JPH04505006A - ｉｎ ｖｉｖｏ アミロイド形成を妨害する医薬活性剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｉ’ｎ’ｖｉｖｏ　アミロイド形成を妨害する医薬活性剤発明の背景 本発明は、生理学的に適合し得る量で一般に「アミロイド」として表示される蛋 白質性組織沈着物の形成を阻害するよづに作用する化合物の同定に関する。更に 詳細には、本発明はｉマｉマ０でアミロイド繊維物質の形成を妨害する医薬活性 剤、及ζ咳活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。

「アミロイド症（ｌＴＩｏｉｄｏｓ日）」の範噂に分類される病１［１的症状に は、細胞外領域での異常な繊維物質（「アミロイド菖雑物質」）の沈着を特徴と する多くの症状がある。７ミロイト繊維物質は、引き続き多種多様の蛋白質の最 終共通経路を表すしかしながら、これらの生化学的組成を問わず、すべてのタイ プのアミロイド繊維物質は、（１）層状のβ−シート構造、（−）−コンゴーレ ッド染料で染色後の偏光顕微鏡下での緑色系複屈折及び（Ｃ）電子顕微鏡下での 典型的な外観をもつ繊維形態を有すアミロイド繊維物質の沈着は、いくつかの器 官に影響を及ぼして例えば家族性地中海熱、家族性アミロイドポリニューロパシ ー及び全身性アミロイド症のような全身性の疾患を発症し得るか、あるいはその 沈着は限局的に１つの器官に制限され得る。

後者には、アルツハイマー病群、すなわアルツハイマー病［前老人性痴呆、老人 性痴呆〕　；ダウン症候群と結合したアルツハイマー病；パーキンソン病のよう な他の中枢神経系疾患と結合したアルツハイマー病；及び［アルツハイマー病と 結合又は非ｒ　、 結合の］フンゴー好性血管障害を含む　脳ア（ロイドｆｌ！、の範喝に分類され る症状がある。

脳アミロイド症の有効な治療法はなく、アミロイド沈着の発症後には殆どいつも 致命的な結果となる。例えば、アルツハイマー病は化アメリカの死亡原因の４番 目又は５番目となっていると推定される。

一般に認められているｔＪｅｌアミロイド症（ｃ＊ｒｃｂｒ＊１、◆ ５ｍ１ｌｏｉｄｏｔ目）微候は、大部分ψアミロイド繊維物質からなる、いわゆ る「老人性プラーク」と呼ばれる多数の病巣の蓄積である。老人性プラークは直 径１６−Ｈｅμ−の範囲の球状であり、時には年配の成人の大脳皮質にも見られ るが、大多数はアルツハイマーに冒された皮質に見られる。

（正常又はアルツハイマーに冒された）ヒト脳内に見出され、まだアミロイドに はなっていない物質の利用、及び該物質のアミロイドへの転換の利用は、全く文 献に報告されていない。また、この分野において、アルツハイマー病の性質によ りて特徴付けられ、ヒト材料からもっばら誘導される実験系に関する記述も皆無 である。アミロイドの存在は、老人性プラーク形成の最も定性的及び定量的に特 異的な指標となるため、抽出され、活性化され、さもなければヒト脳から誘導さ れる前駆物質から実験的にアミロイド繊維物質を再生することは、脳アミロイド 症の進行と薬剤又は前駆物質とを結び付ける最も入手可能な証拠を構築すること は殆どの専門家の認めるところである。

このような結び付きをテストすることを可能にする実験系が重要であると認識さ れているにも゛かかわらず、ヒト脳組織から単独に誘導される物質から実験的に アミロイドを再生することは不可能であった。それ故、老人性アミロイド症を治 療するのに有効であると考えられる化合物に対する入手可能な確実な指標はなく 、また、生理学的に許容し得る量の活性剤で脳限局性前駆物質が老人性アミロイ ドに転化するのを阻止する一群の化合物（すなわち、「抗アミａイド活性剤」と 表示する）が存在するかどうかを決定することもできない。

デンスミクロスフェア（ｄｓ＊ｓｓ　ｍ１ｃｒ＊Ｂｋｅｔ＊）　と称する、顕微 φ 鏡下の構造は、正常な脳及びアルツハイマー病に冒された脳に存在することが知 られている。Ａｖｔｒｋａｃｋ、　Ａｔｌ５　Ｎｅ＊ｒ＊ｅｐｓＨａｌ。

６１　：　１４８−８　（１９８３）を参照せよ。また、その結果は、Ｈｓｒ＊ 。

１、！ｌｅ＠＋ａｐ＊ｊｋ、Ｅｔｐ、Ｎｅｍｒｏｌ、（１９８６）により確認さ れたが、この文献も参照せよ。デンスミクロスフェア（ＤＭＳ）が存在スるとい う証拠は、顕微鏡下での固定全脳組織の組織切片研究から得られ、デンスミクロ スフェア、連続した膜（ｒＤＭｓ膜」）で囲まれた蛋白質性中心領域（ｒＤＭＳ 蛋白質」）を有することが分かる。デンスミクロスフェアは、ミトコンドリアの ような他の限定された脳構造体に対して、概算で、、−１６以下の単位頻度で、 概算で１０−ｇ以下の総脳容積を占める無作為に分散された互いに非常に離間し あった構造体として観察される。

ＤＭＳ単離試料の抽出、精製及び特性付けも、またＤＭＳ物質のいかなる利用法 も報告されていない。このように、ＤＭＳは、未証明の機能及び未知の重要性又 は有用性を有する構造体であり、実体的な形態では効果的に入手し得なかった。

発明の概要 従って、本発明の目的は、アミロイドの形成を妨害し、よって、異常な量の７ミ ロイドβ−蛋白質の存在によって特徴付けられる蟇アミロイド症の治療に有用な 療法のスクリーニング法を提供することである。

また、本発明の目的は、通常生理学的に許容され得る量で１匹においてアミロイ ド繊維物質の形成を阻害する活性を有する医薬活性剤の種類から選択される化合 物を投与することによってβ−アミロイド症を治療する方法を提供することであ る。

