PT1945622E - Compostos de benzofurano marcados isotopicamente enquanto agentes de imagiologia para proteínas amilóides - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSTOS DE BENZOFURANO MARCADOS ISOTOPICAMENTE ENQUANTO AGENTES DE IMAGIOLOGIA PARA PROTEÍNAS AMILÓIDES

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se genericamente ao campo dos compostos de benzofurano marcados isotopicamente que são substratos para proteínas amiloidogénicas como a βΑΙ-42, por exemplo, uma proteína amilóide cujos depósitos no cérebro estão associados à doença de Alzheimer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO I. AMILOIDOSE CEREBRAL

[0002] A doença de Alzheimer ("DA") é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela perda de memória e outros défices cognitivos. McKhann et al., Neurology 34: 939 (1984) . É a causa mais comum de demência nos Estados Unidos. A DA pode afectar pessoas tão jovens como aquelas na faixa dos 40-50 anos de idade, no entanto, uma vez que a presença da doença é difícil de determinar sem o recurso a uma perigosa biópsia cerebral, o momento de início da doença é desconhecido. A prevalência da DA aumenta com a idade, estimando-se que a percentagem de população afectada seja tão alta como 40-50% na faixa etária dos 85-90. Evans et al., JAMA 262: 2551 (1989); Katzman, Neurology 43: 13 (1993) .

[0003] Os estudos sugerem que a deposição amilóide no cérebro é um evento precoce e etiológico na patogénese da doença de Alzheimer (DA). A progressão da deposição amilóide resulta na formação de placas neuríticas e emaranhados neurofibrilares em regiões do cérebro envolvidas na aprendizagem e memória. Uma placa neurítica típica da doença de Alzheimer inclui neurites distróficas, em torno de um núcleo de material amilóide. 0 principal componente do núcleo amilóide é uma proteína designada por beta-amilóide (βΑ) [0004] Na prática, a DA é definitivamente diagnosticada através da análise de tecido cerebral, geralmente na autópsia. Khachaturian, Arch. Neurol. 42: 1097 (1985); McKhann et al., Neurology 34: 939 (1984). Neuropatologicamente, esta doença é caracterizada pela 1 presença de placas neuríticas (PN), emaranhados neurofibrilares (NFT) e perda neuronal, assim como por uma série de outros resultados. Mann, Mech. Ageing Dev. 31: 213 (1985). As lâminas de tecido cerebral de vitimas da doença de Alzheimer, colhidas post mortem, apresentam amilóides sob a forma de núcleos proteicos extracelulares das placas neuríticas características da DA.

[0005] Os núcleos amilóides destas placas neuríticas sao compostos por uma proteína designada por β-amilóide (βΑ) , que se encontra predominantemente disposta numa configuração em folha-beta pregueada. Mori et al., Journal of Biological Chemistry 267: 17082 (1992); Kirschner et al.f PNAS 83: 503 (1986) . As placas neuríticas são um aspecto precoce e invariável da doença. Mann et al. , J. Neurol. Sei. 89: 169; Mann, Mech. Ageing Dev. 31: 213 (1985); Terry et al. , J. Neuropathol. Exp. Neurol 46: 262 (1987) .

[0006] A deposição inicial da βΑ ocorre, provavelmente, muito antes de os sintomas clínicos serem perceptíveis. Os "critérios microscópicos mínimos" actualmente recomendados para o diagnóstico da DA baseiam-se no número de placas neuríticas encontradas no cérebro. Khachaturian, Arch. Neurol. (1985), supra. No entanto, a avaliação da contagem de placas neuríticas deve ser adiada até depois da morte.

[0007] As placas neuríticas que contêm amilóides são uma característica proeminente das áreas selectivas do cérebro na DA e no síndrome de Down, assim como dos indivíduos homozigóticos para o alelo apolipoproteína E4, extremamente susceptíveis ao desenvolvimento da DA. Corder et al., Science 261: 921 (1993); Divry, P., J. Neurol. Psych. 27: 643-657 (1927); Wisniewski et al., em Zimmerman, H.M. (ed.): PROGRESS IN NEUROPATHOLOGY (Grune and Stratton, N.Y. 1973) pp. 1-26.

[0008] 0 amilóide cerebral é rapidamente demonstrado pela coloração de secções do cérebro com tioflavina S ou vermelho Congo. Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 35 (1962) . A proteína amilóide corada com vermelho do Congo caracteriza-se por uma aparência dicróica, exibindo uma cor de polarização amarelo-verde. A ligação dicróica é o resultado da estrutura em folha-beta pregueada das proteínas amilóides. Glenner, G. N. Eng. J. Med. 302: 1283 (1980). Pode ser encontrada uma discussão detalhada acerca da bioquímica e histoquímica do amilóide em Glenner, N. Eng. J. Med., 302: 1333 (1980).

[0009] Até à data, o diagnóstico da DA tem sido, maioritariamente, conseguido através da avaliação de 2 critérios clínicos, biópsias cerebrais e estudo de tecidos colhidos post mortem. Os esforços de investigação para o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico in vivo da doença de Alzheimer incluem testes genéticos, métodos de imunoensaio e técnicas de imagiologia.

[0010] Os indícios de que a existência de anomalias no metabolismo da βΑ é necessária e suficiente para o desenvolvimento da DA baseiam-se na descoberta de mutações pontuais no percursor da βΑ em diversas famílias excepcionais portadoras de uma forma autossómica dominante da DA. Hardy, Nature Genetics 1: 233 (1992); Hardy et al., Science 256: 184 (1992). Estas mutações ocorrem nas proximidades dos pontos de clivagem N- e C-terminal para a produção de βΑ a partir da sua proteína percursora. St. George-Hyslop et ai., Science 235: 885 (1987); Kang et al., Nature 325: 733 (1987); Potter WO 92/17152. A análise genética de várias famílias com DA demonstrou, contudo, que esta é geneticamente heterogénea. St. George-Hyslop et ai., Nature 347: 194 (1990) . A ligação aos marcadores do cromossoma 21 é mostrada apenas nalgumas famílias com início precoce da DA, não surgindo em famílias com início tardio da DA. Mais recentemente, foi identificado um gene no cromossoma 14 cujo produto se prevê conter múltiplos domínios transmembranares e se assemelha a uma proteína de membrana integral, por Sherrington et al., Nature 375: 754-760 (1995). Este gene pode ser responsável por até 70% dos casos de início precoce da DA autossómica dominante. Os dados preliminares sugerem que esta mutação do cromossoma 14 causa um aumento na produção de βΑ. Scheuner et al., Soc. Neurosci. Abstr. 21: 1500 (1995). Foi identificada uma mutação num gene muito semelhante no cromossoma 1 em famílias alemãs do Volga com início precoce da DA. Levy-Lahad et al., Science 269: 973-977 (1995).

[0011] O rastreio do genótipo da apolipoproteína E foi sugerido como um auxílio ao diagnóstico da DA. Scott, Nature 366: 502 (1993); Roses, Ann. Neurol. 38: 6-14 (1995). Contudo, surgem dificuldades com esta tecnologia, uma vez que o alelo da apolipoproteína E4 é apenas um factor de risco para a DA e não um marcador da doença. Este está ausente em muitos doentes com DA e presente em muitas pessoas idosas não dementes. Bird, Ann. Neurol. 38: 2-4 (1995) .

[0012] Os métodos de imunoensaio têm sido desenvolvidos para a detecção da presença de marcadores neuroquímicos em doentes com DA e para detectar uma proteína amilóide associada à DA no líquido cefalorraquidiano. Warner, Anal. Chem. 59: 1203A (1987); Patente Mundial N.° 92/17152 por Potter; Glenner et al., Patente U.S. N.° 4.666.829. Estes 3 métodos de diagnóstico da DA não foram comprovados como capazes de detectar a DA em todos os doentes, especialmente em fases precoces da doença e são relativamente invasivos, requerendo uma punção lombar. Para além disso, têm sido feitas tentativas para desenvolver sondas de anticorpos monoclonais para detecção imagiológica da βΑ. Majocha et ai., J. Nucl. Med., 33: 2184 (1992); Majocha et al., WO 89/06242 e Majocha et al., Patente U.S. 5.231.000. A principal desvantagem das sondas de anticorpos é a dificuldade em conseguir que estas moléculas de grandes dimensões atravessem a barreira hemato-encefálica. A utilização de anticorpos para o diagnóstico in vivo da DA implicaria a existência de anomalias evidentes na barreira hemato-encefálica para possibilitar o acesso ao cérebro. Não existem indícios funcionais convincentes da existência de anomalias na barreira hemato-encefálica na DA. Kalaria, Cerebrovascular & Brain Metabolism Reviews 4: 226 (1992).

[0013] O péptido βΑ radiomarcado tem sido utilizado para marcar placas de tipo neurítico difusas e compactas, em secções do cérebro DA. Ver Maggio et al., WO 93/04194. Contudo, estes péptidos partilham todas as desvantagens associadas aos anticorpos. Especificamente, os péptidos não atravessam normalmente a barreira hemato-encefálica em quantidade suficiente para possibilitar a obtenção de imagens e, uma vez que estas sondas reagem com placas difusas, não são específicos para a DA.

[0014] As placas neuríticas e os emaranhados neurofibrilares são os dois aspectos patológicos mais característicos da DA. Klunk and Abraham, Psychiatric Development, 6:121-152 (1988). As placas surgem primeiro no neocórtex, onde se encontram distribuídas de modo relativamente uniforme. Thal et al., Neurology 58:1791-1800 (2002). Os emaranhados surgem primeiro nas áreas límbicas como o córtex transentorrinal e progridem ao longo do neocórtex, num padrão topográfico previsível. Braak and Braak, Acta Neuropathologica 82:239-259 (1991). Arnold et al. mapearam a distribuição de emaranhados neurofibrilares (NFT) e placas neuríticas nos cérebros de doentes com DA. Arnold et al., Cereb.Córtex 1:103-116 (1991). Quando comparadas aos emaranhados neurofibrilares (NFT) as placas neuríticas estavam, em geral, distribuídas de modo relativamente uniforme ao longo do córtex, com excepção do córtex perirrinal e alocórtex límbicos (as áreas com maior densidade de emaranhados neurofibrilares (NFT)), onde se encontraram consideravelmente menos placas neuríticas. Através da coloração com tioflavina S, os lobos com maior densidade de placas neuríticas são o temporal e o occipital, os lobos com a menor densidade são o límbico e o frontal e, com densidade intermédia, o parietal. Arriagada 4 et al., Neurology 42 : 1681-1688 (1992). Arriagada et al. estudaram a distribuição topográfica de alterações patológicas do tipo da DA em cérebros de idosos presumidamente não dementes. As suas observações sugerem que a maioria dos indivíduos com idade superior a 55 anos têm, pelo menos, alguns NFT e placas. Os subtipos imunohistoquimicamente definidos de SP apresentavam padrões de distribuição distintos, com uma presença de placas βΑ imunorreactivas mais acentuada nas zonas neocorticais do que nas límbicas e uma presença pouco frequente das placas Alz-50 imunorreactivas, limitada às zonas que contêm neurónios Alz-50 positivos e emaranhados neurofibrilares (NFT) . Estes padrões sugeriram uma convergência nos processos patológicos que levam ao surgimento de NFT e SP, quer durante o envelhecimento como na DA.

[0015] Subsiste ainda uma discussão quanto a se as placas e emaranhados são subprodutos do processo neurodegenerativo encontrado na DA ou, se são a causa da morte das células neuronais. Ross, Current Opinion in Neurobiol. 96:644-650 (1996); Terry, J. of Neuropath. & Exp. Neurol. 55:1023-1025 (1996); Terry, J Neural Transmission- Suppl. 53:141-145 (1998) . Os indícios são claros quanto à clara correlação entre a perda de sinapses a nível neocortical e do hipocampo e o estado cognitivo pré-mórbido. Alguns investigadores sugerem que a distribuição da estrutura e função microtubulares, causada pela hiperfosforilação da proteína associada aos microtúbulos, proteína tau, desempenha um papel etiológico chave na perda de sinapses em particular e na DA, em geral. Terry, J. of Neuropath. & Exp. Neurol. 55:1023-1025 (1996); Terry, J Neural Transmission- Suppl. 53:141-145 (1998). Foi proposto que as lesões oxidativas e a ruptura da membrana desempenham importantes papéis na DA. Perry, Free Radical Biology & Medicine 28:831-834 (2000); Pettegrew et al., Annals of the New York Academy of Sciences 826:282-306 (1997). Os factores vasculares que incluem a hipoperfusão cerebral moderada e crónica foram igualmente implicados na patogénese da DA. De la Torre, Annals of the New York Academy of Sciences 903:424-436 (2000); Di Iorio et al., Aging (Milano) 11:345-352 (1999). Apesar de ser provável que todos estes factores desempenhem algum papel na patogénese da DA, existem indícios crescentes que apontam para a existência de anomalias no processamento do péptido beta-amilóide (βΑ), um péptido com uma constante de dissociação de 4 kD que se agrega numa estrutura fibrilar, em folha-beta pregueada. Glenner and Wong, Biochemical & Biophysical Research Communications 120:885-890 (1984). Foi sugerido que a βΑ desempenha um papel importante na patogénese da DA, por vários motivos: 1) os depósitos de βΑ são os marcadores neuropatológicos mais precoces na DA e 5 síndrome de Down e podem anteceder em várias décadas a formação de emaranhados neurofibrilares (NFT) Mann et al., Neurodegeneration 1:201-215 (1992); Naslund et al., JAMA 283:1571-1577 (2000). 2) A β-amiloidose é relativamente especifica à DA e perturbações estreitamente relacionadas; Selkoe, Trends in Neurosciences 16:403-409 (1993); 3) A βΑ é tóxica para neurónios cultivados, Yankner Neurobiol. Aging 13:615-616 (1992); Mattson et al., J. Neuroscience 12:376-389 (1992); Shearman et al., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 91:1470-1474 (1994), toxicidade essa que aparenta ser dependente da estrutura secundária em folha-beta e da agregação em, pelo menos, oligómeros. Lambert et al. Proc.Natl.Acad.Sei. USA 95:6448-6453 (1989); Pike et al., J. Neuroscience 13:1676-1687 (1993); Simmons et al., Molecular Pharmacology 45:373-379 (1994). Apesar de a βΑ existir, certamente, em equilíbrio distribuída pelas fraeções monomérica, oligomérica e fibrilar/placa fibrilar, a forma oligomérica da βΑ foi fortemente implicada enquanto componente neurotóxico chave. Selkoe, Alzheimer disease, editado por R.D.Terry, et al, pp. 293-310 Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia (1999); Selkoe, Science 298, 789-91 (2002). O reconhecimento dos efeitos tóxicos da βΑ oligomérica formou uma base de compromisso para alguns opositores da "hipótese da cascata amilóide" da DA. Terry, Ann. Neural. 49:684 (2001). Aquela que é, talvez, a maior evidência para a existência de um papel da βΑ na patogénese da DA deriva da descoberta de mutações no gene da proteína percursora amilóide (PPA) que levam a alguns tipos de início precoce da DA familiar. Goate et al., Nature 349:704-706 (1991). Adicionalmente, todas as formas familiares da DA autossómica dominante têm em comum um nível elevado da forma com a taxa de agregação mais elevada da βΑ com 42 aminoácidos. Younkin Rinsho Shinkeigaku -Clinicai Neurology 37:1099 (1997). Em contraste, nenhuma das mutações da proteína tau demonstrou ser causadora da DA. Em vez disso, as mutações nas proteínas tau (cromossoma 17) estão ligadas à demência frontotemporal no Parkinsonismo. Goedert et al., Neuron 21:955-958 (1998). Indícios recentes têm demonstrado uma boa correlação entre os níveis de βΑ no cérebro e o declínio cognitivo na DA e a deposição de amilóide parece ser um evento precoce, senão o primeiro, na patogénese da DA, precedendo qualquer défice cognitivo. Naslund, et al., JAMA 283:1571-1577 (2000). A presença de depósitos amilóides pode modular um número de vias bioquímicas que resultam na deposição de ainda outras proteínas, a activação da astróglia e micróglia e, eventualmente, a morte de células neuronais e consequente disfunção cognitiva. 6

II. AMILOIDOSE LOCALIZADA E SISTÉMICA

[0016] A amiloidose é uma condição lentamente progressiva que pode conduzir a uma morbilidade e mortalidade significativas. A rubrica "amiloidose" abrange um grupo diversificado de processos de doença e é caracterizada por depósitos de tecido extracelulares de várias proteínas fibrilares insolúveis genericamente designadas por "amilóide", num ou em vários órgãos e em quantidades suficientes para comprometer a sua função normal.

