CN109475562A - 用于预防风险患者中的阿尔茨海默病的噁嗪衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及噁嗪衍生物BACE‑1抑制剂和包含这样的噁嗪衍生物的药物组合物，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病，并且尤其是，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

Description

用于预防风险患者中的阿尔茨海默病的噁嗪衍生物

技术领域

本发明涉及噁嗪衍生物和包含这种噁嗪衍生物的药物组合物，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途；并且尤其是，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是世界上最普遍的神经障碍之一，也是最常见且使人衰弱的年龄相关病状，其导致进行性遗忘、痴呆并最终导致整体认知障碍和死亡。目前，唯一可用的药物疗法是诸如胆碱酯酶抑制剂的对症药物，或用于控制AD继发性行为症状的其他药物。针对AD致病性级联的研究性治疗包括旨在干扰淀粉样物质-β(Aβ)种类的产生、积聚或中毒后遗症的那些治疗(Kramp VP,Herrling P,2011)。通过以下方法靶向降低Aβ的策略具有潜在治疗价值：(1)用针对Aβ的主动或被动免疫疗法提高淀粉样物质清除率；(2)通过抑制β位点-APP裂解酶-1(BACE-1，一种参与淀粉样前体蛋白[APP]加工的酶)降低产量。

基于针对该疾病痴呆阶段的近期临床试验中的动物数据和有限益处，越来越多的人认为在临床前阶段降低Aβ的疗法在预防或减缓AD的进展方面可能最有效。此方法允许参与者在症状和疾病发作之前或其最早阶段，在纤维性Aβ平稳期、广泛出现τ(神经纤维)病理表现、和不可逆的突触或神经元损失之前进行治疗。

载脂蛋白E(ApoE4)基因的ε4等位基因是阿尔茨海默病(AD)的主要风险因素。APOE基因存在于三个多态性等位基因ε2、ε3和ε4中，其中ε3最常见。APOE同种型对Aβ清除、聚集和沉积的影响不同；ε2似乎具有保护性，而ε4携带者具有增强的病理表现和加速的年龄依赖性认知衰退(综述参见Liu CC等人，2013)。

人ApoE位于19号染色体上(基因APOE，Uniprot P02649，基因编码317个氨基酸，包括18个氨基酸的前肽)，成熟形式由299个氨基酸组成，并具有2个单独的由柔性接头连接的N端和C端结构域。N端结构域含有供受体结合的结合结构域(aa 136-150)，而脂质结合结构域(aa240-260)位于C端部分中。在人类中已知三种主要的同种型(apoE2、apoE3和apoE4)，ApoE3(在位置112处具有Cys并且在位置158处具有Arg)在人类中的等位基因频率为约50％-90％。ApoE2(在位置112和158处具有Cys)在人类中的等位基因频率为1％-5％，并且ApoE4(在位置112和158处具有Arg)在人类中的等位基因频率为5％-35％。ApoE3和ApoE4以高亲和力结合LDL受体，而ApoE2(由于Cys-158)仅具有低亲和力。

据估计，ApoE4纯合体占一般群体的2％至3％，并且与具有其他APOE基因型的人相比，发展AD症状的风险高得多，发作时平均年龄为68岁(Corder EH等人，1993)。到85岁时，男性纯合体的症状性AD的终生风险可能高达51％，并且女性纯合体可能高达60％-68％。85岁ApoE4杂合体的相应百分比风险对于携带ApoE3/4基因型的男性和女性分别为23％和30％，对于携带ApoE2/4基因型的男性和女性分别为20％和27％(Genin E等人，2011)。有人提出，ApoE4基因的存在通过影响Aβ清除、聚集和沉积而增加AD的风险(Liu CC等人，2013)。预期ApoE4杂合体中脑淀粉样物质病理表现的存在显著增加发展AD临床症状的风险(与纯合体相当)。

发明内容

化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺，在本文中称为“化合物1”是口服活性BACE抑制剂，先前描述在WO2012/095469A1中，对BACE-1的选择性是对BACE-2的约3倍，并且没有相关的脱靶结合或脱靶活性。

鉴于迄今为止该领域中的挫折和失望率很高(Cummings JL等人，2014)，关于任何实验疾病缓解性AD疗法是否会对风险患者奏效，存在高度不确定性。然而，本文用化合物1证明了在以下方面的高度有效性：(i)在不存在不良副作用(例如毛发变色)的情况下降低ApoE4转基因小鼠和人ApoE4携带者中的Aβ水平；(ii)减少APP23小鼠模型中的淀粉样物质-β沉积；并且特别是，(iii)提高脑脊液中的Aβ42/Aβ40比率，表明对潜在AD病理表现的作用；这强烈表明在处于发展AD临床症状风险中的患者并且尤其是携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者中预防AD方面，化合物1将会是有效的。

本文描述了II/III期临床试验，该试验被设计为用于证明化合物1在预防认知未受损的ApoE4纯合体患者或认知未受损的、淀粉样物质阳性的ApoE4杂合体患者中的AD方面的有效性。基于目前的知识，提出的该临床试验的结论和本文所述的结果可以推广并适用于ApoE4纯合体和杂合体之外的风险患者中的AD(例如在携带淀粉样前体蛋白(APP)、早老素-1和早老素-2基因突变的患者中(O’Brien RJ,Wong PC,2011)或在唐氏综合征患者中(Head E等人，2012))，因为预期BACE抑制剂疗法会独立于淀粉样物质沉积的多种潜在原因，减少和/或防止淀粉样物质斑块积聚。

在本发明的第一方面，因而提供了化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途。

在本发明的第二方面，提供了包含N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途。

在本发明的第三方面，提供了在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的方法，该方法包括向这样的患者给予治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

在本发明的第四方面，提供了在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的方法，该方法包括向这样的患者给予药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

在本发明的第五方面，提供了化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途。

在本发明的第六方面，提供了包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途。

在本发明的第七方面，提供了化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于生产用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的药剂的用途。

具体实施方式

附图列表

图1：用化合物1或NB-360长期处理8周的C57BL/6小鼠的毛皮颜色评分(平均值±SEM)

图2：用8μmol/kg和50μmol/kg的化合物1处理时在最后一个剂量后C57BL/6小鼠脑Aβ40的减少(平均值±SD，每组n＝4)

图3：急性给予化合物1对APOE4-TR雄性和雌性小鼠前脑Aβ40水平的影响(3-5月龄，平均值±SEM)

图4：急性给予化合物1对APOE4-TR雄性和雌性小鼠的CSF Aβ40水平的影响(3-5月龄)(平均值±SEM)

图5：急性施用化合物1对APOE4-TR雄性和雌性小鼠的CSF Aβ42水平的影响(3-5月龄)(平均值±SEM)

图6：APOE4-TR雄性和雌性小鼠中化合物1的急性暴露(3-5月龄，平均值±SD)

图7：脑PK/PD关系(个体数据)

图8：脑PK/PD关系(平均值±SD)

图9：在人类受试者的多次递增口服剂量研究中，化合物1在暴露两周后对CSF Aβ40水平的影响

图10：人类受试者中化合物1对CSF Aβ40水平的影响-3个月时(最后一次给药后24小时)相对于基线的％变化

图11：化合物1对Triton TX-100提取的APP23脑中的Aβ40的影响

图12：化合物1对Triton TX-100提取的APP23脑中的Aβ42的影响

图13：化合物1对Triton TX-100提取的APP23脑中的sAPPα的影响

图14：化合物1对Triton TX-100提取的APP23脑中的sAPPβ(Swe)的影响

图15：化合物1处理对APP23小鼠脑脊液中的Aβ40的影响

图16：化合物1对小鼠中甲酸可溶性Aβ40的影响(值是平均值±SEM)

图17：化合物1对小鼠中甲酸可溶性Aβ42的影响(值是平均值±SEM)

图18：化合物1对小鼠中甲酸可溶性总Aβ(40+42)的影响(值是平均值±SEM)

图19：化合物1对小鼠中甲酸可溶性Aβ42/40比率的影响(值是平均值±SEM)

图20：化合物1对斑块组织学-小斑块数量的影响(数据针对总面积进行归一化)

图21：化合物1对斑块组织学-中等斑块数量的影响(数据针对总面积进行归一化)

图22：化合物1对斑块组织学-大斑块数量的影响(数据针对总面积进行归一化)

图23：化合物1对斑块组织学-总斑块面积的影响(数据针对总面积进行归一化)

图24：GFAP阳性总面积，针对总面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图25：斑块相关的GFAP阳性面积，针对总面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图26：非斑块相关的GFAP阳性面积，针对总面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图27：近端GFAP阳性面积，针对总面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图28：远端GFAP阳性面积，针对总面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图29：化合物1处理对IBA1阳性总面积的影响。显示了不同的小胶质细胞群，按样品面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图30：化合物1处理对斑块相关IBA1阳性面积的影响。显示了不同的小胶质细胞群，按样品面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图31：化合物1处理对非斑块相关的IBA1+面积的影响。显示了不同的小胶质细胞群，按样品面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图32：化合物1处理对近端IBA1+面积的影响。显示了不同的小胶质细胞群，按样品面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图33：化合物1处理对远端IBA1+面积的影响。显示了不同的小胶质细胞群，按样品面积进行归一化。显示的是平均值±SEM。用Dunnett多重比较测试进行比较。

图34：健康受试者的两部分、开放标签、两期、固定顺序研究的设计，用于评价化合物1在单独给予和联合强CYP3A4抑制剂伊曲康唑或强CYP3A4诱导剂利福平给予时的PK。

图35：基线时，在CSF Aβ42/Aβ40比率<0.09的非ApoE4携带者和ApoE4携带者健康老年受试者中，响应于用化合物1处理，CSF Aβ42/Aβ40比率相对于基线的倍数变化。用Dunnett多重比较测试进行比较。

本文描述了本发明的各种实施例。

本发明第一方面的A系列实施例

实施例A1：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途。

实施例A2：根据实施例A1所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向或患有唐氏综合征。

实施例A3：根据实施例A2所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向并且该遗传倾向为：

(i)淀粉样前体蛋白、早老素-1或早老素-2的基因突变；或

(ii)存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例A4：根据实施例A3所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例A5：根据实施例A4所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例A6：根据实施例A4所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例A7：根据实施例A1至A6中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例A8：根据实施例A7所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该淀粉样物质阳性通过PET或CSF测量来确定。

实施例A9：根据实施例A3至A8中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例A10：根据实施例A1至A9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。

实施例A11：根据实施例A1至A9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。

实施例A12：根据实施例A1至A9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。

实施例A13：根据实施例A1至A9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。

实施例A14：根据实施例A1至A9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按15mg/天的剂量使用。

实施例A15：根据实施例A1至A9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按50mg/天的剂量使用。

实施例A16：根据实施例A1至A9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例A17：根据实施例A1至A9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例A18：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例A19：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝，并且其中该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。

实施例A20：根据实施例A1至A19中任一项所述的用于该用途的化合物，其中该化合物呈游离形式。

实施例A21：根据实施例A1至A20中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗。

实施例A22：根据实施例A1至A20中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗超过三个月的期限。

实施例A23：根据实施例A21或A22所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例A24：根据实施例A23所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

本发明第二方面的B系列实施例

实施例B1：一种药物组合物，该药物组合物包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途。

实施例B2：根据实施例B1所述的用于该用途的药物组合物，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向或患有唐氏综合征。

实施例B3：根据实施例B2所述的用于该用途的药物组合物，其中该患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向并且该遗传倾向为：

(i)淀粉样前体蛋白、早老素-1或早老素-2的基因突变；或

(ii)存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例B4：根据实施例B3所述的用于该用途的药物组合物，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例B5：根据实施例B4所述的用于该用途的药物组合物，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例B6：根据实施例B4所述的用于该用途的药物组合物，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例B7：根据实施例B1至B6中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例B8：根据实施例B7所述的用于该用途的药物组合物，其中该淀粉样物质阳性通过PET或CSF测量来确定。

实施例B9：根据实施例B3至B8中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例B10：根据实施例B1至B9中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。

实施例B11：根据实施例B1至B9中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。

实施例B12：根据实施例B1至B9中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。

实施例B13：根据实施例B1至B9中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。

实施例B14：根据实施例B1至B9中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该化合物按15mg/天的剂量使用。

实施例B15：根据实施例B1至B9中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该化合物按50mg/天的剂量使用。

实施例B16：根据实施例B1至B9中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例B17：根据实施例B1至B9中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例B18：一种药物组合物，该药物组合物包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例B19：一种药物组合物，该药物组合物包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝，并且其中该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。

实施例B20：根据实施例B1至B19中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该化合物呈游离形式。

实施例B21：根据实施例B1至B20中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗。

实施例B22：根据实施例B1至B20中任一项所述的用于该用途的药物组合物，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗超过三个月的期限。

实施例B23：根据实施例B21或B22所述的用于该用途的药物组合物，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例B24：根据实施例B23所述的用于该用途的药物组合物，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

本发明第三方面的C系列实施例

实施例C1：一种用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的方法，该方法包括向这样的患者施用治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例C2：根据实施例C1所述的方法，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向或患有唐氏综合征。

实施例C3：根据实施例C2所述的方法，其中该患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向并且该遗传倾向为：

(i)淀粉样前体蛋白、早老素-1或早老素-2的基因突变；或

(ii)存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例C4：根据实施例C3所述的方法，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例C5：根据实施例C4所述的方法，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例C6：根据实施例C4所述的方法，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例C7：根据实施例C1至C6中任一项所述的方法，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例C8：根据实施例C7所述的方法，其中该淀粉样物质阳性通过PET或CSF测量来确定。

实施例C9：根据实施例C3至C8中任一项所述的方法，其中该患者超过60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75岁。

实施例C10：根据实施例C3至C8中任一项所述的方法，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例C11：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的日剂量使用。