更に、本発明の別の目的は、生物学的試料におけるＤＭＳの存在を検出するため に用い得る抗体を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明の態様の１゛つに従って、（ｉ）　コンゴ ーレッド染料で染色し得る物質を産生するような哺乳動物の脳組織由来のデンス ミクロスフェアを破砕し、（１）　該物質をコンゴーレッド染料と接触させ、次 いで（ｉｉｉ　）　該物質をコンゴ−好性（Ｃ・ＢＢｋｉｌｉｃ）複屈折の発生 を検出するための試験にかける、 各工程を包含するアミロイド形成を妨害する能力をスクリーニングする方法を提 供する。好ましい実施態様において、本発明のスクリーニング法は、更に、工Ｉ Ｉ　（ｉ）の前に、デンスミクロスフェアを薬剤と接触させる工程を含む。

本発明の別の態様によれば、ＤＭＳの脳内注入を受けるテスト動物に約１０’Ｍ 以下の組織内濃度で投与するとアミロイド繊維物質の形成を阻害する化合物を、 医薬上有効量で、アミロイド形成が予期される被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与 する段階を含む脳アミロイド症の治療方法も提供される。好ましい実施態様の１ つにおいて、このように投与された化合物は、その場でＤＭＳ蛋白質が層状のβ −シート構造に構造変化するのを防止するような方法でＤＭＳ蛋白質又はＤＭＳ 膜に作用してアミロイド形成を阻害する。

また、本発明の別の態様によれば、本質的に、哺乳動物の脳組織由来のデンスミ クロスフェアに対して反応性のある抗体、好ましくはモノクローナル抗体からな る組成物が提供される。

本発明の他の目的、構成及び効果は以下の詳細な説明によって明らかになるであ ろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施態 様を示すものであって、単に説明するためのものであり、従って当業者には、こ の詳細し得ることは自明であろう。

好適実施態様の詳細な説明 今度、例えば脳アミロイド症の発症と関係のあるアミロイド繊維物質の発生は、 ｉｎ　ｗｉマ０での非抑制的ＤＭＳ崩解と密接に関連していることを発見した。

ＤＭＳ崩解とアミロイド形成の間の関係は、コンゴーレッド染料で処理した崩解 ＤＭＳは老人性プラークアミロイドに見られるものと同一の赤−緑色のコンゴ− 好性複屈折を示すという亭実により部分的に立証される。

従って、脳アミａイド症の特徴である最も重大な様相の脳損傷は、本発明に従っ て、正常な哺乳動物の脳試料由来の物質を用いて再現し得る。

また、約１１１−５Ｍ又はそれ以下の組織内濃度で、脳内注入によりＤＭＳを受 容するテスト動物のアミロイド繊維物質形成を妨害する効果のある化合物は、ア ルツハイマー病を含む脳アミロイド症の治療に使用し得ることを発見した。ここ で特に有効な化合物は、例えば細胞内又は細胞外結合を介しＤＭＳ蛋白質又はＤ ＭＳＨに作用し、脳内のＤＭＳ蛋白質の層状のβ−シートコンホーメーシ厘ンへ の構造変化を防ぐ化合物である。

本発明で使用されるミクロスフェア体は哺乳動物の脳組織から誘導され、本質的 に均質な状態で、約０．１μ烏〜約Ｉｓμ−の直径範囲、上述の外膜／蛋白質性 コア構造のＤＭＳ、及びあるうのは、ＤＭＳが光学顕微鏡レベルで被験組成物に おいて識別し得るＤＭＳ構造のみを表わすことを意味する。）例えば本発明のミ クロスフェア体は、オスミウム及び鉛で染色する場合に電子密度が均一であり、 薄切片電子顕微鏡で見ることが可能であり、また、光学顕微鏡下の試験の際には 、それらはエオシン好性及びフロキシン好性の性質を示し、コンゴーレッドで染 色した場合に非複屈折である。本発明のミクロスフェア体が破砕されると、コン ゴ−好性複屈折を現出させる物質が生成される。

すなわち、フンゴーレッドで染色すると、該物質は、入射光線波を互いに垂直な 振動面を持つた２つの波に分離する程度まで光学的に異方性となる。

ＤＭＳは球形であり、膜に結合し、細胞内構造体であり、直径約０．１〜１５μ 腸であり、ヒト及び他の哺乳動物の脳に見出される。更に詳細には、ＤＭＳの王 宮な位置は灰白質神経網中であり、ここでは、球形構造体は小さな神経細胞突起 の中に包括されている。ＤＭＳは孤立性、非細胞体及び非融合性であり、かつ、 小脳中又は白質中には見られない。ＤＭＳ間の距離に関しては、灰白質領域中の ＤＭＳの空間的な分布は無作為である。

物質形態のＤＭＳ組成物は、本発明により抽出により製造することができ、球状 体の均質な試料が得られる。

脳組織からのＤＭＳの抽出の後に、以下の工程が続けられる。

（１）　ヒト又は動物に対する標準の死後技術を用いて死後の頭蓋から全編を取 り出す。ヒト又は動物が循環停Ｊ裕から６時間以内に脳を摘出するか、あるいは 死後できるだけ早く死体を冷蔵すると良好な結果が、得られる。ＤＭＳは死後６ 時間以上経ても依然抽出可能であり、また死体の冷却が遅れたり、冷却しない場 合であっても抽出可能であるが、これら２つの因子は個々の脳あたりの全ＤＭＳ 平均収量を通常非常に減少させる。

ＤＭＳに及ぼす、循環停止後の時間間隔及び温度の影響に加えて、脳あたりのＤ ＭＳ含量にはかなり個体差があり、また、ＤＭＳ抽出能力においても個体間で変 化があり、それは臨死時の（ｉｌｏｕｔｌ）代謝状態、すべての病状及び他の因 子にも関係する。

脳あたりの全ＤＭＳ収量を決定する全ての因子がＤＭＳ抽出に影響するが、これ は、均質なりＭＳの量は抽出能力の割合の減少に比例して減少するためである。

このような減少は、抽出工程の間正確な認識を妨げるのに十分であると思われる 。更に、本発明による、推定される抗アミロイド症療法のスクリーニング及び単 離した０ＭＳ試料の特徴付けは、相応して更に困難となりかつコスト高となり、 結局極めて少量のＤＭＳでは不可能であると考えられる。