[0017] Os depósitos amilóides são extracelulares e não metabolizados ou eliminados pelo corpo. 0 amilóide pode ser grosseiramente detectado através de uma reacção de coloração com iodo semelhante à do amido; dai a designação amilóide. Microscopicamente, o amilóide é diferenciado pela sua distribuição extracelular, pelas suas propriedades tintoriais e ópticas quando corado com vermelho Congo e pela sua estrutura proteica fibrilar. Desse modo, sob microscopia óptica, o amilóide é uma substância homogénea altamente refractiva, com afinidade para o corante vermelho Congo, quer em tecidos fixados quer in vivo. Sob microscopia electrónica, o amilóide é composto por fibrilas lineares não ramificadas com 100 A° (10 nm); sob difracção de raios X, tem uma configuração beta-cruzada.

[0018] As doenças associadas à amiloidose são todas caracterizadas pela acumulação de depósitos amilóides. Os depósitos amilóides são caracterizados pela presença de uma ou mais proteínas amiloidogénicas, que derivam de proteínas percursoras que têm ou uma estrutura anormal ou se encontram em níveis anormalmente elevados no soro.

[0019] A causa da produção amilóide e da sua deposição em tecidos é desconhecida. Os mecanismos etiológicos podem variar entre os diferentes tipos bioquímicos da amiloidose. Na amiloidose secundária, por exemplo, pode existir uma anomalia no metabolismo da proteína precursora (o reagente de fase aguda: amilóide A sérica) , enquanto que na amiloidose hereditária parece estar presente uma proteína geneticamente variável. Na amiloidose primária, uma população monoclonal de células medulares produz fragmentos ou cadeias completas que podem ser anormalmente processadas para formar amilóide.

[0020] Foram definidos bioquimicamente os três principais tipos de amilóide e as suas diversas formas menos comuns: 0 primeiro tipo, que tem uma sequência N-terminal homóloga a uma porção de região variável de uma imunoglobulina de cadeia leve, é designado por AL e ocorre na amiloidose primária e na amiloidose associada ao mieloma múltiplo. O 7 segundo tipo tem uma sequência N-terminal única de uma proteína, que não a imunoglobulina, designada por proteína AA e ocorre em doentes com amiloidose secundária. 0 terceiro tipo, que está associado à polineuropatia amilóide familiar é, geralmente, uma molécula de transtirretina (pré-albumina) que tem uma substituição de aminoácidos simples. Constatou-se que outros tipos de amiloidose hereditária são compostos por uma gelsolina mutante em algumas famílias, uma apolipoproteína A-I mutante em muitas outras e por outras proteínas no amilóide hereditário da artéria cerebral. No amilóide associado à hemodiálise crónica, a proteína amilóide foi constituída pela 2-microglobulina. 0 amilóide associado ao processo de envelhecimento na pele e em órgãos endócrinos pode representar outras formas bioquímicas de amiloidose. 0 amilóide encontrado nas lesões histopatológicas da doença de Alzheimer é composto por proteínas. As análise química referente a diversas formas de amiloidose conduziu a uma classificação mais refinada. Uma proteína única, uma pentraxina designada por AP (ou AP sérica), é universalmente associada a todas as formas de amilóide e forma a base do teste de diagnóstico.

[0021] Sao actualmente reconhecidas três formas clínicas sistémicas principais. A amiloidose é classificada como primária ou idiopática (forma AL) quando não existem doenças associadas e como secundária, adquirida ou reactiva (forma AA) quando associada a doenças crónicas, quer infecciosas (tuberculose, bronquiectasia, osteomielite, lepra), quer inflamatórias (artrite reumatóide e ileíte granulomatosa). 0 amilóide também está associado ao mieloma múltiplo (AL), doença de Hodgkin (AA), outros tumores e à febre mediterrânica familiar (AA) . A amiloidose pode acompanhar o envelhecimento. Os três tipos principais surgem nas formas familiares sem associação a outra doença, frequentemente com tipos distintos de neuropatia, nefropatia e cardiopatia.

[0022] Podem estar envolvidos na amiloidose primária (AL) o coração, pulmão, pele, língua, glândula tireoide e o tracto intestinal. Podem ser encontrados "tumores" amilóides localizados nas vias respiratórias ou em outros locais. Os órgãos parenquimatosos (fígado, baço, rim) e o sistema vascular, especialmente o coração, estão frequentemente envolvidos.

[0023] A amiloidose secundária (AA) mostra uma predilecção pelo baço, fígado, rim, glândulas supra-renais e nódulos linfáticos. Contudo, nenhum sistema de órgãos é poupado e o envolvimento vascular pode ser generalizado, apesar do envolvimento cardíaco com significado clínico ser raro. 0 8 fígado e o baço são, frequentemente, dilatados, firmes e semelhantes a borracha. Os rins são, frequentemente, dilatados. As secções do baço têm áreas dilatadas, translúcidas e cerosas onde os corpos de Malpighi são substituídos por amilóide lívido, originando o baço sagu.

[0024] A amiloidose hereditária é caracterizada por uma neuropatia sensorial periférica e motora, frequentemente autonômica e pelo amilóide cardiovascular e renal. Podem ocorrer o síndrome do túnel cárpico e anomalias vítreas.

[0025] 0 amilóide associado a certas doenças malignas (por exemplo, mieloma múltiplo) tem a mesma distribuição que o amilóide idiopático (AL); quando associado a outras doenças malignas (por exemplo, carcinoma medular da glândula tireoide) pode ocorrer localmente, associado ao tumor ou metástases. 0 amilóide é frequentemente encontrado no pâncreas de indivíduos com diabetes mellitus tipo 2 do adulto.

[0026] Apesar da amiloidose ser presumida com base em sintomas e sinais clínicos específicos, o seu diagnóstico definitivo apenas pode ser realizado através da biópsia. Actualmente, a aspiração abdominal de gordura adiposa subcutânea e a biópsia da mucosa rectal são os melhores testes de rastreio. Os outros locais úteis para biópsia são a gengiva, pele, nervos, rim e fígado. As secções de tecido devem ser coradas com vermelho Congo e observadas com um microscópio de polarização para a birrefringência verde característica do amilóide. 0 soro AP marcado isotopicamente tem sido utilizado num teste cintilográfico para confirmar o diagnóstico de amiloidose. São necessárias melhores metodologias de diagnóstico de modo a proporcionar um diagnóstico precoce e a possibilitar, dessa forma, um tratamento eficaz.

[0027] Existe alguma especulação acerca de uma ligação entre a inibição de depósitos amilóides e a terapia da diabetes, ver, por exemplo, a patente WO 02/16333. A obtenção de imagens do pâncreas para o diagnóstico da diabetes é uma metodologia adequada para a medição definitiva dos níveis de amilóide no pâncreas, cuja correlação parece ser indicativa de um diagnóstico de diabetes.

III. MARCADORES DE SUBSTITUIÇÃO

[0028] Acredita-se que a DA afecte cerca de 4 milhões de americanos e, talvez, entre 20-30 milhões de pessoas em todo o mundo. A DA é reconhecida pelas nações desenvolvidas como um importante problema de saúde pública. Têm emergido 9 vários alvos terapêuticos do continuo esclarecimento acerca da base molecular da DA. Por exemplo, foram aprovados quatro inibidores da colinesterase para o tratamento sintomático de doentes com DA - tacrina (Cognex, Warner-Lambert, Morris Plains, New Jersey); donepezilo (Aricept, Eisai, Inc., Teaneck, New Jersey, e Pfizer, Inc., New York, New York); rivastigmina (Exelon, Novartis, Basel, Switzerland); e galantamina (Reminyl, Janssen, Titusville, New Jersey). As novas potenciais terapias para a DA actualmente em desenvolvimento envolvem a imunoterapia, inibidores de secretase e fármacos anti-inflamatórios. Contudo, até à data, não estão disponíveis fármacos que modifiquem comprovadamente o curso do declínio cognitivo.

[0029] É exemplificado um importante obstáculo ao desenvolvimento de terapias anti-amiloidose na seguinte citação (Hock, C. et al., 2003, Neuron, 38:547-554), direccionada à utilização da imunoterapia enquanto terapia anti-amiloidose: "não sabemos se a carga cerebral βΑ-amilóide foi reduzida nos nossos doentes de estudo; serão necessárias técnicas de imagiologia in vivo para responder a esta questão." A capacidade de quantificar a carga amilóide antes do tratamento e a monitorização dos seus efeitos é crítica para o desenvolvimento eficiente desta classe de fármacos.

IV. DIAGNÓSTICO DE FORMAS PRODRÓMICAS DE AMILOIDOSE

[0030] Uma condição estreitamente relacionada com a doença de Alzheimer (DA) é caracterizada quer pela perda de memória isolada quer pelo comprometimento de vários domínios cognitivos, sem gravidade suficiente para preencher os critérios de diagnóstico da doença de Alzheimer. Esta condição tem sido designada como défice cognitivo ligeiro (DCL) e pode representar uma fase prodrómica da DA. O défice cognitivo ligeiro é definido como um estado intermédio ou transitório entre um estado cognitivo normal e a demência. Os sujeitos com défice cognitivo ligeiro têm, tipicamente, uma perda de memória para além da expectável relativamente à idade e educação, contudo, não se encontram ainda dementes.

[0031] Existem alguns indícios de que os doentes diagnosticados com défice cognitivo ligeiro irão progredir para a DA. Existem também indicações de que o défice cognitivo ligeiro pode representar uma condição heterogénea complexa e que alguns doentes com défice cognitivo ligeiro não irão desenvolver a DA ou outros transtornos demenciais.

[0032] Tem existido um grande interesse relativamente à determinação do limite da demência para a DA. A maioria do 10 interesse lida com um estado limite ou transitório entre o envelhecimento normal e a demência ou, mais especificamente, a doença de Alzheimer (DA) . A revisão de vários estudos indicou que estes indivíduos estão em risco acrescido para o desenvolvimento da DA, com uma variação entre 1% e 25% por ano. A variabilidade destas taxas reflecte, provavelmente, diferentes critérios de diagnóstico, instrumentos de medição e o estudo de amostras de pequenas dimensões. Ver Dawe et al., Int'1 J. Geriatr. Psychiatry 7: 473 (1992).

[0033] Os doentes diagnosticados com DCL estão também a tornar-se um factor de interesse para os ensaios de tratamento. 0 estudo Alzheimer's Disease Cooperative Study, que é um consórcio de grupos de investigação da doença de Alzheimer do National Institute on Aging, está a lançar um ensaio multicêntrico de agentes destinados a alterar a progressão para DA de doentes com DCL. Ver Grundman et al., Neurology, 1996, A403.

[0034] Podem ser levantadas questões relativamente aos critérios de diagnóstico para a DCL. Alguns investigadores acreditam que virtualmente todos os doentes com doença moderada têm, neuropatologicamente, DA e que, desse modo, esta distinção pode não ser útil. Ver Morris et al., Neurology 41: 469 (1991). Outros destacam que apesar de muitos doentes progredirem para a DA nem todos o fazem e que, consequentemente, a distinção é importante. Ver Grundman, ibid; Petersen et al., JAMA 273: 1274 (1995); Petersen et al., Ann N Y Acad. Sei. 802: 58 (1996).

V. SUBSTRATOS PARA PROTEÍNAS AMILÓIDOGÉNICAS—BENZOFURANOS RADIOMARCADOS

[0035] Têm sido postulados potenciais substratos para as proteínas amiloidogénicas e variam entre corantes, como o vermelho Congo e derivados da Crisamina G (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 6.168.776), e péptidos de sequência específica que foram marcados para efeitos de obtenção de imagens da beta-A insolúvel. Estes péptidos incluem o próprio péptido beta-A marcado, péptido putrescina-gadolínio-beta-A, beta-A radiomarcado, [111In] beta-A, [125I ] beta-A, beta-A marcado com radioisótopos emissores de radiação gama, derivados DTPA-beta-A, putrescina radiomarcada, ligantes com base em KVLFF e derivados dos mesmos (ver, por exemplo, Pub. Internacional WO93/04194 e Pat. U.S. N.° 6.331.440).

[0036] Foram descritos alguns benzofuranos não radiomarcados implicados no diagnóstico da doença de 11

Alzheimer na Patente U.S. N.° 6.696.039. Contudo, nenhum dos compostos de benzofurano aqui descritos foi radiomarcado ou descrito como eficaz na obtenção de imagens para a doença de Alzheimer num doente vivo.

[0037] Ape sar de serem conhecidos alguns benzofuranos marcados, nenhum foi utilizado para diagnóstico da doença de Alzheimer. Ver Aitken et al., Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1: Organic and Bio-Organic Chemistry (1998), (23), 3937-3942 que divulga um derivado de benzofurano deuterado; Givens et al. divulga o 2-fenil-benzofuran-d no Journal of the American Chemical Society (1993) 115(14), 6001-12 e Davies et al. divulga o 2-fenil-benzofurano 14C no Journal of the Chemical Society (1959) 3544-7.

[0038] M. Ono et al., Nuclear Medicine and Biotechnology 29 (2002) 633-642 divulga alguns compostos de benzofurano radioiodados enquanto agentes de imagiologia direccionados às placas amilóides na doença de Alzheimer.

[0039] A Patente WO 03/051859 divulga alguns compostos de benzofurano e versões radiomarcadas dos mesmos para o diagnóstico ou imagiologia in vivo de doenças associadas ao amilóide, como a doença de Alzheimer.

[0040] A Patente WO 2004/100998 divulga alguns compostos de benzimidazol, benzotiazol, benzofurano e versões radiomarcadas do mesmo para a avaliação dos niveis de beta-A solúvel para o diagnóstico de doenças associadas ao amilóide, como a doença de Alzheimer.

[0041] Desse modo, existe uma necessidade de compostos de benzofurano marcados isotopicamente, capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica e de se ligar a depósitos amilóides insolúveis, para a obtenção de imagens no diagnóstico da doença de Alzheimer.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0042] A presente invenção satisfaz esta necessidade e outras fornecendo, numa modalidade, um composto de ligação amilóide (I) ou de um dos seus sais f armacologicamente aceitáveis:

R10 R‘ R3 R* onde 12 Y é F, Cl, Br, I, 0-(CR"2)n-X ou -(CR"2)n-X; em que X é F, Cl, Br ou I; e n é 1-5; R' é H ou um grupo alquilo Ci-8; R' ' é H ou um grupo alquilo Ci_8; R3-R10 são independentemente seleccionados do grupo composto por H, F, Cl, Br, I, alquilo C1-C5, (CH2) 1-3-ORn, CF3, - (CHzJi-a-X, -0- (CH2) !-3-X, CN, -C0-Rn, -N(Rn)2, -NR"3+, -N02, -C0-N(Rh)2, -0-(C0)-Rh, OR11, SRn, COORn, RPh/· -CRii=CRn-RPh e -C (Rn) 2-C (Rn) 2RPh, em que X é F, Cl, Br ou I; e

Rph é fenilo opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo constituído por F, Cl, Br, I, alquilo C1-C5, (CH2) i-3-0-Rn, CF3, _(CH2)i-3-X, -0- (CH2) !-3-X, CN, -C0-Rn, -N(Rn)2, -C0-N(Rn)2, -0- (CO) -Rn, ORn, SRn, e COORn, em que cada Rn é independentemente H ou alquilo C1-C5; e o -1 Λ Y ou R -R compreende pelo menos um marcador detectável seleccionado do grupo constituído por 131I, 123I, 124I, 125I, 76Br, 75Br, 18F, 19F nC, 13C, 14C e 3H.

[0043] Noutra modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica que contém uma quantidade eficaz de um composto de ligação amilóide consonante com a fórmula (I) como acima descrito e um veículo farmacologicamente aceitável.

[0044] Ainda outra modalidade diz respeito aos compostos com a fórmula (I) para utilização num método de detecção in vivo do(s) depósito(s) amilóide(s). 0 método compreende (i) a administração a um mamífero de uma quantidade eficaz de um composto de ligação amilóide de acordo com a fórmula (I), em que o composto se ligaria a qualquer do(s) depósito(s) amilóide(s) no mamífero; e (ii) a detecção da ligação entre o composto e o(s) depósito(s) amilóide(s) no mamífero.

[0045] Adicionalmente, de modo individual ou em combinação com qualquer outra modalidade aqui descrita, a invenção engloba a utilização de um composto de acordo com a fórmula (I), como aqui definido, para a detecção in vivo de depósitos amilóides num mamífero. Numa modalidade relacionada, a invenção proporciona ainda a utilização de um composto com a fórmula (I) na preparação de um medicamento para utilização na detecção in vivo de depósitos amilóides em tal sujeito.

[0046] Ainda outra modalidade é um método para detecção in vitro de depósito(s) amilóide(s). 0 método compreende (i) o contacto entre um tecido corporal e uma quantidade eficaz 13 de um composto de ligação amilóide de acordo com a fórmula (I), em que o composto se ligaria a qualquer depósito amilóide no tecido; e (ii) a detecção da ligação do composto ao (s) depósito (s) amilóide (s) no tecido.

[0047] Isoladamente ou em conjunto com qualquer outra modalidade aqui descrita, outra modalidade é a utilização de um composto de acordo com a fórmula (I), como aqui definido, para a detecção in vitro de depósitos amilóides. Noutra modalidade, a invenção proporciona a utilização de um composto com a fórmula (I) na preparação de um medicamento para aplicação na detecção in vitro de depósitos amilóides.

