CN109789145A

CN109789145A - 用于在脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用的噁嗪衍生物

Info

Publication number: CN109789145A
Application number: CN201780060026.7A
Authority: CN
Inventors: C·洛佩兹-洛佩兹; U·诺伊曼; D·席姆谢克
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2016-10-13
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2019-05-21
Also published as: AU2017342207A1; AU2017342207B2; CL2019001007A1; US20180125853A1; RU2019113756A3; WO2018069843A1; MX2019004342A; TW201817424A; EP3525793A1; IL265579A; JP2019534885A; KR20190068567A; PH12019500464A1; BR112019006591A2; MA46519A; US10722518B2; SG11201901889QA; RU2019113756A; CA3035852A1; WO2018069843A9

Abstract

本发明涉及噁嗪衍生物BACE‑1抑制剂和包含这种噁嗪衍生物的药物组合物，用于在脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用并且特别是用于其中携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者。

Description

用于在脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用的噁嗪衍生物

技术领域

本发明涉及噁嗪衍生物和包含这种噁嗪衍生物的药物组合物，用于在脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用；并且特别是，其中该化合物用于治疗或预防携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病。

背景技术

脑淀粉样血管病(CAA)是一种常见的与年龄相关的脑小血管疾病，其特征在于淀粉样物质-β(Aβ)，特别是Aβ40，在大脑皮层以及上覆的软脑膜的中小型动脉、小动脉和毛细血管的壁上的渐进沉积(Charidimou A等人，2011)。CAA通常与阿尔茨海默病(AD)共存。轻度CAA通常表现为无症状；然而，CAA也可能导致严重的血管病变，并且是脑出血的危险因素，脑出血范围从无声微出血到自发性脑内出血(一种毁灭性的中风形式)。

APOE4是AD和CAA的强遗传风险因子(Shinohara M等人，2016)。人ApoE位于19号染色体上(基因APOE，Uniprot P02649)。在人类中已知三种主要的同种型(apoE2、apoE3和apoE4)。ApoE4(在位置112和158处具有Arg)在人类中的等位基因频率为5％-35％(Verghese PB等人，2011)并且据估计，ApoE4纯合体占一般群体的约2％至3％(Quintino-Santos SR等人，2012)。

已经显示ApoE4等位基因与皮质毛细血管中的Aβ沉积(所谓的毛细血管CAA(CAA-1型))密切相关(Thal等人，2002)。第二种类型的CAA(CAA-2型)在除皮质毛细血管外的软脑膜和皮质血管中呈现Aβ沉积。CAA-2型与ApoE4等位基因无关。

通过以下方法靶向降低Aβ的策略在CAA的治疗中可能具有潜在治疗价值：用针对Aβ的主动或被动免疫疗法提高淀粉样物质清除率；通过抑制β位点-APP裂解酶-1(BACE-1，一种参与淀粉样前体蛋白[APP]加工的酶)降低产量。然而，文献中尚未描述CAA的有效疾病缓解性治疗，以及与其相关的脑内出血。

Beckmann N等人，2016描述了纵向无创磁共振成像(MRI)在监测体内脑微出血中的适用性。在这项研究中，作者用有效的BACE抑制剂、NB360和Aβ抗体β1治疗老年APP23小鼠三个月。与用Aβ抗体β1治疗相反，体积MRI评估揭示了对用NB360治疗的小鼠中CAA相关的微出血没有影响。

发明内容

化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺，在本文中称为“化合物1”是口服活性BACE抑制剂，先前描述在WO 2012/095469 A1中，对BACE-1的选择性是对BACE-2的约3倍，并且没有相关的脱靶结合或脱靶活性。

在不存在任何证明的疾病缓解性疗法的情况下，关于任何潜在的治疗剂是否会对治疗或预防CAA和相关的脑内出血有效，存在高度不确定性。然而，本文用化合物1证明的在以下方面的高度有效性：在CAA的APP23转基因小鼠模型中用化合物1治疗后观察到脑血管壁中Aβ沉积的降低和脑内出血的减少，表明化合物1可有效治疗或预防CAA和相关的脑内出血。鉴于本文提供的数据证明了化合物1减少APP23转基因小鼠中皮质毛细管Aβ沉积的能力，预期化合物1在治疗CAA-1型中特别有效。

还预期化合物1对易于发展CAA的患者特别有益，例如携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者。因此，本文描述了II/III期临床试验，该试验被设计为用于在认知未受损的ApoE4纯合体患者或认知未受损的、淀粉样物质阳性的ApoE4杂合体患者的群体中，证明化合物1在预防AD方面的有效性并评估其对CAA的有效性。基于目前的知识，提出的该临床试验的发现和本文所述的结果可以推广并适用于ApoE4纯合体和杂合体之外的患者中的CAA(例如在由于衰老而发展CAA的患者中；在患有唐氏综合征(Kumar-Singh S,2008)的患者中；或在携带早老素-1(Dermaut B等人，2001)、或淀粉样前体蛋白(Kumar-Singh S,2008)基因突变的患者中)，因为预期BACE抑制剂疗法会独立于CAA的多种潜在原因，减少和/或预防Aβ积聚，以及沉积在脑血管壁中。

在本发明的第一方面，因而提供了化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

在本发明的第二方面，提供了包含N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物，用于在脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

在本发明的第三方面，提供了用于治疗或预防脑淀粉样血管病的方法，该方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

在本发明的第四方面，提供了用于治疗或预防脑淀粉样血管病的方法，该方法包括向患者给药药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

在本发明的第五方面，提供了化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于治疗或预防脑淀粉样血管病的用途。

在本发明的第六方面，提供了包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物用于治疗或预防脑淀粉样血管病的用途。

在本发明的第七方面，提供了化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于制造治疗或预防脑淀粉样血管病的药物的用途。

具体实施方式

附图列表

图1：急性给药化合物1对APOE4-TR雄性和雌性小鼠的前脑Aβ40水平的影响

图2：急性给药化合物1对APOE4-TR雄性和雌性小鼠的CSF Aβ40水平的影响

图3：急性给药化合物1对APOE4-TR雄性和雌性小鼠的CSF Aβ42水平的影响

图4：APOE4-TR雄性和雌性小鼠中化合物1的急性暴露

图5：脑PK/PD关系(个体数据)

图6：脑PK/PD关系(平均值±SD)

图7：在人类受试者的多次递增口服剂量研究中，化合物1在暴露两周后对CSF Aβ40水平的影响

图8：人类受试者中化合物1对CSF Aβ40水平的影响-3个月时相对于基线的％变化

图9：化合物1对Triton TX-100提取的老年APP23脑中的Aβ40的影响

图10：化合物1对Triton TX-100提取的老年APP23脑中的Aβ42的影响

图11：化合物1对Triton TX-100提取的老年APP23脑中的sAPPα的影响

图12：化合物1对Triton TX-100提取的老年APP23脑中的sAPPβ(Swe)的影响

图13：化合物1治疗对老年APP23小鼠脑脊液中的Aβ40的影响

图14：化合物1对老年APP23小鼠中甲酸可溶性Aβ40的影响

图15：化合物1对老年APP23小鼠中甲酸可溶性Aβ42的影响

图16：化合物1对老年APP23小鼠中甲酸可溶性总Aβ(40+42)的影响

图17：化合物1对老年APP23小鼠中甲酸可溶性Aβ42/40比率的影响

图18：化合物1对老年APP23小鼠中总CD31+脑血管数量的影响

图19：化合物1对老年APP23小鼠中总小+中等和大CD31+脑血管数量的影响

图20：化合物1对老年APP23小鼠中具有>10％Aβ覆盖率的血管％的影响

图21：化合物1对老年APP23小鼠中具有>10％Aβ覆盖率的小+中等和大血管％的影响

图22：化合物1对老年APP23小鼠中CAA频率(具有>10％Aβ覆盖率的血管)的影响

图23：化合物1对老年APP23小鼠中CAA频率(小+中等和大血管(具有>10％Aβ覆盖率的血管))的影响

图24：化合物1对老年APP23小鼠中总血管相关的Aβ区域的影响

图25：化合物1对老年APP23小鼠中总血管相关的Aβ区域(小+中等和大血管)的影响

图26：化合物1和β1抗体治疗的APP23小鼠的体重

图27：通过MRI在APP23小鼠中检测到总病变体积

图28：在归一化为基线的APP23小鼠中的总病变体积

图29：相对于基线计算的病变体积增加因子

图30：健康受试者的两部分、开放标签、两期、固定顺序研究的设计，用于评价化合物1在单独给予和联合强CYP3A4抑制剂伊曲康唑或强CYP3A4诱导剂利福平给予时的PK。

本发明第一方面的A系列实施例

实施例A1：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

实施例A2：根据实施例A1所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物用于治疗或预防患有阿尔茨海默病的患者的脑淀粉样血管病。

实施例A3：根据实施例A1或A2所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物用于治疗或预防患者的脑淀粉样血管病，该患者携带发展脑淀粉样血管病的遗传倾向。

实施例A4：根据实施例A3所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该发展脑淀粉样血管病的遗传倾向为：

i.唐氏综合征；

ii.淀粉样前体蛋白或早老素-1的基因突变；或者

iii.存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例A5：根据实施例A4所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例A6：根据实施例A5所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例A7：根据实施例A5所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例A8：根据实施例A1至A7中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例A9：根据实施例A8所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该淀粉样物质阳性是通过PET或CSF测量确定的。

实施例A10：根据实施例A1至A9中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例A11：根据实施例A1至A10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。

实施例A12：根据实施例A1至A10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。

实施例A13：根据实施例A1至A10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。

实施例A14：根据实施例A1至A10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。

实施例A15：根据实施例A1至A10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按15mg/天的剂量使用。

实施例A16：根据实施例A1至A10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按50mg/天的剂量使用。

实施例A17：根据实施例A1至A10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例A18：根据实施例A1至A10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例A19：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在患有阿尔茨海默病的患者的脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

实施例A20：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

实施例A21：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在患有阿尔茨海默病以及携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

实施例A22：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在患有阿尔茨海默病以及携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用，并且其中该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。

实施例A23：根据实施例A1至A22中任一项所述使用的化合物，其中该化合物呈游离形式。

实施例A24：根据实施例A1至A23中任一项所述使用的化合物，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗。

实施例A25：根据实施例A1至A23中任一项所述使用的化合物，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗超过三个月的期限。

实施例A26：根据实施例A24或A25所述使用的化合物，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例A27：根据实施例A26所述使用的化合物，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

实施例A28：根据实施例A1至A27中任一项所述使用的化合物，其中该脑淀粉样血管病是CAA-1型。

本发明第二方面的B系列实施例

实施例B1：包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物，用于在脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

实施例B2：根据实施例B1所述使用的药物组合物，其中该药物组合物用于治疗或预防患有阿尔茨海默病的患者的脑淀粉样血管病。

实施例B3：根据实施例B1或B2所述使用的药物组合物，其中该药物组合物用于治疗或预防患者的脑淀粉样血管病，该患者携带发展脑淀粉样血管病的遗传倾向。

实施例B4：根据实施例B3所述使用的药物组合物，其中该发展脑淀粉样血管病的遗传倾向为：

i.唐氏综合征；

ii.淀粉样前体蛋白或早老素-1的基因突变；或者

iii.存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例B5：根据实施例B4所述使用的药物组合物，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例B6：根据实施例B5所述使用的药物组合物，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例B7：根据实施例B5所述使用的药物组合物，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例B8：根据实施例B1至B7中任一项所述使用的药物组合物，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例B9：根据实施例B8所述使用的药物组合物，其中该淀粉样物质阳性通过PET或CSF测量来确定。

