KR101282885B1 - 스티릴피리다진온 유도체를 이용한 아밀로이드 단백질 응집물의 검출 방법 - Google Patents

스티릴피리다진온 유도체를 이용한 아밀로이드 단백질 응집물의 검출 방법 Download PDF

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amyloid
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박용대
양승대
허민구
박정훈
윤용진
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한국원자력연구원
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Abstract

본 발명은 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 조성물 및 베타 아밀로이드 응집증 진단용 조성물에 관한 것이고, 상기 각각의 조성물을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 형광 시약과 베타 아밀로이드 응집증 진단 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 베타 아밀로이드 응집증 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 사용하는 것을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

스티릴피리다진온 유도체를 이용한 아밀로이드 단백질 응집물의 검출 방법 {Method for detecting amyloid aggregates using Styrylpyridazin-one derivatives}
본 발명은 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 조성물 및 베타 아밀로이드 응집증 진단용 조성물에 관한 것이고, 상기 각각의 조성물을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 형광 시약과 베타 아밀로이드 응집증 진단 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 베타 아밀로이드 응집증 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 사용하는 것을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
보건사회부 자료에 따르면 국내의 치매 환자 규모는 98년 당시 약 28만여명, 2002년에는 40만 명에 이르는 것으로 알려져 있다. 미국 알츠하이머 협회 자료에 의하면 미국의 경우, 4백만 명이 알츠하이머 치매로 고통 받고 있으며, 오는 2050년에는 환자수가 1,400만 명에 달할 것으로 추산되고 있다. 2025년에는 전 세계적으로 2,200만 명의 사람이 알츠하이머 치매로 고통받을 것으로 예측되고 있다.
전 세계적으로 이렇게 치매 환자수가 급격히 증가하는 주된 이유로는 사회의 고령화를 들 수 있다. 평균 수명이 늘어나면서 노인 인구가 증가함에 따라 자연적으로 치매 환자수가 증가한다는 것이다. 빠른 경제적 성장을 이룬 우리나라의 경우 역시 노인 인구의 증가로 인해 고령화 사회로 급격히 이행해 가고 있으며, 이에 따라 알츠하이머병 (AD)으로 대표되는 노인성 치매, 뇌졸중 또는 파킨슨병의 발병률이 증가하고 있다. 유엔 식량농업국 (FAO)의 최신 자료에 따르면 60세 이상 연령층의 인구 증가는 세계적인 추세로, 아시아 지역만 해도 60세 이상 노인층이 2000년 당시 전체 인구의 8% 수준에서 오는 2050년 경에는 25%에 달할 것으로 예측하고 있다. 고령화와 치매의 발병률은 상관 관계가 극히 높다. 우리나라의 경우, 75~79세 노인 인구의 15%가 치매를 앓고 있으며 80세 이상의 노인 인구의 39%가 치매 환자이다. 또한 남성보다 여성의 치매 유병률이 앞서 있으나 정확한 원인은 밝혀지고 있지 않고 있어서 세계 각국의 의학계가 그 원인을 경쟁적으로 모색 중에 있다.
알츠하이머병은 두뇌의 신경 세포가 줄어들면서 인지능력 감퇴, 비가역적 기억 손실, 방향감각 상실 및 언어능력 손상 장애를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질병이다. 이러한 알츠하이머병 환자에게서는 두뇌 속에 베타 아밀로이드 (Aβ) 펩티드, 및 높은 수준으로 인산화된 타우 (tau) 단백질 섬유에 의해 형성된 수많은 신경섬유 매듭 (NFT)으로 구성된 다수의 노인성 플라크 (SP)가 나타난다 (Ginsberg, S. D., et al., "Molecular Pathology of Alzheimer's Disease and Related Disorders," in Cerebral Cortex: Neurodegenerative and Age-related Changes in Structure and Function of Cerebral Cortex, Kluwer Academic/Plenum, NY (1999), pp. 603-654; Vogelsberg-Ragaglia, V., et al., "Cell Biology of Tau and Cytoskeletal Pathology in Alzheimer's Disease," Alzheimer's Disease, Lippincot, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (1999), pp.359-372). 아직까지 베타 아밀로이드가 알츠하이머병의 직접 원인인지 또는 원인의 결과로 나오는 것인지에 대한 이론은 불분명하나, 현재까지 알려진 바로는 베타 아밀로이드 집적에 의한 응집물이 알츠하이머병의 가장 대표적인 증상 또는 예후 (hallmark)이다. 따라서, 베타 아밀로이드 응집물은 2004년 미국 NIA (National Institute of Aging)에 의하여 결성된 ADNI (Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative)에서 알츠하이머병의 가장 유력한 바이오마커로 규정되었으며, 따라서 비침습적 생체 분자 영상을 이용하여 베타 아밀로이드 응집물의 축적을 정량화하는 것은 알츠하이머병의 조기 진단과 치료에 획기적 발전을 가져올 수 있고, 알츠하이머병은 베타 아밀로이드 응집물 및 탱글의 형성을 억제하는 약물을 투여함으로써 그 진행의 억제가 가능하다.
알츠하이머병을 포함하여 베타 아밀로이드 응집물을 정량적으로 검출함으로써 진단할 수 있는 질병의 진단을 위하여 베타 아밀로이드 응집물에 잘 결합하여 그 존재를 쉽게 나타내는 형광을 가진 화합물들이 많이 연구되고 있다. 이러한 화합물 중 대표적인 것이 콩고 레드 (Congo red, CR)이며, 알츠하이머병의 확실한 진단은 부검을 하여 뇌를 콩고레드로 염색함으로써 가능하다. 하지만, 살아 있는 사람에게는 이러한 방법을 사용할 수가 없다. 왜냐하면 콩고 레드는 수용성이 강하여 뇌혈관장벽 (brain blood barrier, BBB)을 통과할 수 없어서 살아 있는 사람에게 투여하여도 뇌 속으로 들어갈 수 없기 때문이다. 따라서 베타 아밀로이드 응집물 및 탱글에 결합하면서 뇌혈관장벽을 통과할 수 있는 표지 물질을 인체에 투여하고 뇌에서의 분포를 영상화함으로써 알츠하이머병 등 베타 아밀로이드 응집물의 축적을 병리학적 특징으로 하는 질병들의 진단이 가능하다.