[0048] Uma modalidade adicional diz respeito a compostos com a fórmula (I) para utilização num método de distinção entre um cérebro afectado pela doença de Alzheimer e um cérebro normal. 0 método compreende (i) a obtenção de tecidos a partir (i) do cerebelo e (ii) de outra secção do mesmo cérebro, de um mamífero normal e de um mamífero com suspeita de afecção pela doença de Alzheimer; (ii) o contacto dos tecidos com um composto de ligação amilóide de acordo com a reivindicação 1; (iii) a quantificação do amilóide ligado ao composto; (iv) o cálculo da proporção entre (a) a quantidade de amilóide numa área do cérebro que não o cerebelo e (b) a quantidade de amilóide no cerebelo; e (v) a comparação entre a proporção obtida para um mamífero e a proporção obtida para um mamífero com suspeita de afecção pela doença de Alzheimer.

[0049] Noutra modalidade, isoladamente ou em combinação com qualquer outra modalidade aqui descrita, a invenção proporciona a utilização de um composto de acordo com a fórmula (I), como aqui definido, para a distinção entre um cérebro afectado pela doença de Alzheimer e um cérebro normal. Outra modalidade é a utilização de um composto com a fórmula (I) na preparação de um medicamento para aplicação na distinção entre um cérebro afectado pela doença de Alzheimer e um cérebro normal.

[0050] Ainda outra modalidade é um método de detecção de depósitos amilóides em tecido humano ou animal proveniente de biópsias ou recolhas post mortem. 0 método compreende os passos de (a) incubar o tecido fixado em formalina ou congelado a fresco com uma solução de um composto de ligação amilóide com a Fórmula (I) ou de um dos seus sais 14 farmacologicamente aceitáveis, para formar um depósito marcado e (b) permitir a detecção do depósito marcado.

[0051] Noutra modalidade, isoladamente ou em combinação com qualquer outra modalidade aqui descrita, a invenção proporciona a utilização de um composto de acordo com a fórmula (I), como aqui definido, para a detecção de depósitos amilóides em tecido humano ou animal proveniente de biópsias ou recolhas post mortem. Outra modalidade é a utilização de um composto com a fórmula (I) para a preparação de um medicamento para aplicação na detecção de depósitos amilóides em tecido humano ou animal proveniente de biópsias ou recolhas post mortem.

[0052] Ainda noutra modalidade, é fornecido um método de quantificação da quantidade de amilóide em tecido proveniente de biópsias ou recolhas post mortem. 0 método compreende os passos de: a) incubação de um derivado radiomarcado de um composto de ligação amilóide com a fórmula (I) ou de um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis com um homogenado de tecido proveniente de biópsias ou recolhas post mortem, em que pelo menos um dos substituintes no composto é marcado com um radiomarcador seleccionado de entre um grupo composto por 125I, 3H e um substituinte que contém carbono, onde pelo menos um carbono é 14C; b) separação do derivado radiomarcado de um composto com a fórmula (I) ligado ao tecido do não ligado ao tecido, c) quantificação do derivado radiomarcado de um composto com a fórmula (I) ligado ao tecido, e d) conversão das unidades de derivado radiomarcado de um composto com a fórmula (I) ligado ao tecido em unidades de microgramas de amilóide por 100 mg de tecido, por comparação a um padrão.

[0053] Noutra modalidade, isoladamente ou em combinação com qualquer outra modalidade aqui descrita, a invenção proporciona a utilização de um composto de acordo com a fórmula (I), como aqui definido, para quantificar a quantidade de amilóide em tecido proveniente de biópsias ou recolhas post mortem. Outra modalidade é a utilização de um composto com a fórmula (I) na preparação de um medicamento para aplicação na quantificação de amilóide em tecido proveniente de biópsias ou recolhas post mortem.

[0054] Noutra modalidade, é fornecido um método para ligar selectivamente um composto de ligação amilóide com a 15 Fórmula (I) ou um dos seus sais f armacologicamente aceitáveis a placas amilóides, mas não a emaranhados neurofibrilares, em tecido cerebral que contém ambos. 0 método compreende o contacto entre placas amilóides e um composto com a Fórmula (I) , numa concentração inferior a cerca de 10 nM, em ensaios de ligação ou coloração in vitro.

[0055] Ainda noutra modalidade, isoladamente ou em combinação com qualquer outra modalidade aqui descrita, a invenção proporciona a utilização de um composto de acordo com a fórmula (I), como aqui descrito, para aplicação num método para ligar selectivamente um composto de ligação amilóide com a Fórmula (I) ou um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis a placas amilóides e não a emaranhados neurofibrilares em tecido cerebral que os contém a ambos. Outra modalidade é a utilização de um composto com a fórmula (I) na preparação de um medicamento para aplicação na ligação selectiva entre um composto de ligação amilóide com a Fórmula (I) ou um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis a placas amilóides e não a emaranhados neurofibrilares em tecido cerebral que os contém a ambos.

[0056] Ainda noutra modalidade, é fornecido um composto com a fórmula (I) para utilização num método para ligar selectivamente in vivo um composto de ligação amilóide com a Fórmula (I) ou um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis a placas amilóides e não a emaranhados neurofibrilares em tecido cerebral que os contém a ambos. 0 método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um composto com a Fórmula (I) ou de um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis, de modo a que a concentração do composto administrado no sangue seja inferior a cerca de 10 nM, in vivo.

[0057] Ainda outra modalidade é um composto com a fórmula (I) para utilização num método para a detecção in vivo ou in vitro num sujeito de pelo menos um depósito amilóide que contenha pelo menos uma proteína amiloidogénica. 0 método compreende os passos de: (a) administração a um sujeito afectado por uma doença associada à amiloidose de uma quantidade detectável de uma composição farmacêutica composta por pelo menos um composto de ligação amilóide com a fórmula (I) ou um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis e um veículo farmacologicamente aceitável, e de 16 (b) detecção da ligação do composto a um depósito amilóide que contenha pelo menos uma proteína amiloidogénica.

[0058] Ainda noutra modalidade, é fornecido um composto com a fórmula (I) para utilização num método de identificação de um doente como prodrómico para uma doença associada à deposição amilóide, que compreende: (A) a administração ao doente, que apresenta sinais de demência clínica ou sinais clínicos de défice cognitivo ligeiro, de um composto de ligação amilóide com a fórmula (I) ou de um dos seus sais f armacologicamente aceitáveis; depois (B) a obtenção de imagens do doente mencionado para obter dados; e (C) a análise dos dados mencionados para averiguar os níveis de amilóide no doente mencionado com referência a um nível normativo, identificando assim o referido doente como prodrómico para uma doença associada à deposição amilóide.

[0059] Noutra modalidade, é fornecido o composto com a fórmula (I) para utilização num método de determinação da eficácia da terapia no tratamento da amiloidose. O método compreende (A) a administração de uma quantidade eficaz de um composto de ligação amilóide (I) ou de um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis a um doente em necessidade desta. (B) a obtenção de imagens do referido doente; e, então (C) a administração de pelo menos um agente anti-amilóide ao referido doente em necessidade deste; (D) subsequentemente, a administração de uma quantidade eficaz de um composto com a fórmula (I) ao referido doente em necessidade deste; (E) a obtenção de imagens do referido doente; e (F) a comparação dos níveis de deposição amilóide no referido doente antes e depois do tratamento com o dito pelo menos um agente anti-amilóide. 17

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0060] A presente invenção explora a capacidade dos derivados de benzofurano marcados isotopicamente atravessarem a barreira hemato-encefálica in vivo e estabelecerem ligação com proteínas amiloidogénicas.

[0061] Um exemplo dessa ligação é a capacidade dos compostos de benzofurano se ligarem à βΑ depositada em placas neuríticas (mas sem difusão), à βΑ depositada no amilóide vascular encefálico e ao amilóide composto pela proteína depositada nos NFT.

Caracterização da ligação específica ao péptido βΑ sintético: Afinidade, cinética, ligação máxima [0062] As características da ligação do derivado de benzofurano foram analisadas utilizando para o efeito βΑ(1-40) sintética e 2-(4'-[3H]metilamino-fenil)-benzotiazol ( [3Η]BTA-1) em solução salina de tampão de fosfato (pH 7,4), como previamente descrito. Klunk et ai., Life Sei. 69:1471 (2001); Mathis et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 12:295 (2002) . A sequência de aminoácidos para a βΑ(1-40) é a seguinte: [0063] 1 2 3 4 5 6 7 I8 9 10 11 I12 Asp Ala Glu :Phe Arg His Asp jSer Gly Tyr Glu jval 13 14 15 ; 16 17 18 19 |20 21 22 23 24 His His Gin ijLys Leu Vai Phe jPhe Ala Glu Asp Vai 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 j 36 Gly Ser Asn ijLys Gly Ala Ile jlle Gly Leu Met jval 37 38 39 40 — — — ~4----------------- — — —........ Gly Gly Vai ijval \

Definições [0064] "Alquilo" refere-se a um radical hidrocarboneto saturado de cadeia linear ou ramificada: os exemplos incluem, mas não exclusivamente, metilo, etilo, propilo, 18 iso-propilo, butilo, iso-butilo, terc-butilo, n-pentilo e n-hexilo.

[0065] Uma "quantidade eficaz" refere-se à quantidade necessária para produzir um efeito pretendido. Os exemplos de uma "quantidade eficaz" incluem as quantidades que possibilitam a detecção e obtenção de imagens, in vivo ou in vitror do(s) depósito(s) amilóide(s) e que produzem uma toxicidade e biodisponibilidade aceitáveis para utilização farmacêutica e/ou previnem a degeneração celular e toxicidade associadas à formação de fibrilas.

[0066] Um "veiculo farmacologicamente aceitável" refere-se a um material, composição ou veiculo farmacologicamente aceitável, tal como um agente de enchimento liquido ou sólido, diluente, excipiente ou material de encapsulação solvente, envolvido na condução ou transporte do composto em epígrafe de um órgão ou parte do corpo para outro órgão ou parte do corpo. Cada veículo é "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e adequado para administração ao doente. Os exemplos de materiais que podem servir como veículos farmacologicamente aceitáveis incluem, mas não exclusivamente: (1) açúcares, como a lactose, glucose e sacarose; (2) amidos, como o amido de milho e batata; (3) celulose e derivados como a carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) goma adragante em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, como a manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, como os óleos de amendoim, semente de algodão, girassol, sésamo, milho, soja e o azeite; (10) glicóis, como o propilenoglicol; (11) polióis, como a glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, como o oleato de etilo e laurato de etilo; (13) ágar; (14) agentes tampão, como os hidróxidos de magnésio e alumínio; (15) ácido algínico; (16) água apirógena; (17) soro fisiológico isotónico; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tamponadas ao pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e (22) outras substâncias não tóxicas compatíveis, empregues em formulações farmacêuticas como as mencionadas em, por exemplo REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15a ed. (Mack Publishing Co., 1975), nas páginas 1405-1412 e 1461-1487e, em THE NATIONAL FORMULARY XIV, 14a ed. (American Pharmaceutical Association, 1975).

[0067] Um "sal farmacologicamente aceitável" refere-se a um sal ácido ou básico do composto inventado que possui a actividade farmacológica pretendida e que não é nem biologicamente ou de outro modo indesejável. 0 sal pode ser formado com ácidos que incluem, não exclusivamente, acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, 19 benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforossulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, gluco-heptanoato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, hidrobrometo, hidroiodeto, 2-hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, tiocianato, tosilato e undecanoato. Os exemplos de um sal básico incluem, não exclusivamente, sais de amónio, sais de metais alcalinos como sais de sódio e potássio, sais de metais alcalino-terrosos como sais de cálcio e magnésio, sais com bases orgânicas como os sais de diciclo-hexilamina, N-metil-D-glutamina e sais com aminoácidos como a arginina e lisina. Em algumas modalidades, os grupos básicos que contêm nitrogénio podem ser quaternizados com agentes que incluem halogenetos de alquilo inferior tais como metilo, etilo, cloretos de propilo e butilo, brometos e iodetos; sulfatos de dialquilo como os sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo e diamilo; halogenetos de cadeia longa como os cloretos de decilo, laurilo, miristilo e estearilo, brometos e iodetos; e halogenetos de aralquilo como brometos de fenetilo.

[0068] 0 termo "parentérico", como aqui empregue, inclui técnicas de infusão e injecção subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intra-esternal, intracraniana e intra-óssea.

[0069] Um "animal" refere-se a um organismo vivo com sensibilidade e capacidade de se mover voluntariamente, cuja existência requer oxigénio e alimentos orgânicos. Os exemplos incluem, não exclusivamente, os membros das espécies humana, equina, suína, bovina, murina, canina e felina. No caso de um humano, um "animal" pode também ser referido como um "doente".

[0070] "Mamífero" refere-se a um animal vertebrado de sangue quente (homeotérmico).

[0071] Um "sujeito" é um mamífero como, por exemplo, um humano. Um exemplo específico é um humano com suspeita de demência.

[0072] "Tratar" refere-se a: (i) prevenção da ocorrência de uma doença, distúrbio ou condição num animal que pode estar predisposto ao desenvolvimento da doença, distúrbio ou condição mas que não foi ainda diagnosticado como seu portador; 20 (ii) inibição da doença, distúrbio ou condição, isto é, à suspensão do seu desenvolvimento; e/ou (iii) atenuação da doença, distúrbio ou condição, isto é, a promoção da regressão da doença, distúrbio e/ou condição.

[0073] 0 termo "terapia" inclui o tratamento e/ou prevenção da doença.

[0074] Os termos "tratar" ou "tratamento" nao implicam, necessariamente, a cura total. Qualquer alivio, em qualquer extensão, de algum sintoma indesejado ou efeito patológico associado à doença ou qualquer abrandamento do seu progresso pode ainda ser considerado como tratamento. Para além disso, o tratamento pode incluir actos que podem piorar a sensação geral de bem-estar do doente, assim como o seu aspecto. Por exemplo, a administração de quimioterapia a doentes oncológicos que pode contribuir para que estes se sintam "mais doentes" é, todavia, considerada como um tratamento.

[0075] 0 termo "prevenção" diz respeito ao decréscimo da probabilidade de um organismo contrair ou desenvolver uma doença associada à deposição amilóide. Por exemplo, o termo "prevenção" refere-se à redução da percentagem de indivíduos que desenvolvem a doença, relativamente a um grupo de controlo que não foi submetido à administração de um agente anti-amilóide.

[0076] Uma "quantidade detectável" significa que a quantidade de composto detectável administrada é suficiente para possibilitar a detecção da ligação do composto ao amilóide.

[0077] Uma "quantidade eficaz para imagiologia" significa que a quantidade de composto detectável administrada é suficiente para possibilitar a obtenção de imagens da ligação do composto ao amilóide.

[0078] 0 termo "imagiologia in vivo" refere-se a qualquer método que permita a detecção de um composto de benzofurano marcado, conforme aqui descrito.

[0079] O termo "método de detecção in vivo ou in vitro" refere-se a qualquer método que permita a detecção de um derivado marcado de tioflavina com a fórmula (I).

[0080] 0 termo "linha de base" refere-se à dimensão e distribuição da deposição amilóide de um doente, antes do inicio da terapia anti-amiloidose. 21 [0081] A menos que o contexto o especifique claramente em contrário, as definições de termos no singular podem ser extrapoladas para se tornarem aplicáveis aos seus homólogos no plural, tal como surgem na aplicação; do mesmo modo, as definições de termos no plural podem ser extrapoladas para se tornarem aplicáveis aos seus homólogos no singular, tal como surgem na aplicação.

Agentes de Imagiologia Amilóide [0082] 0 agente de imagiologia amilóide da presente invenção é qualquer composto com a fórmula (I) ou um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis:

Rio R’ Ra *4 em que R', R3-R10, e Y são como acima definidos.

[0083] Os compostos com a fórmula (I), também aqui designados "compostos de benzofurano", "derivados de benzofurano" ou "agentes de imagiologia amilóide" possuem cada uma das seguintes características: (1) ligação especifica à βΑ sintética, in vitro, (2) capacidade para atravessar a barreira hemato-encefálica não comprometida in vivo, (3) ligação especifica a um depósito amilóide que contém, pelo menos, uma proteína amiloidogénica, onde a proteína amiloidogénica é seleccionada do grupo constituído por AL, AH, ATTR, BA2M, AA, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, AFib, ACys, ABri, ADan, APrP, ACal, A1APP, AANF, APro, AIns, AMed, AKer, A(tbn), e ALac (4) ligação à βΑ depositada em placas neuríticas (mas sem difusão), à βΑ depositada no amilóide vascular encefálico, ao amilóide composto pela proteína depositada em emaranhados neurofibrilares (NFT) e (5) são também não-tóxicos em níveis de dosagem apropriados e apresentam uma duração satisfatória do seu efeito.

[0084] Numa modalidade, opcionalmente combinada com qualquer das outras modalidades aqui descritas, Y pode ser H, N02, -NR"3+, F, Cl, Br, I, ou -(CR"2)n-X.