实施例B10：根据实施例B1至B9中任一项所述使用的药物组合物，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例B11：根据实施例B1至B10中任一项所述使用的药物组合物，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。

实施例B12：根据实施例B1至B10中任一项所述使用的药物组合物，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。

实施例B13：根据实施例B1至B10中任一项所述使用的药物组合物，其中该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。

实施例B14：根据实施例B1至B10中任一项所述使用的药物组合物，其中该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。

实施例B15：根据实施例B1至B10中任一项所述使用的药物组合物，其中该化合物按15mg/天的剂量使用。

实施例B16：根据实施例B1至B10中任一项所述使用的药物组合物，其中该化合物按50mg/天的剂量使用。

实施例B17：根据实施例B1至B10中任一项所述使用的药物组合物，其中该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例B18：根据实施例B1至B10中任一项所述使用的药物组合物，其中该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例B19：包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物，用于在患有阿尔茨海默病的患者的脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

实施例B20：包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物，用于在携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

实施例B21：包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物，用于在患有阿尔茨海默病以及携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

实施例B22：包含化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物，用于在患有阿尔茨海默病以及携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用，并且其中该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。

实施例B23：根据实施例B1至B22中任一项所述使用的药物组合物，其中该化合物呈游离形式。

实施例B24：根据实施例B1至B23中任一项所述使用的药物组合物，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗。

实施例B25：根据实施例B1至B23中任一项所述使用的药物组合物，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗超过三个月的期限。

实施例B26：根据实施例B24或B25所述使用的药物组合物，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例B27：根据实施例B26所述使用的药物组合物，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

实施例B28：根据实施例B1至B27中任一项所述使用的药物组合物，其中该脑淀粉样血管病是CAA-1型。

本发明第三方面的C系列实施例

实施例C1：一种用于治疗或预防脑淀粉样血管病的方法，该方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例C2：根据实施例C1所述的方法，其中该患者患有阿尔茨海默病。

实施例C3：根据实施例C1或C2所述的方法，其中该患者携带发展脑淀粉样血管病的遗传倾向。

实施例C4：根据实施例C3所述的方法，其中该发展脑淀粉样血管病的遗传倾向为：

i.唐氏综合征；

ii.淀粉样前体蛋白或早老素-1的基因突变；或者

iii.存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例C5：根据实施例C4所述的方法，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例C6：根据实施例C5所述的方法，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例C7：根据实施例C5所述的方法，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例C8：根据实施例C1至C7中任一项所述的方法，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例C9：根据实施例C8所述的方法，其中该淀粉样物质阳性通过PET或CSF测量来确定。

实施例C10：根据实施例C1至C9中任一项所述的方法，其中该患者超过60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75岁。

实施例C11：根据实施例C1至C10中任一项所述的方法，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例C12：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中给药该化合物导致化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。

实施例C13：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中给药该化合物导致化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低至少70％。

实施例C14：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中给药该化合物导致化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低至少50％。

实施例C15.根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中给药该化合物导致化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416周后CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低范围达10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％至99％、97％、95％、93％、90％、87％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％。

实施例C16.根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中给药该化合物导致在至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％的患者中或在80％、85％或90％至99％、97％、95％或93％的患者中CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低范围达40％至70％、45％至65％或50％至60％、或降低至少50％。

实施例C17.根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中该化合物按在至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％的患者中或在80％、85％或90％至99％、97％、95％或93％的患者中导致CSF、血液或血浆中的Aβ1-40降低范围达65％至95％、75％至90％或80％至90％、或降低至少80％的日剂量使用。

实施例C18：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中该化合物的治疗有效量为5mg/天与10mg/天之间、10mg/天与15mg/天之间、15mg/天与20mg/天之间、20mg/天与25mg/天之间、25mg/天与30mg/天之间、30mg/天与35mg/天之间、35mg/天与40mg/天之间、45mg/天与50mg/天之间、50mg/天与55mg/天之间、55mg/天与60mg/天之间、60mg/天与100mg/天之间、100mg/天与200mg/天之间、200mg/天与300mg/天之间、15mg/天与85mg/天之间、50mg/天与85mg/天之间、15mg/天与300mg/天之间、或50mg/天与300mg/天之间的剂量。

实施例C19：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中该化合物的治疗有效量为10mg/天与30mg/天之间的剂量。

实施例C20：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中该化合物的治疗有效量为30mg/天与50mg/天之间的剂量。

实施例C21：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中该化合物的治疗有效量为15mg/天的剂量。

实施例C22：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中该化合物的治疗有效量为50mg/天的剂量。

实施例C23：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中该化合物的治疗有效量为产生以下血浆稳态C最大值的剂量：0ng/ml与50ng/ml之间、50ng/ml与100ng/ml之间、100ng/ml与150ng/ml之间、150ng/ml与200ng/ml之间、200ng/ml与250ng/ml之间、250ng/ml与300ng/ml之间、300ng/ml与350ng/ml之间、350ng/ml与400ng/ml之间、400ng/ml与450ng/ml之间、450ng/ml与500ng/ml之间、500ng/ml与550ng/ml之间、550ng/ml与600ng/ml之间、600ng/ml与650ng/ml之间、或650ng/ml与700ng/ml之间。

实施例C24：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中该化合物的治疗有效量为产生70ng/ml与170ng/ml之间血浆稳态C最大值的剂量。

实施例C25：根据实施例C1至C11中任一项所述的方法，其中该化合物的治疗有效量为产生200ng/ml与500ng/ml之间血浆稳态C最大值的剂量。

实施例C26：一种用于治疗或预防脑淀粉样血管病的方法，该方法包括向患者给药治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该患者患有阿尔茨海默病。

实施例C27：一种用于治疗或预防脑淀粉样血管病的方法，该方法包括向患者给药治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例C28：一种用于治疗或预防脑淀粉样血管病的方法，该方法包括向患者给药治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该患者患有阿尔茨海默病并且携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例C29：一种用于治疗或预防脑淀粉样血管病的方法，该方法包括向患者给药治疗有效量的化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该患者患有阿尔茨海默病并且携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝，并且其中该化合物的治疗有效量为15mg/天或50mg/天的剂量。

实施例C30：根据实施例C1至C29中任一项所述的方法，其中该化合物呈游离形式。

实施例C31：根据实施例C1至C30中任一项所述的方法，其中化合物1包含在药物组合物中。

实施例C32：根据实施例C1至C31中任一项所述的方法，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗。

实施例C33：根据实施例C1至C31中任一项所述的方法，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗超过三个月的期限。

实施例C34：根据实施例C32或C33所述的方法，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例C35：根据实施例C34所述的方法，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

实施例C36：根据实施例C1至C35中任一项所述的方法，其中该脑淀粉样血管病是CAA-1型。

本发明第五方面的D系列实施例

实施例D1：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于治疗或预防脑淀粉样血管病的用途。

实施例D2：根据实施例D1所述的用途，其中该化合物用于治疗或预防患有阿尔茨海默病的患者的脑淀粉样血管病。

实施例D3：根据实施例D1或D2所述的用途，其中该化合物用于治疗或预防患者的脑淀粉样血管病，该患者携带发展脑淀粉样血管病的遗传倾向。

实施例D4：根据实施例D3所述的用途，其中该发展脑淀粉样血管病的遗传倾向为：

i.唐氏综合征；

ii.淀粉样前体蛋白或早老素-1的基因突变；或者

iii.存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例D5：根据实施例D4所述的用途，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例D6：根据实施例D5所述的用途，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例D7：根据实施例D5所述的用途，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例D8：根据实施例D1至D7中任一项所述的用途，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例D9：根据实施例D8所述的用途，其中该淀粉样物质阳性通过PET或CSF测量来确定。

实施例D10：根据实施例D1至D9中任一项所述的用途，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例D11：根据实施例D1至D10中任一项所述的用途，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。

实施例D12：根据实施例D1至D10中任一项所述的用途，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。

实施例D13：根据实施例D1至D10中任一项所述的用途，其中该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。

实施例D14：根据实施例D1至D10中任一项所述的用途，其中该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。

实施例D15：根据实施例D1至D10中任一项所述的用途，其中该化合物按15mg/天的剂量使用。

实施例D16：根据实施例D1至D10中任一项所述的用途，其中该化合物按50mg/天的剂量使用。

实施例D17：根据实施例D1至D10中任一项所述的用途，其中该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例D18：根据实施例D1至D10中任一项所述的用途，其中该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例D19：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于治疗或预防患有阿尔茨海默病的患者的脑淀粉样血管病的用途。

实施例D20：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于治疗或预防携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的用途。

实施例D21：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于治疗或预防患有阿尔茨海默病以及携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的用途。

实施例D22：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于治疗或预防患有阿尔茨海默病以及携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的用途，并且其中该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。

实施例D23：根据实施例D1至D22中任一项所述的用途，其中该化合物呈游离形式。

实施例D24：根据实施例D1至D23中任一项所述的用途，其中该化合物包含在药物组合物中。

实施例D25：根据实施例D1至D24中任一项所述的用途，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗。

实施例D26：根据实施例D1至D24中任一项所述的用途，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗超过三个月的期限。

实施例D27：根据实施例D25或D26所述的用途，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例D28：根据实施例D27所述的用途，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

实施例D29：根据实施例D1至D28中任一项所述的用途，其中该脑淀粉样血管病是CAA-1型。

本发明第七方面的E系列实施例

实施例E1：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于制造治疗或预防脑淀粉样血管病的药物的用途。

实施例E2：根据实施例E1所述的用途，其中该化合物用于治疗或预防患有阿尔茨海默病的患者的脑淀粉样血管病。

实施例E3：根据实施例E1或E2所述的用途，其中该化合物用于治疗或预防患者的脑淀粉样血管病，该患者携带发展脑淀粉样血管病的遗传倾向。

实施例E4：根据实施例E3所述的用途，其中该发展脑淀粉样血管病的遗传倾向为：

i.唐氏综合征；

ii.淀粉样前体蛋白或早老素-1的基因突变；或者

iii.存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例E5：根据实施例E4所述的用途，其中患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

实施例E6：根据实施例E5所述的用途，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

实施例E7：根据实施例E5所述的用途，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

实施例E8：根据实施例E1至E7中任一项所述的用途，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

实施例E9：根据实施例E8所述的用途，其中该淀粉样物质阳性通过PET或CSF测量来确定。

实施例E10：根据实施例E1至E9中任一项所述的用途，其中该患者在60岁与75岁之间。

实施例E11：根据实施例E1至E10中任一项所述的用途，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用。

实施例E12：根据实施例E1至E10中任一项所述的用途，其中该化合物按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用。