（２）　清潔な器具を眉いて、取り出したばかりの脳は即座に解体される。解体 はｔｏ　ｌ／２Ｃの低温室で行うのが好ましい。注意深＜、シかし速やかで、鋭 く、そして粗野な解体によって、内包、放射冠、生卵円中心、脳幹、小脳、軟及 び硬髄膜、くも膜肉芽、脈絡膜叢及び血管が分離、廃棄され、そして残った脳の 塊はすばやく次の段階に使用される。（顕微鏡研究用の標準ブロックはこの段階 で取り出され、組織固定液に別に貯蔵される。）解体した脳の塊（ｒＤＢＭＪ　 ）は、解体後すぐに使用するのが好ましい。また、−Ｉｌｌ　Ｉ／２ｃ〜−ＴＯ １／２’Ｃの温度で冷凍保存しても良いが、冷凍すると個々の脳当りのＤＭＳの 全平均収量は減少する。

（３）　ＤＢＭからのＤＭＳ物質の抽出は、遠心分離工程と組み合わせて実施し 得る。抽出の１例においては、ＤＢＭ対０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ緩衝液（？　 Ｈ７，５）の容量比２：１で、該緩衝液中で機械的に均質化されたＤＢＭは、約 ２０Ｏｒｐｍで約１０分間遠心分離される。（すべての操作は約４　１／２Ｃで 実施される。）このようにして得られた沈殿物（「沈殿物ｉ）を、２６．０００ ｒｐｍ　ｓ　３０分間でシラ糖密度勾配（１，５８９Ｍ、即ち４５％、１．８９ ５Ｍ。

即ち５２％；　２．３８９５Ｍ、即ち６２，５％）遠心分離する。１．８９５Ｍ と１１０１５Ｍ　（５６，７％シ１糖）との間に位置する物質はＤＭＳ含有画分 であることを見出し、従ってこの画分はエオシンで染色し顕微鏡試験によって確 認され得る。

沈殿物Ｉから得られるＤＭＳ含有画分は、実質的に上述のデンスミクロスフェア からなり、本発明によるスクリーニング法に使用し得る。しかしながら、この両 分はＤＭＳ濃度を増すために付加的操作に掛けるのが好ましい。この目的のため に、例えばＤＭＳ含有画分を緩衝液中−一上述のホモジナイゼーシ葺ン緩衝液が この目的のために適しているｍ−で洗浄し、また、得られた混合物を再度（１０ ，ＧＯＧｒｐｉで７分間）回転させてＤＭＳに冨む沈殿物（「沈殿物ＩＩＪ）を 得るのが有利であることが判明した。

沈殿物Ｉと同様に、沈殿物■も密度勾配操作によってＤＭＳの量を更に増すよう にし得る。このような場合においては炭水化物Ｐｅｒｃｏ１１＠（Ｐｈ＠ｒｉｉ 山）が、特に有用である。Ｉｌ、１５ＭＮａＣ１中８０％Ｐｚｒｃ＊ｌｌ＠（１ ，Ｈｇ／ａｄ）の市販調製物は等浸透圧勾配を与え、沈殿物■をこの勾配遠心（ ３０，００Ｏｒｐｍで１５分間）に掛けることができる。連続した試料はそれぞ れ０．２５〜ｌＣこの量で勾配の長さ方向に沿って採取され、ＤＭＳに富む画分 が単離される。これらの画分を緩衝液中で再度洗浄後、再び（１５，０１１ｉｐ ■で１０分間）１度回転させて実質的に純粋なりＭＳである沈殿物（「沈殿物１ ［Ｊ）を得ることができる。

上述のようにして得たＤＭＳ物賃は、本発明に従って抗アミロイド症療法のスク リーニングに使用し得る。特に、本発明の範囲である均質なりＭＳ物装置、脳ア ミロイド症に対する推定療法からなる治療又は活性剤の１部について、ＤＭＳの 崩壊に付随して起るアミロイド形成で見られる赤から緑色のコンゴ−好性複題折 を防ぐ＋１マ目ｒｏでの効果を確かめるべく使用される。

ＤＭＳが対照試料において崩壊する全ての手段によって、推定される抗アミロイ ド症薬剤又は療法を、テスト条件下アミロイド形成を遅らせるか又は妨げる能力 に関してふるい分けることが可能である。例えば、ガラス又はプラスチック製ス ライドのような適当な観察面上でのＩ６マ１ｌｒｏＤ　Ｍ　Ｓ崩壊（以下のテス ト１参照）は、機械的手段により；１０％トリプシン又はペプシン溶液中のよう な酵素処理又は他の化学物質との接触作用により；又はＤＭＳ物質を極端なｐＨ 値（室温でｐＨ２もしくはｐＨ１Ｏ）又は温度（例えば１１１０１／２Ｃで１時 間）にさらすことによって、達成され得る。ＤＭＳの崩壊はまた、本発明のＤＭ Ｓ物質を単離組織試料に注入することによっても効果的に実施される（テスト２ 参照）。この目的の為には脳切片が好ましいが、肝臓、膵臓及び他の組織も組織 試料源に用い得る。

次にｉｓ　ｗａｒ・で効果のあることが証明されている活性剤又は治療法を、本 発明に従って均質なりＭＳ物質を注入した、例えばラット、イヌ、ネコ又は他の 適宜の実験動物からなる脳アミロイド症の動物モデルにおいてアミロイド繊維物 質の形成を阻止させるｉｓマｉマ・での効能を、本発明に従ってテストする。脳 内注入が好ましいけれども、皮膚及び筋肉のような脳以外のテスト動物の体の注 入部位は、アミロイド形成を妨害するのに提案された活性剤又は治療段階の能力 を決定するために遍している。ガラススライド上へのＤＭＳの単なる注入ではア ミロイド形成が起こらないので、ＤＭＳの注入によるアミロイド繊維物質の１１ マｉｔｓでの生成は注入された組織の細胞外の場所で起こることが分かる。