콩고 레드 외에, 가장 먼저 개발된 화합물 중 하나로는 크리사민 G (Chrysamine-G)의 유도체들을 들 수 있으나 이 역시 뇌혈관장벽을 통과하는 수준이 너무 낮아 실제로 사용할 수는 없었다 (Klunk WE, Debnath ML, Pettegrew JW. Development of small molecule probes for the beta-amyloid protein of Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 1994; 15:691-8. Klunk WE, Debnath ML, Pettegrew JW. Chrysamine-G binding to Alzheimer and control brain: Autopsy study of a new amyloid probe. Neurobiol Aging 1995; 16:541-8.)
그 이후 6-다이알킬아미노-2-나프틸에틸리덴 (FDDNP) 유도체와 티오플라빈-T (Thioflavin T, ThT) 계통의 유도체들이 개발되면서 연구에 더욱 더 활기를 띠게 되었다. (Agdeppa ED, Kepe V, Liu J, Flores-Torres S, Satyamurthy N, Petric A, Cole GM, Small GW, Huang SC, Barrio JR. Binding characteristics of radiofluorinated 6-dialkylamino-2-naphthylethylidene derivatives as positron emission tomography imaging probes for β-amyloid plaques in Alzheimer's disease. J Neuroscience 2001; 21:1-5. Mathis CA, Bacskai BJ, Kajdasz ST, MlLellan ME, Frosch MP, Hyman BT, Holt DP, Wang Y, Huang G-F, Debnath ML, Klunk WE. A lipophilic thioflavin-T derivative for positron emission tomography (PET) imaging of amyloid in brain. Bioorg Med Chem Lett 2002; 12:295-298.)
또한 각종 벤조티아졸 유도체와 스틸벤 유도체가 베타 아밀로이드를 영상화할 수 있는 방사성 동위 원소 표지 화합물로서 특허 출원된 바 있다 (US Patent Pub. No. 2002/0133019 A1, W.E. Klunk, C.A. Mathis Jr, Thioflavin derivatives for use in antemortem diagnosis of Alzheimer's disease and vivo iamging and revention of amyloid diposition; US Patent Pub. No. 2003/0149250 A1, H.F. Kung, M-P. Kung, Z-P. Zhuang, Stilbene derivatives and their use for binding and imaging amyloid plaques).
그러나, 기존 개발된 베타 아밀로이드 검출 형광 리간드는 제조 과정이 복잡하고 분자량이 크며, 베타 아밀로이드 응집물과 결합 후 형광 특성의 큰 변화를 보여 주지 못하였다. 또한, 선택적으로 베타 아밀로이드와만 결합하는 것이 아니라 인산화된 타우 (tau) 단백질 섬유에도 결합하여 검출 선택성이 높지 않고 동물 실험에서 흡수율이 낮고 리간드를 뇌에서 제거하는 것이 용이하지 못하다는 단점이 있어 실제 사용에는 어려움이 있다.
상기 종래 개발된 베타 아밀로이드 검출용 리간드들의 문제점으로 인하여, 이를 극복할 수 있는 베타 아밀로이드 응집물을 염색하기 위한 진단 시약 차원에서의 특이적 시약의 개발에 대한 요구가 계속되고 있다.
미국 공개특허공보 US 20080038195 A1 일본 공개특허공보 JP 2004506723 A 일본 공개특허공보 JP 2009511583 A
본 발명의 목적은 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 조성물 및 베타 아밀로이드 응집증 진단용 조성물을 제공하고, 상기 조성물을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 형광 시약과 베타 아밀로이드 응집증 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 또 다른 목적은 베타 아밀로이드 응집증 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 사용하는 것을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 관점은 하기 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
화학식 (I)
Figure 112012093775817-pat00001
여기서, 상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 치환 또는 비치환된 카르보닐, 니트로, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알킬, 치환 또는 비치환된 페닐, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 n은 1 내지 3의 정수이다.
본 발명의 또 다른 관점은 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 베타 아밀로이드 응집증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
화학식 (I)에 대한 설명은 상기 기재와 중복되므로 생략한다.
본 발명의 또 다른 관점은, 베타 아밀로이드 응집증 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 사용하는 것을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
화학식 (I)에 대한 설명은 상기 기재와 중복되므로 생략한다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 베타 아밀로이드 응집물 검출용 조성물을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 형광 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 베타 아밀로이드 응집증 진단용 조성물을 포함하는 베타 아밀로이드 응집증 진단 키트를 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예는 하기 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 조성물을 포함한다.
화학식 (I)
Figure 112012093775817-pat00002
여기서, 상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 치환 또는 비치환된 카르보닐, 니트로, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알킬, 치환 또는 비치환된 페닐, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 n은 1 내지 3의 정수이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 하기 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 베타 아밀로이드 응집증 진단용 조성물을 포함한다.
화학식 (I)
Figure 112012093775817-pat00003
여기서, 상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 치환 또는 비치환된 카르보닐, 니트로, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알킬, 치환 또는 비치환된 페닐, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 n은 1 내지 3의 정수이다.