[0085] Numa modalidade, R3-Ri0 podem ser independentemente seleccionados do grupo composto por H, F, Cl, Br, I, N (Rn) 2, e ORn. Em combinação com esta ou qualquer outra modalidade aqui descrita, R8 e R9 podem ser, de modo independente, ORn.

[0086] Noutra modalidade, opcionalmente combinada com 22 outras modalidades aqui descridas, tanto R7 como Ri0 podem ser H. Ainda noutra modalidade, tanto R3, R^ R5 como R6 podem ser H.

[0087] Ainda noutras modalidades da invenção, Y pode ser F, Cl, Br, I, ou -N02. F é um exemplo específico de Y.

[0088] Noutra modalidade, o composto de ligaçao amilóide com a fórmula (I) prevê que cada um dos R3, R4, R5, R6, R7, e Rio sejam H, e Rs e Rg sejam, de modo independente, ORn.

[0089] Outra modalidade prevê que Y contenha, pelo menos, um marcador detectável.

[0090] Os compostos ilustrativos com a fórmula (I) incluem, mas não exclusivamente:

Métodos de utilização [0091] Os compostos da invenção podem ser usados para determinar a presença, localização e/ou quantidade de um ou mais depósitos amilóides num órgão ou zona do corpo de um animal, incluindo o cérebro. 0(s) depósito(s) amilóide(s) engloba(m), sem limitação, o(s) depósito(s) de βΑ Ao permitir o seguimento da sequência temporal da deposição amilóide, os compostos da invenção podem ainda ser utilizados para correlacionar a deposição amilóide com o 23 início dos sintomas clínicos associados à doença, distúrbio ou condição. Os compostos da invenção podem, em última análise, ser utilizados para diagnosticar uma doença, distúrbio ou condição caracterizada pela deposição amilóide como a DA, a DA familiar, o síndrome de Down, a amiloidose, a diabetes mellitus Tipo II, o défice cognitivo ligeiro e a homozigotia para o alelo da apolipoproteína E4. Os compostos da invenção podem também ser utilizados como marcadores de substituição para a avaliação de terapias anti-amiloidose. Técnicas de Imagiologia [0092] Um método desta invenção determina a presença e localização de depósitos amilóides num órgão ou zona do corpo, como o cérebro, de um doente. O método compreende a administração a um doente de uma quantidade detectável de uma composição farmacêutica que contém um composto de ligação amilóide da presente invenção designado por "composto detectável" ou um dos seus sais solúveis em água farmacologicamente aceitáveis. Uma "quantidade detectável" significa que a quantidade de composto detectável administrada é suficiente para possibilitar a detecção da ligação do composto ao amilóide. Uma "quantidade eficaz para imagiologia" significa que a quantidade de composto detectável administrada é suficiente para possibilitar a obtenção de imagens da ligação do composto ao amilóide.

[0093] A invenção emprega agentes de imagem amilóide que, em conjunto com técnicas de neuroimagem não invasivas como a espectroscopia por ressonância magnética (ERM), ressonância magnética (RM) ou a imagiologia gama como a tomografia por emissão de positrões (PET) ou a tomografia computadorizada por emissão de fotão único (SPECT), são utilizadas para quantificar in vivo a deposição amilóide. 0 método envolve a obtenção de imagens de um doente para estabelecer uma linha de base para a deposição amilóide. Para a imagiologia gama, a radiação emitida pelo órgão ou zona do corpo em exame é medida e expressa quer como ligação total quer como a proporção em que a ligação total num tecido é normalizada (por exemplo, dividida por) para a ligação total noutro tecido do mesmo sujeito, durante o mesmo procedimento de obtenção de imagens in vivo. A ligação total in vivo é definida como a totalidade do sinal detectado num tecido através de uma técnica de imagiologia in vivo, sem necessidade de correcção por uma segunda injecção de uma quantidade idêntica do composto marcado, conjugada com um grande excesso de composto não marcado mas que é, de outro modo, quimicamente idêntico. 0 método pode ainda compreender, pelo menos, uma sessão imagiológica de um doente, após administração de uma terapia anti- 24 amiloidose. 0 método pode também incluir a obtenção de imagens de um doente antes e depois do tratamento com, pelo menos, um agente anti-amilóide. A obtenção de imagens pode ser realizada em qualquer momento durante o tratamento.

[0094] Para os efeitos da obtenção de imagens in vivo, o tipo de instrumento de detecção disponível é um importante factor na selecção de um determinado marcador. Por exemplo, podem ser utilizados nos métodos da presente invenção isótopos radioactivos e 19F para a obtenção de imagens in vivo. 0 tipo de instrumento utilizado irá orientar a selecção do radionuclídeo ou isótopo estável: Por exemplo, o radionuclídeo seleccionado deve ter um tipo de degradação detectável por um determinado tipo de instrumento. Outra consideração diz respeito à semivida do radionuclídeo. A semivida deve ser suficientemente longa para que este seja ainda detectável no momento de captação máxima e suficientemente curta para que o hospedeiro não seja sujeito a radiação nociva. Os compostos radiomarcados da invenção podem ser detectados utilizando imagiologia gama, na qual é detectada a irradiação gama emitida no comprimento de onda adequado. Os métodos de imagiologia gama incluem, mas não exclusivamente, SPECT e PET. Numa modalidade, tal como para a detecção SPECT, o radiomarcador seleccionado não terá uma emissão de partículas mas irá produzir um elevado número de fotões num intervalo de 140-200 keV. Para a detecção PET, o radiomarcador seleccionado será um radionuclídeo como o 19F, que se aniquilará para formar dois raios gama com 511 keV, que poderão ser detectados pela câmara PET.

[0095] Na presente invenção, são produzidos compostos de ligação/agentes de imagem para amilóide, úteis para a imagiologia in vivo e quantificação da deposição amilóide. Estes compostos devem ser utilizados em conjunto com técnicas de neuroimagem não invasivas como a espectroscopia (ERM) ou obtenção de imagens por ressonância magnética (1VIRI), tomografia por emissão de positrões (PET) e tomografia computadorizada por emissão de fotão único (SPECT) . De acordo com esta invenção, os compostos de benzofurano podem ser marcados com 19F ou 13C para ERM/RM, através de técnicas gerais de química orgânica conhecidas na área. Ver, por exemplo, ADVANCES ORGANIC CHEMISTRY: REACTION, MECHANISMS, AND STRUCTURE, 3a ed. (1985) . Os compostos de benzofurano podem também ser radiomarcados para PET com 18F, nC, 75Br ou 76Br através de técnicas bem conhecidas na arte, descritas por Fowler, J. e Wolf, A. em POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY 391-450 (Raven Press, 1986). Os compostos de benzofurano podem também ser radiomarcados com 123I para SPECT, através de qualquer uma das diversas técnicas conhecidas na área. Ver, 25 e.g.f Kulkarni, Int. J. Rad. Appl. & Inst. (Part B) 18: 647 (1991). Adicionalmente, os compostos de benzofurano podem ser marcados com qualquer isótopo de iodo radiactivo adequado tal como, mas não exclusivamente, I, I ou I, por iodinação de um derivado amino diazotado, directamente através de diazónio de iodo, ver Greenbaum, F. Am. J. Pharm. 108: 17 (1936), ou por conversão do amino diazotado instável para o triazeno estável, ou por conversão de um percursor halogenado não radioactivo num derivado estável de estanho trialquilo que pode então ser convertido no composto de iodo através de diversos métodos bem conhecidos na arte. Ver, Satyamurthy e Barrio, J. Org. Chem. 48: 4394 (1983), Goodman et al. , J. Org. Chem. 49: 2322 (1984), e Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994: 905; Chumpradit et al. , J. Med. Chem. 34: 877 (1991); Zhuang et al., J. Med Chem. 37: 1406 (1994); Chumpradit et al., J. Med Chem. 37: 4245 (1994). Por exemplo, um derivado estável de estanho triazeno ou trialquilo de benzofurado é colocado em reacção com um agente halogenante contendo 131I, 125I, 123I, 76Br, 75Br, 18F ou 19F. Desse modo, os derivados estáveis de estanho trialquilo de benzofurano são percursores inovadores para a síntese de muitos dos compostos radiomarcados no âmbito da presente invenção. Como tal, estes derivados de estanho trialquilo são considerados uma modalidade desta invenção.

[0096] Os métodos da presente invenção podem utilizar isótopos detectáveis por espectroscopia por ressonância magnética nuclear para efeitos imagiológicos e espectroscópicos in vivo. Os elementos úteis na espectroscopia por ressonância magnética incluem, mas não exclusivamente, 19F e 13C.

[0097] Os radioisótopos adequados aos fins desta invenção podem ser emissores beta, gama, de positrões e de raios X. Estes radioisótopos incluem 131I, 123I, 18F, nC, 75Br e 76Br.

Os isótopos estáveis adequados para utilização em Ressonância Magnética (RM) ou espectroscopia por ressonância magnética (ERM) incluem, de acordo com esta invenção, 19F e 13C.

Os radioisótopos adequados à quantificação in vitro de amilóides em homogenados de tecido proveniente de biópsias ou recolhas post-mortem incluem 125I, 14C e 3H.

Os exemplos de radiomarcadores são nC ou 18F para utilização na imagiologia PET in vivo, 123I para utilização na SPECT, 19F para a ERM/RM e 3H ou 14C para estudos in vitro. Contudo, de acordo com esta invenção, pode ser utilizado qualquer método convencional para a visualização de agentes imagiológicos de diagnóstico.

[0098] De acordo com uma modalidade da invenção que diz 26 respeito a um método de detecção de depósitos amilóides em tecidos provenientes de biópsias ou recolhas post mortem, o método envolve a incubação de tecido fixado em formalina com uma solução de um composto de benzofurano de ligação amilóide da presente invenção. Numa modalidade, a solução é constituída por 25-100% de etanol (sendo o remanescente água), saturada com um composto de benzofurano de ligação amilóide de acordo com a presente invenção. Após a incubação, o composto cora ou marca o depósito amilóide no tecido, podendo o depósito corado ou marcado ser detectado ou visualizado através de qualquer método padrão. Tais meios de detecção incluem técnicas de microscopia tais como a microscopia de campo claro, fluorescência, confocal a laser e de polarização cruzada.

[0099] O método de quantificação da quantidade de amilóide em tecido proveniente de biópsias ou recolhas post mortem envolve a incubação de um derivado de benzofurano marcado consonante com a presente invenção ou de um dos seus sais não tóxicos, solúveis em água, com homogenados de tecido proveniente de biópsias ou recolhas post mortem. O tecido é obtido e homogeneizado através de métodos bem conhecidos na área. Numa modalidade, o marcador é um radiomarcador, apesar de outros marcadores como por exemplo enzimas, compostos quimioluminescentes e imunofluorescentes serem bem conhecidos dos especialistas. Os exemplos de radiomarcadores, incluem, mas não exclusivamente, 125I, 14C e 3H contidos num substituinte substituído num dos compostos com as presentes fórmulas aqui descritas. O tecido que contém depósitos amilóides irá ligar-se aos derivados marcados dos compostos de benzofurano de ligação amilóide da presente invenção. O tecido ligado é então separado do tecido não ligado através de qualquer mecanismo conhecido do especialista, tal como a filtração. O tecido ligado pode depois ser quantificado através de quaisquer meios conhecidos do especialista. As unidades de derivados de benzofurano radiomarcados ligados ao tecido podem então ser convertidas em unidades de amilóide por 100 mg de tecido, por comparação com uma curva padrão gerada através da incubação de quantidades conhecidas de amilóide com o derivado de benzofurano radiomarcado.

[0100] O método para distinguir um cérebro afectado pela doença de Alzheimer de um cérebro normal envolve a obtenção de tecido de um (a) cerebelo e (b) de outra área do mesmo cérebro, que não o cerebelo, de sujeitos com suspeita de estar afectados pela doença de Alzheimer. Esses tecidos são transformados em homogenados separados através da utilização de técnicas bem conhecidas do especialista e depois incubados com um composto de benzofurano de ligação amilóide radiomarcado com a fórmula (I). São, então, 27 calculadas a quantidade de tecido que se liga ao composto de benzofurano de ligação amilóide radiomarcado para cada tipo de tecido (por exemplo, do cerebelo, extra-cerebelo, normal, anormal) e a proporção para a ligação de tecido extra-cerebelo a tecido do cerebelo de doentes normais ou com suspeita de afecção pela doença de Alzheimer. Estas proporções são então comparadas. Se a proporção do cérebro com suspeita de afecção pela doença de Alzheimer for superior em 90% à proporção obtida a partir de um cérebro normal, é feito o diagnóstico de doença de Alzheimer. As proporções normais podem ser obtidas a partir de dados previamente recolhidos ou, alternativamente, ser recalculadas em simultâneo com o estudo do tecido cerebral suspeito.

[0101] A capacidade dos presentes compostos para se ligarem especificamente a emaranhados neurofibrilares sobre placas amilóides é particularmente evidente em concentrações inferiores a 10 nM, que incluem o intervalo de concentração in vivo dos radiomarcadores PET. Nessas concentrações reduzidas, que contêm apenas emaranhados e não placas, a ligação significativa não resulta quando comparada com o tecido cerebral de controlo que não contém placas ou emaranhados. Contudo, a incubação de homogenados de tecido cerebral que contêm sobretudo placas e alguns emaranhados com compostos radiomarcados das fórmulas aqui descritas resulta num aumento significativo na ligação quando comparada com a obtida para o tecido de controlo, sem placas ou emaranhados. Estes dados sugerem que uma das vantagens destes compostos é a sua especificidade para os depósitos de βΑ em concentrações inferiores a 10 nM.

Estas concentrações reduzidas são detectáveis em estudos PET, o que torna possível a detecção PET com utilização de compostos radiomarcados específicos para depósitos βΑ com as fórmulas aqui descritas. A utilização de tais compostos permite a detecção PET em depósitos βΑ, tais como os encontrados nas placas amilóides e no amilóide vascular encefálico. Uma vez que foi reportado um aumento dos níveis βΑ no córtex frontal que antecede a formação de emaranhados poderia depreender-se que os compostos radiomarcados da presente invenção, utilizados como detectores PET, seriam específicos para as primeiras alterações no córtex DA. Naslund et al., JAMA 283: 1571 (2000). Método e uso na detecção in vivo do(s) depósito(s) amilóide(s) [0102] Conforme acima mencionado, a invenção fornece ainda, numa modalidade, um composto com a fórmula (I) para utilização num método para a detecção in vivo do(s) depósito(s) amilóide(s), que engloba: 28 (i) a administração a um animal de uma quantidade eficaz do composto de acordo com a fórmula (I), em que o composto se ligaria a quaisquer depósitos amilóides no animal; e (ii) a detecção da ligação do composto ao(s) depósito(s) amilóide(s) no animal.

[0103] Depois de ter decorrido tempo suficiente para a ligação do composto ao(s) depósito(s) amilóide(s), por exemplo, entre 30 minutos e 48 horas após administração, a ligação pode ser detectada através de quaisquer meios conhecidos na arte. Os exemplos de meios de detecção incluem, mas não exclusivamente, ensaios (tais como o ensaio imunométrico, calorimétrico, densitométrico, espectrográfico e cromatográfico), tecnologia de neuro-imagem não invasiva (tal como a espectroscopia por ressonância magnética (ERM), ressonância magnética (RM)) e técnicas imagiológicas gama como a tomografia computadorizada por emissão de fotão único (SPECT) e a tomografia por emissão de positrões (PET). Para a imagiologia gama, a radiação emitida pelo órgão ou zona do corpo em exame é medida e expressa quer como ligação total quer como a proporção em que a ligação total num tecido é normalizada (por exemplo, dividida por) para a ligação total noutro tecido do mesmo sujeito, durante o mesmo procedimento de obtenção de imagens in vivo. A ligação total in vivo é definida como a totalidade do sinal detectado num tecido através de uma técnica de imagiologia in vivo, sem necessidade de correcção por uma segunda injecção de uma quantidade idêntica do composto marcado, conjugada com um grande excesso de composto não marcado mas que é, de outro modo, quimicamente idêntico.

[0104] 0 tipo de instrumento de detecção disponível pode ser um factor na selecção do halo radioactivo ou isótopo de carbono. Por exemplo, o radioisótopo seleccionado deverá ter um tipo de degradação detectável por um determinado instrumento. Outra consideração diz respeito à semivida do radioisótopo. A semivida deve ser suficientemente longa para que o radioisótopo seja detectável no momento de absorção máxima pelo alvo mas suficientemente curta para que o hospedeiro não tenha de ser sujeito a radiação prejudicial. Para a detecção SPECT, o radioisótopo pode não emitir partículas podendo, contudo, produzir um elevado número de fotões no intervalo de 140-200 keV. Para a detecção PET, o radioisótopo seleccionado pode ser um radioisótopo emissor de positrões, que se aniquila para formar dois raios gama de 511 keV detectáveis através de uma câmara PET. 29 [0105] Os radioisótopos úteis incluem, sem limitaçao: 125I, 14C e 3H para quantificação in vitro de amilóides em tecidos provenientes de biópsias ou recolhas post mortem; Ce F para imagiologia PET m vivo; I para imagiologia SPECT; 18F para ERM/RM; 3H ou 14C para estudos in vitro; e 18F e 13C para espectrocopia por ressonância magnética. Numa modalidade, a detecção é efectuada por imagiologia gama, ressonância magnética ou espectroscopia por ressonância magnética. Noutra modalidade, a imagiologia gama é PET ou SPECT. Método e uso na detecção in vitro do(s) depósito (s) amilóide (s) [0106] Esta invenção fornece ainda um método para a detecção in vitro de depósito(s) amilóide(s), que compreende: (i) o contacto entre um tecido corporal e uma quantidade eficaz de um composto com a fórmula (I), onde o composto ligaria quaisquer depósitos amilóides no tecido; e (ii) a detecção da ligação do composto ao(s) depósito(s) amilóide(s) no tecido.