实施例E13：根据实施例E1至E10中任一项所述的用途，其中该化合物按10mg/天与30mg/天之间的剂量使用。

实施例E14：根据实施例E1至E10中任一项所述的用途，其中该化合物按30mg/天与50mg/天之间的剂量使用。

实施例E15：根据实施例E1至E10中任一项所述的用途，其中该化合物按15mg/天的剂量使用。

实施例E16：根据实施例E1至E10中任一项所述的用途，其中该化合物按50mg/天的剂量使用。

实施例E17：根据实施例E1至E10中任一项所述的用途，其中该化合物按产生70ng/ml与170ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例E18：根据实施例E1至E10中任一项所述的用途，其中该化合物按产生200ng/ml与500ng/ml之间的血浆稳态C最大值的日剂量使用。

实施例E19：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于制造治疗或预防患有阿尔茨海默病的患者的脑淀粉样血管病的药物的用途。

实施例E20：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于制造治疗或预防携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的药物的用途。

实施例E21：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于制造治疗或预防患有阿尔茨海默病以及携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的药物的用途。

实施例E22：化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐用于制造治疗或预防患有阿尔茨海默病以及携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝的患者的脑淀粉样血管病的药物的用途，并且其中该化合物按15mg/天或50mg/天的剂量使用。

实施例E23：根据实施例E1至E22中任一项所述的用途，其中该化合物呈游离形式。

实施例E24：根据实施例E1至E23中任一项所述的用途，其中该药剂是药物组合物。

实施例E25：根据实施例E1至E24中任一项所述的用途，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗。

实施例E26：根据实施例E1至E24中任一项所述的用途，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗超过三个月的期限。

实施例E27：根据实施例E25或E26所述的用途，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强、中度或弱抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强、中度或弱诱导剂。

实施例E28：根据实施例E27所述的用途，其中该CYP3A4抑制剂是CYP3A4的强抑制剂；并且该CYP3A4诱导剂是CYP3A4的强诱导剂。

实施例E29：根据实施例E1至E28中任一项所述的用途，其中该脑淀粉样血管病是CAA-1型。

定义

如本文所用，术语“化合物1”或“Cmpd 1”是指具有下列结构式的N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺：

在实例1中，使用替代性化学命名形式，“化合物1”也称为3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-甲酸[6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-三氟甲基-3,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基)-5-氟-吡啶-2-基]-酰胺。

术语“化合物1”、“Cmpd 1”及其相应的完整化学名称在本发明的整个说明书中可互换使用。除非上下文明确地表明仅指一种形式的化合物，否则该术语旨在指游离形式或药学上可接受的盐形式的化合物。在WO 2012/095469 A1的实例34中描述了化合物1。WO2012/095469 A1通过援引以其全文，特别是与实例34的合成有关的披露内容并入本文。

如本文所用，术语“脑淀粉样血管病”或“CAA”是指以皮质和软脑膜血管壁中β-淀粉样蛋白(Aβ)的积聚为特征的疾病。CAA是老年人血管壁破裂和血管功能障碍的常见原因，使其成为致死性或致残性脑内出血(ICH)以及缺血性损伤和痴呆的主要原因(Gurol ME等人，2016)。如本文所用，除非上下文明确指出仅指CAA-1型或CAA-2型，否则术语“脑淀粉样血管病”或“CAA”涵盖CAA-1型和CAA-2型两者。

如本文所用，术语“CAA-1型”是指以皮质毛细血管壁中的Aβ蛋白沉积为特征的毛细血管CAA(capCAA)(Thal等人，2002)。

如本文所用，术语“CAA-2型”是指以除皮质毛细血管外的软脑膜和皮质血管壁中的Aβ蛋白沉积为特征的CAA(Thal等人，2002)。

如本文所用，术语“CAA的治疗”是指向患者给药化合物1以减缓或阻止CAA的发展或CAA的至少一种临床症状，例如ICH、缺血性损伤或痴呆。可以通过使用正电子发射断层扫描(PET)示踪剂(例如¹⁸F-氟贝他吡)测量皮质(例如枕叶皮质)和软脑膜血管壁中Aβ的积聚来评估CAA的发展(Gurol ME等人，2016)。可替代地，可以通过监测脑微出血(CMB)作为CAA的出血标志物来评估CAA的发展(Greenberg SM等人，2014)。用于监测CMB的适合的技术包括例如磁共振成像(MRI)、磁敏度加权成像(SWI)和MRI T2*加权的梯度回波成像(GRE)，并且描述于Cheng AL等人，2013。此外，诊断为CAA的患者的白质高信号(WMH)的体积远远高于健康老年个体或患有AD或轻度认知损害(MCI)的患者(Greenberg SM等人，2014)。因此，可以通过使用MRI测量WMH体积来监测CAA发展(Chen YW等人，2006)。预期“CAA的治疗”将具有经历接受CAA治疗的患者中脑缺血事件发生的可能性的最终益处。因此，在本发明的一个实施例中，术语“CAA的治疗”等同于术语“脑内出血的治疗”。在本发明的另一个实施例中，术语“CAA的治疗”等同于术语“CAA和/或脑内出血的治疗”。在本发明的另一个实施例中，术语“CAA的治疗”等同于术语“CAA和与之相关的脑内出血的治疗”。

如本文所用，术语“CAA的预防”是指CAA的预防性治疗；延迟CAA的发作或进展；或延迟CAA的至少一种临床症状的发作或进展。例如，CAA的发作或进展延迟至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在本发明的一个实施例中，术语“CAA的预防”等同于术语“脑内出血的预防”。在本发明的另一个实施例中，术语“CAA的预防”等同于术语“CAA和/或脑内出血的预防”。在本发明的另一个实施例中，术语“CAA的预防”等同于术语“CAA和与之相关的脑内出血的预防”。

如本文所用，术语“发展CAA的遗传倾向”包括但不限于其中遗传倾向由以下原因引起的情况：唐氏综合征；淀粉样前体蛋白或早老素-1的基因突变；或者存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

如本文所用，除非上下文明确指出仅指临床前阿尔茨海默病或仅指临床阿尔茨海默病，否则术语“阿尔茨海默病”或“AD”涵盖临床前和临床阿尔茨海默病两者。

如本文所用，除非上下文明确指出仅指AD引起的MCI或由AD引起的痴呆，否则术语“临床阿尔茨海默病”或“临床AD”涵盖由AD引起的轻度认知损害(MCI)和由AD引起的痴呆两者。欧洲药品管理局(EMA，European Medicines Agency)在其“Draft guidelines on theclinicalinvestigation of medicines for the treatment of AD and otherdementias”[用于治疗AD和其他痴呆的药物的临床研究指南草案](EMA/人用药品委员会(CHMP，Committee for Medicinal Products for Human Use)/539931/2014)中总结了国家老龄化研究所对于如下所述由AD引起的MCI、和AD痴呆的诊断标准。

由AD引起的MCI诊断需要个体内衰退的证据，表现为：

a)如自我报告或填报者报告和/或临床医生的判断所指出的那样，认知从先前达到的水平发生变化。

b)相对于年龄和教育匹配的规范值，至少一个领域(但不一定是情景记忆)的认知受损；容许一个以上认知领域的损害。

c)保持功能能力的独立性，尽管该标准也接受在开展工具性日常生活活动(IADL)时的“轻微问题”，此时可接受有限的辅助(即，不坚持独立，而是该标准允许因功能丧失引起的轻度依赖)。

d)无痴呆，其名义上是c的功能(上文)。

e)在没有其他潜在痴呆症的情况下，临床表现与AD表型一致。可以通过以下方面提高诊断可信度

1)最佳：阳性Aβ生物标志物和阳性变性生物标志物

2)不太理想：

i.阳性Aβ生物标志物，无变性生物标志物

ii.阳性变性生物标志物，无测试Aβ生物标志物

AD痴呆的诊断需要：

a)由个体内认知和功能的下降确定存在痴呆。

b)起病隐匿性和渐进性认知下降。

c)两个或更多个认知领域的损害；尽管遗忘表现是最常见的，但该标准允许基于非遗忘表现(例如执行功能和视觉空间能力的损害)进行诊断。

d)不存在与其他痴呆症相关的突出特征。

可以通过上文由AD引起的MCI章节中讨论的生物标志物算法提高诊断可信度。

如本文所用，术语“临床前阿尔茨海默病”或“临床前AD”是指在没有临床症状的情况下存在AD的体内分子生物标志物。美国国家老龄化研究所和阿尔茨海默病协会(National Institute on Aging and Alzheimer’s Association)提供了如下表1所示的方案，其中列出了临床前AD的不同阶段(Sperling RA等人，2011)。

表1：临床前AD阶段类别

sMRI＝结构磁共振成像

如本文所用，术语“患者”是指人类受试者。

如本文所用，术语“淀粉样物质阳性”是指脑中具有可检测水平的积聚Aβ的患者。在一个实施例中，如果基于对CSF中的Aβ的评估、或淀粉样物质PET成像、或两者，患者具有可检测水平的积聚Aβ，则该患者呈“淀粉样物质阳性”。

如本文所用，术语“通过PET确定的淀粉样物质阳性”是指与背景相比淀粉样物质PET示踪剂保留水平增加。可以通过视觉读数和/或使用标准化摄取比率(SUVR)的半定量测量来进行比较。用于通过定性视觉读数测量淀粉样物质阳性的适合的PET示踪剂包括¹⁸F-氟贝他吡(Palmqvist S等人，2015)、¹⁸F-氟比他班(florbetaben)(NeuraCeq)和¹⁸F-氟美他莫(flutemetamol)(Vizamyl)。脑¹⁸F-氟贝他吡PET扫描(每次扫描260MBq)中1.1或更高的SUVR可用作指示淀粉样物质阳性的半定量诊断阈值(Schreiber S等人，2015)。1.2或1.3的SUVR也可用作阈值。

如本文所用，术语“通过CSF测量确定的淀粉样物质阳性”是指与健康对照组中观测到的值相比降低的CSF Aβ1-42值。例如，淀粉样物质阳性可以通过CSF中192ng/L或更低的Aβ1-42值来确定(Mattsson N等人，2015)。然而，用于确定淀粉样物质阳性的CSF Aβ 1-42截止值将根据所用的特定技术而变化(Forlenza OV等人，2015)。淀粉样物质阳性也可以通过CSF中小于0.09的Aβ1-42/Aβ 1-40比率来确定(Janelidze S等人，2016)。在一个实施例中，Aβ 1-42/Aβ 1-40或Aβ42/Aβ40比率小于0.20、0.15、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06或0.05，或在0.20与0.01之间、0.15与0.01之间、0.10与0.01之间或0.05与0.01之间。可以使用标准免疫测定技术测量Aβ1-40和Aβ1-42值，例如使用Luminex平台的单克隆单抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)测定法(Herskovitz AZ等人，2013)或Meso Scale Discovery(MSD)96孔多阵列人/啮齿动物(6E10)Aβ40和42夹心免疫测定法(MSD公司(Meso ScaleDiscovery),罗克维尔市,马里兰州,美国)。