바람직하게는, 상기 화학식 (I)에 있어서, 상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, C1~C3 알콕시 카르보닐, 니트로, C1~C3 알킬, 페닐, 페닐 비닐, C1~C3 디알킬 아미노, 아미노, C1~C3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 화학식 (I)에 있어서, 상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 메톡시 카르보닐, 니트로, 메틸, 페닐, 페닐 비닐, 디메틸 아미노, 아미노, 메톡시로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체는 (E)-4,5-디클로로-2-(4-(디메틸아미노)스티릴)피리다진-3(2H)-온일 수 있다.
베타 아밀로이드 응집물의 검출은 스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 등의 유효 성분과 아밀로이드 응집물 간의 "결합"에 의하여 이루어지며, "결합"은 화학적 상호작용을 의미한다. 따라서, 결합의 예로는 공유 결합, 이온 결합, 친수성-친수성 상호작용, 소수성-소수성 상호작용 및 착화합물 결합을 들 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 건전한 의료적 판단 범위 내에서, 대상체의 조직과 접촉하여 사용되기에 적합하고, 부적절한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없고, 합리적인 유익/위험비를 가지고, 의도하는 용도에 효과적인 본 발명의 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체의 카르복실산 염 또는 산 부가염뿐만 아니라, 가능한 경우, 그의 쯔비터이온 형태를 의미한다. 용어 "염"은 본 발명의 화합물의 상대적으로 비독성인 무기 및 유기산 부가염을 의미한다. 또한 지방족 모노 및 디카르복실산, 예를 들어, 아세트산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산 및 알칸디산, 방향족 산, 및 지방족 및 방향족 술폰산과 같은 비독성 유기산으로부터 유래하는 염이 포함된다. 이들 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 중에 바로 (in situ) 제조되거나, 정제된 화합물의 유리 염기 형태를 적절한 유기 또는 무기산과 별도로 반응시키고 이렇게 형성된 염을 단리함으로써 제조될 수 있다. 대표적인 추가 염은 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 술페이트, 비술페이트, 니트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락티오비오네이트 및 라우릴술포네이트 염, 프로피오네이트, 피발레이트, 시클라메이트, 이세티오네이트 등을 포함한다. 이들은 알칼리 및 알칼리 토금속, 예컨대, 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 기재로 하는 양이온, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 비독성 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "아밀로이드 응집물"은 다양한 불용성 섬유상 단백질이 환자의 조직에 침착된 응집 상태를 일컫는 것이다. 아밀로이드 응집물은 아밀로이드 단백질이 응집하여 형성된 응집체 (aggregate) 및/또는 아밀로이드 단백질의 추가적인 조합에 의하여 형성되는 아밀로이드 침착물 (deposit)을 포함한다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한 알츠하이머병으로 대표되는 베타 아밀로이드 응집증의 예방 또는 치료제로서의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 알츠하이머병으로 대표되는 베타 아밀로이드 응집증의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 아밀로이드 응집증은 베타 아밀로이드의 응집을 병리학적 특징으로 하는 질환을 통칭하는 것이며, 본 발명은 베타 아밀로이드 응집물을 검출하기 위하여 상기 응집물에 특이적으로 결합하는 상기 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공하고, 베타 아밀로이드 응집물과의 특이적 결합을 통하여 베타 아밀로이드 응집증을 진단할 수 있는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.
상기 베타 아밀로이드 응집증은 치매, 알츠하이머병, 다운증후군, 아밀로이드 맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드증, 더취 (Dutch)형 아밀로이드증, 봉입체 근염 (inclusion-body myositis), 지중해 열, 머클-웰스 (Muckle-Wells) 증후군, 특발성 골수종, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드 심근병증, 전신성 노인성 아밀로이드증, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 다운 증후군, 스크라피(Scrapie), 크로이츠 펠트-야콥병, 쿠루병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 갑상선 수질 암종, 근육쇠약병, 랑게르한스섬 II형 당뇨병으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 베타 아밀로이드 응집증이 알츠하이머병인 경우, 그 진단 조성물은 뇌혈관장벽을 통과하기 위해, 세포막에 확산될 수 있는 충분한 지방 친화성을 가져야 한다. 또한 이상적인 알츠하이머병 진단 조성물은 정상인의 뇌에서 빠르게 섭취 후, 어떠한 대사 반응에도 관여함이 없이 빠른 시간 내에 체외로 배출되어야 한다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 베타 아밀로이드 응집증 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 하기 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 사용하는 것을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물을 검출하는 방법을 포함한다.
화학식 (I)
Figure 112012093775817-pat00004
여기서, 상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 치환 또는 비치환된 카르보닐, 니트로, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알킬, 치환 또는 비치환된 페닐, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 C1~C10 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 n은 1 내지 3의 정수이다.
바람직하게는, 상기 화학식 (I)에 있어서, 상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, C1~C3 알콕시 카르보닐, 니트로, C1~C3 알킬, 페닐, 페닐 비닐, C1~C3 디알킬 아미노, 아미노, C1~C3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 화학식 (I)에 있어서, 상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 메톡시 카르보닐, 니트로, 메틸, 페닐, 페닐 비닐, 디메틸 아미노, 아미노, 메톡시로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체는 (E)-4,5-디클로로-2-(4-(디메틸아미노)스티릴)피리다진-3(2H)-온일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 아밀로이드 응집증은 베타 아밀로이드의 응집을 병리학적 특징으로 하는 질환을 통칭하는 것이다. 본 발명은 베타 아밀로이드 응집물을 검출하기 위하여 상기 응집물에 특이적으로 결합하는 상기 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공함으로써, 이를 사용하여 베타 아밀로이드 응집증을 진단할 수 있는 정보를 제공하기 위한 베타 아밀로이드 응집물의 검출 방법을 제공할 수 있다.