[0107] A ligação pode ser detectada através de quaisquer meios conhecidos na arte. Os exemplos de meios de detecção incluem, sem limitação, técnicas de microscopia tais como a microscopia de campo claro, fluorescência, confocal a laser e de polarização cruzada.

[0108] Numa modalidade, o tecido é tecido proveniente de biópsias ou recolhas post mortem que é fixado em formalina ou congelado a fresco. Noutra modalidade, o tecido é homogeneizado. Ainda noutra modalidade, o composto da invenção está numa solução que contém ainda 25-99% de etanol, sendo o remanescente da solução constituído por água. Ainda noutra modalidade, a solução inclui 0-50% de etanol e entre 0,0001 e 100 μΜ do composto. Ainda noutra modalidade, o método pode ainda compreender (iii) a separação do tecido do(s) depósito(s) amilóide(s) ligado(s) ao composto; e (iv) a quantificação do(s) depósito(s) amilóide(s) ligado(s) ao composto da invenção. 0(s) depósito(s) amilóide(s) ligado(s) pode(m) ser separado(s) do tecido através de qualquer método conhecido na arte, tal como a filtração. A quantidade de depósito(s) amilóide(s) ligado(s) pode ser convertida em unidades de pg de depósito(s) amilóide(s) por 100 mg de tecido por comparação a uma curva padrão, gerada através da incubação de quantidades conhecidas de amilóide com o composto ou sal, 30 hidrato, solvato ou pró-fármaco farmacologicamente aceitáveis da invenção. Método e uso para distinção entre um cérebro afectado pela doença de Alzheimer e vim cérebro normal [0109] Esta invenção fornece ainda um composto com a fórmula (I) para utilização num método para a distinção entre um cérebro afectado pela doença de Alzheimer e um cérebro normal, que envolve: (i) a obtenção de tecidos do (a) cerebelo e (b) outra secção do mesmo cérebro, de um animal normal e de um animal com suspeita de estar afectado pela doença de

Alzheimer; (ii) o contacto dos tecidos com o composto de acordo com a fórmula (I) ; (iii) a quantificação do amilóide ligado ao composto; (iv) o cálculo da proporção entre a quantidade de amilóide numa área do cérebro que não o cerebelo e a quantidade de amilóide no cerebelo; (v) a comparação entre a proporção obtida para um animal normal e a proporção obtida para um animal com suspeita de estar afectado pela doença de Alzheimer.

[0110] Um diagnóstico da doença de Alzheimer pode ser feito se a proporção obtida para um animal com suspeita de afecção pela doença de Alzheimer for, por exemplo, superior em 90% relativamente à proporção obtida para um animal normal. Para este método, um animal "normal" é um animal que não sofre da doença de Alzheimer.

Administração e composições farmacêuticas [0111] De acordo com a presente invenção, uma composição farmacêutica que contém um agente de imagem amilóide com a fórmula (I) pode ser administrado em sujeitos para quem são antecipadas as formações de amilóide ou de fibrila amilóide, por exemplo, doentes com diagnóstico clínico da doença de Alzheimer ou de outra doença associada à deposição amilóide.

[0112] A administração ao sujeito pode ser local ou sistémica e conseguida, por exemplo, por via intravenosa, intra-arterial, intratecal (através do fluido espinal) ou similares. A administração pode também ser intradérmica ou intracavitária, dependendo da zona do corpo em análise. 31

Depois de ter decorrido tempo suficiente para a efectivação da ligação do composto ao amilóide, por exemplo de 30 minutos a 48 horas, a zona do sujeito sob investigação é examinada através de técnicas imagiológicas de rotina tais como a ERM/RM, SPECT, imagiologia de cintilação planar, PET assim como através de quaisquer técnicas imagiológicas emergentes. O protocolo exacto irá necessariamente variar de acordo com factores específicos ao doente, como acima mencionado, e dependendo da zona do corpo a ser examinada, do método de administração e do marcador utilizado; a determinação dos procedimentos específicos deverá ser rotineira para o especialista. Para a imagiologia cerebral, como exemplo, a quantidade (de ligação total ou específica) do composto de benzofurano marcado radioactivamente ou análogo da presente invenção é medida e comparada (como uma proporção) com a quantidade de composto de benzofurano marcado ligado ao cerebelo do doente. Esta proporção é então comparada com a mesma proporção num cérebro normal emparelhado pela idade. Para a obtenção de imagens de órgãos, noutro exemplo, a quantidade (de ligação total ou específica) do derivado de tioflavina marcado radioactivamente ou análogo da presente invenção é medida e comparada (como uma proporção) com a quantidade de derivado de tioflavina marcado ligado ao órgão do doente. Esta proporção é então comparada com a mesma proporção num órgão normal emparelhado pela idade.

[0113] Os agentes de imagem amilóide da presente invenção podem ser administrados na forma de composições injectáveis, como acima mencionado, mas podem também ser formulados em sistemas de administração de fármacos bem conhecidos (por exemplo, sistemas de administração oral, rectal, parentérica (intravenosa, intramuscular, ou subcutânea), intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local (pós, pomadas ou gotas) ou como uma pulverização nasal ou bucal) . Uma composição típica para esse efeito inclui um veículo farmacologicamente aceitável. Por exemplo, a composição pode conter cerca de 10 mg de albumina sérica humana e cerca de 0,5 a 500 microgramas do composto de benzofurano marcado por mililitro de tampão fosfato, contendo NaCl. Outros veículos farmacologicamente aceitáveis incluem soluções aquosas, excipientes não tóxicos, incluindo sais, conservantes, tampões e similares como descrito, por exemplo, na publicação REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15th Ed. Easton: Mack Publishing Co. pp. 1405-1412 e 1461-1487 (1975) e THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14the Ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975).

[0114] Os exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleo vegetal e ésteres 32 orgânicos injectáveis como o oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, soluções salinas, veículos parentéricos como o cloreto de sódio, dextrose de Ringer, etc. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e de nutrientes. Os conservantes incluem agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelatantes e gases inertes. 0 pH e a concentração exacta dos vários componentes da composição farmacêutica são ajustados em conformidade com os procedimentos de rotina na área. Ver, THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7a Ed.) de Goodman e Gilman.

[0115] O protocolo de digitalizaçao PET pode incluir uma digitalização de corpo inteiro (que abrange da cabeça até à pélvis), completada 15-60 minutos após a administração da injecção do radiofármaco, ou uma digitalização sobre uma zona específica do corpo (por exemplo, coração, pulmões, fígado, rins). Este protocolo de digitalização é análogo ao de uma digitalização oncológica PET de corpo inteiro ou direccionada a uma zona específica do corpo, realizada com [F-18]2-fluoro-2-deoxiglicose (FDG). Isto é, o radiofármaco específico para amilóide é injectado por via intravenosa, é alocado o tempo para a distribuição do radiomarcador pelo corpo, absorção do radiomarcador pelo(s) órgão(s) de interesse e para a sua depuração do sangue e de outros órgãos em que o amilóide não está presente, sendo realizada uma digitalização de 20-40 minutos sobre todo o corpo ou sobre uma zona específica do corpo para obter imagens do radiomarcador ligado ao amilóide. Adicionalmente, a(s) digitalização(ões) pode(m) ser utilizada(s) imediatamente após a amostragem directa da(s) biópsia (s) de tecido digitalizado(s).

[0116] Geralmente, a dosagem do composto detectável de benzofurano marcado de acordo com a fórmula (I) irá variar tomando em consideração factores como a idade, condição, sexo e desenvolvimento da doença no doente, contra-indicações, se existirem, terapias concomitantes e outras variáveis a serem ajustadas pelo médico especialista. Os níveis de dosagem na ordem de cerca de 0,001 pg/kg/dia a cerca de 10.000 mg/kg/dia de um composto da invenção são úteis nos métodos da mesma. Numa modalidade, o nível de dosagem é de cerca de 0,001 pg/kg/dia a cerca de 10 pg/kg/dia. Noutra modalidade, o nível de dosagem é de cerca de 0,01 pg/kg/dia a cerca de 1,0 pg/kg/dia. Ainda noutra modalidade, o nível de dosagem é de cerca de 0,1 mg/kg/dia a cerca de 100 mg/kg/dia.

[0117] O nível de dosagem específico para qualquer doente em particular irá variar de acordo com diversos factores, incluindo a actividade e possível toxicidade do composto 33 específico empregue, idade, peso corporal, estado de saúde geral, sexo e tipo de dieta do doente, momento da administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, e forma de administração. Tipicamente, os resultados in vitro para a relação dosagem-efeito fornecem orientações úteis acerca das doses adequadas para administração ao doente. São também úteis os estudos em modelos animais. As considerações para a determinação dos níveis de dosagem apropriados são conhecidas na arte e fazem parte das competências de qualquer médico.

[0118] Pode ser utilizado qualquer regime de administração conhecido para regular o momento e a sequência da administração do fármaco para realizar o tratamento nos métodos da invenção. O regime pode incluir pré-tratamento e/o co-administração com agente(s) terapêutico (s) adicional(is).

[0119] Numa modalidade, os compostos de acordo com a fórmula (I) são administrados a um animal sob suspeita de ter ou em risco de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição que se caracteriza pela deposição amilóide. Por exemplo, o animal pode ser um humano idoso.

[0120] Noutra modalidade, os compostos da invenção ligam-se à βΑ com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 0,0001 μΜ a cerca de 10,0 μΜ, quando medida pela ligação ao péptido βΑ sintético ou a tecido cerebral com DA.

[0121] Esta invenção fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende: (i) uma quantidade eficaz de pelo menos um composto da invenção; e (ii) um veículo farmacologicamente aceitável.

[0122] A composição pode incluir um ou mais ingredientes farmacologicamente aceitáveis incluindo, mas não exclusivamente, um ou mais agentes humidificadores, agentes tampão, agentes de suspensão, agentes lubrificantes, emulsionantes, desintegrantes, absorventes, conservantes, surfactantes, corantes, aromatizantes, edulcorantes e agentes terapêuticos.

[0123] A composição pode ser formulada sob a forma de um sólido, líquido, gel ou suspensão para: (1) administração oral como, por exemplo, uma aspersão (solução ou suspensão aquosa ou não aquosa), comprimido (direccionado, por exemplo, à absorção bucal, sublingual ou sistémica), bólus, pó, grânulo, pasta para aplicação lingual, cápsula 34 gelatinosa rígida, cápsula gelatinosa mole, pulverização oral, emulsão e microemulsão; (2) administração parentérica por injecção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo, uma solução, suspensão ou formulação de libertação prolongada estéreis; (3) aplicação tópica como, por exemplo, um creme, pomada, adesivo de libertação prolongada ou pulverização aplicada sobre a pele; (4) administração intravaginal ou rectal como, por exemplo, um pessário, creme ou espuma; (5) administração sublingual; (6) administração ocular; (7) administração transdérmica; ou (8) administração nasal.

[0124] Numa modalidade, a composição pode ser formulada para administração intravenosa e o veículo inclui um repositor de fluidos e/ou nutrientes. Noutra modalidade, a composição é capaz de se ligar especificamente ao amilóide in vivo, é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica, é não tóxica em níveis de dosagem adequados e/ou tem um tempo de actuação satisfatório. Ainda noutra modalidade, a composição contém cerca de 10 mg de albumina sérica humana e cerca de 0,5 a 500 mg do composto da invenção por mililitro de tampão fosfato, contendo NaCl.

[0125] Adicionalmente, os presentes compostos de benzofurano podem ser utilizados para determinar a eficácia da terapia no tratamento da amiloidose. O método envolve a utilização de imagiologia amilóide como um marcador de substituição. Os marcadores de substituição são um tipo especial de biomarcador que pode ser utilizado como critério clínico, em substituição das medições clínicas, para efeitos de aprovação de fármacos. Por exemplo, a medição dos níveis de colesterol é agora aceite como um marcador de substituição para a aterosclerose. A presente invenção envolve a utilização da imagiologia amilóide como um marcador de substituição para a eficácia das terapias anti-amiloidose.

[0126] 0 presente método fornece um meio de avaliação do sucesso de terapias anti-amiloidose. Nalgumas modalidades, o presente método fornece um meio para a avaliação do sucesso clínico das terapias anti-amiloidose. Nalgumas modalidades, o método pode ser utilizado para avaliar o sucesso clínico em sujeitos com disfunção ligeira, com poucos ou nenhuns sintomas para acompanhar. 0 método básico para determinar a eficácia da terapia no tratamento da amiloidose envolve: (A) a administração de uma quantidade eficaz do composto com a fórmula (I) ou de um sal farmacologicamente aceitável, conforme acima descrito, a um doente com necessidade disso; 35 (B) a obtenção de imagens do referido doente; e, então (C) a administração de pelo menos um agente anti-amilóide ao referido doente em necessidade deste; (D) subsequentemente, a administração de uma quantidade eficaz de um composto com a fórmula (I) ao referido doente em necessidade deste; (E) a obtenção de imagens do referido doente; e (F) a comparação entre os níveis de deposição amilóide no referido doente antes do tratamento com, pelo menos, um agente anti-amilóide e os níveis de deposição amilóide no referido doente após tratamento com, pelo menos, um agente anti-amilóide.

Terapias anti-amiloidose e utilizações [0127] Outra modalidade da invenção é um método para determinar a eficácia da terapia no tratamento da amiloidose num doente com necessidade da mesma. 0 método envolve a administração de um composto com a fórmula (I) e, em seguida, a obtenção de imagens do doente. Após a obtenção de imagens, é administrado ao doente pelo menos um agente/terapia anti-amiloidose. A quantidade administrada, a via de administração e a duração da terapia são determinadas por um especialista na área com base na idade, peso e condição do doente. Tais determinações encontram-se dentro das competências do especialista. As quantidades adequadas incluem, não exclusivamente, as doses entre 0,01 e 100 mg/kg. As vias de administração adequadas incluem, não exclusivamente, a oral, subcutânea e a intravenosa. As durações adequadas para a terapia incluem, não exclusivamente, entre uma dose única e a administração por período indeterminado de quatro doses diárias. Os momentos adequados para a obtenção de imagens incluem, não exclusivamente, o momento imediatamente após a primeira dose e um período de até 10 anos após a administração da dose mais recente. Os exemplos de momentos para a obtenção de imagens incluem, não exclusivamente, um período entre 7 dias e 6 meses após a administração da dose mais recente.

[0128] Um "agente anti-amilóide" ou uma "terapia anti- amiloidose" é qualquer agente ou combinação de agentes que trata ou previne a amiloidose. Os exemplos de doenças associadas à deposição amilóide, amiloidose, incluem doença de Alzheimer, síndrome de Down, diabetes mellitus tipo 2, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (holandesa), amiloidose por amilóide A (reactiva), amiloidose secundária, défice cognitivo ligeiro (DCL), febre 36 mediterrânica familiar, neuropatia amilóide familiar com urticária e surdez (sindrome de Muckle-wells) , Αβ2Μ (hemodiálise crónica) com cadeias leves lambda ou kappa (idiopática ou associada a mieloma ou macroglobulinemia), ATTR (polineuropatia amilóide familiar (Portuguesa, Japonesa, Sueca)), cardiomiopatia amilóide familiar (Dinamarquesa), amiloidose por amilóide cardíaco isolado, amiloidose sistémica senil, amilina ou polipeptídeo amilóide dos ilhéus pancreáticos (AIAPP) ou insulinoma, factor natriurético auricular (amilóide auricular isolado), procalcitonina (carcinoma medular da tiróide), gelsolina (amiloidose familiar (finlandesa)), cistatina (hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (islandesa)), Apolipoproteína A (AApo-A-I) (polineuropatia amiloidótica familiar - Iowa), Apolipoproteína AII (senescência acelerada em ratos), amilóide associado ao fibrinogéneo; Asor ou Pr P-27 (tremor epizoótico, doença de Creutzfeld-Jacob, sindrome de Gerstmann-Strâussler-Scheinker, encefalopatia espongiforme bovina) ou nos casos de pessoas com homozigotia para o alelo da apolipoproteína E4 e da condição associada à homozigotia para o alelo da apolipoproteína E4 ou da doença de Huntington. A invenção inclui doenças associadas à deposição de placas amilóides. Numa modalidade, a doença associada à deposição amilóide é a DA.