实施例C12：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。

实施例C13：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。

实施例C14.根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低范围达10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％至99％、97％、95％、93％、90％、87％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的日剂量使用。

实施例C15.根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按在至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％的患者中或在80％、85％或90％至99％、97％、95％或93％的患者中导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低范围达40％至70％、45％至65％或50％至60％、或降低至少50％的日剂量使用。

实施例C16.根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按在至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％的患者中或在80％、85％或90％至99％、97％、95％或93％的患者中导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低范围达65％至95％、75％至90％或80％至90％、或降低至少80％的日剂量使用。

实施例C17：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按以下剂量使用：5mg/天与10mg/天之间、10mg/天与15mg/天之间、15mg/天与20mg/天之间、20mg/天与25mg/天之间、25mg/天与30mg/天之间、30mg/天与35mg/天之间、35mg/天与40mg/天之间、45mg/天与50mg/天之间、50mg/天与55mg/天之间、55mg/天与60mg/天之间、60mg/天与100mg/天之间、100mg/天与200mg/天之间、200mg/天与300mg/天之间、15mg/天与85mg/天之间、50mg/天与85mg/天之间、15mg/天与300mg/天之间、或50mg/天与300mg/天之间。

实施例C18：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。

实施例C19：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。

实施例C20：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按15mg/天的剂量使用。

实施例C21：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按50mg/天的剂量使用。

实施例C22：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按产生以下血浆稳态C最大值的日剂量使用：0ng/ml与50ng/ml之间、50ng/ml与100ng/ml之间、100ng/ml与150ng/ml之间、150ng/ml与200ng/ml之间、200ng/ml与250ng/ml之间、250ng/ml与300ng/ml之间、300ng/ml与350ng/ml之间、350ng/ml与400ng/ml之间、400ng/ml与450ng/ml之间、450ng/ml与500ng/ml之间、500ng/ml与550ng/ml之间、550ng/ml与600ng/ml之间、600ng/ml与650ng/ml之间、或650ng/ml与700ng/ml之间。

实施例C23：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例C24：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例C25：一种用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的方法，该方法包括向这样的患者给予治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例C26：一种用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的方法，该方法包括向这样的患者施用治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝，并且其中该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。

实施例C27：根据实施例C1至C26中任一项所述的方法，其中该化合物呈游离形式。

实施例C28：根据实施例C1至C27中任一项所述的方法，其中化合物1包含在药物组合物中。

实施例C29：根据实施例C1至C28中任一项所述的方法，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗。

实施例C30：根据实施例C1至C28中任一项所述的方法，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗超过三个月的期限。

实施例C31：根据实施例C29或C30所述的方法，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例C32：根据实施例C31所述的方法，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

本发明第五方面的D系列实施例

实施例D1：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途。

实施例D2：根据实施例D1所述的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向或患有唐氏综合征。

实施例D3：根据实施例D2所述的用途，其中该患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向并且该遗传倾向为：

(i)淀粉样前体蛋白、早老素-1或早老素-2的基因突变；或

(ii)存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例D4：根据实施例D3所述的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例D5：根据实施例D4所述的用途，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例D6：根据实施例D4所述的用途，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例D7：根据实施例D1至D6中任一项所述的用途，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例D8：根据实施例D7所述的用途，其中该淀粉样物质阳性通过PET或CSF测量来确定。

实施例D9：根据实施例D3至D8中任一项所述的用途，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例D10：根据实施例D1至D9中任一项所述的用途，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。

实施例D11：根据实施例D1至D9中任一项所述的用途，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。

实施例D12：根据实施例D1至D9中任一项所述的用途，其中该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。

实施例D13：根据实施例D1至D9中任一项所述的用途，其中该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。

实施例D14：根据实施例D1至D9中任一项所述的用途，其中该化合物按15mg/天的剂量使用。

实施例D15：根据实施例D1至D9中任一项所述的用途，其中该化合物按50mg/天的剂量使用。

实施例D16：根据实施例D1至D9中任一项所述的用途，其中该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例D17：根据实施例D1至D9中任一项所述的用途，其中该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例D18：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例D19：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝，并且其中该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。

实施例D20：根据实施例D1至D19中任一项所述的用途，其中该化合物呈游离形式。

实施例D21：根据实施例D1至D20中任一项所述的用途，其中该化合物包含在药物组合物中。

实施例D22：根据实施例D1至D21中任一项所述的用途，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗。

实施例D23：根据实施例D1至D21中任一项所述的用途，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗超过三个月的期限。

实施例D24：根据实施例D22或D23所述的用途，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例D25：根据实施例D24所述的用途，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

本发明第七方面的E系列实施例

实施例E1：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于生产用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的药剂的用途。

实施例E2：根据实施例E1所述的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向或患有唐氏综合征。

实施例E3：根据实施例E2所述的用途，其中该患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向并且该遗传倾向为：

(i)淀粉样前体蛋白、早老素-1或早老素-2的基因突变；或

(ii)存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例E4：根据实施例E3所述的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例E5：根据实施例E4所述的用途，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例E6：根据实施例E4所述的用途，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例E7：根据实施例E1至E6中任一项所述的用途，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例E8：根据实施例E7所述的用途，其中该淀粉样物质阳性通过PET或CSF测量来确定。

实施例E9：根据实施例E3至E8中任一项所述的用途，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例E10：根据实施例E1至E9中任一项所述的用途，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。

实施例E11：根据实施例E1至E9中任一项所述的用途，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。

实施例E12：根据实施例E1至E9中任一项所述的用途，其中该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。

实施例E13：根据实施例E1至E9中任一项所述的用途，其中该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。

实施例E14：根据实施例E1至E9中任一项所述的用途，其中该化合物按15mg/天的剂量使用。

实施例E15：根据实施例E1至E9中任一项所述的用途，其中该化合物按50mg/天的剂量使用。

实施例E16：根据实施例E1至E9中任一项所述的用途，其中该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例E17：根据实施例E1至E9中任一项所述的用途，其中该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例E18：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于生产用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的药剂的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例E19：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于生产用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的药剂的用途，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝，并且其中该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。

实施例E20：根据实施例E1至E19中任一项所述的用途，其中该化合物呈游离形式。

实施例E21：根据实施例E1至E20中任一项所述的用途，其中该药剂是药物组合物。

实施例E22：根据实施例E1至E21中任一项所述的用途，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗。

实施例E23：根据实施例E1至E21中任一项所述的用途，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗超过三个月的期限。

实施例E24：根据实施例E22或E23所述的用途，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例E25：根据实施例E24所述的用途，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

在又一个发明中，提供了一种用于治疗或预防阿尔茨海默病的方法，该方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗。在一个实施例中，该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗超过三个月的期限。在一个实施例中，该患者同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗不超过三个月的期限。在一个实施例中，该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。在一个实施例中，该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。在一个实施例中，患者超过60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75岁。在一个实施例中，患者在60岁与75岁之间。在一个实施例中，该化合物按化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的日剂量使用。在一个实施例中，该化合物按化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。在一个实施例中，该化合物按化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。在一个实施例中，该化合物按以下剂量使用：5mg/天与10mg/天之间、10mg/天与15mg/天之间、15mg/天与20mg/天之间、20mg/天与25mg/天之间、25mg/天与30mg/天之间、30mg/天与35mg/天之间、35mg/天与40mg/天之间、45mg/天与50mg/天之间、50mg/天与55mg/天之间、55mg/天与60mg/天之间、60mg/天与100mg/天之间、100mg/天与200mg/天之间、200mg/天与300mg/天之间、15mg/天与85mg/天之间、50mg/天与85mg/天之间、15mg/天与300mg/天之间、或50mg/天与300mg/天之间。在一个实施例中，该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。在一个实施例中，该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。在一个实施例中，该化合物按15mg/天的剂量使用。在一个实施例中，该化合物按50mg/天的剂量使用。在一个实施例中，该化合物按产生以下血浆稳态C最大值的日剂量使用：0ng/ml与50ng/ml之间、50ng/ml与100ng/ml之间、100ng/ml与150ng/ml之间、150ng/ml与200ng/ml之间、200ng/ml与250ng/ml之间、250ng/ml与300ng/ml之间、300ng/ml与350ng/ml之间、350ng/ml与400ng/ml之间、400ng/ml与450ng/ml之间、450ng/ml与500ng/ml之间、500ng/ml与550ng/ml之间、550ng/ml与600ng/ml之间、600ng/ml与650ng/ml之间、或650ng/ml与700ng/ml之间。在一个实施例中，该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。在一个实施例中，该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。在又一个实施例中，该化合物以游离形式使用。

在又一个发明中，提供了用作药剂的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中用该药剂治疗的患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗。在该又一个发明的另一方面，提供了化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于治疗或预防阿尔茨海默病的用途，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗。在该又一个发明的一个实施例中，该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗超过三个月的期限。在该又一个发明的一个实施例中，患者同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗不超过三个月的期限。在又一个实施例中，该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。在又一个实施例中，该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。在又一个实施例中，该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。在又一个实施例中，该化合物以游离形式使用。在另一个实施例中，该化合物包含在药物组合物中。

定义

如本文所用，术语“化合物1”或“Cmpd 1”是指具有下列结构式的N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺：

在实例1中，使用替代性化学命名形式，“化合物1”也称为3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-甲酸[6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-三氟甲基-3,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基)-5-氟-吡啶-2-基]-酰胺。

术语“化合物1”、“Cmpd 1”及其相应的完整化学名称在本发明的整个说明书中可互换使用。除非上下文明确地表明仅指一种形式的化合物，否则该术语旨在指游离形式或药学上可接受的盐形式的化合物。在WO 2012/095469 A1的实例34中描述了化合物1。WO2012/095469 A1通过援引以其全文，特别是与实例34的合成有关的披露内容并入本文。

如本文所用，除非上下文明确指出仅指临床前阿尔茨海默病或仅指临床阿尔茨海默病，否则术语“阿尔茨海默病”或“AD”涵盖临床前和临床阿尔茨海默病两者。

如本文所用，除非上下文明确指出仅指AD引起的MCI或由AD引起的痴呆，否则术语“临床阿尔茨海默病”或“临床AD”涵盖由AD引起的轻度认知损害(MCI)和由AD引起的痴呆两者。

如本文所用，术语“临床前阿尔茨海默病”或“临床前AD”是指在没有临床症状的情况下存在AD的体内分子生物标志物。美国国家老龄化研究所和阿尔茨海默病协会(National Institute on Aging and Alzheimer’s Association)提供了如下表1所示的方案，其中列出了临床前AD的不同阶段(Sperling等人，2011)。

表1：临床前AD阶段类别

sMRI＝结构磁共振成像

如本文所用，术语“预防阿尔茨海默病”是指预防性治疗AD；或延迟AD的发作或进展。例如，AD的发作或进展延迟至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一个实施例中，“预防阿尔茨海默病”是指预防性治疗临床前AD；或延迟临床前AD的发作或进展。在又一个实施例中，临床前AD的发作或进展延迟至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在另一个实施例中，“预防阿尔茨海默病”是指预防性治疗临床AD；或延迟临床AD的发作或进展。在又一个实施例中，临床AD的发作或进展延迟至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。

可以通过相对于初始基线值，测量体内分子生物标志物来评估临床前AD发作或进展的延迟，例如，通过测量：

(a)脑中淀粉样物质沉积的减少。例如，通过使用正电子发射断层摄影(PET)成像来测量复合皮质淀粉样物质标准摄取值比率(SUVR)相对于基线的变化。适于测量SUVR比率的PET示踪剂是¹⁸F-氟贝他吡(florbetapir)(((E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-([¹⁸F]氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶-3-基)乙烯基)-N-甲基苯胺))。通过这种方法，可以测量非痴呆个体的独立样品中随时间推移淀粉样物质积聚的发展(Palmqvist S等人，2015)。可以计算预定义的脑皮质目标区(ROI)中的SUVR测量值，参考预定义参考区中的示踪剂摄取。皮质ROI包括已知在AD中具有高淀粉样物质沉积的区域，包括但不限于顶叶区、枕区、外侧颞叶区和内侧颞新皮质区，以及通常在早期AD受影响的区域(Vlassenko AG等人，2012)。在一个实施例中，相对于初始基线值的脑淀粉样物质沉积减少至每年治疗低于0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10.0％的比率；

(b)对潜在τ病理表现的作用，更具体地说是使用PET和合适的τ示踪剂，例如¹⁸F-THK5351(Harada R等人，2016)，来测量脑τ病理表现中SUVR相对于基线的变化，或使用脑脊液(CSF)来测量总τ和磷酸化τ(Forlenza OV等人，2015)。在一个实施例中，CSFτ或磷酸化τ的水平相对于初始基线值每年治疗降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；

(c)使用¹⁸F-FDG(2-脱氧-2-[¹⁸F]氟化葡萄糖)PET(每次扫描200MBq)测量对神经元葡萄糖代谢、密度和/或活性的影响。已经证实受AD影响的脑区域中的¹⁸F-FDG PET信号与AD中的认知损害、后续认知衰退和神经病理表现相关，并随着时间的推移在AD的临床和临床前阶段进展，且是疾病和治疗功效生物标志物(Foster NL等人，2007)。分析数据以确定相对于所选参考区的葡萄糖代谢变化。在一个实施例中，通过¹⁸F-FDG PET测定的受AD影响的脑区域中神经元葡萄糖代谢相对于初始基线值的降低量限于每年治疗低于5％、10％、15％、20％、25％或30％；

(d)脑容量损失较缓慢的下降，如通过体积磁共振成像(vMRI)而评估以测量脑容量相对于基线的变化。vMRI可用于测量海马体、侧脑室和总脑容量的变化。在一个实施例中，海马体容量损失限于每年治疗低于1％、2％或3％；或