상기 베타 아밀로이드 응집증은 치매, 알츠하이머병, 다운증후군, 아밀로이드 맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드증, 더취 (Dutch)형 아밀로이드증, 봉입체 근염 (inclusion-body myositis), 지중해 열, 머클-웰스 (Muckle-Wells) 증후군, 특발성 골수종, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드 심근병증, 전신성 노인성 아밀로이드증, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 다운 증후군, 스크라피 (Scrapie), 크로이츠 펠트-야콥병, 쿠루병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 갑상선 수질 암종, 근육쇠약병, 랑게르한스섬 II형 당뇨병으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 베타 아밀로이드 응집물의 검출 방법은 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 검출 가능한 양으로 세포 또는 대상체에 도입하는 단계; 상기 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이 베타 아밀로이드 응집물과 결합하여 형광 표지물을 형성할 수 있는 시간을 허용하는 단계; 및 상기 형광 표지물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 형광 표지물을 검출하는 단계는 살아있는 핵의학적 분석방법인 단일 광자 방출 전산화 단층 촬영 (single photon emission computed tomography, SPECT)이나 양전자 방출 단층 촬영 (positron emission tomography, PET)을 이용하여 이루어질 수 있으며, 특히 양전자 방출 단층 촬영술을 이용하여 실시간으로 영상화하는 방법으로 이루어질 수 있다.
상기 영상화에 있어서, 첫 단계는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물의 검출가능한 양이 조직 또는 환자 내에 도입됨으로써 이루어질 수 있다. 화합물은 전형적으로 제약 조성물의 일부이며, 당업자에게 공지된 방법으로 조직 또는 대상체에 투여된다.
조성물의 환자에의 투여는 전신 또는 국소 투여 경로에 의해 이루어 질 수 있다. 예를 들어, 조성물은 경구적, 직장내, 비경구적 (정맥내, 근육내 또는 피하), 수조내, 질내, 복막내, 방광내, 국소 (분말, 연고 또는 점적) 또는 볼내 또는 비내 스프레이로 투여될 수 있다. 조성물은 신체를 통해 이동할 수 있도록 대상체에 투여될 수 있다. 다르게는, 조성물은 관심있는 특정 장기 또는 조직에 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 알츠하이머병의 진행을 진단 또는 추적하기 위해서 뇌 내 아밀로이드 응집물의 위치를 결정 및 정량하는 것이 바람직할 수 있다. 뇌의 생체 내 영상화 있어 가장 필요한 특징 중 하나는 유효 성분이 급속 (bolus) 정맥 주사 후 손상되지 않은 상태로 혈액-뇌 장벽을 통과하는 능력이다.
본 발명의 베타 아밀로이드 응집물의 검출 방법에서는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 검출 가능한 양으로 대상체 내에 도입하고, 화합물이 아밀로이드 응집물과 결합되기에 충분한 시간이 흐른 후, 형광 표지물을 대상체 내에서 비침습적으로 검출할 수 있다. 다르게는, 조직 샘플을 대상체로부터 분리하여 상기 조성물을 조직 샘플 내에 도입하고 조성물 중의 스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 등이 아밀로이드 응집물과 결합되기에 충분한 시간이 흐른 뒤, 형광 표지물을 검출할 수 있다.
용어 "조직"은 대상체 신체의 일부를 의미한다. 조직의 예로는 뇌, 심장, 간, 혈관 및 동맥을 들 수 있다. 검출 가능한 양은 선택된 검출 방법에 의해 검출되는데 필요한 조성물의 양이다. 검출되기 위해 환자 내로 도입되는 조성물의 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 조성물 중의 유효 성분이 선택된 검출 방법에 의해 검출될 때까지 조성물의 양을 증가시키며 대상체에 투여할 수 있다.
용어 "대상체"는 인간 또는 기타 동물을 의미한다. 당업자는 또한 스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 등이 아밀로이드 응집물과 결합하기 위한 충분한 시간을 결정하는데 익숙하다. 필요한 시간은 상기 조성물을 검출가능한 양으로 대상체에 도입한 뒤, 투여 후 다양한 시점에 표지물을 검출함으로써 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 베타 아밀로이드 응집물 검출용 조성물을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 형광 시약을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 베타 아밀로이드 응집증 진단용 조성물을 포함하는 베타 아밀로이드 응집증 진단 키트를 포함한다.
본 발명은 섬유상 Aβ 응집물에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 조성물을 개발하여 그 결과 상기 응집물을 검출하고 그 결과 베타 아밀로이드 응집증을 진단할 수 있다.
본 발명의 스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 등을 포함하는 조성물은 생체 내 진단용 도구로서 및 생존 환자의 AD 아밀로이드 생성 연구에서 Aβ의 진행성 침착의 가시화를 위한 탐침으로 사용될 수 있다.
현재 아밀로이드의 검출은 생검 또는 부검물의 조직학적 분석을 통하여 이루어진다. 그러나, 예를 들어 부검은 사후 진단을 위해서만 사용될 수 있는 등의 단점을 가지고 있다. 따라서 본 발명은 현재 절실하게 요구되고 있는, 환자로부터 아밀로이드 응집물을 검출 및 정량화하기 위한 간단한 비침습적 방법을 제공한다는 점에서 우수한 것이다.
뇌에서 Aβ 응집물을 영상화하는 것은 몇몇 잠재적인 이점이 있다. 영상화 기술은 뇌에 과량의 Aβ 응집물이 축적된, 따라서 알츠하이머병이 발병할 가능성이 높은 잠재적인 환자를 확인함으로써 진단 방법을 개선할 수 있다. 또한, 상기 기술은 알츠하이머병의 진행을 모니터하는데 유용할 것이다. 항-베타 아밀로이드 약물 치료가 가능해지면, 뇌의 Aβ 응집물의 영상화는 치료를 모니터하기 위한 중요한 수단을 제공할 수 있다.