[0129] Os presentes benzofuranos de acordo com a fórmula (I) podem ser utilizados na imagiologia amilóide, servindo como um marcador de substituição da eficácia da terapia anti-amiloidose. A administração de um agente de imagiologia amilóide para o estabelecimento de uma linha de base para a deposição amilóide e a subsequente obtenção de imagens de um doente, antes e depois do tratamento com um agente anti-amilóide, permitem a determinação da eficácia da terapia anti-amiloidose. 0 método pode ser utilizado para determinar a eficácia de qualquer tratamento anti-amilóide, uma vez que a administração de um agente de imagiologia amilóide e a obtenção de imagens do doente podem ser realizadas antes e depois de qualquer terapia anti-amiloidose. 0 método contempla a determinação das terapias anti-amiloidose ineficazes para o tratamento de doenças associadas à deposição amilóide, assim como das terapias anti-amiloidose eficazes para o tratamento de doenças associadas à deposição amilóide. Um especialista de habilidade comum na área pode determinar as condições e dosagens da terapia anti-amiloidose, de acordo com os protocolos apropriados. Assim, a presente invenção contempla a determinação da eficácia das terapias anti-amiloidose que são actualmente conhecidas, assim como das terapias que ainda não foram descobertas. Os exemplos não 37 limitativos de terapias anti-amiloidose são descritos abaixo.

[0130] Nalgumas modalidades, pode ser determinada a eficácia dos inibidores da acetilcolinesterase através do presente método. A terapia da acetilcolinesterase é baseada em estudos de padrões de degeneração na DA, que identificaram reduções substanciais entre os grupos de neurónios no prosencéfalo basal. Todas estas células utilizaram o transmissor acetilcolina e a sua perda significou que estava a ser libertada menos acetilcolina nos seus terminais no córtex. Foram desenvolvidos vários fármacos, tais como tacrina, donepezilo, rivastigmina e galantamina com base nestas conclusões e coloca-se a hipótese de que estes funcionem por inibição da enzima acetilcolinesterase (Ingram, V., American Scientist, 2003, 91 (4) :312-321) .

[0131] Noutras modalidades, a eficácia da terapia anti- amiloidose direccionada às enzimas responsáveis pela formação de fragmentos nocivos da proteína precursora amilóide (PPA) no tratamento da amiloidose é determinada pelos compostos da invenção de acordo com a metodologia descrita. Nalgumas modalidades, os fragmentos nocivos da proteína precursora amilóide (PPA) são péptidos βΑ anormalmente configurados. Por exemplo, a sobreprodução do fragmento βΑ1-42 é considerada por alguns cientistas como uma das principais causas da DA. O fragmento βΑ1-42 é formado pela clivagem da PPA pela enzima β-secretase (BACE1) (que produz o terminal amino) e pela enzima γ-secretase (que cliva o terminal carboxil da PPA). Os inibidores destas enzimas secretase podem ser utilizados como terapia anti-amiloidose (Ingram, V., American Scientist, 2003, 91(4):312-321).

[0132] Nalgumas modalidades, a eficácia das estratégias imunoterapêuticas no tratamento da amiloidose pode ser determinada através do presente método. A imunoterapia funciona utilizando o sistema imunitário do doente para localizar e destruir placas amilóides, e os cientistas têm estado a utilizar activamente numerosas estratégias imunoterapêuticas. As estratégias imunoterapêuticas podem ser passivas ou activas. Por exemplo, na imunoterapia activa, um doente pode receber uma injecção ou aplicação por pulverização nasal do péptido βΑ, que produz uma resposta imune anti-amilóide. Por outro lado, a terapia passiva pode envolver o contorno da proteína beta-amilóide, utilizando em sua substituição o anti-soro produzido em resposta à beta-amilóide. A imunoterapia que envolve anticorpos contra o péptido βΑ tem sido estudada para o tratamento da DA. Por exemplo, AN-1792 é uma preparação de 38 beta-amilóide pré-agregada sintética (βΑ; comprimento 1-42) em conjunto com o adjuvante QS-21 (Hock, C. et al., 2003, Neuron, 38:547-554). Foram tratados com esta preparação aproximadamente 300 doentes com DA até à suspensão do ensaio clinico, causada pelos efeitos secundários (Birmingham, K. and Frantz, S., 2002, Nature Medicine, 8:199-200) .

[0133] Noutras modalidades, a eficácia das estratégias neuroprotectoras no tratamento da amiloidose é determinada pelo presente método. Por exemplo, muitos clínicos recomendam que os doentes tomem doses elevadas (1000-2000 IU/dia) de vitamina E. Foram sugeridos outros tipos de estratégias neuroprotectoras para o tratamento da amiloidose como doses elevadas de vitamina C, modeladores do canal de cálcio, eliminadores de radicais livres e quelantes de iões metálicos. (Selkoe et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2003, 43:545-84).

[0134] Nalgumas modalidades, a eficácia das estratégias com fármacos anti-inflamatórios (AINEs) no tratamento da amiloidose é determinada pelo presente método. Os tratamentos que envolvem AINEs baseiam-se em indícios de que uma resposta celular inflamatória no córtex é desencadeada pela acumulação progressiva do péptido βΑ. Os exemplos de fármacos anti-inflamatórios são prednisona, inibidores não específicos da ciclooxigenase e os inibidores da ciclooxigenase-2. (Clark, M., et al., Annals of Internai Medicine, 2003, 138(5):400-410; e Hardy, John, Annu. Rev. Med., 2004, 55:15-25).

[0135] Nalgumas modalidades, o presente método pode determinar a eficácia das terapias de redução do colesterol incluindo, não exclusivamente, os inibidores da coenzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductase (estatinas). Os tratamentos que envolvem fármacos redutores do colesterol (tais como as estatinas) têm base em indícios epidemiológicos de que os doentes tratados com estatinas têm uma incidência inferior da DA e de que as estatinas podem alterar o metabolismo da βΑ para reduzir os seus níveis de βΑ (Wolozin,B (2002) Cholesterol and Alzheimer's disease. Biochemical Society Transactions. 30:525-529). Os exemplos de fármacos de estatina redutores do colesterol incluem lovastatina, pravastatina, rosuvastatina, fluvastatina, atorvastatina e sinvastatina. Outros fármacos redutores do colesterol incluem niacina, colestiramina, fenofibrato, colesevelam e ezetimiba.

[0136] Noutras modalidades, a eficácia das moléculas de pequenas dimensões que eliminam a neurotoxicidade do fragmento βΑ1-42 agregado no tratamento da amiloidose é 39 determinada pelo presente método. Tal fármaco, quando administrado numa fase precoce da doença, por exemplo, "desintoxicaria" o péptido βΑ com acumulação gradual, antes de ser infligido qualquer dano permanente aos neurónios. (Clark, M., et al., Annals of Internai Medicine, 2003, 138 (5) :400-410) [0137] Nalgumas modalidades, a eficácia dos "péptidos chamariz" no tratamento da amiloidose é determinada pelo presente método. Os péptidos chamariz são moléculas de pequenas dimensões que se ligam ao péptido agregador βΑ1-42 e o forçam a assumir uma estrutura não tóxica. Exemplos de péptidos chamariz são péptidos de pequenas dimensões (com um comprimento de 5, 6 ou 9 aminoácidos), seleccionados entre bibliotecas extensas de fragmentos proteicos pela sua capacidade para formar uma associação firme com ο βΑ1-42 marcado. (Clark, M., et al., Annals of Internai Medicine, 2003, 138 (5) :400-410) .

[0138] Noutras modalidades, a eficácia da modulação da homeostase do colesterol no tratamento da amiloidose é determinada pelo presente método. A utilização crónica de fármacos redutores do colesterol foi recentemente associada a uma menor incidência da DA. Paralelamente, foi demonstrado que as dietas ricas em colesterol provocam um aumento da patologia βΑ em animais e que os fármacos redutores do colesterol reduzem a patologia em ratos transgénicos PPA. Estão em curso ensaios clínicos para estudar o efeito da modulação da homeostase do colesterol no tratamento da DA. (Hardy, John, Annu. Rev. Med., 2004, 55:15-25).

[0139] Acredita-se que certos anticorpos como o designado por m266 (DeMattos, RB, Bales, KR, Cummins, DJ, Dodart, JC, Paul, SM, Holtzman, DM (2001) "Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mouse model of Alzheimer's disease" Proc.Natl.Acad.Sei.USA 98:8850-8855) ou moléculas, que não anticorpos, (Matsuoka, Y, Saito, M, LaFrancois, J, Saito, M, Gaynor, K, Olm, V, Wang, L, Casey, E, Lu, Y, Shiratori, C, Lemere, C, Duff, K (2001) "Novel therapeutic approach for the treatment of Alzheimer's disease by peripheral administration of agents with an affinity to beta-amyloid" Journal of Neuroscience, 23:29-33) reduzem o amilóide cerebral por ligação com péptidos βΑ no sangue criando, dessa forma, uma "redução periférica" e o desvio do equilíbrio de βΑ do cérebro até ao sangue, onde pode ser eliminado do corpo. Tais agentes são aqui referidos como "agentes de redução periférica". 40

Avaliação da eficácia da terapia anti-amiloidose [0140] A metodologia que emprega benzofuranos de acordo com a fórmula (I) para determinar a eficácia da terapia no tratamento da amiloidose compreende a administração de um composto com a fórmula (I) a um doente com necessidade deste e a obtenção de imagens do doente. Após a obtenção de imagens, é administrado ao doente pelo menos um agente anti-amilóide. Em seguida, é administrada ao doente uma quantidade eficaz de um composto com a fórmula (I) e o doente é novamente sujeito a imagiologia. Finalmente, são comparados os níveis de base de deposição amilóide do doente antes do tratamento com o agente anti-amilóide com os níveis de deposição amilóide apresentados pelo doente após o tratamento com o agente anti-amilóide. Tal comparação encontram-se dentro das competências de um especialista qualificado.

[0141] Nalgumas modalidades, os níveis de deposição amilóide no doente antes do tratamento com o agente anti-amilóide serão mais elevados do que os níveis de deposição amilóide no doente após o tratamento com o agente anti-amilóide. Tal resultado indica que o agente/terapia anti-amiloidose é eficaz no tratamento de doenças associadas à deposição amilóide.

[0142] Por exemplo, AN-1792 é uma preparação de beta-amilóide pré-agregada sintética (βΑ; comprimento 1-42) em conjunto com o adjuvante QS-21. Foram tratados com esta preparação aproximadamente 300 doentes com DA até à suspensão do ensaio clínico, causada pelos efeitos secundários (Birmingham, K. and Frantz, S., 2002, Nature

Medicine, 8:199-200). Apesar deste revés, o optimismo em volta desta abordagem foi levantado por duas constatações. Primeiro, a existência de vários resultados invulgares no único relatório de autópsia publicado relativamente a um doente de DA tratado com AN-1792, incluindo: (i) áreas extensas do neocórtex com muito poucas placas βΑ; (ii) áreas do córtex totalmente desprovidas de placas Αβ que continham densidades de emaranhados, filamentos do neurópilo e angiopatia amilóide cerebral (AAC) semelhantes à da DA não imunizada mas que não apresentavam neurites distróficas associadas a placas e agrupamentos de astrócitos; (iii) a imunorreactividade da βΑ estava associada à micróglia em algumas regiões do cérebro desprovidas de placas (Nicoll, J. et al., 2003, Nature

Medicine 9:448-452). Segundo, num pequeno subconjunto de 30 doentes tratados com AN-1792, aqueles que geraram anticorpos anti-βΑ, como determinado por um ensaio de imunorreatividade das placas amilóides (TAPIR), apresentaram taxas de declínio das funções cognitivas e de 41 actividades da vida diária substancialmente inferiores, como indicado pelos testes Mini Mental State Examination, Disability Assessment for Dementia e Visual Paired Associates de evocação tardia da Wechsler Memory Scale, quando comparados com doentes sem tais anticorpos (Hock, C. et al., 2003, Neuron, 38:547-554).

[0143] Noutra modalidade, a invenção contempla a administração de compostos de acordo com a fórmula (I) a um doente num método de imagiologia de depósitos amilóides em cérebros de doentes que não preenchem os critérios clínicos para o diagnóstico da DA. Estes incluem, não exclusivamente, doentes que apresentam sinais clínicos de demência ou doentes com uma disfunção cognitiva moderada, tais como, por exemplo, os doentes que apresentam um transtorno demencial de etiologia questionável, onde os dados de imagiologia amilóide revelam que determinados depósitos amilóides são um sintoma premonitório da DA ou de outro distúrbio caracterizado pela deposição amilóide.

[0144] Outra modalidade da presente invenção é um método de identificação de um doente como prodrómico do diagnóstico clínico padrão de uma doença caracterizada pela deposição amilóide. O método compreende a utilização de agentes de imagiologia amilóide para a obtenção de dados quantitativos e qualitativos de um doente. De acordo com a presente invenção, a imagiologia amilóide quantitativa e qualitativa deveria permitir um diagnóstico mais precoce e exacto de doenças caracterizadas pelo depósito amilóide e deveria auxiliar no desenvolvimento de terapias anti-amiloidose. O doente alvo para esta metodologia pode ser um doente que apresenta sinais de demência clínica ou um doente que apresenta sinais clínicos de défice cognitivo ligeiro.

[0145] De acordo com a prática convencional, o especialista pode aplicar diferentes critérios para a determinação de sinais de demência clínica. Tais critérios incluem, não exclusivamente, os do DSM-III (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 3a edição), ADDTC (Alzheimer's Disease Diagnostic and Treatment Center), ICD-10 (International Statistical Classification of Diseases, 10a revisão), NINDS-AIREN (National Institute of Neurological Disorders and Stroke-Association Internationale pour la Recherche et 1'Enseignment en Neurosciences) e os do DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4a Edição). Ver Pohjasvaara et al., Stroke 31: 2952-57 (2000).

[0146] A caracterizaçao clínica de um doente como portador de défice cognitivo ligeiro é da competência do especialista. A análise de um doente para a elucidação de tal condição envolve a realização de uma série de testes 42 psicológicos. Os métodos para o diagnóstico clinico encontram-se amplamente revistos e são discutidos, por exemplo, em Petersen et ai., Arch. Neurol. 56: 303-08 (1999) .

[0147] Apenas com base em testes clínicos, os sujeitos identificados com DCL podem ser convertidos num diagnóstico de DA (numa proporção de cerca de 10-15% por ano), permanecer com DCL ou reverter para um diagnóstico de normalidade (10-15% por ano). Larrieu et al., Neurology 59: 1594-99 (1926). Assim, existe uma considerável incerteza de prognóstico associada a este diagnóstico clínico. A possibilidade de identificar a presença ou ausência de deposição amilóide cerebral num sujeito com diagnóstico clínico de DCM tem o potencial de aumentar significativamente a precisão do prognóstico quanto à conversão para DA.

[0148] A categoria de doenças associadas à deposição amilóide inclui, não exclusivamente, doença de Alzheimer, síndrome de Down, diabetes mellitus tipo 2, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (holandesa) , amiloidose por amilóide A (reactiva), amiloidose secundária, febre mediterrânica familiar, neuropatia amilóide familiar com urticária e surdez (síndrome de Muckle-wells), Αβ2Μ (hemodiálise crónica) com cadeias leves lambda ou kappa (idiopática ou associada a macroglobulinemina ou mieloma), ATTR (polineuropatia amilóide familiar (portuguesa, japonesa, sueca)), cardiomiopatia amilóide familiar (dinamarquesa), amiloidose por amilóide cardíaco isolado, amiloidose sistémica senil, amilina ou polipeptídeo amilóide dos ilhéus pancreáticos (AIAPP) ou insulinoma, factor natriurético auricular (amilóide auricular isolado), procalcitonina (carcinoma medular da tiróide), gelsolina (amiloidose familiar (finlandesa)), cistatina C (hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (islandesa)), Apolipoproteína A (AApo-A-I) (polineuropatia amiloidótica familiar - Iowa), Apolipoproteína AII (senescência acelerada em ratos), amilóide associado ao fibrinogéneo; Asor ou Pr P-27 (tremor epizoótico, doença de Creutzfeld-Jacob, síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, encefalopatia espongiforme bovina), ou nos casos de pessoas com homozigotia para o alelo da apolipoproteína E4 e da condição associada à homozigotia para o alelo da apolipoproteína E4 ou da doença de Huntington. Numa modalidade, a doença associada à deposição amilóide é uma doença caracterizada pela deposição de placas amilóides. Uma doença específica associada à deposição amilóide é a DA.

[0149] De acordo com a invenção, uma metodologia básica 43 para a identificação de um doente como prodrómico para uma doença caracterizada pela deposição amilóide implica: (A) a administração de uma quantidade eficaz do composto com a fórmula I acima descrito ou de um seu sal farmacologicamente aceitável ao doente, que apresenta sinais de demência clínica ou sinais clínicos de défice cognitivo ligeiro e tem necessidade de tal. (B) a obtenção de imagens do referido doente e (C) a análise dos dados mencionados para averiguar os níveis de amilóide no doente, com referência a um doente normativo.