ある場合にＤＭＳを注入したテスト動物におけるアミロイドのｉｎ　ｗｉマＯ形 成を妨げる活性剤は、アルツハイマー病を含む脳アミロイド度を治療する上述の 方法で有用であることが認められる。更に精密に言えば、今回新規に定義した医 薬活性剤の範躊に入る物質−−即ち、組織中≦ＩＯ’Ｍ濃度レベルで誘導アミロ イド形成を阻害する種類の化合物−一は、本発明に従って、第２ｉａマ１マ０ア ツセイでテストし得る。特に、この目的のために好ましいのは、脳アミロイド實 の「老人性動物」モデルであり責変化し得るアルツハイマー型脳老人性プラーク 数を増大させることが知られている（Ｗｉｓａｉｃｖｔｋｉら、Ｊ、　Ｆｓｓｒ ｏｐｓｌｂｏＩ、＆　Ｅｌ。

１１ｓｉ＋ｏ１．　コ２　：　５６６　（１９７３）；　５ｅｌｈｋｏｓら、　 ｔｃｉｅ＋＋ｃｓ　２３５　：　８フ３（１０７）参照）年とりたイヌ又はサル のような動物がアミロイド阻害に関してテストされる。このｉｎマｉマ０アッセ イは、老人性プラークの存在を確定し、定量化するための、初期の前治療−及び 対照−生検モニタリングを含むものであり、さらにそれに続＜、ＤＭＳ及び老人 性プラークの発生をその場で及びアミロイド形成阻害性がある（又はない）こと を定量的に覧視するための脳生検を含むものである。

脳アミロイド症を治療するための本発明の方法は、アミロイド形成が予期される 被検体に使用される。治療は、老人性ブラーりと同様に、脳アミロイド症の上記 項目で列挙した診断を持った年長の痴呆症の人々や患者を含めた脳アミロイドの 発症の危険のある人々に適用されつる。これらの患者群におけるその使用に加え て、本発明による予防的治療は、脳アミロイド症の上記項目で列挙した病気のた めに痴呆が予期されない年長の非痴呆性被検体において、少量の脳アミロイド形 成と相関関係にある低重症度の脳機能低下を阻止し予防するのに効果がある。

組織内濃度が約１０　Ｍ以下、例えば約１０−５〜１０’Ｍで抗アミ０イド活性 を示す本発明の範囲の化合物は、被検体に、経口的に、直腸に、鼻を介して、非 経口的に（皮膚又は他の経路を含む）、スプレー又は噴霧形式で、又は吸入法に より投与され得る。本発明の化合物は、このように医薬上許容し得る、生理食塩 水溶液のような担体中に含有させて投与され得る。

を有することに加えて、適切な投与量で無毒であり、効果の持続時間が滴定すべ きものであり、血液脳関門を通過する適切な能力を示す。また、特に、ＤＭＳ成 分に対して特異的で選択的な結合親和性を育する化合物が好ましい。

本発明に従って投与される化合物の医薬的な有効量は、薬動力学データ及び臨床 効能の標準的な評価に従つて決まる。

ＧＯＯＤＭＡＮ　ＡＮＤ　Ｇ［ＬＭＡＮ’Ｓ　ＴＨＥ　ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧ ＩＣＡＬ　ＩＩＡＳＩＳ　ＦＯＲＴＩＩＥＩｔＡＰ！ＵＴＩＣ３（３１７版）参 照。このように、上述のｉｎ　ｗｉｒｅ動物テストは、ヒトに臨床的に課せられ る投与範囲又は投与計画に基づいて与えられる。この点での評価は薬動力学デー タ、例えば生物学的利用率、吸収性、代謝、血清レベル及び排泄に関してなされ る。

このようなデータは、神経行動テスト（＋＋ｃｍｔｏｂｅｂ＊マ１ｏｒｘｌ＋ｅ ｓｆｉａｔ）Ｎえば記憶テスト及び認知機能のテストによって、及び臨床医学的 評価によって同時に得られる臨床データと対比して評価される。もし投与が、症 候性患者即ち脳アミロイド症を患っていると診断された被検体の臨床パラメータ ーにおいて、痴呆の進行を停止させるならば、上記投与はまた、年長の、非痴呆 性の人々に予防効果があると言えるだろう。更に、本発明の医薬組成物は、アミ ロイド形成に伴なう脳機能の低下を回復又は予防するのに用いられ、この事は痴 呆の重症度を低下させ、即ち、被検体は指導又は看護を必要としない。

上記の人々の予防的療法は、本発明に従って、指定された年令群、例えば６５又 は７０歳から７５歳に入る脳機能の正常なすべての人々に対して効果がある。あ るいは、予防的療法は、正常な脳機能を示すが、一方診断テストにより脳内での ＤＭＳ崩壊の証拠が認められるどの年令の非痴呆性の人々にも適用され得る。

この種の診断テストは、脳組織に由来しない生物学的試料例えば、血清、をｉｎ 液及び他の体液の試料において、ＤＭＳ膜、ＤＭＳ蛋白質又はそれらの断片のよ うなりＭＳ成分の存在に関して免疫原的に若しくはその他の方法でアッセイする ことによって実施され得る。テストはまた、１種以上のＤＭＳ成分に対する抗体 を被検体において検出することによっても可能である。

更に、本発明の予防的療法は、痴呆の危険性を示唆し、放射線医学又は診断上の 画像化、遺伝子テスト、脳波検査法又は他の手段で明らかにされる他の因子に基 づく非痴呆性の人々にも適用され得る。

以下の模範的テスト法は、上述のＤＭＳ物質が上述の覆類の化合物の範囲に入る 抗アミロイド症薬剤を確定する際に、本発明に従って常習的に使用し得る方法を 示している。

する。使用するＤＭＳの容量及び数は任意であるが、判定を容易にするためには 少なくとも数千であることが推奨される（以下の実施例１参照）。多量の試料は コスト高を招くが、試験を更に容易にし且つ確実な結果を与える。ステンレス製 スパーチルを用いて、ＤＭＳをガラススライドに１分間前後に反復移動させてこ すっておしつけて機械的にＤＭＳを崩壊させる。

スライドを空気乾燥させる。次いで、フンゴーレッド染料を２．３滴乾燥したス ライドに加え、乾燥した崩壊ＤＭＳ上を３０秒間静かに通過させた後、染料をス ライドからティッシュペーパー又は濾紙に吸収させて除く。スライドを光学顕微 鏡下で試験する。このとき、顕微鏡には赤−線コンゴー好性複屈折を評価するた めに交差偏光レンズを装着する。結果は、アルツハイマー患者の老人性プラーク アミロイドにおいて、最初にスライドに適用されたＤＭＳの容量に比例した量で 見られる赤から薄縁色の複屈折と同様の明白な赤から緑色（「澄んだ薄縁色」） の複屈折である。すべての他の反応、染色結果、又は定量的に無意味な結果は、 崩壊したＤＭＳが老人性プラークアミロイドの性質を有することを示す適用した ＤＭＳの量に比例した量で、待機的な色相変化−陽性染色結果がない場合には陰 性であると考えられる。