아밀로이드 응집물을 생체 내에서 직접 영상화하는 것이 어려운 이유는 응집물이 정상 조직과 동일한 많은 물리적 특성, 예컨대 밀도 및 수분 함량 등을 가지기 때문이다. 이와 같은 이유로 자기 공명 영상 (MRI) 및 전산화 단층촬영 (CAT)을 이용하여 아밀로이드 응집물을 영상화하기 위한 시도는 실망스러운 결과를 보여주었고, 아밀로이드 응집물을 항체, 혈청 아밀로이드 P 단백질 또는 다른 탐침 분자로 표지하려는 노력은 조직 주변부에 대한 얼마간의 선택성을 제공하였으나, 조직 내부에 대해서는 불량한 영상만을 제공하였다.
살아있는 대상의 뇌의 Aβ 응집물을 검출하기 위한 잠재적인 리간드는 손상되지 않은 혈액-뇌 장벽을 가로질러야 한다. 따라서, 뇌 유입은 상대적으로 작은 분자 크기 및 높은 친지질성 (lipophilicity)을 가지는 리간드를 이용함으로써만 이루어질 수 있고, 본 발명의 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체는 이러한 요구를 만족시키는 화합물로서 베타 아밀로이드 응집증의 진단에 획기적인 진보를 가져올 수 있다.
기존 개발된 베타아밀로이드 응집물 검출 형광 리간드는 제조 과정이 복잡하고 분자량이 600 Da 이상이지만 본 발명의 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 등은 제조 과정이 간단하고 분자량도 300 Da 정도로 적당하므로 상기 조건을 만족시킴을 알 수 있다.
또한, 기존 형광 리간드는 응집물과 결합 후 형광 특성의 큰 변화를 보여 주지 못하지만 본 발명의 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 등은 베타 아밀로이드 응집물과 결합 후 40배 이상 형광 세기가 증가하고 형광 특성에 큰 변화가 있었다. 베타 아밀로이드 응집물을 상기 수준으로 고감도로 검출하는 화합물 및 이를 이용하는 검출 방법 또는 진단 방법은 본 발명에서 처음으로 제시하는 것이다.
결론적으로, 기존 방사성 동위원소 표지 치매 진단 화합물들과 비교하여 본 발명의 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 등은 전하를 띠지 않고도 작은 분자량을 가지며, 동물 실험에서 흡수율이 높고 뇌에서 제거가 용이하며 아밀로이드와 선택적으로 결합할 수 있다는 장점을 가진다.
따라서, 본 발명의 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 등의 베타 아밀로이드 응집물과의 우수한 결합 특성을 이용하면, 베타아밀로이드 응집물의 측정을 위한 진단 키트 및 영상화 제품화가 가능하고, 나아가 베타아밀로이드 응집물 형성 억제 물질 (치매 치료제)을 검색할 수 있는 검출용 제품화도 가능하게 된다. 나아가 본 발명의 베타 아밀로이드 응집물 검출용 또는 베타 아밀로이드 응집증 진단용의 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물과 베타 아밀로이드 응집증 진단용 베타 아밀로이드 응집물 검출 방법은 스티닐피리다진온의 방사성 의약품 개발의 원천 기술이 될 수 있을 것으로 보인다.
도 1은 (A) 화합물 14의 형광 방출 세기 (청색선: Aβ40 응집물과 혼합 전, 적색전: Aβ40 응집물과 혼합 후) 및 (B) Aβ40 응집물의 존재 하 화합물 14의 농도 함수에 따른 형광 세기 그래프를 보여준다.
도 2는 FITC-Aβ42의 세포 흡수를 보여준다:
(A) SHSY5Y 세포
(B) FITC-Aβ42 1 μM를 첨가하여 3일간 배양한 SHSY5Y 세포의 형광 현미경 영상
(C) SHSY5Y 세포 추출물의 형광 현미경 영상 (Aβ42 무첨가 배양 + 화합물 14 염색)
(D) SHSY5Y 세포 추출물의 형광 현미경 영상 (Aβ42 첨가 배양 + 화합물 14 염색)
(E) SHSY5Y 세포 추출물의 형광 현미경 영상 (Aβ42 무첨가 배양 + 티오플라빈 T 염색)
(F) SHSY5Y 세포 추출물의 형광 현미경 영상 (Aβ42 첨가 배양 + 티오플라빈 T 염색)
도 3은 마우스 뇌 섹션의 조직 염색을 보여준다:
(A) 대조군 마우스, 화합물 14 염색
(B) APP/SP1 트랜스제닉 AD 모델 마우스, 화합물 14 염색
(C) APP/SP1 트랜스제닉 AD 모델 마우스, 화합물 14 염색
(D) 대조군 마우스, 티오플라빈 T 염색
(E) APP/SP1 트랜스제닉 AD 모델 마우스, 티오플라빈 T 염색
(F) APP/SP1 트랜스제닉 AD 모델 마우스, 티오플라빈 T 염색
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
1. 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체의 제조
(1) 4,5-디클로로-2-클로로메틸피리다진-3(2H)-온의 합성
4,5-디클로로피리다진-3(2H)-온 (60 g, 364 mmol)과 증류수 (350 mL)를 실온에서 10 분간 교반하였다. 포름알데히드 용액 (36%, 70 mL)을 첨가한 후, 1.5 시간 환류시켰다. 5~10℃까지 냉각시킨 후, 생성된 침전물을 여과하고 냉수 (0~5℃, 200 mL)로 세척, 외기 건조하여 N-하이드록시메틸-4,5-디클로로피리다진-3(2H)-온을 수득하였다. 상기 N-하이드록시메틸-4,5-디클로로피리다진-3(2H)-온 및 메틸렌 클로라이드 (550 mL)의 혼합물에 티오닐 클로라이드 (357 mmol) 및 디메틸포름아미드 (360 mmol)의 메틸렌 클로라이드 용액 (50 mL)을 실온에서 30 분간 서서히 첨가하며 교반하였다. 이 혼합물을 실온에서 2 시간 교반하였다. 0℃까지 냉각시킨 후, 물 (200 mL)을 서서히 첨가하였다. NaHCO3 포화 용액을 이용하여 상기 용액을 pH 6.7~7.4로 중화시켰다. 유기층을 분리해 낸 후 무수 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 감압하 상기 유기 용액을 증발 농축시켰다. 잔류물을 n-헥산 (100 mL)으로 세척하여 백색의 4,5-디클로로-2-클로로메틸피리다진-3(2H)-온 (71.2 g, 92%)을 얻었다. 백색 결정 (디에틸 에테르/n-헥산 = 1:5, v/v). mp 69~70℃. TLC (CH2Cl2) Rf = 0.65. IR (KBr) 3046, 2984, 1670, 1292, 1122, 964 cm_1; 1H NMR (CDCl3): δ 5.83 (s,2H), 7.88 ppm (s, 1H); 13C NMR (CDCl3) δ 58.40, 134.87, 137.23, 137.34, 155.58 ppm. C5H3Cl3N2O 성분 분석치: C 28.13, H 1.42, N 13.12; 실측: C 28.10, H 1.41, N 13.09.