如本文所用，术语“CYP3A4”是指细胞色素P450 3A4。CYP3A4是一种在多种药物的代谢中起主要作用的酶(Luo G等人，2004)。

如本文所用，术语“CYP3A4诱导剂”是指引起CYP3A4活性水平增加的药物。CYP3A4诱导剂的实例包括但不限于卡马西平、苯妥英、利福平和圣约翰草(St John’s wort)。适于测量CYP3A4活性的技术是公知的(参见例如Sevrioukova IF,Poulos TL,2015)。CYP3A4的“强”、“中度”和“弱”诱导剂是分别使化合物1的血浆曲线下面积(AUC)(按照0到无穷大的曲线下面积(AUCinf)计算)减小≥80％、≥50％至<80％和≥20％至<50％的药物。在一个实施例中，“CYP3A4诱导剂”是“CYP3A4的强诱导剂”。CYP3A的强诱导剂的实例包括但不限于卡马西平、恩杂鲁胺、米托坦、苯妥英、甲哌利福霉素(也称为利福平)和圣约翰草。CYP3A的中度诱导剂的实例包括但不限于波生坦、依法韦仑、依曲韦林和莫达非尼。CYP3A的弱诱导剂的实例包括但不限于阿莫达非尼和卢非酰胺。参见http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentReso urces/DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm#table3-3(最后访问时间为2016年10月11日)。

如本文所用，术语“CYP3A4抑制剂”是指引起CYP3A4活性水平降低的药物。适于测量CYP3A4活性的技术是公知的(参见例如Sevrioukova IF,Poulos TL,2015)。CYP3A4抑制剂的实例包括但不限于克拉霉素、葡萄柚汁和伊曲康唑。CYP3A4的“强”、“中度”和“弱”诱导剂是分别使化合物1的血浆AUC(按照0到无穷大的曲线下面积(AUCinf)计算)增加≥5倍、≥2至<5倍和≥1.25至<2倍的药物。在一个实施例中，“CYP3A4抑制剂”是“CYP3A4的强抑制剂”。CYP3A的强抑制剂的实例包括但不限于波普瑞韦、可比司他、考尼伐坦、丹诺普韦和利托那韦、埃替拉韦和利托那韦、葡萄柚汁、茚地那韦和利托那韦、伊曲康唑、酮康唑、洛匹那韦和利托那韦、帕利瑞韦和利托那韦和(奥比他韦和/或达萨布韦)、泊沙康唑、利托那韦、沙奎那韦和利托那韦、特拉匹韦、替拉那韦和利托那韦、醋竹桃霉素、伏立康唑、克拉霉素、地尔硫艾代拉里斯、萘法唑酮和奈非那韦。CYP3A的中度抑制剂的实例包括但不限于阿瑞匹坦、甲腈咪胍、环丙沙星、克霉唑、克唑替尼、环孢菌素、决奈达隆、红霉素、氟康唑、氟伏沙明、伊马替尼、托非索泮和维拉帕米。CYP3A的弱抑制剂的实例包括但不限于氯唑沙宗、西洛他唑、福沙吡坦、伊曲茶碱、伊伐卡托、洛美他派、雷尼替丁、雷诺嗪、他克莫司和替卡格雷。参见http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm#table3-2(最后访问时间为2016年10月11日)。

如本文所用，术语“同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗”是指患者接受CYP3A4抑制剂或诱导剂的治疗方案，同时还接受化合物1的治疗方案的情形。在一个实施例中，患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂和化合物1治疗超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16周。在另一个实施例中，患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂和化合物1治疗超过1、2、3、4、5、7、10或12个月。在某个实施例中，患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂和化合物1治疗超过3个月。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指保持本发明化合物的生物有效性并且通常在生物学上或其他方面并非是不合需要的盐(Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use[药用盐：性质、选择和使用]，第2修订版(2011)P.Heinrich Stahl,Camille G.Wermuth)。

如本文所用，“药物组合物”包含适于经口给药的固体形式(通常为明胶胶囊)的本发明化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体。可以在Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿氏药物科学]中找到药学上可接受的载体的列表。

术语本发明的化合物的“治疗有效量”是指本发明的化合物在患者中将引起BACE-1抑制的量，正如CSF或血浆Aβ 1-40水平相对于初始基线值降低所证明的那样。

为了阐明，每当本文提供某个范围时，所述范围意在包括端点。例如，30mg/天与50mg/天之间的剂量范围也包括30mg/天和50mg/天的剂量。

缩写列表

实例

以下实例说明如何制备化合物1(实例1)；显示化合物1在APOE4转基因小鼠模型中的PK/PD作用(实例2)；显示化合物1在首次人体临床研究中的PD作用(实例3)；证明化合物1在3个月临床研究中的安全性和耐受性(实例4)；显示在3个月临床研究中ApoE4基因型对化合物1PD反应的影响(实例5)；证明化合物1在APP23 AD小鼠模型中减轻CAA方面的治疗有效性(实例6)；证明化合物1在减少老年APP23小鼠脑微出血中的明显治疗有效性(实例7)；显示当联合CYP3 A4的强抑制剂或诱导剂给予时，如何影响化合物1的AUC(实例8)；并说明如何在ApoE4纯合体风险患者中进行化合物1治疗CAA和与之相关的脑内出血的功效研究(实例9)。

实例1：化合物1的制造

在WO 2012/095469 A1(实例34)中描述了化合物1的制造。也可如下所述制造化合物1。

NMR方法

除非另有说明，否则用Bruker 400MHz超屏蔽光谱仪(ultrashieldspectrometer)记录质子光谱。化学位移相对于甲醇(δ3.31)、二甲基亚砜(δ2.50)或氯仿(δ7.29)以ppm表示。将少量干燥样品(2mg至5mg)溶于适当的氘代溶剂(0.7mL)中。匀场自动进行，并且光谱根据本领域普通技术人员公知的程序获得。

一般色谱信息

HPLC方法H1(Rt_H1)：

HPLC柱尺寸：3.0x30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA；B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内30％至100％B，流量＝0.7ml/min

LCMS方法H2(Rt_H2)：

HPLC柱尺寸：3.0x30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA，B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内10％至100％B，流量＝0.7ml/min

UPLCMS方法H3(Rt_H3)：

HPLC柱尺寸：2.1x50mm

HPLC柱类型：Acquity UPLC HSS T3，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％甲酸+3.75mM乙酸铵，B)ACN+0.04体积％甲酸

HPLC梯度：1.4min内2％至98％B，0.75min 98％B，流量＝1.2ml/min

HPLC柱温：50℃

LCMS方法H4(Rt_H4)：

HPLC柱尺寸：3.0x30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA；B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内70％至100％B，流量＝0.7ml/min

LCMS方法H5(Rt_H5)：

HPLC柱尺寸：3.0x30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA；B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内80％至100％B，流量＝0.7ml/min

LCMS方法H6(Rt_H6)：

HPLC柱尺寸：3.0x30mm

HPLC柱类型：Zorbax SB-C18，1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积％TFA；B)ACN+0.05体积％TFA

HPLC梯度：在3.25min内40％至100％B，流量＝0.7ml/min

a)2-溴-5-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶

将二异丙胺(25.3g，250mmol)于370ml THF中的溶液用干冰丙酮浴在-75℃冷却。滴加BuLi(100ml，250mmol，2.5M的己烷溶液)，同时保持温度低于-50℃。在混合物温度再次达到-75℃后，滴加2-溴-5-氟吡啶(36.7g，208mmol)于45ml THF中的溶液。将混合物在-75℃搅拌1h。迅速添加三乙基氯硅烷(39.2g，260mmol)。温度保持在-50℃以下。移除冷却浴并允许将反应混合物加温至-15℃，倒到NH₄Cl水溶液(10％)上。添加TBME并将各层分离。用盐水洗涤有机层，用MgSO₄.H₂O干燥，过滤并蒸发得到褐色液体，将褐色液体在0.5mm Hg下蒸馏以产生呈浅黄色液体的标题化合物(沸点105℃-111℃)。HPLC：Rt_H4＝2.284min；ESIMS：290,292[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：8.14(s,1H),7.40(d,1H),1.00-0.82(m,15H)。

b)1-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-乙酮

将二异丙胺(25.4g，250mmol)于500ml THF中的溶液冷却至-75℃。滴加BuLi(100ml，250mmol，2.5M的己烷溶液)，同时保持温度低于-50℃。在反应温度再次达到-75℃后，滴加2-溴-5-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶(56.04g，193mmol)于60ml THF中的溶液。将混合物在干冰浴中搅拌70分钟。快速添加N,N-二甲基乙酰胺(21.87g，250mmol)，反应温度升至-57℃。将反应混合物在干冰浴中搅拌15min，然后升温至-40℃。将其倒入2M HCl水溶液(250ml，500mmol)、250ml水和100ml盐水的混合物中。将混合物用TBME提取，用盐水洗涤，经MgSO₄.H₂O干燥，过滤并蒸发以得到黄色油状物，将黄色油状物在硅胶柱上通过用己烷/0％-5％TBME洗脱而纯化，以产生58.5g呈黄色液体的标题化合物。TLC(Hex/TBME 99/1)：R_f＝0.25；HPLC：Rt_H4＝1.921min；ESIMS：332,334[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：7.57(d,1H),2.68(s,3H),1.00-0.84(m,15H)。

c)(S)-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-2-三甲基硅烷氧基-丙腈

首先，通过将水(54mg，3.00mmol)溶解在100ml无水DCM(≦0.001％水)中来制造催化剂溶液。将这种湿的DCM(44ml，1.32mmol含水量)添加到充分搅拌的丁醇钛(IV)(500mg，1.47mmol)于20ml无水DCM中的溶液中。使所得的澄清溶液回流1h。然后将该溶液冷却至rt并添加2,4-二叔丁基-6-{[(E)-(S)-1-羟甲基-2-甲基-丙基亚氨基]-甲基}-苯酚[CAS155052-31-6](469mg，1.47mmol)。将所得的黄色溶液在rt搅拌1h。将这种催化剂溶液(0.023M，46.6ml，1.07mmol)添加到1-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-乙酮(35.53g，107mmol)和三甲基甲硅烷基氰化物(12.73g，128mmol)于223ml无水DCM中的溶液中。将混合物搅拌2天，然后蒸发得到47g呈橙色油状物的粗制标题化合物。HPLC：Rt_H5＝2.773min；ESIMS：431,433[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：7.46(d,1H),2.04(s,3H),1.00(t,9H),1.03-0.87(m,15H),0.20(s,9H)。

d)(R)-1-氨基-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-丙-2-醇盐酸盐

将硼烷二甲硫醚复合物(16.55g，218mmol)添加到粗制(S)-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-2-三甲基硅烷氧基-丙腈(47g，109mmol)于470ml THF中的溶液中。使混合物回流2h。移除加热浴，小心滴加MeOH使反应混合物淬灭。在气体停止释出后，缓慢添加6M HCl水溶液(23.6ml，142mmol)。蒸发所得溶液，将残余物溶于MeOH中并蒸发(两次)，以产生44.5g纯度足以用于进一步反应的黄色泡沫。HPLC：Rt_H1＝2.617min；ESIMS：363,365[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：7.93(s,br,3H),7.53(d,1H),6.11(s,br,1H),3.36-3.27(m,1H),3.18-3.09(m,1H),1.53(s,3H),0.99-0.81(m,15H)。

e)(R)-N-(2-(6-溴-3-氟-4-(三乙基甲硅烷基)吡啶-2-基)-2-羟丙基)-4-硝基苯磺酰胺

向粗制(R)-1-氨基-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基硅烷基-吡啶-2-基)-丙-2-醇盐酸盐(43.5g，109mmol)于335ml THF中的溶液中添加NaHCO₃(21.02g，250mmol)于500ml水中的溶液。将混合物冷却至0℃-5℃并滴加4-硝基苯磺酰氯(26.5g，120mmol)于100ml THF中的溶液。将所得乳液搅拌过夜，同时使温度达到rt。用TBME提取混合物。将有机层用MgSO₄.H₂O干燥，过滤并蒸发以得到橙色树脂，将橙色树脂在硅胶柱上通过用己烷/10％-20％EtOAc洗脱而纯化，以产生37.56g呈黄色树脂的标题化合物。TLC(Hex/EtOAc 3/1)：R_f＝0.34；HPLC：Rt_H4＝1.678min；ESIMS：548,550[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：8.40(d,2H),8.06(t,1H),7.97(d,2H),7.45(d,1H),5.42(s,1H),3.23(d,2H),1.44(s,3H)0.97-0.81(m,15H)；手性HPLC(Chiralpak AD-H 1213,UV 210nm)：90％ee。

f)6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺酰基)-氮杂环丙烷-2-基]-4-三乙基硅烷基-吡啶