(e)随时间推移的CSF Aβ1-42/Aβ1-40比率，例如在基线CSF Aβ1-42/Aβ1-40比率低于0.09的受试者中，其表明皮质淀粉样物质沉积，如本文实例10中所述。在一个实施例中，CSF Aβ1-42/Aβ1-40比率在至少3、6、9、12、18、24或36个月的期限内相对于初始基线值增加至少10％、20％、30％、40％、50％、80％、100％、200％。

也可以使用灵敏的认知指标来跟踪该疾病临床前阶段的变化，例如，使用阿尔茨海默病预防协会(API)临床前综合认知(APCC)成套测试来评估临床前AD发作或进展相对于初始基线值的延迟。APCC作为一款灵敏的工具而开发，用于检测和跟踪有进展成晚发性AD(LOAD)临床阶段的风险的个体的认知下降(Langbaum JB等人，2014)。

可以通过测量由AD引起的认知和功能损害的延迟，例如，通过测量由AD引起的轻度认知损害(MCI)和/或由AD引起的痴呆在临床诊断时间上的延迟来评估临床AD发作的延迟。例如，国家老龄化研究所-阿尔茨海默病协会工作组提出的核心临床诊断标准可用于诊断MCI(Albert MS等人，2011)或痴呆(McKhann GM等人，2011)。欧洲药品管理局(EMA，European Medicines Agency)在其“Draft guidelines on the clinical investigationof medicines for the treatment of AD and other dementias”[用于治疗AD和其他痴呆的药物的临床研究指南草案](EMA/人用药品委员会(CHMP，Committee for MedicinalProducts for Human Use)/539931/2014)中总结了国家老龄化研究所对于如下所述由AD引起的MCI、和AD痴呆的诊断标准。

由AD引起的MCI诊断需要个体内衰退的证据，表现为：

a)如自我报告或填报者报告和/或临床医生的判断所指出的那样，认知从先前达到的水平发生变化。

b)相对于年龄和教育匹配的规范值，至少一个领域(但不一定是情景记忆)的认知受损；容许一个以上认知领域的损害。

c)保持功能能力的独立性，但该标准也接受在开展工具性日常生活活动(IADL)时的“轻微问题”，此时可接受有限的辅助(即，不坚持独立，而是该标准允许因功能丧失引起的轻度依赖)。

d)无痴呆，其名义上是c的功能(上文)。

e)在没有其他潜在痴呆症的情况下，临床表现与AD表型一致。可以通过以下方面提高诊断可信度

1)最佳：阳性Aβ生物标志物和阳性变性生物标志物

2)不太理想：

i.阳性Aβ生物标志物，无变性生物标志物

ii.阳性变性生物标志物，没有测试Aβ生物标志物

AD痴呆的诊断需要：

a)由个体内认知和功能的下降确定存在痴呆。

b)起病隐匿性和渐进性认知下降。

c)两个或更多个认知领域的损害；尽管遗忘表现是最常见的，但该标准允许基于非遗忘表现(例如执行功能和视觉空间能力的损害)进行诊断。

d)不存在与其他痴呆症相关的突出特征。

e)可以通过上文由AD引起的MCI章节中讨论的生物标志物算法提高诊断可信度。

在对由AD引起的MCI、和AD痴呆的诊断中的认知损害和下降可以使用灵敏的认知指标来测量，以跟踪疾病临床阶段的变化，例如使用：

a)临床痴呆评定(CDR)量表-总分(SOB)。CDR是评价认知和功能表现的总体指标，并广泛用于AD的临床研究(Morris JC，1993)。该量表评估六个领域：记忆、方向、判断和解决问题、社区事务、家庭和爱好、以及个人护理。为每个领域分配一个分数，对这些分数求和以获得总分(SOB)。

b)可重复成套神经心理状态测验(RBANS)。RBANS(Randolph C，1998)是一款临床工具，专门设计用于诊断目的和跟踪神经认知状态随时间的变化。该成套测验的一个关键设计目标是检测和表征非常轻微的痴呆；或

c)日常认知量表(ECog)。ECog测量与认知相关的日常能力，包括39项，涵盖6个认知相关领域：日常记忆、日常语言、日常视觉空间能力、日常计划、日常组织和日常分散注意力(Farias ST等人，2008)。

如上所述，用于诊断由AD引起的MCI、和AD痴呆的合适Aβ生物标志物包括例如脑中的CSF Aβ1-40、Aβ1-42、或β淀粉样物质神经炎性斑块的PET成像。

上文关于用于评估临床前AD的发作或进展延迟的体内分子生物标志物，描述了用于诊断由AD引起的MCI、和AD痴呆的合适的变性生物标志物，并且包括例如对潜在τ病理表现的影响；对神经元葡萄糖代谢的影响；或者脑容量损失的较缓慢下降。

如本文所用，术语“患者”是指人类受试者。

如本文所用，术语“处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者”是指：

(a)具有发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向的人类受试者，例如：

i.携带淀粉样前体蛋白(APP)或早老素-1和早老素-2基因突变的受试者(O’BrienRJ,Wong PC,2011)，或

ii.携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的受试者(Liu CC等人，2013)；

(b)患有唐氏综合征的人类受试者(Head E等人，2012)；或

(c)84岁以上的人类受试者。

如本文所用，术语“淀粉样物质阳性”是指脑中具有可检测水平的积聚Aβ的患者。在一个实施例中，如果基于对CSF中的Aβ的评估、或淀粉样物质PET成像、或两者，患者具有可检测水平的积聚Aβ，则该患者呈“淀粉样物质阳性”。如本文所用，术语“通过PET确定的淀粉样物质阳性”是指与背景相比淀粉样物质PET示踪剂保留水平增加。用于测量淀粉样物质阳性的合适的PET示踪剂包括¹⁸F-氟贝他吡(Palmqvist S等人，2015)、¹⁸F-氟比他班(florbetaben)(NeuraCeq)和¹⁸F-氟美他莫(flutemetamol)(Vizamyl)。例如，脑¹⁸F-氟贝他吡PET扫描(每次扫描260MBq)中1.1或更高的SUVR可用作淀粉样物质阳性诊断阈值(Schreiber S等人，2015)。1.2或1.3的SUVR也可用作阈值。

如本文所用，术语“通过CSF测量确定的淀粉样物质阳性”是指与健康对照组中观测到的值相比降低的CSF Aβ1-42值。例如，淀粉样物质阳性可以通过CSF中192ng/L或更低的Aβ1-42值来确定(Mattsson N等人，2015)。然而，用于确定淀粉样物质阳性的CSF Aβ1-42截止值将根据所用的特定技术而变化(Forlenza OV等人，2015)。淀粉样物质阳性也可以通过CSF中小于0.09的Aβ1-42/Aβ1-40比率来确定(Janelidze S等人，2016)。在一个实施例中，Aβ1-42/Aβ1-40比率小于0.20、0.15、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06或0.05，或在0.20与0.01之间、0.15与0.01之间、0.10与0.01之间或0.05与0.01之间。可以使用标准免疫测定技术测量Aβ1-40和Aβ1-42值，例如使用Luminex平台的单克隆单抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)测定法(Herskovitz AZ等人，2013)或Meso Scale Discovery(MSD)96孔多阵列人/啮齿动物(6E10)Aβ40和42夹心免疫测定法(MSD公司(Meso Scale Discovery),罗克维尔市,MD,美国))。

如本文所用，术语“CYP3A4”是指细胞色素P450 3A4。CYP3A4是一种在多种药物的代谢中起主要作用的酶(Luo G等人，2004)。

如本文所用，术语“CYP3A4诱导剂”是指引起CYP3A4活性水平增加的药物。CYP3A4诱导剂的实例包括但不限于卡马西平、苯妥英、利福平和圣约翰草(St John’s wort)。适于测量CYP3A4活性的技术是公知的(参见例如Sevrioukova IF和Poulos TL,2015)。CYP3A4的“强”、“中度”和“弱”诱导剂是分别使化合物1的血浆曲线下面积(AUC)(按照0到无穷大的曲线下面积(AUCinf)计算)减小≥80％、≥50％至<80％和≥20％至<50％的药物。在一个实施例中，“CYP3A4诱导剂”是“CYP3A4的强诱导剂”。CYP3A的强诱导剂的实例包括但不限于卡马西平、恩杂鲁胺、米托坦、苯妥英、甲哌利福霉素(也称为利福平)和圣约翰草。CYP3A的中度诱导剂的实例包括但不限于波生坦、依法韦仑、依曲韦林和莫达非尼。CYP3A的弱诱导剂的实例包括但不限于阿莫达非尼和卢非酰胺。参见http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentReso urces/DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm#table3-3(最后访问时间为2016年10月11日)。

如本文所用，术语“CYP3A4抑制剂”是指引起CYP3A4活性水平降低的药物。适于测量CYP3A4活性的技术是公知的(参见例如Sevrioukova IF和Poulos TL,2015)。CYP3A4抑制剂的实例包括但不限于克拉霉素、葡萄柚汁和伊曲康唑。CYP3A4的“强”、“中度”和“弱”诱导剂是分别使化合物1的血浆AUC(按照0到无穷大的曲线下面积(AUCinf)计算)增加≥5倍、≥2至<5倍和≥1.25至<2倍的药物。在一个实施例中，“CYP3A4抑制剂”是“CYP3A4的强抑制剂”。CYP3A的强抑制剂的实例包括但不限于波普瑞韦、可比司他、考尼伐坦、丹诺普韦和利托那韦、埃替拉韦和利托那韦、葡萄柚汁、茚地那韦和利托那韦、伊曲康唑、酮康唑、洛匹那韦和利托那韦、帕利瑞韦和利托那韦和(奥比他韦和/或达萨布韦)、泊沙康唑、利托那韦、沙奎那韦和利托那韦、特拉匹韦、替拉那韦和利托那韦、醋竹桃霉素、伏立康唑、克拉霉素、地尔硫艾代拉里斯、萘法唑酮和奈非那韦。CYP3A的中度抑制剂的实例包括但不限于阿瑞匹坦、甲腈咪胍、环丙沙星、克霉唑、克唑替尼、环孢菌素、决奈达隆、红霉素、氟康唑、氟伏沙明、伊马替尼、托非索泮和维拉帕米。CYP3A的弱抑制剂的实例包括但不限于氯唑沙宗、西洛他唑、福沙吡坦、伊曲茶碱、伊伐卡托、洛美他派、雷尼替丁、雷诺嗪、他克莫司和替卡格雷。参见http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm#table3-2(最后访问时间为2016年10月11日)。

如本文所用，术语“同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂治疗”是指患者接受CYP3A4抑制剂或诱导剂的治疗方案，同时还接受化合物1的治疗方案的情形。在一个实施例中，患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂和化合物1治疗超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16周。在另一个实施例中，患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂和化合物1治疗超过1、2、3、4、5、7、10或12个月。在某个实施例中，患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂和化合物1治疗超过3个月。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指保持本发明化合物的生物有效性并且通常在生物学上或其他方面并非是不合需要的盐(Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use[药用盐：性质、选择和使用]，第2修订版(2011)P.Heinrich Stahl,Camille G.Wermuth)。

如本文所用，“药物组合物”包含适于经口给药的固体形式(通常为明胶胶囊)的本发明化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体。

术语“治疗有效量”的本发明的化合物是指本发明的化合物在患者中将引起BACE-1抑制的量，正如CSF或血浆Aβ1-40水平相对于初始基线值降低所证明的那样。

为了阐明，每当本文提供某个范围时，所述范围意在包括端点。例如，30mg/天与50mg/天之间的剂量范围也包括30mg/天和50mg/天的剂量。

缩写列表

实例

以下实例说明如何制备化合物1(实例1)；证明化合物1在不存在用对比物化合物NB-360观察到的不良毛发变色副作用的情况下，在降低野生型小鼠中的Aβ水平方面是有效的(实例2)；显示化合物1在APOE4转基因小鼠模型中的PK/PD作用(实例3)；显示化合物1在首次人体临床研究中的PD作用(实例4)；证明化合物1在3个月临床研究中的安全性和耐受性(实例5)；显示在3个月临床研究中ApoE4基因型对化合物1PD反应的影响(实例6)；证明化合物1在APP23AD小鼠模型中减小淀粉样斑块数量和面积方面的治疗有效性(实例7)；说明可以如何在ApoE4纯合体风险患者中进行化合物功效研究(实例8)；显示当联合CYP3A4的强抑制剂或诱导剂给予时，如何影响化合物1的AUC(实例9)；以及证明用化合物1治疗如何影响ApoE4携带和非携带患者的潜在AD病理表现(实例10)。

实例1：化合物1的制备

在WO 2012/095469 A1(实例34)中描述了化合物1的制备。也可如下所述制备化合物1。

NMR方法

除非另有说明，否则用Bruker 400MHz超屏蔽光谱仪(ultrashieldspectrometer)记录质子光谱。化学位移相对于甲醇(δ3.31)、二甲基亚砜(δ2.50)或氯仿(δ7.29)以ppm表示。将少量干燥样品(2mg至5mg)溶于适当的氘代溶剂(0.7mL)中。匀场自动进行，并且光谱根据本领域普通技术人员公知的程序获得。

一般色谱信息

HPLC方法H1(Rt_H1)：

HPLC柱尺寸：3.0mm×30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA；B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内30％至100％B，流量＝0.7ml/min

LCMS方法H2(Rt_H2)：

HPLC柱尺寸：3.0mm×30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA，B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内10％至100％B，流量＝0.7ml/min

UPLCMS方法H3(Rt_H3)：

HPLC柱尺寸：2.1mm×50mm

HPLC柱类型：Acquity UPLC HSS T3，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％甲酸+3.75mM乙酸铵，B)ACN+0.04体积％甲酸