テストの目的の為に、対応する０ＭＳ試料を可能性のある薬剤と接触させ、上記 のＤＭＳ崩壊／染色手順を繰り返す。多くの変形が可能であり、例えば活性剤は 、スライドに適用する前にＤＭＳの溶液中に又はスライド上のＤＭＳに適用され 得る。

いずれの場合にも、薬剤が陰性対照スライド（薬剤は存在しない）で観察される 赤−線色複屈折を妨害する場合には、活性剤は脳アミロイド症に対する効能につ いて更にテストされるべきである。

陽性対照として、テストスライドはまた、ジフェニルジアゾ−ビス−α−ナフチ ルアミンスルホン酸ナトリウム、Ｃ３２Ｈ２２Ｎ６Ｎａ２０６Ｓ２の１％水溶液 と接触後にＤＭＳを崩壊させたスライドと比較し得る。該化合物、即ちコンゴー レッドはＧｒ＊ｙｅｓ　＆にｔｃｋｈｔ（ｉｔ　ＥＢＩｉｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｄ、 ２Ｌ４　：　ＩＦｉ２−８３（１９３６１；及びＷｔｌｌａｃｅ、　Ｔｈｅ　Ｌ ■ｃｅｔ　（Ｆｔｂ、２Ｇ、１．９３２）、３９１−９３に記載され、本発明の ミクロスフェアベースのＩｏ　ｔｅｒａアッセイでアミロイド形成を阻止するこ とを見出した。

テスト２　ヒト脳切片中のｉｓ　ｙｉｌｒｏＤ　Ｍ　Ｓ崩壊死後のヒトの脳試料 の組織ブロックサイズ（ブロックサイズは任意に選択可能である；通常１−５ｃ ！ｌＸｌ−５備Ｘｉ−３ｗ）を無菌の手袋、メス及び鉗子を用いた無菌の手法で 取出し、ペトリ皿のような無菌の空のプラスチック容器に入れた後、抽出したＤ ＭＳを室温で各脳試料に注入する。室温で１時間の培養後、脳試料を組織固定液 に浸漬し、光学顕微鏡観察用の標準技術により組織を処理する。対照、接種物の 大きさ、スライドの調製及び結果の判定は、以下のｉａマＩマＯテスト３で論議 するものでカバーされる。

テスト３　生組織にＤＭＳを注入することによってｉａ　ｗｉマＯで誘発される アミロイドの形成 実験げっ歯動物に麻酔をかけ、その脳を通常行われている方法で固定化し、頭骨 及びＮＨに無菌の針を挿入することにより大脳皮賀表面領域に均質なりＭＳを注 入する。（ＤＭＳ陰性物質の擬似対照物を対偶性皮質又は別の動物に注入し得る 。）麻酔の方法、開頭術の種類、脳実質内の注入の位置、針及び注射器又は他の 注入具の大きさ、傷の閉鎖技術及び使用する動物の数は、テストに決定的な事で はなく、使用される動物によって変化し得る。従って、大きい哺乳動物ではバー ホール（１＋１ｔｔｋｏｌ＊］が必要であるのに反して、小さいマウスでは頭骨 弁を必要としない。また、針又は注入具の大きさは動物の脳の大きさ等で変化し 得る（実施例１参照）。注入量は選択的であり、注入量が少ないほど組織学、酌 に追跡することをより困難にし、かつ高価となる（以下参照５）が、一方性入量 を多くするほど使用されるＤＭＳの数によって更に高価になる。例示としての実 験結果は実施例１に詳述する。

動物は注入後約３０分又はそれ以上して無痛的に死亡させる。

死亡の正確な時間は選択的であり、一般に１〜２４時間が好ましいが、ＤＭＳ転 換は持続され、種々の時間間隔で認識され得る。

動物を犠牲にした後、脳を標準的な方法で取出し、組織固定液中で浸漬固定する 。潅流固定法は、潅流圧が通常注入室を破壊し、結果を得難（するので推兵され ない。

標準的な方法に従って、全体を数日間（より大きい動物の脳では相応してより長 くなる）固定し、スライスし、包埋し、切断し、スライドに固定し、そして組織 学的研究用に染色する。

解剖用顕微鏡が注入部位を定めるために使用され、そのブロックに脳切片を正確 に置き、そして顕微鏡切片作製法に従って切片を注意深く詳細に調べて切片内の 注入位置を確めるが、トリミング操作の間に切片を捨てることはない。切片を固 定したスライドは標準方法によりコンゴーレッドで染色される。切片を上述の偏 光レンズを取付けた光学顕微鏡で試験し、ｉｍマ１ｌｒＯテストに関して上記と 同様に評価する。

陽性及び陰性の対照を使用し、推定される活性剤のテストを、続（上述したｉｎ ｗ目ｒｅテスト法と同様の方法で実施する。化合物層を注射、経口摂取又はその 他の経路で、ＤＭＳ導入の前後又はその間に、及びＤＭＳと共に又は別々にｉｎ 　ｒｉｖｅテストし得るという亭実に基づく種々の変形が可能である。更に、薬 剤の作用に基づくもの以外の治療戦術はあらゆる動物で研究することが可能であ る。