(2) 트랜스-4,5-디클로로-2-스티릴피리다진-3(2H)-온의 합성 방법
4,5-디클로로-2-클로로메틸피리다진-3(2H)-온 (3 g, 14.055 mmol), 요오드화칼륨 (2.45 g, 14.76 mmol) 및 아세토니트릴 (50 mL)을 10 시간 환류하였다. 30~40℃로 냉각시킨 후, 트리페닐포스핀 (4.07 g, 15.51 mmol)을 상기 반응 용액에 첨가하였다. 그 후 혼합물을 6 시간 환류하였다. 실온으로 냉각시킨 후, Celite 545를 이용하여 여과한 후 메틸렌 클로라이드 (50 mL)로 세척하였다. 감압하에서 유기층을 농축하였다. 디클로로메탄 (100 mL)을 첨가한 후, 상기 용액을 20 분간 교반하였다. 이 용액을 여과하고 감압하에 농축하였다. 실온까지 냉각시킨 후, 얻어진 침전물을 여과하고, 과량의 디에틸 에테르로 세척한 후 건조시켜 옅은 황색 결정형의 생성물을 수득하였다. 추가 정제 없이 상기 생성물을 사용하였다.
0~10℃에서 벤즈알데히드 (1.5 g, 14.10 mmol)를 아세토니트릴 (50 mL)에 첨가하고 크루드 화합물인 요오드화((4,5-디클로로-6-옥소피리다진-1(6H)-일)메틸)트리페닐 포스포늄 (8 g, 14.10 mmol)을 상기 혼합물에 첨가하였다. 30 분간 교반 후, 포타슘 t-부톡사이드 (2.05 g, 95%, 17.21 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 2 시간 교반하였다. 상기 용액을 감압하에 농축시켰다. 디클로로메탄 (100 mL)을 첨가하고, 그 후 물 (50 mL)을 첨가한 후, 이 용액을 10 분간 교반하고 NaHCO3 포화 용액을 이용하여 pH 6.7~7.4로 중화시켰다. 유기층을 분리해 낸 후 무수 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 감압하 상기 유기 용액을 증발 농축시켰다. 잔류물을 오픈-베드 실리카 겔 (open-bed silica gel) 상에 주입하였다. 컬럼을 메틸렌 클로라이드 /n-헥산 (1:4, v/v)으로 용리하였다. 트랜스-이성질체를 함유하는 분획을 모아 증발 농축시켜 순수한 트랜스-이성질체 (화합물 1)를 수득하였다.
(3) 트랜스-4,5-디클로로-2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체의 합성
벤즈알데히드 대신 하기 표에 기재된 알데히드를 사용한 것을 제외하고는 상기 트랜스-4,5-디클로로-2-스티릴피리다진-3(2H)-온의 제조 방법과 동일한 조건 및 방법으로 그 유도체들을 제조하였다. 하기 표 1은 각각의 유도체를 제조하는데 사용된 알데히드를 보여준다.