HPLC梯度：1.4min内2％至98％B，0.75min 98％B，流量＝1.2ml/min

HPLC柱温：50℃

LCMS方法H4(Rt_H4)：

HPLC柱尺寸：3.0mm×30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA；B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内70％至100％B，流量＝0.7ml/min

LCMS方法H5(Rt_H5)：

HPLC柱尺寸：3.0mm×30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA；B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内80％至100％B，流量＝0.7ml/min

LCMS方法H6(Rt_H6)：

HPLC柱尺寸：3.0mm×30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA；B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内40％至100％B，流量＝0.7ml/min

a)2-溴-5-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶

将二异丙胺(25.3g，250mmol)于370ml THF中的溶液用干冰丙酮浴在-75℃冷却。滴加BuLi(100ml，250mmol，2.5M的己烷溶液)，同时保持温度低于-50℃。在混合物温度再次达到-75℃后，滴加2-溴-5-氟吡啶(36.7g，208mmol)于45ml THF中的溶液。将混合物在-75℃搅拌1h。迅速添加三乙基氯硅烷(39.2g，260mmol)。温度保持在-50℃以下。移去冷却浴并使反应混合物升至-15℃，倒到NH₄Cl水溶液(10％)上。添加TBME并将各层分离。用盐水洗涤有机层，用MgSO₄.H₂O干燥，过滤并蒸发得到褐色液体，将褐色液体在0.5mm Hg下蒸馏以产生呈浅黄色液体的标题化合物(沸点105℃-111℃)。HPLC：Rt_H4＝2.284min；ESIMS：290,292[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):8.14(s,1H),7.40(d,1H),1.00-0.82(m,15H)。

b)1-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-乙酮

将二异丙胺(25.4g，250mmol)于500ml THF中的溶液冷却至-75℃。滴加BuLi(100ml，250mmol，2.5M的己烷溶液)，同时保持温度低于-50℃。在反应温度再次达到-75℃后，滴加2-溴-5-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶(56.04g，193mmol)于60ml THF中的溶液。将混合物在干冰浴中搅拌70分钟。快速添加N,N-二甲基乙酰胺(21.87g，250mmol)，反应温度升至-57℃。将反应混合物在干冰浴中搅拌15min，然后升温至-40℃。将其倒入2M HCl水溶液(250ml，500mmol)、250ml水和100ml盐水的混合物中。将混合物用TBME萃取，用盐水洗涤，经MgSO₄.H₂O干燥，过滤并蒸发以产生黄色油状物，将黄色油状物在硅胶柱上通过用己烷/0-5％TBME洗脱而纯化，以产生58.5g呈黄色液体的标题化合物。TLC(Hex/TBME 99/1)：R_f＝0.25；HPLC：Rt_H4＝1.921min；ESIMS：332,334[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.57(d,1H),2.68(s,3H),1.00-0.84(m,15H)。

c)(S)-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-2-三甲基硅烷氧基-丙腈

首先，通过将水(54mg，3.00mmol)溶解在100ml无水DCM(≤0.001％水)中来制备催化剂溶液。将这种湿的DCM(44ml，1.32mmol含水量)添加到充分搅拌的丁醇钛(IV)(500mg，1.47mmol)于20ml无水DCM中的溶液中。使所得的澄清溶液回流1h。然后将该溶液冷却至室温并添加2,4-二叔丁基-6-{[(E)-(S)-1-羟甲基-2-甲基-丙基亚氨基]-甲基}-苯酚[CAS155052-31-6](469mg，1.47mmol)。将所得的黄色溶液在室温搅拌1h。将这种催化剂溶液(0.023M，46.6ml，1.07mmol)添加到1-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-乙酮(35.53g，107mmol)和三甲基甲硅烷基氰化物(12.73g，128mmol)于223ml无水DCM中的溶液中。将混合物搅拌2天，然后蒸发得到47g呈橙色油状物的粗制标题化合物。HPLC：Rt_H5＝2.773min；ESIMS：431,433[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.46(d,1H),2.04(s,3H),1.00(t,9H),1.03-0.87(m,15H),0.20(s,9H)。

d)(R)-1-氨基-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-丙-2-醇盐酸盐

将硼烷二甲硫醚复合物(16.55g，218mmol)添加到粗制(S)-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-2-三甲基硅烷氧基-丙腈(47g，109mmol)于470ml THF中的溶液中。使混合物回流2h。移去加热浴，小心滴加MeOH使反应混合物淬灭。在气体停止释出后，缓慢添加6M HCl水溶液(23.6ml，142mmol)。蒸发所得溶液，将残余物溶于MeOH中并蒸发(两次)，以产生44.5g纯度足以用于进一步反应的黄色泡沫。HPLC：Rt_H1＝2.617min；ESIMS：363,365[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.93(s,br,3H),7.53(d,1H),6.11(s,br,1H),3.36-3.27(m,1H),3.18-3.09(m,1H),1.53(s,3H),0.99-0.81(m,15H)。

e)(R)-N-(2-(6-溴-3-氟-4-(三乙基甲硅烷基)吡啶-2-基)-2-羟丙基)-4-硝基苯磺酰胺

向粗(R)-1-氨基-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-丙-2-醇盐酸盐(43.5g，109mmol)于335ml THF中的溶液中添加NaHCO₃(21.02g，250mmol)于500ml水中的溶液。将混合物冷却至0-5℃并滴加4-硝基苯磺酰氯(26.5g，120mmol)于100ml THF中的溶液。将所得乳液搅拌过夜，同时使温度达到室温。用TBME萃取混合物。将有机层用MgSO₄.H₂O干燥，过滤并蒸发以产生橙色树脂，将橙色树脂在硅胶柱上通过用己烷/10％-20％EtOAc洗脱而纯化，以产生37.56g呈黄色树脂的标题化合物。TLC(Hex/EtOAc 3/1)：R_f＝0.34；HPLC：Rt_H4＝1.678min；ESIMS：548,550[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):8.40(d,2H),8.06(t,1H),7.97(d,2H),7.45(d,1H),5.42(s,1H),3.23(d,2H),1.44(s,3H)0.97-0.81(m,15H)；手性HPLC(Chiralpak AD-H 1213,UV 210nm)：90％ee。

f)6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺酰基)-氮杂环丙烷-2-基]-4-三乙基硅烷基-吡啶

将三苯基膦(21.55g，82mmol)和(R)-N-(2-(6-溴-3-氟-4-(三乙基甲硅烷基)吡啶-2-基)-2-羟丙基)-4-硝基苯磺酰胺(37.56g，69mmol)于510ml THF中的溶液冷却至4℃。滴加偶氮二甲酸二乙酯于甲苯中的溶液(40重量％，38.8g，89mmol)，同时保持温度低于10℃。移去冷却浴，将反应混合物在室温搅拌1h。用大约1000ml甲苯稀释反应混合物并在旋转蒸发仪上蒸发除去THF。将所得粗产物的甲苯溶液在硅胶柱上通过用己烷/5-17％EtOAc洗脱而预纯化。将最纯的级分合并、蒸发并从TBME/己烷中结晶，以产生29.2g呈白色晶体的标题化合物。HPLC：Rt_H4＝2.546min；ESIMS：530,532[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):8.40(d,2H),8.19(d,2H),7.39(d,1H),3.14(s,1H),3.02(s,1H),2.01(s,3H)1.03-0.83(m,15H)；α[D]-35.7°(c＝0.97,DCM)。

g)6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺酰基)-氮杂环丙烷-2-基]-吡啶

将氟化钾(1.1g，18.85mmol)添加到6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺酰基)-氮杂环丙烷-2-基]-4-三乙基硅烷基-吡啶(5g，9.43mmol)和AcOH(1.13g，9.43mmol)于25ml THF中的溶液中。添加DMF(35ml)并将该悬浮液在室温搅拌1h。将反应混合物倒到饱和NaHCO₃水溶液和TBME的混合物上。将各层分离并用盐水和TBME洗涤。将合并的有机层用MgSO₄.H₂O干燥，过滤并蒸发得到黄色油状物，将黄色油状物从TBME/己烷中结晶，以产生3.45g呈白色晶体的标题化合物。HPLC：Rt_H6＝2.612min；ESIMS：416,418[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):8.41(d,2H),8.19(d,2H),7.48(dd,1H),7.35(t,1H),3.14(s,1H),3.03(s,1H),2.04(s,3H)；α[D]-35.7°(c＝0.89,DCM)。

h)(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酸乙酯

将(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基-丙酸乙酯(11.93g，64.1mmol)于DMF(158ml)中的溶液抽空/用氮气吹扫两次。滴加KOtBu(6.21g，55.5mmol)于DMF(17ml)中的溶液，同时使用水浴冷却以保持约25℃的反应温度。15min后，添加固体6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺酰基)-氮杂环丙烷-2-基]-吡啶(17.78g，42.7mmol)，继续搅拌3h。将反应混合物倒到1M HCl(56ml)、盐水和TBME的混合物上。将各层分离，用盐水和TBME洗涤。将合并的有机层用MgSO₄·H₂O干燥，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法(己烷/25％至33％TBME)纯化反应粗产物，以产生16.93g呈黄色树脂的标题化合物，它被异构副产物污染(¹H-NMR测得的比率为70:30)。

HPLC：Rt_H6＝2.380min；ESIMS：602,604[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):8.32(d,2H),8.07(d,2H),7.46-7.41(m,1H),7.30-7.23(m,1H),6.92(s,1H),3.39-4.30(m,2H),3.95(d,1H),3.84(d,1H),1.68(s,3H),1.56(s,3H),1.40-1.34(m,3H)+异构副产物。

i)(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酰胺

将(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酸乙酯(16.93g，28.1mmol)于NH₃/MeOH(7M，482ml)中的溶液在50℃在密封容器中搅拌26h。蒸发反应混合物，将残余物从DCM中结晶，以产生9.11g呈无色晶体的标题化合物。

HPLC：Rt_H6＝2.422min；ESIMS：573,575[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):8.33(d,2H),8.06(d,2H),7.42(dd,1H),7.30-7.26(m,1H),7.17(s,br,1H),6.41(s,1H),5.57(s,br,1H),4.15(m,2H),1.68(s,3H),1.65(s,3H)。

j)N-[(R)-1-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-((R)-1-氰基-2,2,2-三氟-1-甲基-乙氧基)-1-甲基-乙基]-4-硝基-苯磺酰胺

将(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酰胺(8.43g，14.70mmol)和三乙胺(5.12ml，36.8mmol)于85ml DCM中的溶液冷却至0℃至5℃。在30min内滴加三氟乙酸酐(2.49ml，17.64mmol)。添加另外的三乙胺(1.54ml，11.07mmol)和三氟乙酸酐(0.75ml，5.29mmol)以完成反应。通过添加14ml氨水(25％)和14ml水淬灭反应混合物。将乳液搅拌15min，添加更多的水和DCM并将各层分离。用MgSO₄H₂O干燥有机层，过滤并蒸发。通过硅胶柱色谱法(己烷/10％-25％EtOAc)纯化得到8.09g呈黄色树脂的标题化合物。

HPLC：Rt_H6＝3.120min；ESIMS：555,557[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):8.35(d,2H),8.11(d,2H),7.50(dd,1H),7.32(dd,1H),6.78(s,1H),4.39(d 1H),4.22(d,1H),1.68(s,6H)。

k)(2R,5R)-5-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基胺

将N-[(R)-1-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-((R)-1-氰基-2,2,2-三氟-1-甲基-乙氧基)-1-甲基-乙基]-4-硝基-苯磺酰胺(9.18g，16.53mmol)和N-乙酰基半胱氨酸(5.40g，33.10mmol)于92ml乙醇中的溶液抽空并用氮气吹扫。添加K₂CO₃(4.57g，33.1mmol)并将混合物在80℃搅拌3天。将反应混合物真空浓缩至原体积的约1/4，并在水与TBME之间分配。用10％K₂CO₃水溶液洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，得到黄色油状物。在二氧化硅上进行柱色谱法(己烷/14-50％(EtOAc:MeOH95:5))，得到4.55g呈灰白色固体的标题化合物。

HPLC：Rt_H2＝2.741min；ESIMS：370,372[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):7.71-7.62(m,2H),5.97(s,br,2H),4.02(d 1H),3.70(d,1H),1.51(s,3H),1.47(s,3H)。

l)(2R,5R)-5-(6-氨基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基胺

用氮气净化玻璃/不锈钢高压釜，添加于乙二醇(130ml)中的Cu₂O(0.464g，3.24mmol)、氨(101ml，25％水溶液，648mmol，30当量)和(2R,5R)-5-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基胺(8g，21.6mmol)。关闭高压釜，将悬浮液加热至60℃，搅拌溶液约48小时(最大压力0.7巴，内部温度59℃至60℃)。将反应混合物用乙酸乙酯和水稀释。有机相用水洗涤并用12％氨水洗涤4次，最后用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将粗产物(7g，含有一些乙二醇，定量产率)不经进一步纯化而用于下一步骤。

HPLC：Rt_H3＝0.60min；ESIMS：307[(M+H)⁺]。

m)[(2R,5R)-5-(6-氨基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基]-氨基甲酸叔丁酯

将(2R,5R)-5-(6-氨基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基胺(6.62g，21.6mmol)、Boc₂O(4.72g，21.6mmol)和Hünig碱(5.66ml，32.4mmol)于二氯甲烷(185ml)中的溶液在室温搅拌18小时。用饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤反应混合物。将水层用二氯甲烷反萃取，并将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并蒸发以得到浅绿色固体(14g)。将粗产物在硅胶上色谱分离(环己烷:乙酸乙酯95:5至60:40)，得到7.68g标题化合物。