将三苯基膦(21.55g，82mmol)和(R)-N-(2-(6-溴-3-氟-4-(三乙基甲硅烷基)吡啶-2-基)-2-羟丙基)-4-硝基苯磺酰胺(37.56g，69mmol)于510ml THF中的溶液冷却至4℃。滴加偶氮二甲酸二乙酯于甲苯中的溶液(按重量计40％，38.8g，89mmol)，同时保持温度低于10℃。移除冷却浴，将反应混合物在rt搅拌1h。用约1000ml甲苯稀释反应混合物并在旋转蒸发仪上蒸发除去THF。将所得粗制产物的甲苯溶液在硅胶柱上通过用己烷/5％-17％EtOAc洗脱而预纯化。将最纯的级分合并、蒸发并从TBME/己烷中结晶，以产生29.2g呈白色晶体的标题化合物。HPLC：Rt_H4＝2.546min；ESIMS：530,532[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：8.40(d,2H),8.19(d,2H),7.39(d,1H),3.14(s,1H),3.02(s,1H),2.01(s,3H)1.03-0.83(m,15H)；α[D]-35.7°(c＝0.97,DCM)。

g)6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺酰基)-氮杂环丙烷-2-基]-吡啶

将氟化钾(1.1g，18.85mmol)添加到6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺酰基)-氮杂环丙烷-2-基]-4-三乙基硅烷基-吡啶(5g，9.43mmol)和AcOH(1.13g，9.43mmol)于25ml THF中的溶液中。添加DMF(35ml)并将该悬浮液在rt搅拌1h。将反应混合物倒到饱和NaHCO₃水溶液和TBME的混合物上。将各层分离并用盐水和TBME洗涤。将合并的有机层用MgSO₄.H₂O干燥，过滤并蒸发得到黄色油状物，将黄色油状物从TBME/己烷中结晶，以产生3.45g呈白色晶体的标题化合物。HPLC：Rt_H6＝2.612min；ESIMS：416,418[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：8.41(d,2H),8.19(d,2H),7.48(dd,1H),7.35(t,1H),3.14(s,1H),3.03(s,1H),2.04(s,3H)；α[D]-35.7°(c＝0.89,DCM)。

h)(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酸乙酯

将(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基-丙酸乙酯(11.93g，64.1mmol)于DMF(158ml)中的溶液抽空/用氮气吹扫两次。滴加KOtBu(6.21g，55.5mmol)于DMF(17ml)中的溶液，同时使用水浴冷却以保持约25℃的反应温度。15min后，添加固体6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺酰基)-氮杂环丙烷-2-基]-吡啶(17.78g，42.7mmol)，继续搅拌3h。将反应混合物倒到1M HCl(56ml)、盐水和TBME的混合物上。将各层分离，用盐水和TBME洗涤。将合并的有机层用MgSO₄.H₂O干燥，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法(己烷/25％-33％TBME)纯化反应粗制产物，以产生16.93g呈黄色树脂的标题化合物，它被异构副产物污染(¹H-NMR测得的比率为70:30)。

HPLC：Rt_H6＝2.380min；ESIMS：602,604[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：8.32(d,2H),8.07(d,2H),7.46-7.41(m,1H),7.30-7.23(m,1H),6.92(s,1H),3.39-4.30(m,2H),3.95(d,1H),3.84(d,1H),1.68(s,3H),1.56(s,3H),1.40-1.34(m,3H)+异构副产物。

i)(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酰胺

将(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酸乙酯(16.93g，28.1mmol)于NH₃/MeOH(7M，482ml)中的溶液在50℃在密封容器中搅拌26h。蒸发反应混合物，将残余物从DCM中结晶，以产生9.11g呈无色晶体的标题化合物。

HPLC：Rt_H6＝2.422min；ESIMS：573,575[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：8.33(d,2H),8.06(d,2H),7.42(dd,1H),7.30-7.26(m,1H),7.17(s,br,1H),6.41(s,1H),5.57(s,br,1H),4.15(m,2H),1.68(s,3H),1.65(s,3H)。

j)N-[(R)-1-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-((R)-1-氰基-2,2,2-三氟-1-甲基-乙氧基)-1-甲基-乙基]-4-硝基-苯磺酰胺

将(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺酰基氨基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酰胺(8.43g，14.70mmol)和三乙胺(5.12ml，36.8mmol)于85ml DCM中的溶液冷却至0℃至5℃。在30min内滴加三氟乙酸酐(2.49ml，17.64mmol)。添加另外的三乙胺(1.54ml，11.07mmol)和三氟乙酸酐(0.75ml，5.29mmol)以完成反应。通过添加14ml氨水(25％)和14ml水淬灭反应混合物。将乳液搅拌15min，添加更多的水和DCM并将各层分离。用MgSO₄H₂O干燥有机层，过滤并蒸发。通过硅胶柱色谱法(己烷/10％-25％EtOAc)纯化得到8.09g呈黄色树脂的标题化合物。

HPLC：Rt_H6＝3.120min；ESIMS：555,557[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：8.35(d,2H),8.11(d,2H),7.50(dd,1H),7.32(dd,1H),6.78(s,1H),4.39(d 1H),4.22(d,1H),1.68(s,6H)。

k)(2R,5R)-5-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基胺

将N-[(R)-1-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-((R)-1-氰基-2,2,2-三氟-1-甲基-乙氧基)-1-甲基-乙基]-4-硝基-苯磺酰胺(9.18g，16.53mmol)和N-乙酰基半胱氨酸(5.40g，33.10mmol)于92ml乙醇中的溶液抽空并用氮气吹扫。添加K₂CO₃(4.57g，33.1mmol)并将混合物在80℃搅拌3天。将反应混合物真空浓缩至原体积的约1/4，并在水与TBME之间分配。用10％K₂CO₃水溶液洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，得到黄色油状物。在二氧化硅上进行柱色谱法(己烷/14％-50％(EtOAc:MeOH95:5))，得到4.55g呈灰白色固体的标题化合物。

HPLC：Rt_H2＝2.741min；ESIMS：370,372[(M+H)⁺,1Br]；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：7.71-7.62(m,2H),5.97(s,br,2H),4.02(d 1H),3.70(d,1H),1.51(s,3H),1.47(s,3H)。

l)(2R,5R)-5-(6-氨基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基胺

用氮气净化玻璃/不锈钢高压釜，添加于乙二醇(130ml)中的Cu₂O(0.464g，3.24mmol)、氨(101ml，25％水溶液，648mmol，30当量)和(2R,5R)-5-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基胺(8g，21.6mmol)。关闭高压釜，将悬浮液加热至60℃，搅拌溶液约48小时(最大压力0.7巴，内部温度59℃至60℃)。将反应混合物用乙酸乙酯和水稀释。有机相用水洗涤并用12％氨水洗涤4次，最后用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将粗产物(7g，含有一些乙二醇，定量产率)不经进一步纯化而用于下一步骤。

HPLC：Rt_H3＝0.60min；ESIMS：307[(M+H)⁺]。

m)[(2R,5R)-5-(6-氨基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基]-氨基甲酸叔丁酯

将(2R,5R)-5-(6-氨基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基胺(6.62g，21.6mmol)、Boc₂O(4.72g，21.6mmol)和Hünig碱(5.66ml，32.4mmol)于二氯甲烷(185ml)中的溶液在rt搅拌18小时。用饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤反应混合物。将水层用二氯甲烷反提取，并将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并蒸发以得到浅绿色固体(14g)。将粗制产物在硅胶上色谱分离(环己烷:乙酸乙酯95:5至60:40)，得到7.68g标题化合物。

TLC(环己烷:乙酸乙酯3:1)：R_f＝0.21；HPLC：Rt_H3＝1.14min；ESIMS：408[(M+H)⁺]；¹H-NMR(400MHz,CDCl3)：11.47(br.s,1H),7.23(dd,J＝10.42,8.78Hz,1H),6.45(dd,J＝8.78,2.64Hz,1H),4.50(br.s,2H),4.32(d,J＝2.38Hz,1H),4.10(d,J＝11.80Hz,1H),1.69(s,3H,CH3),1.65(s,3H,CH3),1.55(s,9H)。

n)((2R,5R)-5-{6-[(3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-羰基)-氨基]-3-氟-吡啶-2-基}-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基)-氨基甲酸叔丁酯

将于DMF(81ml)中的[(2R,5R)-5-(6-氨基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基]-氨基甲酸叔丁酯(3.3g，8.12mmol)、3-氯-5-三氟甲基吡啶甲酸(2.2g，9.74mmol)、HOAt(1.99g，14.62mmol)和EDC盐酸盐(2.33g，12.18mmol)的混合物在rt搅拌48小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将粗制产物(12g)在硅胶上进行色谱分离(环己烷:乙酸乙酯1:1)，以产生5.2g标题化合物。

TLC(硅胶，环己烷:乙酸乙酯3:1)：R_f＝0.47；HPLC：Rt_H3＝1.40min；ESIMS：615,616[(M+H)⁺,1Cl]；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)：11.68(s,1H),10.41(s,1H),8.81(dd,J＝1.82,0.69Hz,1H),8.45(dd,J＝8.91,3.14Hz,1H),8.19(dd,J＝1.88,0.63Hz,1H),7.59(dd,J＝9.79,9.16

Hz,1H),4.38(d,J＝2.13Hz,1H),4.18(d,J＝11.80Hz,1H),1.75(s,3H),1.62(s,3H),1.60(s,9H)。

o)3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-甲酸[6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-三氟甲基-3,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基)-5-氟-吡啶-2-基]-酰胺