[0150] Uma modalidade diz respeito a um método para o diagnóstico de um doente que apresenta um quadro de demência de etiologia questionável. Este método compreende determinar a probabilidade de as demências de etiologia questionável serem DA ou outro distúrbio caracterizado pela deposição amilóide com base nos dados referentes à deposição amilóide. 0 método compreende a administração a um doente de um composto com a Fórmula (I) e a aplicação de técnicas de imagiologia a este para obter dados e determinar se a demência de etiologia questionável é DA com base nos achados referentes à deposição amilóide.

[0151] 0 termo "transtorno demencial de etiologia questionável" diz respeito à condição em que a pessoa se apresenta para avaliação clínica (que pode ser composta por avaliações neurológicas, psiquiátricas, médicas e neuropsicológicas comummente utilizadas pelos especialistas na área para o diagnóstico de indivíduos com transtornos demenciais) e, após esta avaliação, o avaliador encontra indícios de que pode estar presente algum transtorno demencial (com base em queixas subjectivas de perda de memória, descrição de queixas de memória por informadores familiarizados com o desvio apresentado pela pessoa relativamente ao seu funcionamento normal e pelo seu baixo desempenho em testes neuropsicológicos e clínicos comummente utilizados pelos especialistas) e não encontra, contudo, indícios suficientes para qualquer transtorno demencial com definição clínica (como a DA, demência frontotemporal, demência com corpos de Lewy, demência vascular, pseudodemência associada a um síndrome depressivo profundo, doença de Creutzfeld-Jacob e outras conhecidas pelos especialistas na área) ou, constata que a pessoa demonstra indícios de mais do que um transtorno demencial até ao ponto em que a distinção entre estes dois (ou mais) transtornos demenciais é questionável, nesta pessoa. 44 [0152] Esta modalidade da invenção emprega agentes de imagem amilóide que, em conjunto com técnicas de neuroimagem não invasivas como a espectroscopia por ressonância magnética (ERM), ressonância magnética (RM) ou a imagiologia gama como a tomografia por emissão de positrões (PET) ou a tomografia computadorizada por emissão de fotão único (SPECT), são utilizadas para quantificar a deposição amilóide in vivo. Estas técnicas de imagiologia obtêm dados de diversas regiões do cérebro. A quantificação em regiões especificas é conseguida pelo delineamento das "regiões de interesse ou RDI" [0153] De acordo com esta modalidade, os dados obtidos de doentes através de uma das técnicas de imagiologia acima descritas podem ser comparados com dados obtidos de doentes normativos com uma conclusão baseada nos critérios que fazem a distinção do doente como prodrómico para um diagnóstico clinico padrão de uma doença caracterizada pela deposição amilóide.

[0154] Através do mesmo protocolo, podem comparar-se os dados obtidos através das técnicas de imagiologia aplicadas aos doentes de modo a: definir um transtorno demencial de etiologia questionável como sendo causado por uma doença caracterizada pela deposição amilóide; fazer a distinção entre doença de Alzheimer e demência frontotemporal; monitorizar o doente para determinar o início da doença de Alzheimer; diagnosticar a doença de Alzheimer num doente com diagnóstico clinico de défice cognitivo ligeiro; identificar um doente como prodrómico para a doença de Alzheimer; identificar um doente como portador de uma doença associada a um distúrbio de deposição amilóide em que o doente apresenta um transtorno demencial de etiologia questionável ou identificar um doente como portador da doença de Alzheimer, em que o doente apresenta um transtorno demencial de etiologia questionável. 45

Análise de dados de imagiologia amilóide [0155] Os dados podem ser expressos quantitativamente nos termos do valor padronizado de captação (SUV) ou nos termos do parâmetros farmacocinético de modelação como a proporção de volume da distribuição de Logan (DVR) para um tecido de referência como o tecido do cerebelo. Os sujeitos que se encontram mais do que um desvio padrão acima do valor de controlo típico de SLTV ou DVR seriam considerados como tendo um teste "positivo" e como prodrómicos para um diagnóstico clínico de uma doença caracterizada pela deposição amilóide, como a DA. Especificamente, os sujeitos podem ser considerados como "positivos" se as suas médias SUV de 40-60 min. forem superiores a 1,0 no córtex frontal, parietal ou cingulado posterior. Este valor separou de forma clara os doentes com DA dos controlos no estudo humano inicial (Klunk, et al., 2004, Ann. Neurol., 55(3) :306-19) . Do mesmo modo, os sujeitos podem ser considerados como "positivos" se o seu valor Logan DVR exceder 1,5 no córtex frontal, parietal ou cingulado posterior. Estas áreas do cérebro e valores exactos de corte são fornecidos apenas a título de exemplo, podendo a prossecução do trabalho divulgar áreas cerebrais adicionais de utilidade e podendo também ser redefinidos os valores de corte e ser aplicadas outras técnicas de modelação (tais como a modelação compartimentai, análise gráfica, modelação de tecidos de referência ou a análise espectral) para a determinação dos valores de corte. Adicionalmente, os dados de digitalização podem ser interpretados qualitativamente a partir de imagens que reflectem a distribuição por região cerebral de parâmetros SUV, Logan DVR ou de outros parâmetros através dos quais um especialista com competência de interpretação de digitalizações PET pode determinar se a quantidade qualitativa e a distribuição de amilóide é consistente com a fase prodrómica de uma doença caracterizada pela deposição amilóide com diagnóstico clínico.

[0156] Noutra modalidade da invenção, é efectuada a detecção in vivo ou in vitro, relativamente a um sujeito que tem ou está em risco de ter, pelo menos, um depósito amilóide (isto é, um depósito composto por, pelo menos, uma proteína amiloidogénica), através de uma metodologia que engloba: (a) a administração a um sujeito afectado por uma doença associada à amiloidose de uma quantidade detectável de uma composição farmacêutica que contém pelo menos um composto com a fórmula (I) conforme acima descrito e um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis; e 46 (b) a detecção da ligação do composto ao depósito amilóide que contém pelo menos uma proteína amiloidogénica, onde a proteína amiloidogénica é seleccionada de entre um grupo composto por AL, AH, ATTR, Αβ2Μ, AA, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, AFib, ACys, ABri, ADan, APrP, ACal, AIAPP, AANF, APro, AIns, AMed, AKer, A(tbn) e ALac.

[0157] Na amiloidose sistémica primária (AL), a proteína amiloidogénica pode corresponder a cadeias leves (k ou λ) de imunoglobulina monoclonal com uma conformação anormal, produzidas por células plasmáticas clonais. As fibrilas depositam-se nos rins, coração, fígado e outros órgãos/tecidos.

[0158] Em alguns casos, as fibrilas da amiloidose associada a cadeias de imunoglobulina contêm apenas sequências de cadeia pesada em vez de sequências de cadeia leve. Nessa circunstância, a doença é designada por "amiloidose de cadeia pesada" (AH).

[0159] Na amiloidose associada à transtiretina, a proteína precursora é uma sequência normal ou mutante da TTR, uma proteína transportadora sintetizada pelo fígado e plexo coróide. A TTR é um tetrâmero de 4 subunidades de 127 aminoácidos cada. A TTR de sequência normal forma depósitos amilóides nos ventrículos cardíacos de indivíduos idosos (> 7 0 anos de idade); esta doença é também designada por "amiloidose cardíaca senil". A prevalência da amiloidose cardíaca associada à TTR aumenta progressivamente com a idade, afectando entre 25% ou mais da população com mais de 90. A ATTR de sequência normal pode ser um resultado incidental da autópsia ou causar sintomas clínicos (por exemplo, insuficiência cardíaca e arritmias).

[0160] Mutações pontuais na TTR aumentam a tendência da TTR para formar amilóide. As mutações amiloidogénicas da TTR são herdadas na forma de uma doença autossómica dominante com penetrância variável. São conhecidas mais de 60 mutações amiloidogénicas da TTR. As mutações da TTR com maior prevalência são a TTR Val30Met (comum em Portugal, no Japão e na Suécia) e a TTR Vall22lle (presente em 3,9% dos afro-americanos). As mutações amiloidogénicas da TTR causam, essencialmente, a formação de depósitos nos nervos periféricos, coração, tracto gastrointestinal e no vítreo.

[0161] Na amiloidose associada à β2-microglobulina, a proteína precursora é uma proteína β2-ιηίοηορ1οόυ1ίη3 normal, que é o componente de cadeia leve do complexo major de histocompatibilidade (MHC). Em contexto clínico, a Αβ2Μ 47 está associada a doentes em diálise e, raramente, a doentes com insuficiência renal que não se encontram em diálise.

[0162] A β2Μ é normalmente catabolizada pelo rim. Em doentes com insuficiência renal, a proteína acumula-se no soro. As membranas da diálise convencional não removem a β2Μ; assim, os níveis séricos podem alcançar patamares 30-60 vezes superiores ao intervalo de valores de referência para doentes em hemodiálise. Os órgãos tipicamente envolvidos incluem o ligamento cárpico e, possivelmente, as membranas sinoviais (conduzindo a artropatias e a quistos ósseos), coração, tracto gastrointestinal, fígado, pulmões, próstata, glândulas supra-renais e língua.

[0163] A amiloidose por amilóide A (AA) é a forma mais comum de amiloidose sistémica a nível mundial. Esta ocorre no decurso de uma doença inflamatória crónica de etiologia infecciosa ou não infecciosa. Na AA, os principais locais de envolvimento são o rim, fígado e o baço.

[0164] A amiloidose associada à apolipoproteína AI (AApoAI) é uma amiloidose autossómica dominante causada por mutações pontuais no gene apoAI. Esta amiloidose é, frequentemente, um amilóide renal proeminente. Algumas famílias têm neuropatia periférica ou doença cardíaca. A ApoAI (provavelmente de sequência normal) é também o precursor fibrilar em placas amilóides localizadas na aorta de pessoas idosas.

[0165] A amiloidose associada à apolipoproteína AII (AApoAII) é uma amiloidose autossómica dominante causada por mutações pontuais no gene apoAII. As 2 famílias descritas com este distúrbio são ambas portadoras de uma mutação pontual no códão de terminação, conduzindo à produção de uma proteína atipicamente longa.

[0166] A proteína precursora na amiloidose associada à gelsolina (AGel) é a gelsolina moduladora da actina. As fibrilas amilóides incluem um fragmento de gelsolina que contém uma mutação pontual.

[0167] A amiloidose associada ao fibrinogénio (AFib) é uma amiloidose autossómica dominante causada por mutações pontuais no gene da cadeia α do fibrinogénio.

[0168] A amiloidose associada à lisozima (ALys) é uma amiloidose autossómica dominante causada por mutações pontuais no gene da lisozima.

[0169] A proteína precursora na amiloidose associada à cistatina C (ACys) é a cistatina C, que é um inibidor das 48 cisteíno proteases que contêm uma mutação pontual. Esta condição é clinicamente designada por HCHWA, do tipo islandês. A ACys é autossómica dominante. A sua apresentação clinica inclui múltiplos acidentes vasculares e alterações do estado mental a partir da segunda ou terceira décadas da vida. A patogénese é do tipo da cistatina mutante que está amplamente distribuída nos tecidos, com formação de fibrilas apenas nos vasos cerebrais; assim, acredita-se que as condições locais possam desempenhar um papel na formação de fibrilas.

[0170] A proteína precursora na amiloidose associada à proteína priónica (APrP) é uma proteína priónica, que é uma glicoproteína da membrana plasmática. A etiologia é infecciosa (i.e., kuru) ou genética (i.e., doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker (GSS) , insónia familiar fatal (FFI)). A unidade infecciosa é a proteína priónica, que induz uma alteração da conformação numa proteína homóloga, codificada por um gene no cromossoma do hospedeiro. Os doentes com CJD, GSS, e FFI são portadores de mutações amiloidogénicas autossómicas dominantes no gene da proteína priónica; assim, a amiloidose forma-se mesmo na ausência de um desencadeador infeccioso.

[0171] Na amiloidose associada à calcitonina (ACal), a proteína precursora é a calcitonina, uma hormona reguladora do cálcio sintetizada pela tiróide. Os doentes com carcinoma medular da tiróide podem desenvolver uma deposição amilóide localizada a nível dos tumores, composta por uma procalcitonina de sequência normal (ACal). A patogénese presumível corresponde à produção local elevada de calcitonina, conduzindo a uma concentração local suficientemente elevada do péptido que conduz à polimerização e formação de fibrilas.

[0172] Na amiloidose associada ao polipéptido dos ilhéus (AIAPP), a proteína precursora é um polipéptido amilóide dos ilhéus (IAPP), também conhecido por amilina. A IAPP é uma proteína segregada pelas células beta dos ilhéus e armazenada com a insulina nos grânulos secretores e libertada em conjunto com a insulina. Normalmente, a IAPP modula a actividade da insulina nos músculos esqueléticos. 0 amilóide de IAPP é encontrado em insulinomas e no pâncreas de muitos doentes com diabetes mellitus tipo 2.

[0173] A amiloidose associada ao factor natriurético auricular está relacionada com a proteína precursora, factor natriurético auricular (ANF), uma hormona que controla a homeostase do sal e da água, que é sintetizada pelos aurículos cardíacos. Os depósitos amilóides 49 localizam-se nos aurículos cardíacos. Esta condição é altamente prevalente em pessoas idosas. A amiloidose associada ao factor natriurético auricular (AANF) é mais comum em doentes com insuficiência cardíaca congestiva de longa duração, presumidamente pela produção persistente de ANF.

[0174] No amilóide de prolactina (APro), encontram-se prolactina ou fragmentos de prolactina no amilóide pituitário. Esta condição é frequentemente observada em idosos e foi também reportada num amiloidoma num doente com um tumor hipofisário produtor de prolactina.

[0175] Os amilóides da pele reagem com anticorpos anti-queratina para gerar uma forma de amiloidose localizada. Contudo, a identidade exacta das fibrilas não foi quimicamente confirmada no amilóide de queratina, sendo estas referidas como proteínas amilóides de queratina (AKer).

[0176] 0 amilóide aórtico médio ocorre na maioria dos idosos de idade superior a 60 anos. O amilóide de medina (AMed) deriva de um fragmento proteolítico da lactoaderina, uma glicoproteína expressa pelo epitélio mamário.

[0177] A demência familiar britânica (FBD) é neuropatologicamente caracterizada pela deposição de uma proteína produtora de amilóide única, ABri. Esta é um fragmento de uma forma anormal de uma proteína precursora, a BRI .

[0178] Na demência familiar dinamarquesa (FDD), a duplicação de um decâmero entre os códões 265 e 266 na região 3' do gene da BRI origina um péptido amilóide designado por ADan, 11 resíduos mais longo que o péptido de tipo selvagem produzido pelo gene normal da BRI. Os depósitos de ADan foram encontrados amplamente distribuídos no SNC de casos de FDD. Os depósitos de ADan são, predominantemente, agregados não fibrilares.

[0179] Os péptidos ABri e ADan são fragmentos derivados de uma proteína precursora, de maiores dimensões, ancorada à membrana, uma proteína designada por precursora BRI e, codificada pelo gene BRI no cromossoma 13.

[0180] O tumor de Pindborg é caracterizado pela produção de quantidades elevadas de amilóide e pela presença de corpos lamelares calcificados. A proteína amilóide associada a este síndrome necessita ainda de designação mas é habitualmente referida como A(tbn). 50 [0181] As fibrilas amilóides podem ser formadas na ausência do componente amilóide P sérico (SAP) e sulfatos de heparina proteoglicanos de vários polipéptidos naturais, como a insulina. Este processo dá origem à proteína amilóide AIns, cuja proteína precursora é a insulina.

[0182] Outra proteína, a lactoferrina, é revelada como a maior proteína fibrilar na amiloidose corneana subepitelial familiar. Presume-se que quer uma anomalia estrutural como uma concentração anormalmente elevada no soro dá origem à proteína amilóide ALac.

[0183] As proteínas amiloidogénicas são detectadas pelos presentes compostos de tioflavina. Os compostos de tioflavina visam pelo menos uma proteína amiloidogénica que deriva de pelo menos uma proteína precursora seleccionada de entre um grupo composto pela cadeia leve de imunoglobulina, cadeia pesada de imunoglobulina, β2-microglobulina, AA (Apo) sérica, apolipoproteína AI, apolipoproteína AII, gelsolina, lisozima, cadeia oí do fibrinogénio, cistatina C, ABriPP, ADanPP, proteína do prião, (Pro)calcitonina, polipéptido amilóide dos ilhéus, factor natriurético auricular, prolactina, insulina, lactoaderina, querato-epitelina, proteína precursora associada ao tumor de Pindborg (tbn) e lactoferrina. São estes alvos proteicos que dão origem a diferentes síndromes ou doenças dos tecidos afectados. Ver Buxbaum, Curr. Opin Rheumatol 16: 67-75 (2003). Ver também, Merlini and Westermark, J Intern Med 255: 159-178 (2004). Os seguintes exemplos são apresentados para ilustrar a presente invenção. Os exemplos ilustram a forma de preparação dos compostos detectáveis da invenção, sem a presença de marcadores detectáveis, assim como a forma como estes compostos de ligam ao péptido βΑ sintético.

