方法；１）哺乳動物の体から幹細胞を取 り出し、２）体に欠損しているかまたは存在しない遺伝子を含有する、請求の範 囲第１項から第７項までのいずれか１項に規定されたベクターで、取り出した幹 細胞を形質転換させ、 ３）体に形質転換させた幹細胞を戻す。
13. １３．マウスのλ免疫グロブリンローカスから得られる機能性エンハンサー成分 。
14. １４．再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｏｌ部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲ Ｉ部位と、このＸｈｏＩ部位の１０ｋｂ下流のＳｎａＢＩ部位との間のＤＮＡ配 列のすべてまたはその機能性部分よりなるＤＮＡ配列より構成される、機能性マ ウス免疫グロブリンλ１エンハンサー。
15. １５．再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｏｌ部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲ １部位の下流の、１．３ｋｂの最初のＨｉｎｄ　ＩＩＩからＨｉｎｄ　ＩＩＩま でのＤＮＡ断片のすべてまたはその機能性部分よりなる、請求の範囲第１４項に 記載の機能性マウス免疫グロブリンλ１エンハンサー。
16. １６．再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｏｌ部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲ １部位の下流の、１．３ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの断片 は、第１１図の「ＨＩＩＩＡ」と記載されるものである、請求の範囲第１５項に 記載の機能性マウス免疫グロブリンλ１エンハンサー。
17. １７．再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｏＩ部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲ Ｉ部位の下流にあって、このＸｈｏＩ部位の１０ｋｂ下流のＳｎａＢＩ部位まで わたっている、３．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩからＨｉｎｄ　ＩＩＩまでのＤＮＡ 断片のすべてまたはその機能性部分よりなる、請求の範囲第１４項に記載の機能 性マウス免疫グロブリンλ１エンハンサー。
18. １８．再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｏＩ部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲ Ｉ部位の下流にあって、このＸｈｏＩ部位の１０ｋｂ下流のＳｎａＢＩ部位まで わたっている、３．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩからＨｉｎｄ　ＩＩＩまでの断片は 、第１１図の「ＨＩＩＩＣ」と記載されているものである、請求の範囲第１７項 に記載の機能性マウス免疫グロブリンλ１エンハンサー。
19. １９．再配列したマウスλ１免疫グロブリン遺伝子の約３０ｋｂ３′の領域由来 の、請求の範囲第１３項に記載の機能性エンハンサー成分。
20. ２０．請求の範囲第１９項に記載の機能性エンハンサー成分と組合さっている、 請求の範囲第１３項に記載の機能性エンハンサー成分よりなる、機能性エンハン サー成分。
21. ２１．請求の範囲第１３項から第２０項までのいずれか１項に記載の機能性マウ ス免疫グロブリンλ１エンハンサーよりなるベクター。
22. ２２．請求の範囲第１３項から第２０項までのいずれか１項に記載の機能性マウ ス免疫グロブリンλ１エンハンサーと、独立した遺伝子発現系よりなる単離され たＤＮＡ配列より構成される、組み込みに適した請求の範囲第２１項に記載のベ クターであるが、ただし該独立した発現系の遺伝子のプロモーターがマウスλ１ 免疫グロブリンプロモーターである時、該遺伝子はマウスλ１免疫グロブリンを コードしない、上記ベクター。
23. ２３．宿主細胞中のベクターの複製を確実にすることができるレプリコンよりな るＤＮＡ配列、請求の範囲第１３項から第２０項までのいずれか１項に記載の機 能性マウス免疫グロブリンλエンハンサー、そして独立した遺伝子発現系から構 成される請求の範囲第２１項に記載のベクターであるが、ただし該独立した発現 系の遺伝子のプロモーターがマウスλ１免疫グロブリンプロモーターである時、 該遺伝子はマウスλ１免疫グロブリンをコードしない、上記ベクター。
24. ２４．以下より選択される、単離された機能性マウス免疫グロブリンλ１エンハ ンサーよりなるトランスファーベクター； １）再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｏＩ部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲＩ 部位と、このＸｈｏＩ部位の１０ｋｂ下流のＳｎａＢＩ部位との間の配列、 ２）再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈｏＩ部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲＩ 部位の下流の、１．３ｋｂの最初のＨｉｎｄ　ＩＩＩからＨｉｎｄ　ＩＩＩまで の断片のすべてまたはその機能性部分、３）再配列したマウスλ１遺伝子のＸｈ ｏＩ部位の３．８ｋｂ下流のＥｃｏＲＩ部位の下流にあって、このＸｈｏＩ部位 の１０ｋｂ下流のＳｎａＢＩ部位までわたっている、３．３ｋｂのＨｉｎｄ　Ｉ ＩＩからＨｉｎ　ＩＩＩまでの断片のすべてまたはその機能性部分。
25. ２５．請求の範囲第２１項から第２４項までのいずれか１項に記載のベクターで 形質転換されたヒトまたは動物の宿主細胞。
26. ２６．請求の範囲第２１項から第２４項までのいずれか１項に記載のベクターで 形質転換されたヒトまたは動物の宿主細胞を培養することよりなる、ポリペプチ ドの産生方法。