将((2R,5R)-5-{6-[3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-羰基)-氨基]-3-氟-吡啶-2-基}-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氢-2H-[1,4]噁嗪-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(4.99g，8.13mmol)和TFA(6.26ml，81mmol)于二氯甲烷溶液(81ml)中的混合物在rt搅拌18小时。蒸发溶剂并将残余物用适合的有机溶剂如乙酸乙酯和氨水稀释。添加冰，用水和盐水洗涤有机相，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发，以产生3.78g标题化合物。

HPLC：Rt_H3＝0.87min；ESIMS：514,516[(M+H)⁺,1Cl]；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.11(s,1H),9.06(s,1H),8.69(s,1H),8.13(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),7.80-7.68(m,1H),5.88(br.s,2H),4.12(d,J＝11.5Hz,1H),3.72(d,J＝11.4Hz,1H),1.51(s,3H),1.49(s,3H)。

实例2：化合物1在APOE4-TR小鼠中的急性PK/PD剂量-反应研究

为了研究化合物1对人APOE4背景中APP代谢的影响，在携带人APOE4等位基因的转基因小鼠中进行了PK/PD研究(小鼠Apoe基因被人APOE4置换；APOE4-TR；(Knouff C等人，1999))。

在这项研究中，用不同剂量(3u mol/kg、10u mol/kg、30u mol/kg)的化合物1急性治疗3至5月龄的雄性和雌性APOE4-TR动物，并在治疗后4h和24h时处死。

动物

从泰克尼克公司(Taconic)获得雄性和雌性转基因纯合APOE4-TR(B6.129P2-Apoe^{tm3(APOE*4)Mae} N8，泰克尼克公司，型号001549，3至5月龄，n＝48)。

剂量选择

化合物1按3μmol/kg、10μmol/kg和30μmol/kg给药。

化合物形式、配制和给药

将化合物1配制成悬浮液。通过经口给药给予媒介物或化合物，体积为一次10ml/kg。媒介物：于0.5％甲基纤维素水溶液中的0.1％Tween80。

表2：治疗组

体重

在给药前称取一次体重。

离体样品和样品收获方法

血液样品用于分析全血化合物水平，并在尸检当天从躯干血液采集到EDTAEppendorf管(Milian SA，目录号TOM-14，飞世尔科技公司(Fisher Scientific),沃伦(Wohlen),瑞士)中，或采集到血清管(CB300Z，扎尔施泰特公司(Sarstedt),宁布雷希特(Nümbrecht),德国)中。

用于淀粉样物质-β(Aβ)分析的血浆通过对EDTA血液离心(8000rpm/6800xg，15min，4℃)而收集到蛋白质Lo-Bind Eppendorf管(0030108.116，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中。

将所有血液/血浆/血清样品在干冰上冷冻并储存在-80℃下直至分析。

断头后立即将脑摘下，用盐水冲洗并沿中线呈矢状向下切片。左侧小脑用于分析化合物水平并置于玻璃管(Chromacol，125x5-SV T051，韦林花园城(Welwyn GardenCity),英国)中，称重并冷冻在干冰中，前脑左半部分(不含嗅球)用于Aβ分析，并冷冻在干冰上的金属板上，且置于蛋白质Lo-bind管(003 0108.116，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中。将右脑在4％多聚甲醛中固定，在PBS中洗涤，然后包埋在石蜡中，用于未来可能的组织学分析。

在研究结束时采集尾部并储存在-20℃。

表3：化合物水平分析

对小鼠脑中Aβ40及CSF中的Aβ40和Aβ42的分析

脑匀化

称取冷冻的小鼠前脑并在9倍体积(w/v)的冰冷的完全TBS(20mM Tris-HCl pH7.4、137mM NaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1836145，罗氏诊断有限公司(RocheDiagnostics GmbH),潘茨堡,德国])中通过超声处理(90％占空比，输出控制5，40至55个脉冲，[Sonifier450，布兰森(Branson)])进行匀化。匀化后，制造几个50μl等分试样用于分析，并储存在-80℃下。

制造合成的Aβ1-40溶液作为标准品

人Aβ肽(1-40)三氟乙酸盐(H 1194.1000，巴亨公司(Bachem),布本多夫(Bubendorf),瑞士)用作Aβ1-40的校准曲线。将其在室温(RT)下以1mg/ml的浓度溶解于无水DMSO(41647，弗鲁克公司(Fluka))中约30min，然后目测检查完全溶解。

在LoBind管(0030108.094，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中制造剩余溶液的20x5μl等分试样和100μl等分试样，用氮气覆盖以避免Aβ肽氧化并储存在-80℃下。对于校准曲线，5μl等分试样仅使用一次，然后丢弃。

小鼠脑内Aβ40的确定

用Meso Scale Discovery(MSD)96孔多阵列人/啮齿动物(4G8)Aβ40超灵敏测定法(#K110FTE-3，MSD公司(Meso Scale Discovery),盖瑟斯堡(Gaithersburg),美国)确定小鼠中的内源性Aβ40。除校准曲线和样品制造外，根据生产商的说明进行测定。TritonX-100(TX-100)可溶性Aβ40是用1％TX-100从前脑中提取的，所述提取使用各自为1:10前脑匀浆的50μl等分试样与50μl 2％TX-100一起混合在完全TBS(20mM Tris-HCl pH 7.4、137mMNaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1836145，罗氏诊断有限公司(Roche DiagnosticsGmbH),潘茨堡,德国])中，达到1％TX-100的最终浓度和1:20前脑稀释度。将样品在冰上孵育15min并且每5min涡旋一次。将样品超速离心(100000xg，4℃，15min)并将50μl澄清的上清液转移到新的管中。对于Aβ40测定，将上清液在3％Blocker A溶液(来自试剂盒)中按1:5进一步稀释成1:100的最终前脑稀释液并施加到板上。

通过掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的1％BlockerA溶液的相应稀释液绘制校准曲线，非转基因小鼠脑样品除外：在这种情况下，用掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的相应经稀释的APP敲除小鼠前脑绘制校准曲线。对于所有样品和标准品，每孔施加25μl。对于每次确定，进行重复孔。来自重复孔的平均值用于计算。由于MSD不提供定量软件，因此将样品和标准品的相对单位导入SOFTmax PRO 4.0进行标准曲线计算和样品定量。

结果

用三种不同剂量(3μmol/kg、10μmol/kg和30μmol/kg)的BACE抑制剂化合物1急性治疗APOE4-TR小鼠(小鼠Apoe基因被人APOE4置换)。在最后一个剂量后4h和24h处死动物并分离前脑。各组的Aβ1-40和Aβ1-42浓度总结在图1、图2和图3；以及表5、表6和表7中。计算相比于媒介物治疗组的减少百分比。所有治疗均在最后一个剂量后4h和24h引起显著且具有剂量依赖性的Aβ40减少，效果范围为4h的43％至77％，24h的20％至66％。对于两个较低剂量组(3μmol/kg和10μmol/kg)而言，Aβ40降低效果在4h和24h时显著降低，但在最后一个剂量后24h基本接近于基线水平。高剂量的化合物1(30μmol/kg)显示出几乎平坦的曲线，在整个24h时间过程中Aβ40减少77％至66％。

表4：化合物1治疗对APOE4-TR小鼠脑中Aβ40水平的影响(n＝6(n＝3只雄性，n＝3只雌性))

n.a.：不适用，媒介物：合并的所有媒介物

表5：化合物1治疗对APOE4-TR小鼠CSF中Aβ40水平的影响(n＝6(n＝3只雄性，n＝3 只雌性))

n.a.：不适用，媒介物：合并的所有媒介物，ns：不显著

表6：化合物1治疗对APOE4-TR小鼠CSF中Aβ42水平的影响(n＝6(n＝3只雄性，n＝3 只雌性))

n.a.：不适用，媒介物：合并的所有媒介物，ns：不显著

图4和表7中显示了急性给药4h和24h时血液和脑中的PK数据。化合物1在24h内在血液和脑中的暴露(表示为AUC_0-24h)总结于表8中。化合物1在血液和脑中的暴露与剂量成比例，并展示出24h后化合物水平的预期轻微下降，同样与剂量成比例。脑中的化合物暴露远远高于血液中的暴露。3μmol/kg、10μmol/kg和30μmol/kg剂量组的脑血液比率相似，4h时分别为5、3和4，24h时分别为9、4和3。计算4h/24h的暴露比，这允许比较不同剂量下化合物暴露的下降(表7)。化合物1具有中度的2-5倍暴露减少，不同剂量之间以及血液与脑之间没有显著差异。

表7：APOE4-TR小鼠的血液和脑中的化合物1水平(n＝6(n＝3只雄性，n＝3只雌性))

表8：APOE4-TR小鼠血液和脑中的化合物1AUC_0-24h

AUC得自4h和24h时间点

所有剂量组的各个动物的脑药代动力学/药效动力学关系如图5所示。化合物1存在明显的PK/PD关系；在低化合物水平下，Aβ减少功效最小，而在高化合物水平下，检测到最大功效作用。

图6显示了不同剂量下平均值的PK/PD关系。同样，对Aβ减少的暴露依赖性影响是明显的，具有明显的最小和最大功效作用。

结论

在该实验实例中呈现的研究表明，化合物1在APOE4-TR小鼠中是可口服、具有中枢活性且强效的BACE抑制剂。使用由小鼠内源性Apoe基因座表达人APOE4的APOE4-TR小鼠来研究了化合物1的PK/PD关系。ApoE4被认为是阿尔茨海默病和CAA的高风险因素。

APOE4-TR小鼠中化合物1的PK特性与野生型小鼠中观察到的PK特性没有差异。观察到血液和脑中剂量依赖性的化合物1暴露，其中脑水平要远远更高。此外，24h后的暴露减少与在野生型小鼠中观察到的相似。30μmol/kg的化合物1对APOE4-TR脑中的Aβ减少产生最大影响(>70％)，对于急性给药而言相似程度持续超过24h。PK/PD关系与野生型小鼠和大鼠非常相似。在最高剂量(30μmol/kg)下，对APOE4-TR小鼠脑中Aβ减少的最大功效作用略低。这可能是由于在APOE-4TR小鼠中观察到的淀粉样物质-β清除率较低引起的(CastellanoJM等人，2011)。

实例3：首次人体研究

该研究已在临床上完成，是一项随机、双盲、安慰剂对照的单次和多次递增口服剂量研究，主要评估化合物1在健康成人和老年受试者中的安全性和耐受性以及药代动力学和药效动力学特性。这项研究的目的是确定化合物1的单个和多个最大耐受剂量，并使用CSF中的Aβ作为主要PD生物标志物评估药代动力学/药效动力学(PK/PD)关系。

经确定，在≥60岁的健康老年受试者中，750mg单剂量和两周内300mg QD的最高测试剂量是安全且耐受的。使用CSF中的Aβ浓度作为药物作用的主要生物标志物的药效动力学评估也已应用于健康老年受试者。在单次和多次给药后，确定Aβ40浓度的剂量依赖性降低分别达到约80％和90％(表9和表10，图7)。

表9：CSF中的Aβ40-随时间相对于基线的变化百分比总结

表10：CSF中的Aβ40-第15天(最后一个剂量后24h)相对于基线的变化百分比总结

实例4：3个月剂量范围安全性和耐受性研究

在I期临床剂量范围安全性和耐受性研究中，将化合物1给药给60岁或以上的健康老年受试者。本研究列于ClinicalTrials.gov中的NCT02576639标识码下。