ヒトの臨床テストに適した無毒性の化合物は、本発明に従い、前記テストによっ て好ましくはＤＭＳ蛋白質の層状β−シートコンホーメーシＩン（β−１ｓｓｔ ＊ｄ　ｓｋｅ！ｊ　ｃｏ＊ｆｏｒｍｔｔｉｏｍ）への変化を阻害することによっ てアミロイド形成を妨げるという事を確認し得る。ＤＭＳ蛋白質は標準実験動物 の免疫原であるので、本発明のＤＭＳ物質はまた、デンスミクロフェアに対する ポリクロナール及びモノクロナール抗体を調製するために使用される。引き続き 、これらの抗体は、ＥＬＩＳＡ−型アッセイ、例えば、マ０ＬＬＥＩら、ＴＨＥ 　Ｅ！ＩＺＴＭＥ　ＬＩＮＩＥＤ　ＩｌＩＭＵｌ１０３０１ＢＥＩＩＴ　ＡＳＳ ＡＴ　（ＩＬＩＳＡ）（Ｄ７＊ｔｌ＊Ｃｋ　Ｌｔｋｓｒｓｌ＋＋ｒｉｓ＊　１９ ７９）参照、及び生物学的試料中のＤＭＳを検出するためのラジオイムノアッセ イのような他の免疫学的テストに使用され得る。例えば、ＫｅｌＩＩＩ！ｔら、 Ｃ＊＋ｒ、　Ｔｏｐ。

Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏ１．　１ｍｍｔｎｏ１．　Ｈニア７−９１　（１９７８）に記 載されているような一般的な技術により、抗ＤＭＳ抗体は本発明のＤＭＳ物質を 用いて調製され、−次いで放射性核種、比色定量剤又は螢光標識を用いて該抗体 に「標識」をつける。標識をつけた抗体は、該抗体がデンスミクロスフェアと反 応してそれを視覚化させ、該成分の存在を検出するための診断テストに使用し得 る。

本明細書中、「抗体」という用語はモノクロナール及びポリクロナール抗体を包 含する。このような抗体はどんなりラスの抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ等）に 属していてもよい。モノクロナール抗体（Ｍａｂ）の製造は、一般に、リンパ球 を単離し、これを骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成することによって 行われる。クローン化したハイブリドーマは次いで「抗ＤＭＳＪ抗体即ち、ＤＭ Ｓ成分と選択的に結合する抗体の製造用としてふるい分けされる。「抗体」には また、Ｆａｂ及びＦ　Ｄｂ’）　ｔのような抗ＤＭＳ抗体断片及びこのような断 片の結合体並びに例えば米国特許第４．７０４．６０号による抗ＤＭＳ抗体−を 主とした、いわゆる「抗原結合蛋白質」　（単鎖抗体）が包含される。

あるいは、本発明の範囲内であるＭ　ａ　ｂ又はその断片は、！、ｃａｌｉ等の 宿主細胞（Ｗｓｔｄら、）Ｉ＊＋ｗｒ＊　３４１：５４４−４６　（１９ｇ９） 参照）又は形質導入されたマウスミエローマ細胞（Ｇｉｌｌｉｅｓ　ラ、Ｂｉｏ ｌ！ｅｈｎｏ１．　７：　７９９−８０４　（１９８９）及びＬｋｘｌＩｉら、 　ｆｏｅ、ｅｉｌ、。

８０５−１０参照）内での前記Ｍａｂの可変領域をコードする単離ＤＮＡの発現 により、通常の方法を用いて製造し得る。更に、Ｆａｂ分子は遺伝学的に形質転 換されたＥ、ｃｏｌｉ等の宿主内で発現及び構築され得る。従って、断片化前の 抗体を産生ずる被検体（＋ｓｌ＋１ｅｃｌ）の潜在的多様性と等しいか又はそれ を凌ぐ潜在的多様性を持ったＦａｂの集団を発現するために、ラムダベクター系 が使用され得る。ｌＩｗ＋ｅら、Ｓｃ：ｔａｃｅ　２４６：　１２７５−８１　 （１９８９）参　。

照。

ＤＭＳ成分に対する抗体はまた、通常の方法によって、例えば上述のハイブリド ーマを用いることによって、抗イデイオタイプ抗体（抗ＤＭＳ抗体を結合する抗 体）の調製に使用され得る。例えば、米国特許第４．６９９．８８０号参照。

ＤＭＳ成分、該成分に対する抗体、及び染料のような他の分子を含み、特異的に 反応してＤＭＳ成分又は抗ＤＭＳ抗体の存在を示す上述の物質は、脳中のＤＭＳ 崩壊のテスト用として使用し得る。このようなテストは、本発明により患者集団 の療法選択に使用することができるだろう。

本発明の他の詳細を次の例示的な実施例を参照して更に記述均質に抽出された約 ８０．　ＧｏｏのＤＭＳをガラススライド上にパスツールピペットから１滴滴下 し、その滴下物を空気乾燥した。

ＤＭＳはガラススライドに付着した。生理食塩水中のアセチルコリン（２０１Ｍ ）を、可能性のあるテスト化合物としてＤＭＳに１滴滴下した。

ＤＭＳをテスト化合物の存在下上述したように機械的に破砕し、次に空気乾燥し た。対照スライドは、テスト化合物を加えないという点以外は、全く同様の方法 で処理した。フンゴーレッド染料を加え、反応生成物を前記のようにして試験し た。

偏光レンズを用いた光学顕微鏡試験下で、両方のスライドはそれぞれ最初のＤＭ Ｓ滴下物の量とほぼ同量の赤く染まった多量の物質を示した。赤い物質は、偏光 レンズの回転の間、明るい澄んだ薄縁色に変ることが観察された。偏光レンズの 前後の回転は、いつまでも持続する、明瞭な多量の赤から緑及び緑から赤の複屈 折を明示した。両方のスライドは、アセチルコリンのテスト結果が陰性であり、 従って、生理学的に許容し得る量で抗アミロイド活性を示す種類の化合物に属す るかどうかを決定するために上述のようなテストを更に行う必要がない事を意味 する、これらの区別できない結果を示した。

実施例２ 生理学的に適合しつる濃度で有効なアミロイド形成阻害剤とル吸入により麻酔を かけた。それらの頭部を頭部定位装具で固定する。両側の頭頂後頭部の頭皮を無 菌のメスブレードで切開（１ａ１）　した。両側の頭頂後頭部に０，５腫のバー ホールを０．５閣のドリルで開けた。

分析される各化合物（以下参照）を６匹のラットのそれぞれに、約４００，００ ０のヒトＤＭＳ及び該化合物を含む無菌の生理食塩水（全容量：　１ｆｌＯｇＬ ）を無菌の２２ゲージ針のついた無菌のｌｃｃの注射器からバーホールを介して その一方の側に注入した。

注入は大脳皮質内に散開の深さで行われ、よって注入は実賀内部に行われ、表面 上又は脳室内ではない。従って、注入した場所での化合物の組織内濃度は生理食 塩水中の化合物の濃度に相当する（以下の表のデータ参照）。