TLC(环己烷:乙酸乙酯3:1)：R_f＝0.21；HPLC：Rt_H3＝1.14min；ESIMS：408[(M+H)⁺]；¹H-NMR(400MHz,CDCl3):11.47(br.s,1H),7.23(dd,J＝10.42,8.78Hz,1H),6.45(dd,J＝8.78,2.64Hz,1H),4.50(br.s,2H),4.32(d,J＝2.38Hz,1H),4.10(d,J＝11.80Hz,1H),1.69(s,3H,CH3),1.65(s,3H,CH3),1.55(s,9H)。

n)((2R,5R)-5-{6-[(3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-羰基)-氨基]-3-氟-吡啶-2-基}-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基)-氨基甲酸叔丁酯

将于DMF(81ml)中的[(2R,5R)-5-(6-氨基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基]-氨基甲酸叔丁酯(3.3g，8.12mmol)、3-氯-5-三氟甲基吡啶甲酸(2.2g，9.74mmol)、HOAt(1.99g，14.62mmol)和EDC盐酸盐(2.33g，12.18mmol)的混合物在室温搅拌48小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将粗产物(12g)在硅胶上进行色谱分离(环己烷:乙酸乙酯1:1)，以产生5.2g标题化合物。

TLC(硅胶，环己烷:乙酸乙酯3:1)：R_f＝0.47；HPLC：Rt_H3＝1.40min；ESIMS:615,616[(M+H)⁺,1Cl]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):11.68(s,1H),10.41(s,1H),8.81(dd,J＝1.82,0.69Hz,1H),8.45(dd,J＝8.91,3.14Hz,1H),8.19(dd,J＝1.88,0.63Hz,1H),7.59(dd,J＝9.79,9.16

Hz,1H),4.38(d,J＝2.13Hz,1H),4.18(d,J＝11.80Hz,1H),1.75(s,3H),1.62(s,3H),1.60(s,9H)。

o)3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-甲酸[6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-三氟甲基-3,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基)-5-氟-吡啶-2-基]-酰胺

将((2R,5R)-5-{6-[3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-羰基)-氨基]-3-氟-吡啶-2-基}-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(4.99g，8.13mmol)和TFA(6.26ml，81mmol)于二氯甲烷溶液(81ml)中的混合物在室温搅拌18小时。蒸发溶剂并将残余物用合适的有机溶剂如乙酸乙酯和氨水稀释。添加冰，用水和盐水洗涤有机相，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发，以产生3.78g标题化合物。

HPLC：Rt_H3＝0.87min；ESIMS:514,516[(M+H)⁺,1Cl]；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.11(s,1H),9.06(s,1H),8.69(s,1H),8.13(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),7.80-7.68(m,1H),5.88(br.s,2H),4.12(d,J＝11.5Hz,1H),3.72(d,J＝11.4Hz,1H),1.51(s,3H),1.49(s,3H)。

实例2：化合物1和对比化合物NB-360在野生型小鼠中的长期给药

在商业野生型小鼠中进行了本文所述的研究以便研究化合物1的长期处理的影响，尤其是对毛皮变色的影响，以确定野生型小鼠的有效剂量，并且将功效与毛皮颜色变化之间的窗口与对比BACE-1抑制剂化合物NB-360(N-(3-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-4-氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶酰胺)的窗口进行比较(Neumann U等人，2015；以及Shimshek DR等人，2016)。

动物

C57BL/6小鼠在法国查尔斯河实验室(Charles River Laboratories,France)订购。

化合物配制和给药

将化合物1和NB-360配制成悬浮液。媒介物、化合物1或NB-360以10ml/kg的体积每天一次(早晨)口服给予，持续8周。媒介物：于0.5％甲基纤维素水溶液中的0.1％Tween80。

体重和毛皮颜色评分

每周称取体重3次(周一、周三、周五)。每周一次(星期三)进行任何毛发颜色变化的主观评分。得分(灰色毛皮的身体百分比)：0：没有变化；1：斑点；2：>30％；3：>50％；4：>75％；5：100％。当观察到毛皮颜色变化时，对动物进行摄影记录。最终的毛皮颜色评分是由不参与研究的人在设盲的情况下进行的。

离体样品和样品收获方法

血液样品用于分析全血化合物水平，并在生命期间从尾静脉采集到EDTA管(CB300，扎尔施泰特公司(Sarstedt),德国)中或在尸检当天从躯干血液采集到EDTAEppendorf管(Milian SA，目录号TOM-14，飞世尔科技公司(Fisher Scientific),沃伦(Wohlen),瑞士)中，或采集到血清管(CB300Z，扎尔施泰特公司(Sarstedt),宁布雷希特(Nümbrecht),德国)中。

用于淀粉样物质-β(Aβ)分析的血浆通过对EDTA血液离心(8000rpm/6800xg，15min，4℃)而收集到蛋白质Lo-Bind Eppendorf管(0030108.116，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中。

处于室温20min后，通过离心(8000xg，15min，4℃)分离血清并收集到蛋白质Lo-Bind Eppendorf管中以检查肾脏毒性生物标志物。将所有血液/血浆/血清样品在干冰上冷冻并储存在-80℃下直至分析。

断头后立即将脑摘下，用盐水冲洗并沿中线呈矢状向下切片。小脑左半部分用于分析化合物水平并置于玻璃管(Chromacol，125x 5-SV T051，韦林花园城(Welwyn GardenCity),英国)中，称重并冷冻在干冰中，前脑左半部分(不含嗅球)用于Aβ分析，并冷冻在干冰上的金属板上，且置于蛋白质Lo-bind管(003 0108.116，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中。

取腹部和背部皮肤以分析化合物水平，称重并在干冰上冷冻。

化合物水平分析

通过液相色谱法/串联质谱法(HPLC/MS/MS)对血液、脑和皮肤生物样品中的化合物1和NB-360水平定量。将脑样品与2倍体积的KH₂PO₄缓冲液混合，并使用装置匀化。将皮肤样品与大约6倍体积的甲醇/水混合，并使用Precellys管匀化。向30μL血液、脑或皮肤匀浆掺入结构相关的内标，随后与至少6倍过量体积的乙腈混合用于蛋白质沉淀。将上清液直接注入LC/MS/MS系统中进行分析。

表2：血液和脑样品的仪器条件

表3：皮肤样品的仪器条件

对小鼠脑内Aβ40的分析

脑匀化

称取冷冻的小鼠前脑并在9倍体积(w/v)的冰冷的完全TBS(20mM Tris-HCl pH7.4、137mM NaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1836145，罗氏诊断有限公司(RocheDiagnostics GmbH),潘茨堡,德国])中通过超声处理(90％占空比，输出控制5，40至55个脉冲，[Sonifier 450，布兰森(Branson)])进行匀化。匀化后，制备几个50μl等分试样用于分析，并储存在-80℃下。

制备合成的Aβ1-40溶液作为标准品

人Aβ肽(1-40)三氟乙酸盐(H 1194.1000，巴亨公司(Bachem),布本多夫(Bubendorf),瑞士)用作Aβ1-40的校准曲线。将其在室温(RT)下以1mg/ml的浓度溶解于无水DMSO(41647，弗鲁克公司(Fluka))中约30min，然后目测检查完全溶解。

在LoBind管(0030108.094，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中制备剩余溶液的20×5μl等分试样和100μl等分试样，用氮气覆盖以避免Aβ肽氧化并储存在-80℃下。对于校准曲线，5μl等分试样仅使用一次，然后丢弃。

小鼠脑内Aβ40的测定

用Meso Scale Discovery(MSD)96孔多阵列人/啮齿动物(4G8)Aβ40超灵敏测定法(#K110FTE-3，MSD公司(Meso Scale Discovery),盖瑟斯堡(Gaithersburg),美国)测定小鼠中的内源性Aβ40。除校准曲线和样品制备外，根据生产商的说明进行测定。TritonX-100(TX-100)可溶性Aβ40是用1％TX-100从前脑中提取的，所述提取使用各自为1:10前脑匀浆的50μl等分试样与50μl 2％TX-100一起混合在完全TBS(20mM Tris-HCl pH 7.4、137mMNaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1836 145，罗氏诊断有限公司(Roche DiagnosticsGmbH),潘茨堡,德国]中，达到1％TX-100的最终浓度和1:20前脑稀释度。将样品在冰上孵育15min并且每5min涡旋一次。将样品超速离心(100000xg，4℃，15min)并将50μl澄清的上清液转移到新的管中。对于Aβ40测定，将上清液在3％Blocker A溶液(来自试剂盒)中按1:5进一步稀释成1:100的最终前脑稀释液并施加到板上。

通过掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的1％Blocker A溶液的相应稀释液绘制校准曲线，非转基因小鼠脑样品除外：在这种情况下，用掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的相应经稀释的APP敲除小鼠前脑绘制校准曲线。对于所有样品和标准品，每孔施加25μl。对于每次测定，进行重复孔。来自重复孔的平均值用于计算。由于MSD不提供定量软件，因此将样品和标准品的相对单位导入SOFTmax PRO 4.0进行标准曲线计算和样品定量。

结果

对长期用NB-360或化合物1处理的C57BL/6小鼠的体重和毛皮颜色的影响

将野生型、首次接受试验的小鼠(C57BL/6)用化合物1或NB360进行8周的长期处理，并且每3天(周一、周三、周五)测量一次体重。没有观察到处理组与媒介物相比的总体显著体重差异，在第56天研究结束时也没有显著差异。然而，对于处理组，可以观察到显著的体重增加(第0天至第56天的体重比较)。

在研究过程中，在用NB-360处理的小鼠中观察到毛皮颜色变化。C57BL/6的黑色毛皮慢慢成片变成灰色。这些灰色斑片在动物的腹侧部分可见，而背部部分未受影响。处理3周后灰色斑片的出现是明显的，并且在高剂量和低剂量NB-360组中以不同程度存在。采用主观评分系统对毛皮变色进行量化。NB-360组中的所有动物均显示出毛皮变色。虽然低剂量NB-360组(20μmol/kg)仅显示出轻微但显著的毛皮评分变化，但高剂量NB-360组(100μmol/kg)展示出更严重和明显的毛皮颜色变化，图1。值得注意的是，在NB-360处理5周后毛皮变色的扩散和增加达到平稳，没有任何进一步的变化。重要的是，在化合物1处理组中没有可检测到的明显毛皮颜色变化。

在血液和组织中的暴露

在第一剂量后的第1天，在中间第14天以及在最后一个剂量后研究结束时测定血液中化合物1的暴露。最后一天的暴露始终低于实验开始时的暴露。化合物1的暴露降低35％左右。

化合物1在过去24小时内在不同组织中的暴露(表示为AUC_0-24h)汇总于表4中。对于血液，AUC由1、4、7和24小时的数据计算，`mini`AUC仅由4和24小时的数据计算。两个值的比较未显示出很大的差异。对于组织暴露，仅4h和24h的数据可用。结论是`mini`AUC足以很好地代表组织暴露。

对于化合物1和NB-360，脑和皮肤中的暴露均远高于血液中的暴露，表4。具体而言，皮肤暴露比血液暴露高几倍。另外，腹侧的暴露似乎比背部皮肤部分更高，特别是对于NB-360而言，表5。在所有组织中，暴露的剂量比例性(dose proportionality)良好。

表4：最后一个剂量(第56天)后不同血液和脑组织中的化合物AUC_0-24h

^aAUC得自1h、4h、7h和24h时间点；^bAUC得自4h和24h时间点；^cn＝2，持续24h

表5：针对化合物的血液暴露归一化的组织暴露(低剂量和高剂量的平均值)

Rel.：相对-针对AUC血液归一化

小鼠脑中淀粉样物质β降低

在研究的最后一天，在接受最后一个剂量后4小时和24小时处死n＝4的各组小鼠。分离前脑，并分析β-淀粉样肽1-40。媒介物和处理组的Aβ40浓度汇总在表6中，并在图2中显现。计算相比于相应媒介物处理组的减少百分比。在最后一个剂量后4小时，处理导致Aβ40显著减少。在最后一个剂量后24小时，化合物1仍显示Aβ40相对于媒介物减少25％，但这并不显著。在高剂量组中，化合物1在最后一个剂量后24小时显示出显著更低水平的Aβ40。50μmol/kg化合物1剂量组显示出几乎平坦的曲线，在整个24小时时间过程中Aβ40减少80％至90％。

表6：BACE抑制剂处理在最后一个剂量后对小鼠脑中Aβ40水平的影响(平均值± SD，n＝4)

n.s.：不显著

NB-360是BACE-1/BACE-2双重抑制剂，如BACE-1和BACE-2酶抑制体外测定(Neumann U等人，(2015))所示，其给出比BACE-2高1.0倍的BACE-1选择性。在相同的测定中，发现化合物1对BACE-1的选择性比BACE-2高3倍。总之，认为化合物1与NB-360之间酶选择性和组织分布的适度变化对长期小鼠研究中毛发变色的发生有影响。尽管在体内具有活性，但化合物1在小鼠中未显示出毛发变色的迹象。

实例3：化合物1在APOE4-TR小鼠中的急性PK/PD剂量-反应研究

为了研究化合物1对人APOE4背景中APP代谢的影响，在携带人APOE4等位基因的转基因小鼠中进行了PK/PD研究(小鼠Apoe基因被人APOE4置换；APOE4-TR；(Knouff C等人，1999))。

在这项研究中，用不同剂量(3μmol/kg、10μmol/kg、30μmol/kg)的化合物1急性处理3至5月龄的雄性和雌性APOE4-TR动物，并在处理后4h和24h时处死。

动物

从泰克尼克公司(Taconic)获得雄性和雌性转基因纯合APOE4-TR(B6.129P2-Apoe^{tm3(APOE*4)Mae} N8，泰克尼克公司，型号001549，3至5月龄，n＝48)。