这项随机、双盲、安慰剂对照研究采用平行组设计，将化合物1按每日一次口服剂量给药给五个治疗组(化合物1：2mg、10mg、35mg或85mg QD和安慰剂)。

该研究的主要目的是详述在首次人体研究中在2周和4周持续时间内获得的先前安全性和耐受性数据，从而允许在处于AD和CAA风险中的受试者中开始将来的长期功效试验。另外，获得了与药代动力学/药效动力学建模相关的数据，以支持将来功效研究的剂量选择决定。

在这项研究中，发现化合物1在三个月内每日一次2mg、10mg、35mg和85mg的剂量是安全且耐受的。表11和图8中显示了给药化合物1对CSF Aβ水平的药效动力学影响。随着时间的推移，Aβ降低的程度是稳定的，在约2至3周后达到PD稳态。

表11：第3个月CSF中的Aβ-Aβ38、Aβ40和Aβ42相对于基线的变化百分比分析

调整后的最小二乘均数、最小二乘均数差异、90％CI和P值得自ANCOVA模型，其中以治疗作为固定效应，以基线AB水平作为协变量

表12中显示了每天按2mg、10mg、35mg和85mg给药三个月(91天)后化合物1的药代动力学参数。

表12：第91天的化合物1药代动力学参数

C最大(ss值)表示按指定剂量每天一次(qd)给药91天后化合物1的最大血浆稳态浓度。“CV％”表示变异系数百分比。基于这些结果，预计每天一次15mg剂量的化合物1会产生在70ng/ml与170ng/ml之间的C最大(ss值)，并且预计每天一次50mg剂量的化合物1会产生在200ng/ml与500ng/ml之间的血浆C最大(ss值)。

基于实例3和4中呈现的数据，在90％的受试者中，药物计量学建模预测50mg的日剂量将实现80％CSF Aβ40降低而15mg的剂量将实现60％CSF Aβ40降低。

实例5：ApoE4基因型对化合物1治疗的反应的影响

在实例3和4中描述的已完成的首次人体以及3个月剂量范围安全性和耐受性临床研究中，在第一剂量(基线)之前和分别在多次给药2周和3个月之后，通过腰椎穿刺获得CSF中的Aβ浓度。还在知情同意的受试者中获得了ApoE4基因型。计算接受研究治疗且没有对药效动力学效应评价具有潜在影响的重大方案偏差的受试者中Aβ40和Aβ42浓度相对于基线的变化百分比。以下表13至表16提供了按照治疗组和ApoE基因型(E4杂合体相比E4非携带者)，相对于基线的变化百分比的总结统计。只有一名具有CSF数据的受试者是E4纯合体(得自3个月剂量范围安全性和耐受性研究)。用安慰剂治疗该受试者，显示出Aβ40和Aβ42浓度均降低11％，未包括在下表中。数据显示在ApoE4携带者与非携带者之间，针对化合物1治疗的CSF Aβ40和Aβ42反应没有差异。

表13：在3个月时按照ApoE基因型和化合物1治疗组相对于基线的Aβ40％变化

表14：在3个月时按照ApoE基因型和化合物1治疗组相对于基线的Aβ42％变化

表15：在首次人体临床研究中在2周时按照ApoE基因型和化合物1治疗组相对于基线的Aβ40％变化

表16：在首次人体临床研究中在2周时按照ApoE基因型和化合物1治疗组相对于基线的Aβ42％变化

实例6：用BACE抑制剂化合物1对带有斑块的雄性APP23小鼠进行长期治疗性治疗并评估CAA

发明内容

将化合物1按两个剂量长期给药给带斑年龄(12个月)的APP23转基因小鼠，持续6个月。与仅接受媒介物的组相比，按0.03g/kg食物给药化合物1导致与媒介物相比淀粉样物质-β40和42略有减少，而按0.3g/kg食物给药导致大大减少。小鼠脑中Aβ的量与基线(12月龄)时的小鼠相似。仅在高剂量组中，血浆和CSF中的可溶性Aβ显著减少。CD31和淀粉样物质-β阳性免疫反应性的共定位/邻近分析显示，高剂量的化合物1降低了具有25％-50％和50％-75％Aβ覆盖率的脑血管。

方法

动物和剂量选择

将雄性转基因、杂合APP23(B6,D2-Tg(Thy1App)23Sdz(Sturchler-Pierrat C等人，1997)，12至14月龄，n＝64)用食物颗粒中0.3g/kg或0.03g/kg的化合物1进行治疗。

表17：治疗组

3个处理组，每个处理组n＝18只小鼠；1个基线组，n＝10

离体样品和样品收获方法

断头后立即将脑摘下，用盐水冲洗并沿中线呈矢状向下切片。将脑左半部分用于分析化合物水平并将其置于玻璃管(Chromacol，125x5-SV T051，英国韦林花园城)中，称重并冷冻在干冰中，将前脑左半部分(不含嗅球)用于Aβ分析，并冷冻在干冰上的金属板上，并置于蛋白质Lo-bind管(003 0108.116，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中。

在研究结束时采集尾部并储存在-20℃。

化合物水平分析

通过液相色谱法/串联质谱法(HPLC/MS/MS)对血液和脑生物样品中的化合物1水平定量。将脑样品与2倍体积的KH2PO4缓冲液混合，并使用装置匀化。向30μL血液或脑匀浆掺入结构相关的内标，随后与至少6倍过量体积的乙腈混合用于蛋白质沉淀。将上清液直接注入LC/MS/MS系统中进行分析。

表18：血液和脑样品的仪器条件

对小鼠组织中Aβ40和Aβ42的分析

脑匀化

称取冷冻的小鼠前脑并在9倍体积(w/v)的冰冷的完全TBS(20mM Tris-HCl pH7.4、137mM NaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1836 145，罗氏诊断有限公司(RocheDiagnostics GmbH),潘茨堡,德国])中通过超声处理(90％占空比，输出控制5，40至55个脉冲，[Sonifier450，布兰森(Branson)])进行匀化。匀化后，制造几个50μl等分试样用于分析，并储存在-80℃下。

制造合成的Aβ溶液作为标准品

在LoBind管(0030 108.094，埃普多夫公司(Eppendorf),汉堡,德国)中制造剩余溶液的20x5μl等分试样和100μl等分试样，用氮气覆盖以避免Aβ肽氧化并储存在-80℃下。对于校准曲线，5μl等分试样仅使用一次，然后丢弃。

APP23小鼠脑中Triton X-100可溶性Aβ的确定

用Meso Scale Discovery(MSD)96孔多阵列人/啮齿动物(6E10)Aβ40/42测定法(MSD公司(Meso Scale Discovery),罗克维尔市,马里兰州,美国)确定小鼠中的人Aβ40和42，如[RD-2010-00284]中所述。除校准曲线和样品制造外，根据生产商的说明进行测定。TritonX-100(TX-100)可溶性Aβ40和Aβ42是用1％TX-100从前脑中提取的，所述提取使用各自为1:10前脑匀浆的50μl等分试样与50μl 2％TX-100一起混合在完全TBS(20mM Tris-HClpH 7.4、137mM NaCl、1x完全[蛋白酶抑制剂混合片剂：1836145，罗氏诊断有限公司(RocheDiagnostics GmbH),潘茨堡,德国])中，达到1％TX-100的最终浓度和1:20前脑稀释度。将样品在冰上孵育15min并且每5min涡旋一次。将样品超速离心(100000xg，4℃，15min)并将50μl澄清的上清液转移到新的管中。将上清液在3％Blocker A溶液(来自试剂盒)中按1:5进一步稀释成1:100的最终前脑稀释液并施加到板上。

通过掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的1％Blocker A溶液的相应稀释液绘制校准曲线，非转基因小鼠脑样品除外：在这种情况下，用掺有合成Aβ1-40肽(1.56pg/ml至100pg/ml)的相应经稀释的APP敲除小鼠前脑绘制校准曲线。对于所有样品和标准品，每孔施加25μl。对于每次确定，进行重复孔。来自重复孔的平均值用于计算。将样品和标准品的相对单位导入SOFTmax PRO 4.0进行标准曲线计算和样品定量。

APP23小鼠脑中甲酸可溶性Aβ的确定

将50微升前脑匀浆与116.6μl的100％甲酸混合，得到70％的最终甲酸浓度。将样品储存在冰上并且每5分钟涡旋一次。为了中和，将50μl混合物移液到新管中，并添加950μl含有1x完全蛋白酶抑制剂的1M Tris碱。将管在室温储存过夜，然后在4℃在Eppendorf微型离心机中以14000rpm离心15分钟。从顶层取出100μl并与100μl的3％Blocker A溶液(MesoScale测定试剂盒的组成部分)混合。将该样品直接施加至测定板(稀释度1:1332)或在1％Blocker A溶液中进一步稀释。

对小鼠CSF中Aβ40的分析

用57μL的1％Blocker A(MSD)稀释小鼠CSF样品(3μl)，并将25μl施加至测定板。

对小鼠血浆中Aβ40的分析

将血浆样品(30μl)与30μl的3％Blocker A(MSD)混合，并将25μl施加至测定板。

使用双荧光免疫组织化学法对淀粉样物质-β斑块和血管内皮细胞进行分析

使用识别淀粉样肽的C端部分的兔抗Aβ一抗(NT12)对淀粉样物质斑块染色(如Schrader-Fischer G和Paganetti PA,1996，以及Schrader-Fischer G等人，1997所述，产生该抗体)。使用来自Dianova GmbH(汉堡,德国)的大鼠抗CD31抗体(参考DIA310)检测血管内皮细胞。所有染色均使用全自动仪器VentanaUltra(罗氏诊断公司(RocheDiagnostics Schweiz AG),罗特克莱兹(Rotkreuz),瑞士)进行。所有化学品均由罗氏诊断公司提供。

使用所有研究动物并且新切割3微米的脑组织切片并收集在SuperFrost+载玻片上。将组织切片脱蜡并在无溶剂条件(EZprep溶液)下再水化，接着在基于EDTA的缓冲液(CC1溶液)中通过热修复循环(heat retrieval cycle)进行32min的抗原修复(去掩蔽)。随后，使用DISCOVERY抑制剂(参考07017944001(罗氏))将载玻片封闭4min。将在抗体稀释剂中以1/10’000稀释的一抗手动添加到组织切片上并在室温孵育1h。在施加多聚体UltraMap-抗兔HRP即用型抗体(参考05269717001)之前，进行16min的短时后固定(0.05％的戊二醛)。

使用DISCOVERY按照生产商的建议进行检测。然后将载玻片在92℃下进行20min的热变性，然后手动施加第二种一抗(在抗体稀释剂中以1/1’000稀释的大鼠抗CD31)并孵育1h。使用多聚体UltraMap-抗兔HRP抗体(参考05891884001)20min以与DISCOVERY罗丹明试剂盒(参考07259883001)相结合来检测CD31。