６匹のテストラットそれぞれの対偶性の側にも、無菌の生理食塩水（ＩＨμＬ） の注入を行った。この内部対照の他に、注入されなかった対照群を、それぞれテ スト群に参入させた。

テスト動物への注入後、傷を覆うために頭皮の切り口に無菌の縫合をし、動物を 観察した。注入後１時間、１２時間及び２４時間の間隔で、４匹の動物（テスト 動物群から２匹と対照動物２匹）のそれぞれにエーテル吸入及びＣＯ２吸入を行 って動物を無痛で犠牲にした。それらの脳を取り出し、１０％のホルマリンに２ ４時間浸漬して固定した。次いで固定した組織を０．５ｍ〜１■厚さの切片に冠 状にスライスし、注入面を切開し、上記“テスト３“に記載したように阻止（ｂ ｌｏｃｋｅｄ）　したＯ注入部位を含むブロックを厚さ６μｍの切片に切断し、 １０番目ずつ切片をスライド固定し、注入部位を含む全部で１０個の技術的に無 傷の切片を作製した。固定した切片を前記のようにコンゴーレッドで処理して染 色し、光学顕微鏡下で偏光光線をあてた場合とあてない場合について試験した。

次の測定を光学ミクロメーター並びに標準計数グリッド及び目盛によって行った ：（１１全病巣面積；（２）コンゴ−好性複屈折アミロイド沈着病巣部の総数及 び（３）コンゴ−好性複屈折アミロイド沈着物を含む病巣面積のパーセント。

テスト化合物：上述のようなテスト１に相当する１塁マｉｌ＋ｏアッセイにより 、以下の各化合物が約１０’Ｍの濃度で抗アミロイド活性を有することが示され た。

マラリアの予防に使用され、哺乳動物酵素を阻害する量以下の濃度でマラリア原 虫のジヒドロ葉酸還元酵素を充分阻害するように作用する。それは経口的に完全 に吸収され、しばしば他の薬剤と組合わせた併合療法で用いられる。ピリメタミ ンは中枢神経系に対する効果がないことが報告されている。

（Ｂ）ジェタノ−ル（「ｌ’ｅｒｓ＊鳳口Ｉ！」）−正式名称が２．６−ビス− （ジェタノールアミノ）−４，８−ジピペリジノピリミドー（５，４−ｄ）−ピ リミジンであるこの化合物は、平滑ａｍ胞によるアデノシンの取込みを阻害する ことに基づく血管拡張剤である。

（Ｃ）ニフェジピン（ｒＰｒｏＣｘ＋ｄｉｓＪ　）−通常心臓の治療に使用され るニフェジピンは舌下投与によって速やかにかつ完全に吸収されるカルシウムチ ャンネルブロッカ−である。血漿蛋白質に９８％結合し、血管拡張性がその唯一 の主要な毒性効果である。この薬剤の中枢神経系に及ぼす作用は知られていない 。

（Ｄ）クロモリン　ナトリウム（ｒｌａｌ＊ｌＪ　）この化合物の公知の用途は 、この化合物に喘息又はアレルギー反応でヒスタミン及び他の作用物室を放出す るのを妨げる活性があることを明らかにしている。該化合物を粉末として吸入器 から投与すると約ＩＤ％が肺に入り、経口的に吸収され難い。

公知の申枢神経作眉はない。

（Ｅ）コンゴーレッド（ジフェニルジアゾ−ビスーα−ナフチルアミンスルホン 駿ナトリウム）−この化合物は、血液容量の測定用及びその他の診断テスト用と して、並びにｐＨ指示薬及び組織染色剤として使用される染料である。例えば、 この化合物をアミロイド症に関するテストで静注すると、正常なヒトの血液から は１時間以内で３ｆ１％の染料が消失するがアミロイド症の罹病者の血液からは 同じ時間の間４０％〜１００％が消失する。しかしながら、それ自体生化学的活 性は認められていなかつた。

（Ｆ）スルフイスオキサゾール（ｒ　Ｇ　ｓ　Ｉｌｌ　ｒ　ｉ　ｓ　ｉ　＊　Ｊ 　）　−ニー　ＣＤ化合物は良好な抗菌スペクトルを青し、すばやく吸収及び排 泄される。これは血漿蛋白質を結合する。スルフイスオキサゾールは、抗菌活性 以外中枢神経系に対する効果は知られていない。

ズル７１ス尤ヤアゾール （Ｇ）エリトロマイシン−水溶性で経口的に効果のあるマクロリドファミリーの 抗生物質、エリトロマイシンは、感受性微生物の５０３リポソームサブユニツト に結合することによって蛋白質合成を阻害する。これは小腸で吸収され、約１６ 時間の半減期を有する。この化合物は公知の中枢神経効果を有していない。

結集：６つのテスト群（１テスト化合物に対して１群）及び対応する対照群の脳 切片から得られた統計的平均有効差に関する標準テストを、上記の測定データに 適用した。次の表に示したように、テスト化合物のそれぞれは、１０”２Ｍ　（ ρ＜　０．０１）で著明な減少効果がある。しかし、ただ３種の化合物、ピリメ タミン、クロモリンナトリウム及びエリトロマイシンはｉｎ　ＢマＯで、　１０ ’〜ｔｏ−’Ｍの範囲の組織内レベルでアミロイドの形成を阻害し、本発明の治 療方法に適した種類の物質にあたることを見出した。

ｔｒ７１１＋ｒｏｍ７ｃｉｔ　１２．８　２　Ｄ、戸Ｇｓ＋＋１ｒｉｓｉａ　１ ０．４　１Ｇ、８　１　１０８　０．１”　８．４Ｐｅ■１ｉｎｅ　１１．１１ 　Ｇ、４　４　１４６　０．２”　１４，６Ｐｒｏｃ＊ｒｄｉｇ　１３．２　１ ．８　４　８８　０．２”　７．６コンゴーレツド　１１４　１０．４　１　１ ０４　０．１”　１１．０〈未処理＞　ｔｌ、ｉ！　１３２　Ｌ２Ｃ８，Ｄ、　 １．２］　Ｃ５，Ｄ、　１２］　［３，Ｄ、　０．２１宰コンゴ−好性複屈折ア ミロイド沈着物書＄未処理の対照群からの著明な減少（ρ＜０．００１）実施例 ３ アミロイド形成阻害剤としての化合物の追加同定。