剂量选择

化合物1按3μmol/kg、10μmol/kg和30μmol/kg施用。

化合物形式、配制和给药

将化合物1配制成悬浮液。通过经口给药给予媒介物或化合物，体积为一次10ml/kg。媒介物：于0.5％甲基纤维素水溶液中的0.1％Tween80。

表7：处理组

体重

在给药前称取一次体重。

离体样品和样品收获方法

血液样品用于分析全血化合物水平，并在尸检当天从躯干血液采集到EDTAEppendorf管(Milian SA，目录号TOM-14，飞世尔科技公司(Fisher Scientific),沃伦(Wohlen),瑞士)中，或采集到血清管(CB300Z，扎尔施泰特公司(Sarstedt),宁布雷希特(Nümbrecht),德国)中。

用于淀粉样物质-β(Aβ)分析的血浆通过对EDTA血液离心(8000rpm/6800xg，15min，4℃)而收集到蛋白质Lo-Bind Eppendorf管(0030108.116，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中。

将所有血液/血浆/血清样品在干冰上冷冻并储存在-80℃下直至分析。

断头后立即将脑摘下，用盐水冲洗并沿中线呈矢状向下切片。左侧小脑用于分析化合物水平并置于玻璃管(Chromacol，125x 5-SV T051，韦林花园城(Welwyn GardenCity),英国)中，称重并冷冻在干冰中，前脑左半部分(不含嗅球)用于Aβ分析，并冷冻在干冰上的金属板上，且置于蛋白质Lo-bind管(003 0108.116，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中。将右脑在4％多聚甲醛中固定，在PBS中洗涤，然后包埋在石蜡中，用于未来可能的组织学分析。

在研究结束时采集尾部并储存在-20℃。

表8：化合物水平分析

对小鼠脑中Aβ40及CSF中的Aβ40和Aβ42的分析

脑匀化

称取冷冻的小鼠前脑并在9倍体积(w/v)的冰冷的完全TBS(20mM Tris-HCl pH7.4、137mM NaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1 836145，罗氏诊断有限公司(RocheDiagnostics GmbH),潘茨堡,德国])中通过超声处理(90％占空比，输出控制5，40至55个脉冲，[Sonifier 450，布兰森(Branson)])进行匀化。匀化后，制备几个50μl等分试样用于分析，并储存在-80℃下。

制备合成的Aβ1-40溶液作为标准品

人Aβ1-40三氟乙酸盐(H 1194.1000，巴亨公司(Bachem),布本多夫(Bubendorf),瑞士)用作Aβ1-40的校准曲线。将其在室温(RT)下以1mg/ml的浓度溶解于无水DMSO(41647，弗鲁克公司(Fluka))中约30min，然后目测检查完全溶解。

在LoBind管(0030108.094，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中制备剩余溶液的20×5μl等分试样和100μl等分试样，用氮气覆盖以避免Aβ肽氧化并储存在-80℃下。对于校准曲线，5μl等分试样仅使用一次，然后丢弃。

小鼠脑内Aβ40的测定

用Meso Scale Discovery(MSD)96孔多阵列人/啮齿动物(4G8)Aβ40超灵敏测定法(#K110FTE-3，MSD公司(Meso Scale Discovery),盖瑟斯堡(Gaithersburg),美国)测定小鼠中的内源性Aβ40。除校准曲线和样品制备外，根据生产商的说明进行测定。TritonX-100(TX-100)可溶性Aβ40是用1％TX-100从前脑中提取的，所述提取使用各自为1:10前脑匀浆的50μl等分试样与50μl 2％TX-100一起混合在完全TBS(20mM Tris-HCl pH 7.4、137mMNaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1836145，罗氏诊断有限公司(Roche DiagnosticsGmbH),潘茨堡,德国]中，达到1％TX-100的最终浓度和1:20前脑稀释度。将样品在冰上孵育15min并且每5min涡旋一次。将样品超速离心(100000xg，4℃，15min)并将50μl澄清的上清液转移到新的管中。对于Aβ40测定，将上清液在3％Blocker A溶液(来自试剂盒)中按1:5进一步稀释成1:100的最终前脑稀释液并施加到板上。

通过掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的1％Blocker A溶液的相应稀释液绘制校准曲线，非转基因小鼠脑样品除外：在这种情况下，用掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的相应经稀释的APP敲除小鼠前脑绘制校准曲线。对于所有样品和标准品，每孔施加25μl。对于每次测定，进行重复孔。来自重复孔的平均值用于计算。由于MSD不提供定量软件，因此将样品和标准品的相对单位导入SOFTmax PRO 4.0进行标准曲线计算和样品定量。

结果

用三种不同剂量(3μmol/kg、10μmol/kg和30μmol/kg)的BACE抑制剂化合物1急性处理APOE4-TR小鼠(小鼠Apoe基因被人APOE4置换)。在最后一个剂量后4h和24h处死动物并分离前脑。各组的Aβ40和Aβ42浓度汇总在图3、图4和图5；以及表9、表10和表11中。计算相比于媒介物处理组的减少百分比。所有处理均在最后一个剂量后4h和24h引起显著且具剂量依赖性的Aβ40减少，效果范围为4h的43％至77％，24h的20％至66％。对于两个较低剂量组(3μmol/kg和10μmol/kg)而言，Aβ40降低效果在4h和24h时显著降低，但在最后一个剂量后24h基本接近于基线水平。高剂量的化合物1(30μmol/kg)显示出几乎平坦的曲线，在整个24h时间过程中Aβ40减少77％至66％。

表9：化合物1处理对APOE4-TR小鼠脑中Aβ40水平的影响(n＝6(n＝3只雄性，n＝3 只雌性))

n.a.：不适用，媒介物：合并的所有媒介物

表10：化合物1处理对APOE4-TR小鼠CSF中Aβ40水平的影响(n＝6(n＝3只雄性，n＝ 3只雌性))

n.a.：不适用，媒介物：合并的所有媒介物，ns：不显著

表11：化合物1处理对APOE4-TR小鼠CSF中Aβ42水平的影响(n＝6(n＝3只雄性，n＝ 3只雌性))

n.a.：不适用，媒介物：合并的所有媒介物，ns：不显著

图6和表12中显示了急性给药4h和24h时血液和脑中的PK数据。化合物1在24h内在血液和脑中的暴露(表示为AUC_0-24h)汇总于表13中。化合物1在血液和脑中的暴露与剂量成比例，并展示出24h后化合物水平的预期轻微下降，同样与剂量成比例。脑中的化合物暴露远高于血液中的暴露。3μmol/kg、10μmol/kg和30μmol/kg剂量组的脑血液比率相似，4h时分别为5、3和4，24h时分别为9、4和3。计算4h/24h的暴露比，这允许比较不同剂量下化合物暴露的下降(表12)。化合物1具有适度的2-5倍暴露减少，不同剂量之间以及血液与脑之间没有显著差异。

表12：APOE4-TR小鼠的血液和脑中的化合物1水平(n＝6(n＝3只雄性，n＝3只雌 性))

表13：APOE4-TR小鼠血液和脑中的化合物1AUC_0-24h

AUC得自4h和24h时间点

所有剂量组的各个动物的脑药代动力学/药效动力学关系如图7所示。化合物1存在明显的PK/PD关系；在低化合物水平下，Aβ减少功效最小，而在高化合物水平下，检测到最大功效作用。

图8显示了不同剂量下平均值的PK/PD关系。同样，对Aβ减少的暴露依赖性影响是明显的，具有明显的最小和最大功效作用。

结论

在该实验实例中呈现的研究表明，化合物1在APOE4-TR小鼠中是可口服、具有中枢活性且强效的BACE抑制剂。使用由小鼠内源性Apoe基因座表达人APOE4的APOE4-TR小鼠来研究了化合物1的PK/PD关系。ApoE4被认为是阿尔茨海默病的高风险因素，APOE4-TR小鼠类似于阿尔茨海默氏症脑中的ApoE4效应。

APOE4-TR小鼠中化合物1的PK特性与野生型小鼠中观察到的PK特性没有差异。观察到血液和脑中剂量依赖性的化合物1暴露，其中脑水平要高得多。此外，24h后的暴露减少与在野生型小鼠中观察到的相似。30μmol/kg的化合物1对APOE4-TR脑中的Aβ减少产生最大影响(>70％)，对于急性给药而言相似程度持续超过24h。PK/PD关系与野生型小鼠和大鼠非常相似。在最高剂量(30μmol/kg)下，对APOE4-TR小鼠脑中Aβ减少的最大功效作用略低。这可能是由于在APOE-4TR小鼠中观察到的淀粉样物质-β清除率较低引起的(Castellano JM等人，2011)。

实例4：首次人体研究

该研究已在临床上完成，是一项随机、双盲、安慰剂对照的单次和多次递增口服剂量研究，主要评估化合物1在健康成人和老年受试者中的安全性和耐受性以及药代动力学和药效动力学特性。这项研究的目的是确定化合物1的单个和多个最大耐受剂量，并使用CSF中的Aβ作为主要PD生物标志物评估药代动力学/药效动力学(PK/PD)关系。

经确定，在≥60岁的健康老年受试者中，750mg单剂量和两周内300mg QD的最高测试剂量是安全且耐受的。使用CSF中的Aβ浓度作为药物作用的主要生物标志物的药效动力学评估也已应用于健康老年受试者。在单次和多次给药后，测定Aβ40浓度的剂量依赖性降低分别达到约80％和90％(表14和表15，图9)。

表14：CSF中的Aβ40-随时间相对于基线的变化百分比汇总

表15：CSF中的Aβ40-第15天(最后一个剂量后24h)相对于基线的变化百分比汇总

实例5：3个月剂量范围安全性和耐受性研究

在I期临床剂量范围安全性和耐受性研究中，将化合物1给予给60岁或以上的健康老年受试者。本研究列于ClinicalTrials.gov中的NCT02576639标识码下。

这项随机、双盲、安慰剂对照研究采用平行组设计，将化合物1按每日一次口服剂量给予给五个处理组(化合物1：2mg、10mg、35mg或85mg QD和安慰剂)。

该研究的主要目的是详述在首次人体研究中在2周和4周持续时间内获得的先前安全性和耐受性数据，从而允许在处于AD风险中的受试者中开始将来的长期功效试验。另外，获得了与药代动力学/药效动力学建模相关的数据，以支持将来功效研究的剂量选择决定。

在这项研究中，发现化合物1在三个月内每日一次2mg、10mg、35mg和85mg的剂量是安全且耐受的。表16和图10中显示了给予化合物1对CSF Aβ水平的药效动力学影响。随着时间的推移，Aβ降低的程度是稳定的，在大约2至3周后达到PD稳态。

表16：第3个月CSF中的Aβ-Aβ38、Aβ40和Aβ42相对于基线的变化百分比分析

调整后的最小二乘均数、最小二乘均数差异、90％CI和P值得自ANCOVA模型，其中以处理作为固定效应，以基线AB水平作为协变量

表17中显示了每天按2mg、10mg、35mg和85mg给药三个月(91天)后化合物1的药代动力学参数。

表17：第91天的化合物1药代动力学参数

C最大(ss值)表示按指定剂量每天一次(qd)给药91天后化合物1的最大血浆稳态浓度。“CV％”表示变异系数百分比。

基于这些结果，预计每天一次15mg剂量的化合物1会产生在70ng/ml与170ng/ml之间的C最大(ss值)，并且预计每天一次50mg剂量的化合物1会产生在200ng/ml与500ng/ml之间的血浆C最大(ss值)。

基于实例4和5中呈现的数据，在90％的受试者中，药物计量学建模预测50mg的日剂量将实现80％CSF Aβ40降低而15mg的剂量将实现60％CSF Aβ40降低。

实例6：ApoE4基因型对化合物1处理的反应的影响

在实例5和6中描述的已完成的首次人体以及3个月剂量范围安全性和耐受性临床研究中，在第一剂量(基线)之前和分别在多次给药2周和3个月之后，通过腰椎穿刺获得CSF中的Aβ浓度。还在知情同意的受试者中获得了ApoE4基因型。计算接受研究处理且没有对药效动力学效应评价具有潜在影响的重大方案偏差的受试者中Aβ40和Aβ42浓度相对于基线的变化百分比。以下表18至表21提供了按照处理组和ApoE基因型(E4杂合体相比E4非携带者)，相对于基线的变化百分比的汇总统计。只有一名具有CSF数据的受试者是E4纯合体(得自3个月剂量范围安全性和耐受性研究)。用安慰剂处理该受试者，显示出Aβ40和Aβ42浓度均降低11％，未包括在下表中。数据显示在ApoE4携带者与非携带者之间，针对化合物1处理的CSF Aβ40和Aβ42反应没有差异。

表18：在3个月时按照ApoE基因型和化合物1处理组相对于基线的Aβ40变化百分比

表19：在3个月时按照ApoE基因型和化合物1处理组相对于基线的Aβ42变化百分比

表20：在首次人体临床研究中在2周时按照ApoE基因型和化合物1处理组相对于基 线的Aβ40变化百分比

表21：在首次人体临床研究中在2周时按照ApoE基因型和化合物1处理组相对于基 线的Aβ42变化百分比

实例7：用BACE抑制剂化合物1对带有斑块的雄性APP23小鼠进行长期治疗性处理

概述

将化合物1按两个剂量长期施用给带斑年龄(12个月)的APP23转基因小鼠，持续6个月。与仅接受媒介物的组相比，按0.03g/kg食物施用化合物1导致与媒介物相比淀粉样物质-β40和42略有减少，而按0.3g/kg食物施用导致大大减少。小鼠脑中Aβ的量与基线(12月龄)时的小鼠相似。仅在高剂量组中，血浆和CSF中的可溶性Aβ显著减少。通过免疫组织化学检测的斑块负荷在低剂量组中也略微(约20％)减少，而在高剂量组中大大(约70％)减少。小、中等和大斑块的数量对处理的反应相同。通过GFAP染色确定了活化星形胶质细胞的数量。通过用化合物1处理以剂量依赖性方式降低了总GFAP免疫反应性。虽然大多数GFAP阳性星形胶质细胞与斑块无关，但斑块相关的星形胶质细胞对化合物1处理的反应比远离斑块的那些星形胶质细胞更强。通过用IBA1染色来检测活化的小胶质细胞。化合物1处理以剂量依赖性方式减少了IBA1阳性小胶质细胞的数量。与远离斑块的小胶质细胞相比，该处理使靠近淀粉样斑块的小胶质细胞减少得更多。