화합물 번호 트랜스-4,5-디클로로-2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 알데히드
2 (E)-4,5-디클로로-2-(4-플루오로스티릴)피리다진-3(2H)-온 4-플루오로 벤즈알데히드
3 (E)-4,5-디클로로-2-(4-클로로스티릴)피리다진-3(2H)-온 4-클로로 벤즈알데히드
4 (E)-2-(4-브로모스티릴)-4,5-디클로로피리다진-3(2H)-온 4-브로모 벤즈알데히드
5 (E)-4,5-디클로로-2-(4-요오도스티릴)피리다진-3(2H)-온 4-요오도 벤즈알데히드
6 (E)-2-(4-시아노스티릴)-4,5-디클로로피리다진-3(2H)-온 4-시아노 벤즈알데히드
7 (E)-4,5-디클로로-2-(4-메톡시카르보닐스티릴)피리다진-3(2H)-온 4-메톡시카르보닐 벤즈알데히드
8 (E)-4,5-디클로로-2-(2-니트로스티릴)피리다진-3(2H)-온 2-니트로 벤즈알데히드
9 (E)-4,5-디클로로-2-(3-니트로스티릴)피리다진-3(2H)-온 3-니트로 벤즈알데히드
10 (E)-4,5-디클로로-2-(4-니트로스티릴)피리다진-3(2H)-온 4-니트로 벤즈알데히드
11 (E)-4,5-디클로로-2-(4-메틸스티릴)피리다진-3(2H)-온 4-메틸 벤즈알데히드
12 (E)-2-(2-(바이페닐-4-일)비닐)-4,5-디클로로피리다진-3(2H)-온 4-페닐 벤즈알데히드
13 4,5-디클로로-2-((E)-4-(E)-스티릴스티릴)피리다진-3(2H)-온
 4-스티릴 벤즈알데히드
14 (E)-4,5-디클로로-2-(4-(디메틸아미노)스티릴)피리다진-3(2H)-온 4-디메틸아미노 벤즈알데히드
15 (E)-4,5-디클로로-2-(4-아미노스티릴)피리다진-3(2H)-온 4-아미노 벤즈알데히드
16 (E)-4,5-디클로로-2-(2-메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 2-메톡시 벤즈알데히드
17 (E)-4,5-디클로로-2-(3-메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 3-메톡시 벤즈알데히드
18 (E)-4,5-디클로로-2-(4-메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 4-메톡시 벤즈알데히드
19 (E)-4,5-디클로로-2-(2,3-디메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온
 2,3-디메톡시 벤즈알데히드
20 (E)-4,5-디클로로-2-(2,4-디메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온
 2,4-디메톡시 벤즈알데히드
21 (E)-4,5-디클로로-2-(2,5-디메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 2,5-디메톡시 벤즈알데히드
22 (E)-4,5-디클로로-2-(2,6-디메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 2,6-디메톡시 벤즈알데히드
23 (E)-4,5-디클로로-2-(3,4-디메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 3,4-디메톡시 벤즈알데히드
24 (E)-4,5-디클로로-2-(3,5-디메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 3,5-디메톡시 벤즈알데히드
25 (E)-4,5-디클로로-2-(2,3,4-트리메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 2,3,4-트리메톡시 벤즈알데히드
26 (E)-4,5-디클로로-2-(2,4,5-트리메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 2,4,5-트리메톡시 벤즈알데히드
27 (E)-4,5-디클로로-2-(2,4,6-트리메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 2,4,6-트리메톡시 벤즈알데히드
28 (E)-4,5-디클로로-2-(3,4,5-트리메톡시스티릴)피리다진-3(2H)-온 3,4,5-트리메톡시 벤즈알데히드
2. 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체의 시험관 내 (in vitro) 형광 측정 실험
2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 28 종 (PBS 중 10 μM)의 형광 특성을 응집된 Aβ40 펩티드 (10 μM, 35℃, 3일간 PBS 완충액 내 응집)와 혼합하기 전후의 형광 세기를 비교함으로써 평가하였다. 9종의 화합물 (화합물 번호 14, 15, 17, 18, 19, 20, 25, 27, 28)이 방출 스펙트럼상 10 배 이상의 형광 세기 증가를 나타내었으며, 이는 이들 화합물들이 Aβ 응집물과 결합하였음을 의미한다 (표 2). 10 μM의 응집 Aβ40 펩티드를 이용하여 이들 9종의 화합물에 대하여 겉보기 결합상수 (Kd)를 측정하였다. PBS에 녹인 0.1, 0.5, 1, 25, 5, 및 10 μM의 각 프로브의 형광 세기와 응집 Aβ 펩티드와 혼합한 형광 세기가 측정되었다. 화합물 14 (도 1A 및 1B)가 Aβ40에 대하여 가장 높은 친화도를 나타내었다 (Kd = 1.84 μM). 이론적으로, 바람직한 Aβ 응집물용 형광 프로브는 응집 Aβ 펩티드에 대하여 형광 반응성 및 결합 친화도가 높아야 한다. Aβ 펩티드에 결합되면서 형광 프로브의 형광 특성은 현저히 변화하게 되는데, 이것은 표적과의 상호작용으로 '턴 온 (turned on)'됨을 의미한다. 화합물 14가 FA β/F0 = 40.84 및 Kd = 1.84 μM로 Aβ 응집물을 검출하여 특히 우수하였다.
화합물 번호 λex (nm) λem (nm) 증가 배수a (FA β/F0) Kd b (평균 ± SD) (μM)
1 350 496 4.72
2 350 492 5.93
3 380 495 3.03
4 370 495 2.12
5 380 498 5.26
6 380 486 2.94
7 370 488 2.07
8 370 500 4.12
9 390 485 2.12
10 390 515 2.24
11 350 516 2.81
12 380 514 1.92
13 380 510 2.04
14 430 636 40.84 1.84±0.31
15 400 598 12.15 2.95±1.15
16 380 492 8.24
17 350 492 11.13 3.48±1.14
18 400 532 19.81 2.57±0.54
19 350 504 15.35 8.52±2.48
20 400 554 11.52 5.03±3.48
21 370 512 3.42
22 350 545 4.53
23 350 552 3.52
24 350 492 5.37
25 390 536 26.81 4.24±0.98
26 350 542 3.95
27 430 560 11.72 17.55±2.49
28 390 580 26.12 4.14±1.94
a 배수 변화는 화합물들 (10 μM의 화합물 및 10 μM의 Aβ40 응집물을 사용)의 λem에서의 형광 방출 세기로 계산된 결과이다.
b Kd 값은 평균 ± SD로 나타내었고, 3회의 독립적 반복 실험으로 얻은 결과이다 (N=3).