EXEMPLOS

Exemplos de síntese

Exemplo 1-Preparação flurofenil)benzofurano de 5-metoxi-2—(4'— [0184] ir « r w m

Scheme: a. 4-fluorobenzylbromide, K2COj, CHjCtf, refluxing 4h; b. P^-t-Bu, Toluene, rcfluxing 12b; c. BBr3, CHClj, r.t 3hr. 51 2-Benziloxi.-5-metoxibenzaldeído (I): [0185] A uma solução de 2-hidroxi-5-metoxibenzaldeído (0,152 g, 1,0 mmol) em MeCN seco (50 mL) foi adicionado brometo de 4-fluorobenzilo (0,145 mg, 1,0 mmol) e K2C03 anidro (0,27g, 2,0 mmol). A mistura foi posta em refluxo durante 4 horas e então foi evaporada sob vácuo. Foi adicionada água (100 mL) e a mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica separada foi seca com MgSCg e depois evaporada sob vácuo. Finalmente, o resíduo foi eluído através de uma coluna de sílica-gel com n-hexano/EtOAc (4: 1) para produzir o composto branco I (0,21 g, 88%) . RMN ΤΗ (300 MHz, acetona-d6) : δ 10,56 (s, 1H, CHO) , 7,35-7,48 (m, 2H) , 7,12-7,19 (m, 5H) , 5,20 (s, 2H, OCH2) , 3,90 (s, 3H, OCH3) . 5-Metoxi-2-(4'-fluorofenil)benzofurano (II): [0186] A uma solução do composto I (50 mg, 0,2 mmol) em tolueno seco (5 mL) foi adicionada solução de fosfazeno base (P4-t-Bu) em hexano (0,2 mL, 1,0 M) e posta em refluxo de um dia para o outro. Foi adicionado CHC12 (50 mL) e a solução foi lavada com água. A camada orgânica separada foi seca com MgSCg e depois evaporada sob vácuo. Finalmente, o resíduo foi separado através de TCL de sílica-gel com hexano/EtOAc (4:1) para obter o composto branco II (39 g, 85%) . RMN (300 MHz, acetona-d6) : δ 7, 92-7, 98 (m, 2H) , 7,46 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,21-7,28(m, 3H), 7,15 (d, J=2,7Hz, 1H), 6,90 (dd, J=3Hz, 1H), 3,90 (s, 3H, 0CH3) . 5-Hidroxi-l-(4'-fluorofenil)benzofurano (III): [0187] Uma solução de composto II (24 mg, 0,1 mmol) em 5 mL de dicloreto de metileno foi adicionada a 2 mL de uma solução 1,0 M de BBr3 em dicloreto de metileno e agitada à temperatura ambiente durante 3h. O solvente foi removido por evaporação e o produto em bruto foi purificado sobre TLC de sílica-gel com hexano/EtOAc(3:1) para produzir o composto branco III (21 mg, 89 %) . RMN 1R (300 MHz, acetona-d6) : δ 8,15 (s, 1H) , 7, 92-7, 95 (m, 2H) , 7,37 (d, J=8,7 Hz, 1H) , 7,26 (t, Ji=J2=8,9 Hz 2H) , 7,14 (s, 1H) , 7,02 (d, J=2,4 Hz, 1H) , 6,85 (dd, J=2,4 Hz, 1H) .

Exemplos 2-5 [0188] Usando procedimentos análogos aos descritos nos Exemplos 1 e 2, foram sintetizados os compostos que se seguem: 52

Exemplo 2:

HO

Exemplo 3: h2n

•F

Exemplo 4:

Exemplo 5:

F

Exemplos Biológicos

Estudos de introdução em cérebro de rato [0189] 5-Metoxi-2-(4'-flurofenil)benzofurano em etanol foi diluído em solução salina normal para produzir uma solução contendo cerca de 500 microCuries por mL. Ratos selvagens tipo Swiss Webster foram pesados, receberam cerca de 30 microCuries por injecção na veia lateral da cauda, e foram mortos em momentos diferentes após a injecção. Uma amostra de sangue total foi colhida por punção cardíaca no momento da morte e o cérebro foi rapidamente removido e dissecado em cerebelo e cérebro inteiro (sem tronco cerebral). Foi igualmente removido um fémur de cada rato e foi determinada a extensão do metabolismo para f luoreto [18F] . Estas fracções foram testadas num contador de poços gama em conjunto com uma porção calibrada do injectado, e as amostras foram corrigidas guanto à decadência para o momento da injecção. As amostras foram pesadas e a dose injectada em percentagem por grama de tecido (%ID/g) foi determinada e normalizada para o peso corporal do rato ((%lD*kg)/g).

Estudos de introdução em cérebro de babuíno 53 [0190] Um babuíno de 40 kg foi anestesiado, imobilizado e colocado num ventilador. 0 babuíno foi posicionado num digitalizador PET para obter imagens do cérebro e foi realizado um varrimento em transmissão para corrigir quanto à atenuação. Foi injectada no babuíno por via intravenosa uma solução com 8 mCi de 5-metoxi-2-(4'-fluorofenil)benzofurano e o cérebro foi visualizado numa série de intervalos de tempo de recolha de dados crescentes ao longo de 2 h após a injecção. Após a aquisição de dados, as imagens foram reconstruídas e foram desenhadas regiões de interesse. Foram geradas curvas de actividade temporal (CAT) corrigidas para os factores atenção e decadência para cada uma das regiões para determinar a duração quantitativa da radioactividade em cada região cerebral. Estas CATs indicam excelente penetração cerebral do radiomarcador e rápida eliminação da radioactividade do cérebro normal de babuíno. Estas propriedades in vivo combinadas com a afinidade relativamente elevada do ligante in vitro com o amilóide agregado indicam que o composto é um agente de imagiologia amilóide potencialmente útil.

Caracterização da afinidade de ligação ao péptido βΑ sintético: [0191] As características da ligação do derivado de benzofurano foram analisadas utilizando para o efeito βΑ(1-40) sintética e 2-(4 ' - [3H]metilamino-fenil)-benzotiazol ( [3H]BTA-1) em solução salina de tampão de fosfato (pH 7,4), como previamente descrito. Klunk et al., Life Sei. 69:1471 (2001); Mathis et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 12:295 (2002). A tabela abaixo lista as constantes de inibição (Ki) dos quatro compostos representados para competição de ligação de [3H]BTA-1 a partir de Αβ(1-40) sintético. Compostos com valores Ki inferiores a 20 nM são exemplares para uso como radiomarcadores PET in vivo.

54

55

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de ligação amilóide com a fórmula (I) ou um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis:

   Y é F, Cl, Br, I, 0-(CR"2)n-X ou -(CR"2)n-X; onde X é F, Cl, Br ou I; e n é 1-5; R' é H ou um grupo alquilo Ci_8; R' ' é H ou um grupo alquilo Ci-8; R3-R10 são independentemente seleccionados do grupo composto por H, F, Cl, Br, I, alquilo Ci-Cs, (CH2) ^-ORu, CF3, -(CH2)n3-X, -0-(CH2) !-3-X, CN, -CO-Rn, -N(Ru)2, -NR"3+, -N02, -C0-N(Ru)2, -0-(C0)-Rn, OR11, SRn, COORn, Rphí _CRii=CRn-Rph θ _C (Rn) 2_C (Rn) 2RPh, em que X é F, Cl, Br ou I; e RPh é fenilo opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo constituído por F, Cl, Br, I, alquilo Ci-Cs, (CHjJ^-O-Rn, CF3, - (CH2) 3_3-X, -0- (CH2)i-3-X, CN, -CO-Rn, -N(Rn)2, -C0-N(Rh)2, -0-(CO)-Rn, ORn, SRn, e COORn, em que cada Rn é independentemente H ou alquilo Ci-C5; e Y ou R3—R10 compreende pelo menos um marcador detectável seleccionado do grupo constituído por I, I, I, I, 76Br, 75Br, 18F, 19F nC, 13C, 14C e 3H. 2. 0 composto de ligação amilóide de acordo com a reivindicação 1, em que R3, R4, R5, R6, R7/· e Rio são H, e R8 e R9 são independentemente ORn. 3. 0 composto de ligação amilóide de acordo com a reivindicação 2, em que Y compreende pelo menos um marcador detectável. 4. 0 composto de ligação amilóide de acordo com a reivindicação 2 com a seguinte fórmula:

   1
2. 5. Uma composição farmacêutica que compreende (i) uma quantidade eficaz de um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4; e (ii) um veiculo farmacologicamente aceitável. 6. 0 composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso num método de detecção in vivo de depósito(s) amilóide(s) , método esse que compreende: (i) a administração a um mamífero de uma quantidade eficaz de um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o composto se liga a qualquer depósito(s) amilóide(s) no mamífero; e (ii) a detecção da ligação do composto ao (s) depósito(s) amilóide(s) no mamífero. 7. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 6, no qual o(s) depósito(s) amilóide(s) se localiza(m) no cérebro do mamífero. 8. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 7, em que o mamífero é um humano com suspeita de afecção pela doença de Alzheimer, doença de Alzheimer familiar, síndrome de Down ou homozigotia para o alelo da apolipoproteína E4.
3. 9. Um método para detecção in vitro de depósito (s) amilóide(s), que compreende: (i) o contacto de um tecido corporal com uma quantidade eficaz de um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o composto se liga a qualquer depósito(s) amilóide(s) no mamífero; e (ii) a detecção da ligação do composto ao(s) depósito(s) amilóide(s) no tecido. 2
4. 10. O método de acordo com a reivindicação 9, método esse que compreende ainda: (iii) a separação do tecido do(s) depósito(s) amilóide(s) ligado(s) ao composto; e (iv) a quantificação do(s) depósito(s) amilóide(s) ligado(s) ao composto.
5. 11. Um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso num método para a distinção entre um cérebro afectado pela doença de Alzheimer e um cérebro normal, que envolve: (i) a obtenção de tecidos do (i) cerebelo e de (ii) outra secção do mesmo cérebro, de um mamífero normal e de um mamífero com suspeita de estar afectado pela doença de Alzheimer; (ii) o contacto dos tecidos com um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4; (iii) a quantificação do amilóide ligado ao composto; (iv) o cálculo da proporção entre (a) a quantidade de amilóide numa área do cérebro que não o cerebelo e (b) a quantidade de amilóide no cerebelo; e (v) a comparação entre a proporção obtida para um mamífero normal e a proporção obtida para um mamífero com suspeita de afecção pela doença de Alzheimer.
6. 12. O composto de ligação amilóide de acordo com a reivindicação 11, no qual a proporção de (i) ligação do composto a uma área do cérebro que não o cerebelo em relação à (ii) ligação do composto ao cerebelo, no sujeito, é comparada com a proporção em sujeitos normais.
7. 13. Um método de detecção de depósitos amilóides em tecido humano ou animal proveniente de biópsia ou recolha post mortem que compreende os passos de: (a) incubação de tecido fixado em formalina ou congelado a fresco com uma solução de um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ou de um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis, para formar um depósito marcado; e 3 (b) detecção do depósito marcado.
8. 14. Um método de quantificação do amilóide em tecido proveniente de biópsia ou recolha post mortem que compreende os passos de: a) incubação de um derivado radiomarcado de um composto de ligação amilóide de acordo com as reivindicações 1-4 ou de um dos seus sais farmacologicamente aceitáveis com um homogenado de tecido proveniente de biópsia ou recolha post mortem, em que pelo menos um dos substituintes no composto é marcado com um radiomarcador seleccionado do grupo composto por 125I, 3H e um substituinte que contém carbono, onde pelo menos um carbono é 14C; b) separação do derivado radiomarcado de um composto ligado ao tecido do não ligado ao tecido, c) quantificação do derivado radiomarcado do composto ligado ao tecido, e d) conversão das unidades de derivado radiomarcado do composto ligado ao tecido em unidades de microgramas de amilóide por 100 mg de tecido, por comparação com um padrão.
9. 15. Um método para ligar selectivamente um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ou um seu sal farmacologicamente aceitável a placas amilóides mas não a emaranhados neurofibrilares em tecido cerebral que contém ambos, método esse que compreende o contacto entre placas amilóides e um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 numa concentração inferior a cerca de 10 nM, em ensaios de ligação ou coloração in vitro.
10. 16. O composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso num método para ligar selectivamente in vivo um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ou um seu sal farmacologicamente aceitável a placas amilóides mas não a emaranhados neurofibrilares em tecido cerebral que contém ambos, método esse que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ou um seu sal f armacologicamente aceitável, de modo a que a concentração no sangue do composto administrado seja inferior a cerca de 10 nM, in vi vo. 4 17. 0 composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso num método in vivo ou in vitro de detecção num sujeito de pelo menos um depósito amilóide que contenha pelo menos uma proteína amiloidogénica, método esse que compreende os passos de: (a) administração a um sujeito afectado por uma doença associada à amiloidose de uma quantidade detectável de uma composição farmacêutica composta por pelo menos um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ou um seu sal farmacologicamente aceitável e um veículo farmacologicamente aceitável; e (b) detecção da ligação do composto a um depósito amilóide que contenha pelo menos uma proteína amiloidogénica. 18. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 17, no qual o sujeito sofre de uma doença associada à amiloidose sistémica. 19. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 18, no qual pelo menos um depósito amilóide localizado no tecido é seleccionado do grupo constituído por nervos periféricos, pele, língua, coração ou fígado. 20. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 18, em que o pelo menos um depósito amilóide se localiza num órgão parenquimatoso. 21. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 20, no qual o órgão é seleccionado do grupo constituído por baço, rim, fígado e supra-renal. 22. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 18, em que a doença associada à amiloidose sistémica é seleccionada do grupo constituído por mieloma múltiplo, macroglobulinemina, linfoma, doença inflamatória crónica, artrite reumatóide, doença infecciosa, dermatomiosite, escleroderma, enterite regional, colite ulcerosa, tuberculose, osteomielite crónica, bronquiectasia, abscesso cutâneo, abcesso pulmonar, cancro, doença de Hodgkin, amiloidose heredofamiliar, febre mediterrânica familiar, demência familiar e polineuropatia amilóide familiar.
11. 23. O composto para uso num método de acordo com a reivindicação 17, em que o sujeito está a receber tratamento de hemodiálise por insuficiência renal crónica. 5 24. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 17, no qual o sujeito sofre de uma doença associada à amiloidose localizada. 25. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 24, em que o pelo menos um depósito amilóide se localiza no pâncreas. 26. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 24, em que a doença associada à amiloidose localizada é seleccionada do grupo constituído por mieloma primário, demência familiar, encefalopatias espongiformes, tumor da tiróide com origem nas células C, insulinoma, prolactinoma e tumor de Pindborg. 27. 0 composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso num método de identificação de um doente como prodrómico para uma doença associada à deposição amilóide, que compreende: (A) a administração ao doente, que apresenta sinais de demência clinica ou sinais clínicos de défice cognitivo ligeiro, de um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ou de um seu sal farmacologicamente aceitável; e depois (B) a obtenção de imagens do referido doente para obter dados; e (C) a análise dos dados mencionados para averiguar os níveis de amilóide no referido doente relativamente a um nível normativo, identificando assim o referido doente como prodrómico para uma doença associada à deposição amilóide. 28. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 27, em que o doente tem o diagnóstico de défice cognitivo ligeiro. 29. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 27, em que a doença amilóide é a doença de Alzheimer. 30. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 27, onde os referidos dados definem um transtorno demencial de etiologia questionável como sendo causado por uma doença caracterizada pela deposição amilóide. 6 31. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 27, compreendendo distinguir a doença de Alzheimer da demência frontotemporal. 32. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 27, compreendendo ainda monitorizar o doente para determinar o inicio da doença de Alzheimer. 33. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 27, que compreende diagnosticar a doença de Alzheimer num doente com o diagnóstico clínico de défice cognitivo ligeiro. 34. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 27, em que o doente apresenta um transtorno demencial de etiologia questionável. 35. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 27 ou 34, em que o doente tem DA não diagnosticada. 36. 0 composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso num método de determinação da eficácia da terapia no tratamento da amiloidose, compreendendo: (A) a administração de uma quantidade eficaz de um composto de ligação amilóide de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ou de um seu sal farmacologicamente aceitável a um doente em necessidade deste. (B) a obtenção de imagens do referido doente; e, então (C) a administração de pelo menos um agente anti-amilóide ao referido doente em necessidade deste; (D) subsequentemente, a administração de uma quantidade eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ao referido doente em necessidade deste; (E) a obtenção de imagens do referido doente; e (F) a comparação dos níveis de deposição amilóide no referido doente antes e depois do tratamento com o dito pelo menos um agente anti-amilóide. 37. 0 composto para uso num método de acordo com a reivindicação 36, em que a referida amiloidose é a DA. 7 8