実施例１で述べた手順の後に更に約５００の化合物を試験したロイド活性を示す ものが２７種あることが明らかとなった。これらのいくつかは、アルツハイマー 病の影響を改善するのに利用し得ると文献で示唆されており、２−アミノ−４− クロロ−６−メチルピリミジン、４−アミノ−６−ヒドロキシピラゾロ［３，４ −Ｄｌ　ピリミジン、塩酸９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジ ン（ＴＨＡ）　、及び２．３−ピリジン−ジカルボン酸を含む化合物であった。

とりわけ、フィチン酸、ネオスチグミン硫酸メチル及び臭化ビリドスチグミンを 含む、アルツハイマー病の症状に育利な作用を与えるとして以前に同定されたい くつかの他の化合物は、実施例２で述べたｉａ　ｖｉｔ＋。

アッセイにおいて１０−２〜ＩＯ’Ｍ濃度範囲でも活性がないことが分かった。

同様に不活性なものは、化合物トラゾドン、チオリダジン、パルプロ酸、カルバ ムアゼビン及びトリメトファンカムシレート（「＾ｒｌｏｎｔｄＪ　）であり、 これらすべては脳に作用することで知られていた。

約１０−２ＭでｉｓマＨｒ＋で抗アミロイド活性を有することが見出された化合 物の中で、以下の化合物だけが、１０’Ｍの範囲組織（Ａ）プルブロガリン一二 の化合物、２，３，４．６−テトラヒドロキシ−５Ｈ−ベンゾシクロへブテン− ５−オンはピロガロールの酸化によって製造され、酸化及び金属汚染を阻止し得 るので、従来、食用及び非食用の油並びに炭化水素燃料及び贋滑剤の添加剤とし て側層されていた。

（Ｂ）タルドラジン（Ｃ，１，酸性染料　黄色２３号）−二本に自由に溶解する この化合物は羊毛及び絹の染料として使用されており、更に食物及び摂取薬剤用 途としてＦＤＡによって承認されている。

（Ｃ）スルファニルアミド−この化合物は水に穏やかに溶解し、また種々の有機 溶媒にも可溶性である。抗菌性を有することが知られている。

（Ｄ）ベンゾプルプリン４Ｂ（Ｃ，ｒ、直接染料赤色２号）−この化合物はｒｅ ｃｌｉｐｓｓ　ｔｅｄＪ及びｒｌｓｓｔ　＋ｃｓ＋ＩｅｌＪとしても知られ、０ −トリジン及び４−アミノ−１−ナフタレンスルホン酸ナトリウムをジアゾ化す ることによって製造される。

主に木綿及びビスコースレーヨンの染料として使用されたこの化合物はＡｌ、Ｍ ｇ、Ｈｇ、Ａｇ及びＵの検出用分析試薬としても、また生物学的染料及びｐＨ指 示薬としても使用される。

（Ｅ）２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン−この化合物は染料として遇しているこ とは分かっているが、生物活性は明らかにこれには見出されていなかった。

（Ｆ）５−メチル−２−チオウリジン−二の化合物はｔＲＮＡの少量成分であり 、ラット肝臓のグルタミン酸−及びリシ”、ｔ−ｔＲＮＡから単離された。Ｐｒ ｏｐ、　ｌ１ｉｃｌｓｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

（Ｇ）１．２−ベンゾイソオキサゾール−この化合物は光感受性があるが、これ まで、実用的な用途はなかった。

１．２−　ベンン°イン７午テン―ル 国際調査報告 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＭＳの脳内注入を受けたテスト動物に約１０−５Ｍ以下の組織内濃度で投 与するとアミロイド繊維物質の形成を阻害する医薬上有効量の化合物を、アミロ イド形成が予期される被検体に投与する段階を含む脳アミロイド症の治療方法。
2. ２．脳内のＤＭＳ蛋白質が層伏β−シートコンホーメーションに構造変化するの を妨げるように前記化合物がＤＭＳ蛋白質又はＤＭＳ膜に作用することによって 、アミロイド繊維物質の形成を阻害する請求項１に記載の方法。
3. ３．前記化合物を、ピリメタミン、クロモリンナトリウム、エリトロマイシン、 プルプロガリン、タルトラジン、スルファニルアミド、ペンゾプルプリン４Ｂ、 ２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、５−メチル−２−チオウリジン及び１，２− ベンゾイソオキサゾールからなる群から選択する請求項１に記載の方法。
4. ４．ＤＭＳの脳内注入を受けたテスト動物に約１０−５Ｍ以下の組織内濃度で投 与するとアミロイド繊維物質の形成を阻害する治療上有効量の化合物を含む医薬 組成物であって、哺乳動物被検体内での脳アミロイド形成を阻害又は予防するこ とに使用するための組成物。
5. ５．前記被検体が、関連した別の疾病状態を伴いながらアルツハイマー病又は痴 呆を示す臨床的又は他の証幾を外に表わしていない請求項４に記載の医薬組成物 。
6. ６．前記使用が、痴呆の木質である脳機能低下を予防することである請求項５に 記載の医薬組成物。
7. ７．痴呆症状は明白でないが、前記被検体が、別の疾病状態のために増大しつつ あるアルツハイマー病又は痴呆の危険度に関するテストで陽性となる請求項４に 記載の医薬組成物。
8. ８．前記被検体が、脳におけるＤＭＳ崩壌の存在に関するテストで陽性よなる請 求項７に記載の医薬組成物。
9. ９．哺乳動物被検体における脳アミロイド形成の阻害又は予防用医薬組成物の製 造のための化合物の使用であって、前記化合物が、ＤＭＳの脳内注入をけたテス ト動物に約１０−５Ｍ以下の組織内濃度で投与するとアミロイド繊維物質の形成 を阻害することを特徴とする使用。
10. １０．脳内のＤＭＳ蛋白質が層伏β−シートコンホーメーションに構造変化する のを妨げるように前記化合物がＤＭＳ蛋白質又はＤＭＳ膜に作用することによっ て、アミロイド繊維物質の形成を阻害する請求項９に記載の使用。