总的来说，与未处理的媒介物相比，化合物1处理显示出脑淀粉样物质-β负荷的剂量依赖性减少，以及两种神经炎症标志物即小鼠脑中活化星形胶质细胞和小胶质细胞的数量的相关性减少。

方法

动物和剂量选择

将雄性转基因、杂合APP23(B6,D2-Tg(Thy1App)23Sdz(Sturchler-Pierrat C等人，1997)，12至14月龄，n＝64)用食物颗粒中0.3g/kg或0.03g/kg的化合物1进行处理。

表22：处理组

3个处理组，每个处理组n＝18只小鼠；1个基线组，n＝10

离体样品和样品收获方法

血液样品用于分析全血化合物水平，并在尸检当天从躯干血液采集到EDTAEppendorf管(Milian SA，目录号TOM-14，飞世尔科技公司(Fisher Scientific),沃伦(Wohlen),瑞士)中，或采集到血清管(CB300Z，扎尔施泰特公司(Sarstedt),宁布雷希特(Nümbrecht),德国)中。

用于淀粉样物质-β(Aβ)分析的血浆通过对EDTA血液离心(8000rpm/6800xg，15min，4℃)而收集到蛋白质Lo-Bind Eppendorf管(0030108.116，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中。

将所有血液/血浆/血清样品在干冰上冷冻并储存在-80℃下直至分析。

断头后立即将脑摘下，用盐水冲洗并沿中线呈矢状向下切片。将左半部分脑用于分析化合物水平并将其置于玻璃管(Chromacol，125x 5-SV T051，英国韦林花园城)中，称重并冷冻在干冰中，将前脑左半部分(不含嗅球)用于Aβ分析，并冷冻在干冰上的金属板上，并置于蛋白质Lo-bind管(003 0108.116，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中。

在研究结束时采集尾部并储存在-20℃。

化合物水平分析

通过液相色谱法/串联质谱法(HPLC/MS/MS)对血液和脑生物样品中的化合物1水平定量。将脑样品与2倍体积的KH2PO4缓冲液混合，并使用装置匀化。向30μL血液或脑匀浆掺入结构相关的内标，随后与至少6倍过量体积的乙腈混合用于蛋白质沉淀。将上清液直接注入LC/MS/MS系统中进行分析。

表23：血液和脑样品的仪器条件

对小鼠组织中Aβ40和Aβ42的分析

脑匀化

称取冷冻的小鼠前脑并在9倍体积(w/v)的冰冷的完全TBS(20mM Tris-HCl pH7.4、137mM NaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1 836145，罗氏诊断有限公司(RocheDiagnostics GmbH),潘茨堡,德国])中通过超声处理(90％占空比，输出控制5，40至55个脉冲，[Sonifier 450，布兰森(Branson)])进行匀化。匀化后，制备几个50μl等分试样用于分析，并储存在-80℃下。

制备合成的Aβ溶液作为标准品

人Aβ肽(1-40)三氟乙酸盐(H 1194.1000，巴亨公司(Bachem),布本多夫(Bubendorf),瑞士)用作Aβ1-40的校准曲线。将其在室温(RT)下以1mg/ml的浓度溶解于无水DMSO(41647，弗鲁克公司(Fluka))中约30min，然后目测检查完全溶解。

在LoBind管(0030 108.094，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中制备剩余溶液的20×5μl等分试样和100μl等分试样，用氮气覆盖以避免Aβ肽氧化并储存在-80℃下。对于校准曲线，5μl等分试样仅使用一次，然后丢弃。

APP23小鼠脑中Triton X-100可溶性Aβ的测定

用Meso Scale Discovery(MSD)96孔多阵列人/啮齿动物(6E10)Aβ40/42测定法(MSD公司(Meso Scale Discovery),盖瑟斯堡(Gaithersburg),美国)测定小鼠中的人Aβ40和42。除校准曲线和样品制备外，根据生产商的说明进行测定。TritonX-100(TX-100)可溶性Aβ40和42是用1％TX-100从前脑中提取的，所述提取使用均为1:10前脑匀浆的50μl等分试样与50μl 2％TX-100一起混合在完全TBS(20mM Tris-HCl pH 7.4、137mM NaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1836 145，罗氏诊断有限公司(Roche Diagnostics GmbH),潘茨堡,德国])中，达到1％TX-100的最终浓度和1:20前脑稀释度。将样品在冰上孵育15min并且每5min涡旋一次。将样品超速离心(100000xg，4℃，15min)并将50μl澄清的上清液转移到新的管中。将上清液在3％Blocker A溶液(来自试剂盒)中按1:5进一步稀释成1:100的最终前脑稀释液并施加到板上。

通过掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的1％Blocker A溶液的相应稀释液绘制校准曲线，非转基因小鼠脑样品除外：在这种情况下，用掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的相应经稀释的APP敲除小鼠前脑绘制校准曲线。对于所有样品和标准品，每孔施加25μl。对于每次测定，进行重复孔。来自重复孔的平均值用于计算。将样品和标准品的相对单位导入SOFTmax PRO 4.0进行标准曲线计算和样品定量。

APP23小鼠脑中甲酸可溶性Aβ40的测定

将50微升前脑匀浆与116.6μl的100％甲酸混合，得到70％的最终甲酸浓度。将样品储存在冰上并且每5分钟涡旋一次。为了中和，将50μl混合物移液到新管中，并添加950μl含有1x完全蛋白酶抑制剂的1M Tris碱。将管在室温储存过夜，然后在4℃在Eppendorf微型离心机中以14000rpm离心15分钟。从顶层取出100μl并与100μl的3％Blocker A溶液(MesoScale测定试剂盒的组成部分)混合。将该样品直接施加至测定板(稀释度1:1332)或在1％Blocker A溶液中进一步稀释。

对小鼠CSF中Aβ40的分析

用57μL的1％Blocker A(MSD)稀释小鼠CSF样品(3μl)，并将25μl施加至测定板。

对小鼠血浆中Aβ40的分析

将血浆样品(30μl)与30μl的3％Blocker A(MSD)混合，并将25μl施加至测定板。

使用双荧光免疫组织化学法对淀粉样物质β斑块和活化的星形胶质细胞进行组织 学分析

使用识别淀粉样肽的C端部分的兔抗Aβ一抗对淀粉样物质斑块染色(如Schrader-Fischer G,Paganetti PA,1996；Schrader-Fischer G等人，1997所述，产生该抗体)。使用商业兔抗GFAP(得自达科公司(Dako Schweiz GmbH),巴尔瑞士(Baar),瑞士的参考Z0334)检测活化的星形胶质细胞。

所有染色均使用全自动仪器VentanaUltra(罗氏诊断公司(RocheDiagnostics Schweiz AG),罗特克莱兹(Rotkreuz),瑞士)进行。所有化学品均由罗氏诊断公司提供。

使用所有研究动物并且新切割3微米的脑组织切片并收集在SuperFrost+载玻片上。将组织切片脱蜡并在无溶剂条件(EZprep溶液)下再水化，接着在基于EDTA的缓冲液(CC1溶液)中通过热修复循环(heat retrieval cycle)进行32min的抗原修复(去掩蔽)。随后，使用DISCOVERY抑制剂(参考07017944001(罗氏))将载玻片封闭4min。将在抗体稀释剂中以1/20’000稀释的一抗手动添加到组织切片上并在室温孵育1h。在施加多聚体UltraMap-抗兔HRP即用型抗体(参考05269717001)之前，进行16min的短时后固定(0.05％的戊二醛)。

使用DISCOVERY按照生产商的建议进行检测。然后将载玻片在92℃下进行20min的热变性，然后手动施加第二种一抗(1/2’000稀释的抗GFAP)并孵育1h。再次使用UltraMap-抗兔HRP抗体20min以与DISCOVERY罗丹明试剂盒(参考07259883001)相结合来检测GFAP。

使用Gold抗褪色试剂(参考P36931，赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，瑞士)洗涤载玻片并封片，并用Hamamatsu载玻片扫描仪(NanoZoomer 2.0HT，扫描软件NDP-Scan 2.5版，滨松光子学法国公司瑞士办事处(Hamamatsu Photonics France,SwissOffice),索洛图恩州(Solothurn),瑞士)在40x物镜下进一步扫描。扫描设置如下：使用DAPI滤光片的曝光时间设为57ms，FITC滤光片也是如此。TRITC滤光片(检测罗丹明)的曝光时间设为14.2ms。

使用双荧光免疫组织化学法对淀粉样物质β斑块和活化的小胶质细胞进行分析

使用相同抗体对淀粉样物质斑块进行染色，并使用得自和光化学有限公司(WakoChemicals GmbH)(德国诺伊斯市(Neuss,Germany))的兔抗IBA1抗体(参考019-19741)检测小胶质细胞，并在抗体稀释剂中以1/200稀释。染色方案和用于淀粉样物质β斑块和星形胶质细胞的方案高度相似。使用相同的设置扫描载玻片。

图像分析

对于基于图像分析的定量斑块评价，基于MS Visual Studio 2010和来自MatroxMIL V9库(加拿大魁北克迈创公司(Matrox Inc,Quebec,Canada))的许多功能开发了专有图像分析平台(ASTORIA，自动化存储图像分析)。

对于β-淀粉样物质斑块和神经炎症分析，执行以下一系列步骤：

-用Hamamatsu Nanozoomer以40倍放大倍数扫描载玻片。对于每种荧光标记(DAPI、FITC和TRITC)，创建单独的图像

-手动勾画ROI(目标区域)以在绿色FITC通道图像上限定脑切片中用于Aβ斑块评估的皮质，然后还将所得轮廓用于其他两个通道图像(复制得到xml文件)

-运行内部开发的ImageScope(V12.1.0.5029，美国艾贝欧公司(Aperio Inc.,USA))插件，为3个荧光通道中的每一个创建和导出*.tif图像文件(10倍放大倍数)

图像批处理：

-通过访问每个独立的荧光通道图像，获得每个切片的组合真彩色图像(DAPI、FITC、TRITC)

-从未染色的黑色背景中分割有效样本(在勾画的ROI内)

-应用自适应阈值技术进行绿色通道图像中的对象分割(FITC标记的Aβ斑块)

-消除在绿色(FITC)通道中显示出信号的过小碎片之后，分离接触的对象以进行正确的后续单个对象分析

-通过形态学顶帽变换(morphological tophat transformation)和阈值化来分割红色通道中TRITC标记的对象(对GFAP或Iba1染色有特异性，指示星形胶质细胞或小胶质细胞)

-基于特征的对象分类

4个对象类别

-非特异性碎片(太微弱、太小的对象)排除在外

-小斑块(40...1000个像素)

-中等斑块(1000...6500个像素)

-大斑块(>6500个像素)

计算有效斑块的几种形态测定和光密度测定特征

-斑块数量

-基于以非线性方式测量和使用适当抗体的染色强度，已经描述了反映蛋白质(抗原)浓度的量的“比光密度”(Rahier等人，1989；Ruifrok等人，2001)

-基于TRITC+信号相比于斑块面积的比率评估“斑块相关GFAP或Iba1”，基于斑块周围扩张环内TRITC+信号的比率评估“近端GFAP或Iba1”

结果

表24：脑和血液中的化合物1水平

在给药2个月和4个月后，以及在6个月研究结束时测定化合物1的血液浓度。如表24所示，在研究过程中持续暴露，动物之间具有可接受的变异，平均为18％(8％至36％)。0.03g/kg食物给药组的化合物1平均血液浓度为0.25±0.13μM(平均值±SD)，0.3g/kg给药组的化合物1平均血液浓度为2.10±0.47μM，与化合物剂量的10倍差异良好吻合。在这项研究中观察到的暴露大致对应于化合物1的5mg/kg和45mg/kg每日口服剂量。在实验结束时测定的脑/血液比率对于0.03g/kg组为2.7，对于0.3g/kg组为3.3。

APP代谢物的生化测定：来自小鼠脑的Triton TX-100可溶性APP代谢物

用缓冲液中的1％Triton X-100提取脑匀浆，并且认为所得的上清液代表可溶形式的APP代谢物。除了Aβ40和42之外，我们还测定了N端APP片段sAPPα(α-分泌酶的直接裂解产物)和sAPPβ(Swe)(BACE1裂解的直接产物)。如表25所示，在未处理组中，可溶性Aβ40和42在研究过程中适度增加(小于2倍)。由于已知在这个年龄期间没有发生APP表达和Aβ生成的变化，因此假设媒介物组(18-20月龄)中的值增加是由Aβ沉积物的“泄漏”引起的(增加了几倍，见下文)。同样，在未处理组中可溶性APP代谢物sAPPα和β的值没有显著变化。

用低剂量的化合物1(0.03g化合物1/kg食物)处理的小鼠显示出可溶性Aβ40和42较弱但不显著的减少，和sAPPα的适度增加(表25和表26，图11、图12和图13)。可溶性APPβ(Swe)显著减少29％(表25和表26，图14)。用0.3g/kg剂量的化合物1处理的小鼠显示出Aβ和sAPPβ(Swe)两者均显著减少，以及sAPPα增加3倍(表25和表26，图11、图12和图14)。

总的来说，化合物1处理导致所有可溶性BACE1裂解产物的剂量依赖性减少和sAPPα的剂量依赖性增加。

表25：用化合物1处理后小鼠脑的Aβ40和42水平

表26：组间变化的比较(Dunnett多重比较测试)