3. 세포 내 Aβ 응집물 형광 영상화
SHSY5Y 신경모세포종 세포의 세포 내 Aβ 응집물에 대하여 화합물 14의 형광 영상화를 시행하였다. Aβ의 세포 내 흡수와 응집을 측정하기 위하여, 플루오레세인 이소티오시아네이트로 표지된 Aβ42 (FITC-Aβ42) 1 μM을 첨가하여 SHSY5Y 세포를 3일간 배양하고 형광 현미경으로 영상화하였다. SHSY5Y 세포에서 FITC-Aβ42의 흡수를 관찰하였다 (도 2B). 종래의 연구는 세포 외 용해성 Aβ가 흡수된 후 고분자량의 Aβ42 응집물 (>200 kDa)을 형성한다고 보고하였다. 화합물 14가 세포 내 Aβ 응집물 검출용 형광 프로브 성분으로 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 표지되지 않은 Aβ42를 첨가한 세포를 SDS로 분해하고, 분쇄된 세포물질을 10 분간 10 μM의 화합물 14와 반응시켰다. Aβ 첨가된 세포 추출물로부터 형광 침전물이 관찰되었다 (도 2D). 표지된 패턴은 티오플라빈 T를 이용하여 관찰한 패턴과 일치하였다 (도 2F). Aβ 없이 생장시킨 세포의 추출물은 형광 염색이 나타나지 않았다 (도 2C 및 2E). 이러한 결과는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온계 프로브가 세포 내 Aβ 응집물을 염색할 수 있다는 것을 강하게 시사한다.
4. 생체 내 뇌 조직 (Ex vivo) 형광 영상화
2-스티릴피리다진-3(2H)-온계 화합물 14가 AD 마우스의 뇌 조직의 베타 아밀로이드 응집물을 염색할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 15 월령 트랜스제닉 AD 마우스 (APP/PS1) 모델의 뇌 섹션에서 화합물 14를 시험하였다. 도 3은 이들 조직 시료의 대표적인 형광 현미경 사진을 보여준다. Aβ 응집물은 화합물 14에 의하여 선명하게 염색되었고, 이 결과는 시험관 내 실험에서 나타났던 (도 3B 및 3C) Aβ 응집물에 대한 화합물 14의 고친화도와 부합하는 것이다. 표지된 패턴은 티오플라빈 T로 염색된 표준 섹션 (도 3E 및 3F)에서 얻어진 시그널과 부합하였다. 반면, 일반 마우스의 조직은 화합물 14 또는 티오플라빈 T로 염색되지 않았다 (도 3A 및 3D). 이러한 결과는 화합물 14가 뇌에서 Aβ 응집물 검출용 프로브로서 기능할 수 있음을 시사한다.
종래에는 Aβ 응집물에 대하여 결합 친화력이 큰 리간드로서 스틸벤 유도체가 알려졌었다. 최근 구조적으로 유사한 두 가지 화합물이 상용 프로브 BAY 94-9172 및 AV-45로 개발되었고, 이들 2종의 분자들은 모두 스틸벤 (BAY 94-9172) 및 스티릴피리딘 (AV-45)의 경직된 구조를 가지고 있다. 본 발명자들은 스틸벤의 페닐기를 치환하여 스티릴피리다진-3(2H)-온을 제조함으로써 Aβ 응집물 검출용 형광 마커를 개발하고자 하였다. 또한, 임상 시험중인 모든 PET 영상화 프로브들 (BAY 94-9172, AV-45 및 GE067)은 Aβ 응집물에 대한 결합 특이성을 부여하는 모노메틸아미노기 또는 디메틸아미노기를 함유한다.
결론적으로, 본 발명자들은 디메틸아미노기를 함유하는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 (화합물 14)가 Aβ 응집물 영상화용으로 가장 적합한 형광 특성을 가짐을 밝혀내었다. 특히, 화합물 14는 Aβ 응집물에 대하여 매우 강력한 형광 반응성 (FA β/F0 = 40.84) 및 결합 친화도 (Kd = 1.84 μM)를 보여주었고 세포 내 Aβ 응집물 및 트랜스제닉 AD 마우스 모델 (APP/PS1)의 Aβ 응집물 모두를 분명하게 염색시켰다. 그러므로, 화합물 14를 포함하는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체는 AD 연구용 형광 영상화제로서 훌륭한 후보 물질임이 틀림없다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물 검출용 조성물:
    화학식 (I)
    Figure 112013034069864-pat00005

    여기서,
    상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, C1~C3 알콕시 카르보닐, 니트로, C1~C3 알킬, 페닐, 페닐 비닐, C1~C3 디알킬 아미노, 아미노, C1~C3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    상기 n은 1 내지 3의 정수이다.
  2. 하기 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 치매 또는 알츠하이머병을 진단하기 위한 조성물:
    화학식 (I)
    Figure 112013034069864-pat00006

    여기서,
    상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, C1~C3 알콕시 카르보닐, 니트로, C1~C3 알킬, 페닐, 페닐 비닐, C1~C3 디알킬 아미노, 아미노, C1~C3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 n은 1 내지 3의 정수이다.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체는 (E)-4,5-디클로로-2-(4-(디메틸아미노)스티릴)피리다진-3(2H)-온인 것인 조성물.
  5. 삭제
  6. 치매 또는 알츠하이머병의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 하기 화학식 (I)로 표시되는 2-스티릴피리다진-3(2H)-온 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 사용하는 것을 포함하는 베타 아밀로이드 응집물을 검출하는 방법:
    화학식 (I)
    Figure 112013034069864-pat00007

    여기서,
    상기 R은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, C1~C3 알콕시 카르보닐, 니트로, C1~C3 알킬, 페닐, 페닐 비닐, C1~C3 디알킬 아미노, 아미노, C1~C3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 n은 1 내지 3의 정수이다.
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