CSF中的APP代谢物

在尸检时从所有小鼠采集CSF。将来自基线组的样品储存大约6个月，并在研究结束时与其余样品一起进行分析。表27和图15中的数据显示CSF Aβ在基线组(12月龄的APP23小鼠)中最高，但在媒介物组(18月龄的APP23小鼠)中下降。与该媒介物组相比，在0.03g/kg食物的化合物1处理组中CSF Aβ40未显著降低，而在0.3g/kg食物的化合物1处理组中显著降低。目前尚不清楚高基线值的原因。假设这是长期储存的影响，此时Aβ寡聚形式的解离可能产生更高的单体浓度。CSF Aβ比来自脑提取物的Triton TX-100溶解的Aβ更多，代表了可溶性淀粉样物质-β的稳态浓度，该浓度直接响应于Aβ生成中的变化。低化合物1剂量下小的且非显著的处理效果(-4.6％至-20％)以及高化合物1剂量下明显且显著的效果(-43.7％至-77％)在从脑组织分离的可溶性Aβ物质与CSF中的Aβ40之间非常相似。

表27：CSF Aβ40结果汇总

前脑中的甲酸可溶性淀粉样物质-β肽

在用甲酸提取不溶性Aβ物质后，研究了化合物1对APP23小鼠脑中淀粉样物质β沉积形式的处理效果。如表28和表29以及图16至图19所示，与基线相比，在媒介物组中观察到沉积的Aβ的大量增加。淀粉样物质-β1-42比Aβ40增加更多(媒介物组中Aβ42/40比率增加55％)，与其更高的聚集倾向吻合。与媒介物相比，在用低剂量的化合物1处理后Aβ40和Aβ42显示减少17％左右，但是没有达到统计学显著性。所提取物质的Aβ42/40比率没有变化。在高化合物1处理组中观察到沉积的Aβ40和1-42强烈且高度显著性(相比于媒介物为80％左右)的减少，并且Aβ42/40比率恢复至0.07的基线值。总之，用高剂量化合物1处理几乎完全阻断APP23小鼠中淀粉样物质β的增加。

表28：小鼠前脑中的甲酸可溶性淀粉样物质-β肽

表29：组比较和统计(Dunnett多重比较测试)

淀粉样物质病理表现和神经炎症的组织学评估：斑块数量和斑块面积

将APP23脑切片上的淀粉样物质斑块用抗Aβ抗体染色，该抗体识别淀粉样肽的C端部分。对于更详细的数据分析，将APP23小鼠中各种形式的淀粉样物质-β沉积分为“小”、“中等”和“大”斑块。此外，测定总免疫染色面积。表30和表31以及图20至图23中显示了定量结果。大多数Aβ沉积物被分类为“小”斑块，而“中等”斑块的数量低10倍，“大”斑块的数量低100倍。在研究持续期间，媒介物组中所有形式的斑块数量增加约4-6倍，观察到总斑块面积也一样增加。用化合物1处理使低剂量处理组中的增加量减少约25％，高剂量处理组减少约60％。与生化测定相比，在组织学分析中，媒介物组中的Aβ增加和0.3g/kg食物的化合物1处理组中的影响较低。二维组织学分析可能无法完全概括实际上在所有3个维度上发生的斑块体积变化。

表30：化合物1处理对APP23小鼠中斑块数量和斑块面积的影响，相对于总面积归 一化(1000000*平均值±SEM)

表31：组的比较和统计

对活化的星形胶质细胞的影响

GFAP(胶质酸性纤维蛋白)存在于静息以及活化的星形胶质细胞中。GFAP免疫反应性通常用作星形胶质细胞数量和活化的标志物。在APP23小鼠中，归一化GFAP阳性面积随着小鼠年龄增加约2倍，并且化合物1处理以剂量依赖性方式减少了这种增加(表32和表33以及图24至图28)。相对于与淀粉样物质斑块的关联，进一步剖析了GFAP免疫反应性(与IBA1免疫反应性相同地进行)。该分析显示绝大部分GFAP免疫反应性是非斑块相关的(远端的)，仅10％是斑块相关的或近端的。在媒介物组中斑块相关和近端GFAP免疫反应性的比例增加，表明主要在淀粉样物质斑块附近存在星形胶质细胞数量/活化的增加。随衰老的增加对于远端和非斑块相关性GFAP阳性染色来说较低。化合物1处理的影响在斑块相关与非斑块相关性GFAP免疫反应性之间也是不同的：对斑块相关/近端GFAP免疫反应性的影响强于对非斑块相关性/远端染色的影响。这些数据表明化合物1主要对紧邻淀粉样物质斑块的GFAP染色发挥作用，最可能是通过对斑块本身的影响而发挥作用。

表32：化合物1处理对活化的星形胶质细胞的影响，表示为GFAP阳性面积，相对于 总面积归一化(100*平均值±SEM)

表33：处理效果和归一化GFAP阳性面积的统计

对IBA1阳性小胶质细胞的影响

IBA1(离子钙结合接头蛋白分子1)是小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白。IBA1免疫反应性通常用作小胶质细胞数量和活化的标志物。在APP23小鼠中，归一化IBA1阳性面积随着小鼠年龄增加约5倍，并且化合物1处理以剂量依赖性方式减少了这种增加(表34和表35)。相对于与淀粉样物质斑块的关联，进一步剖析了IBA1免疫反应性。该分析显示大约75％的IBA1免疫反应性是非斑块相关的(远端的)，仅25％是斑块相关的或近端的。在媒介物组中，斑块相关和近端IBA1免疫反应性的比例增加。在较低程度上，远端和非斑块相关性IBA1阳性染色随着小鼠年龄而增加。化合物1处理的影响在斑块相关与非斑块相关性IBA1免疫反应性之间也是不同的：对斑块相关/近端IBA1免疫反应性的影响强烈且显著。未发现对非斑块相关/远端染色的显著影响。这在图29至表33中有进一步说明，显示了相对于斑块面积，总IBA1染色和斑块相关性IBA1染色的影响。这些数据表明化合物1主要对紧邻淀粉样物质斑块的IBA1染色发挥作用，最可能是通过影响斑块本身而发挥作用。对斑块的影响不那么强烈地影响远离斑块的小胶质细胞活化/数量(其占IBA1+免疫反应性的大部分)。

表34：化合物1处理对IBA1阳性小胶质细胞的影响，按总面积归一化(值是平均值 ±SEM)

表35：处理效果和归一化IBA1阳性面积的统计

实例8：用于评价化合物1在处于AD临床症状发作风险中的参与者中的功效的随 机、双盲、安慰剂对照研究的总结

在本文所述的临床试验中，ApoE4纯合体的鉴定被用作预后富集策略，以在合理的时间范围内选择认知显著恶化可能性更高的个体，可在临床试验的环境中对这些个体进行实际评估。本研究列于ClinicalTrials.gov中的NCT02565511标识码下。在该替代方案中，该实例可以用60岁至75岁认知未受损的ApoE4携带者(纯合体；或者例如通过PET或CSF测量，有脑淀粉样物质额外富集(“淀粉样物质阳性”)的杂合体)，按每天一次15mg或50mg化合物1的口服剂量来进行。本研究列于ClinicalTrials.gov中的NCT03131453标识码下。

在提出的临床试验中，在至少5年的治疗持续时间期间，预计相当大比例的参与者将被诊断为患有由AD引起的轻度认知损害(MCI)或痴呆。预计大多数诊断为MCI，预计MCI先于痴呆诊断2-4年。

表36：用于评价化合物1在处于AD临床症状发作风险中的参与者中的功效的随机、 双盲、安慰剂对照研究的总结

实例9：在单独给予和联合强CYP3A4抑制剂伊曲康唑或强CYP3A4诱导剂利福平给 予时，化合物1的药代动力学的人体研究

在健康志愿者的药物-药物相互作用(DDI)研究中，评价了强CYP3A4抑制剂(伊曲康唑)和强CYP3A4诱导剂(利福平)对化合物1的PK的影响。图34概述了DDI研究设计。与单独给予化合物1时相比，当与化合物1一起给予时，剂量为200mg q.d.的伊曲康唑使化合物1的平均AUC增加2至3倍并且使化合物1的平均C最大增加25％(表37)。与单独给予化合物1时相比，当与化合物1一起给予时，剂量为600mg q.d.的利福平使化合物1的平均AUC减小5至6倍并且使化合物1的平均C最大减小2.5倍(表38)。总之，在1期研究中，强CYP3A4诱导剂和强CYP3A4抑制剂对化合物1暴露的影响已经表明CYP3A4/5对于消除化合物1是非常重要的。

表37：药代动力学结果-伊曲康唑对化合物1血浆PK参数的影响的统计分析：化合 物130mg SD+伊曲康唑200mg QD相比于化合物130mg SD

n*＝无值缺失的受试者数量。

将以治疗和受试者作为固定效应的ANOVA模型拟合到每个对数变换的PK参数。对结果进行反向转换以获得“经调整的几何平均值”、“几何平均值比”和“90％CI”。

表38：药代动力学结果-利福平对化合物1血浆PK参数的影响的统计分析：化合物 1100mg SD+利福平600mg QD相比于化合物1100mg SD

n*＝无值缺失的受试者数量。

将以治疗和受试者作为固定效应的ANOVA模型拟合到每个对数变换的PK参数。对结果进行反向转换以获得“经调整的几何平均值”、“几何平均值比”和“90％CI”。

实例10：评价响应于用化合物1治疗，健康老年ApoE4杂合体和ApoE4非携带者中Aβ 42/Aβ40比率相对于基线的变化

可以通过使用已确立的PET示踪剂(例如¹¹C-匹兹堡化合物B、¹⁸F-氟比他班或¹⁸F-氟美他莫)进行皮质Aβ的PET成像来确定脑中Aβ沉积的增加，并且也可以确定CSF Aβ1-42的减少。一些研究已表明PET成像与CSF Aβ1-42分析之间在检测脑中淀粉样物质-β病理表现时的高度一致性(Weigand SD等人，2011；Barthel H等人，2011；Schipke CG等人，2017)。相关性表明CSF Aβ1-42的减少是脑中淀粉样物质-β沉积增加的结果。与Aβ1-42形成对比，即使在具有高皮质淀粉样物质-β负荷的患者中，不太容易在皮质淀粉样沉积物中积聚的Aβ1-40的CSF浓度实际上保持恒定。与此一致，已经证明当使用CSF Aβ1-42/Aβ1-40比率(PanneeJ等人，2016；Janelidze S等人，2016)，而不是单独的Aβ1-42时，获得更稳健的PET-CSF相关性。虽然使用Aβ1-42/Aβ1-40比率作为检测脑中淀粉样物质-β病理表现的诊断工具已经得到充分认可，但是该参数响应于用抗淀粉样物质剂治疗的变化之前尚无描述。

在实例5中描述的健康老年受试者的完整3个月剂量范围安全性和耐受性临床研究中，在第一个剂量(基线)之前和3个月多次给药之后通过腰椎穿刺获得了CSF中的Aβ40和Aβ42浓度。发现大量受试者的基线CSF Aβ42/Aβ40低于正常值(低于0.09的截止值)，表明皮质淀粉样物质沉积。与非携带者(15％)相比，ApoE4携带者组(33％)中比率低于0.09的受试者的百分比更高。这与ApoE4携带者发展淀粉样变性的风险增加相符。

在基线CSF Aβ42/Aβ40比率低于0.09的受试者中测定了在用化合物1治疗3个月结束时的CSF Aβ42/Aβ40比率，图35。发现与相同受试者中的基线值相比，用化合物1治疗以剂量依赖性方式使Aβ42/Aβ40比率增加。对于ApoE4等位基因的携带者和非携带者而言，响应于治疗发现Aβ42/Aβ40比率均增加。具体地讲，35mg和85mg的日剂量导致Aβ42/Aβ40比率增加1.36倍(相比于安慰剂p<0.01)和1.46倍(相比于安慰剂p<0.01)。

该结果表明在用较高剂量的化合物1治疗的受试者中，Aβ42从脑向CSF的转运增加，与皮质淀粉样物质-β负荷减少相对应。皮质淀粉样物质-β负荷的减少证明在ApoE4等位基因的携带者和非携带者中化合物1均能够改变AD特有的淀粉样物质病理表现，因此，预计在这些患者组的任一组中均能有效预防AD。

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本文引用的所有参考文献，例如科学出版物或专利申请公开，通过援引整体并入本文并用于所有目的，其程度如同具体且单独地指出每个参考文献通过援引整体并入本文以用于所有目的一样。虽然为了清楚理解的目的已经通过说明和举例的方式相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的传授内容，对本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可以对本发明进行某些变化和修改。

Claims (15)

1.化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者中预防阿尔茨海默病的用途。

2.根据权利要求1所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向或患有唐氏综合征。

3.根据权利要求2所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带发展阿尔茨海默病临床症状的遗传倾向并且该遗传倾向为：

(i)淀粉样前体蛋白、早老素-1或早老素-2的基因突变；或

(ii)存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

4.根据权利要求3所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该处于发展阿尔茨海默病临床症状风险中的患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

5.根据权利要求4所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

6.根据权利要求4所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

8.根据权利要求7所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该淀粉样物质阳性是通过PET或CSF测量确定的。

9.根据权利要求3至8中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者在60岁与75岁之间。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用该化合物。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用该化合物。

12.根据权利要求1至9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中按15mg/天的剂量使用该化合物。

13.根据权利要求1至9中任一项所述的用于该用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中按50mg/天的剂量使用该化合物。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的用于该用途的化合物，其中该化合物呈游离形式。

15.一种药物组合物，其包含游离形式或药学上可接受的盐形式的根据权利要求1至13中任一项所述的用于该用途的化合物。