使用Gold抗褪色试剂(参考P36931，赛默飞世尔公司(ThermoFisher),瑞士)洗涤载玻片并封片，并用Hamamatsu载玻片扫描仪(NanoZoomer 2.0HT，扫描软件NDP-Scan 2.5版，滨松光子学法国公司瑞士办事处(Hamamatsu Photonics France,SwissOffice),索洛图恩州(Solothurn),瑞士)在40x物镜下进一步扫描。扫描设置如下：使用DAPI滤光片的曝光时间设为28.5ms，FITC滤光片和TRITC滤光片也是如此(检测罗丹明)。

图像分析

对于基于图像分析的定量斑块和血管相关的淀粉样物质-β评价，基于MS VisualStudio 2010和来自Matrox MIL V9库(加拿大魁北克迈创公司(Matrox Inc,Quebec,Canada))的许多功能开发了专有图像分析平台(ASTORIA，自动化存储图像分析)。

对于β-淀粉样物质斑块和血管分析，执行以下一系列步骤：

-用Hamamatsu Nanozoomer以40倍放大倍数扫描载玻片。对于每种荧光标记(DAPI、FITC和TRITC)，创建单独的图像

-手动勾画ROI(目标区域)以在绿色FITC通道图像上限定脑切片中用于Aβ斑块评估的皮质，然后还将所得轮廓用于其他两个通道图像(复制得到xml文件)

-运行内部开发的ImageScope(V12.1.0.5029，美国艾贝欧公司(Aperio Inc.,USA))插件，为3个荧光通道中的每一个创建和导出*.tif图像文件(10倍放大倍数)

图像批处理：

-通过访问每个独立的荧光通道图像，获得每个切片的组合真彩色图像(DAPI、FITC、TRITC)

-从未染色的黑色背景中分割有效样本(在勾画的ROI内)

-应用自适应阈值技术进行绿色通道图像中的对象分割(FITC标记的Aβ斑块)

对CD31有特异性

-通过形态学顶帽变换(morphological tophat transformation)(设置为10、15和20)和阈值化来分割红色通道中TRITC标记的对象(对CD31染色有特异性，指示血管)，然后进行尺寸过滤(设置为15、30、50和200)-将顶帽10和尺寸15的组合用于本报告中的详细分析

-通过扩张和减去初始对象在分割血管周围生成环，以表征Aβ评估的有效范围(与血管相邻)，即所谓的“影响区”

-根据先前确定的影响区内NT12阳性比率对血管进行分类

CD31+NT12

将血管(CD31阳性)分配为3个尺寸类别(小：<70个像素，中等：70…500个像素，大：>500个像素)，并且-对于每个尺寸类别中的每个血管-分为5类NT12阳性之一

-0％(血管上没有Aβ)

-1…10％血管相关的Aβ

-11…25％血管相关的Aβ

-26…50％血管相关的Aβ

-51…75％血管相关的Aβ

-76…100％血管相关的Aβ

额外计算

-ROI内的总NT12信号

-ROI内的总CD31信号

-血管相关Aβ区域的比率，即如上所述的总“影响区”区域内的NT12信号。

结果

表19：脑和血液中的化合物1水平

在给药2个月和4个月后，以及在6个月研究结束时确定化合物1的血液浓度。如表19所示，在研究过程中持续暴露，动物之间具有可接受的变异，平均为18％(8％至36％)。0.03g/kg食物给药组的化合物1平均血液浓度为0.25±0.13μM(平均值±SD)，0.3g/kg给药组的化合物1平均血液浓度为2.10±0.47μM，与化合物剂量的10倍差异良好吻合。在这项研究中观察到的暴露大致对应于化合物1的5mg/kg和45mg/kg每日口服剂量。在实验结束时确定的脑/血液比率对于0.03g/kg组为2.7，对于0.3g/kg组为3.3。

APP代谢物的生化测定：来自小鼠脑的Triton TX-100可溶性APP代谢物

用缓冲液中的1％Triton X-100提取脑匀浆，并且认为所得的上清液代表可溶形式的APP代谢物。除了Aβ40和42之外，我们还确定了N端APP片段sAPPα(α-分泌酶的直接裂解产物)和sAPPβ(Swe)(BACE1裂解的直接产物)。如表24所示，在未治疗组中，可溶性Aβ40和42在研究过程中适度增加(小于2倍)。由于已知在这个年龄期间没有发生APP表达和Aβ生成的变化，因此假设媒介物组(18-20月龄)中的值增加是由Aβ沉积物的“泄漏”引起的(增加了几倍，见下文)。同样，在未治疗组中可溶性APP代谢物sAPPα和β的值没有显著变化。

用低剂量的化合物1(0.03g化合物1/kg食物)治疗的小鼠显示出可溶性Aβ40和42较弱、不显著的减少，以及sAPPα的中度增加(表20和表21，图9-图11)。可溶性APPβ(Swe)显著减少29％(表20和表21，图12)。用0.3g/kg剂量的化合物1治疗的小鼠显示出Aβ和sAPPβ(Swe)两者均显著减少，以及sAPPα增加3倍(表20和表21，图9-图12)。

总的来说，化合物1治疗导致所有可溶性BACE1裂解产物的剂量依赖性减少和sAPPα的剂量依赖性增加。

表20：用化合物1治疗后小鼠脑的Aβ40和42水平

表21：组间变化的比较(邓尼特(Dunnett)多重比较测试)

CSF中的APP代谢物

在尸检时从所有小鼠采集CSF。将来自基线组的样品储存约6个月，并在研究结束时与其余样品一起进行分析。表22和图13中的数据显示CSF Aβ在基线组(12月龄的APP23小鼠)中最高，但在媒介物组(18月龄的APP23小鼠)中下降。与该媒介物组相比，在0.03g/kg食物的化合物1治疗组中CSF Aβ40未显著降低，而在0.3g/kg食物的化合物1治疗组中显著降低。目前尚不清楚高基线值的原因。假设这是长期储存的影响，此时Aβ寡聚形式的解离可能产生更高的单体浓度。CSF Aβ比来自脑提取物的Triton TX-100溶解的Aβ更多，代表了可溶性淀粉样物质-β的稳态浓度，该浓度直接响应于Aβ生成中的变化。低化合物1剂量下小的且非显著的治疗效果(-4.6％至-20％)以及高化合物1剂量下明显且显著的效果(-43.7％至-77％)在从脑组织分离的可溶性Aβ物质与CSF中的Aβ40之间非常相似。

表22：CSF Aβ40结果总结

前脑中的甲酸可溶性淀粉样物质-β肽

在用甲酸提取不溶性Aβ物质后，研究了化合物1对APP23小鼠脑中淀粉样物质-β沉积形式的治疗效果。如表23和表24以及图14至图17所示，与基线相比，在媒介物组中观察到沉积的Aβ的大量增加。淀粉样物质-β42比Aβ40增加更多(媒介物组中Aβ42/40比率增加55％)，与其更高的聚集倾向吻合。与媒介物相比，在用低剂量的化合物1治疗后Aβ40和Aβ42显示减少17％左右，但是没有达到统计学显著性。所提取物质的Aβ42/40比率没有变化。在高化合物1治疗组中观察到沉积的Aβ40和42强烈且高度显著性(相比于媒介物为80％左右)的减少，并且Aβ42/40比率恢复至0.07的基线值。总之，用高剂量化合物1治疗几乎完全阻断APP23小鼠中淀粉样物质β的增加。

表23：小鼠前脑中的甲酸可溶性淀粉样物质-β肽

表24：组比较和统计(邓尼特(Dunnett)多重比较测试)

对CAA的影响

老年APP23动物显示出强烈程度的CAA，其通过共免疫荧光中CD31和淀粉样物质-β(NT12)阳性免疫反应性的共定位/邻近分析来评估。CD31，也称为血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)，是I型整合膜糖蛋白，其在早期和成熟内皮细胞、血小板和大多数白细胞亚群中以高水平表达。CD31免疫反应性通常用作可视化脑血管内皮细胞的标志物。对于定量图像分析，检测到皮质的CD31阳性结构，定义了这些结构周围的影响区并量化了这些影响区内的Aβ。评估CD31+血管的总数(归一化为总样本面积)和具有不同Aβ覆盖率的CD31+血管的％(表25)。将CD31+血管的Aβ覆盖率分成不同类别：0％、1％-10％、10％-25％、25％-50％、50％-75％和>75％Aβ覆盖率(表25)。另外，总结了具有>10％Aβ覆盖率的所有CD31+血管(表25)，因为这将确保消除潜在的非特异性Aβ信号。如Winkler DT等人,2001所述计算CAA频率(具有>10％Aβ覆盖率的CD31+血管，归一化为总样本面积)(表31)，不同之处在于使用计算机辅助定量图像分析来评估受Aβ影响的CD31+血管。最后，分析总血管相关的Aβ区域并归一化为总CD31+面积(表31)。

在APP23小鼠中，受Aβ影响的血管的百分比(>10％Aβ覆盖率)随小鼠年龄增加约2倍，并且通过高剂量的化合物1治疗降低了这种增加(表28，图20)。低剂量的化合物1治疗没有降低受Aβ影响的血管(具有>10％Aβ覆盖率的血管)的百分比。大多数具有25％-50％和50％-75％Aβ覆盖率的血管而非具有其他Aβ覆盖率百分比的血管，通过高剂量化合物1治疗减少(表28)。重要的是，总CD31+血管的数量在所有治疗组中是相似的(表25，图18)。有趣的是，只有低剂量的化合物1显著减少了没有Aβ覆盖率的血管数量，并且同时增加了具有低Aβ覆盖率(<10％Aβ覆盖率)的血管数量，而高化合物1剂量在这些参数上没有明显的年龄依赖性差异和治疗效果(表28)。

此外，CAA频率随小鼠年龄增加约2倍，并且通过高剂量的化合物1治疗降低了这种增加(表34，图22)。同样，对于低剂量的化合物1没有显著的治疗效果。总血管相关的Aβ区域归一化为总CD31+面积的分析揭示了相对于高剂量化合物1的媒介物，治疗效果小，尽管该效果无统计学意义，而该参数的年龄依赖性增加略显著(表34，图24)。

为了区分CAA-1型和CAA-2型，以类似于上述的方式确定血管大小和它们各自的Aβ覆盖率(小+中等和大血管)(表26，表27)。老年APP23动物在小、中等和大血管中显示出强烈程度的CAA，其可能分别代表毛细血管、皮质动脉和软脑膜血管。在APP23小鼠中，Aβ影响小+中等大小血管的百分比(>10％Aβ覆盖率)随小鼠年龄增加约2倍，并且通过高剂量的化合物1治疗降低了这种增加(表26和29，图21)。低剂量的化合物1治疗没有降低受Aβ影响的小+中等大小血管(具有>10％Aβ覆盖率的血管)的百分比。大多数具有10％-25％、25％-50％和50％-75％Aβ覆盖率的小+中等大小血管而非具有其他Aβ覆盖率百分比的血管，通过高剂量化合物1治疗减少(表29)。重要的是，总CD31+小+中等大小血管的数量在所有治疗组中是相似的(表26，图19)。尽管这些参数存在年龄依赖性增加，但在观察到的大血管中高剂量和低剂量化合物1没有治疗效果(表27和30，图21)。同样，总CD31+大血管的数量在所有治疗组中是相似的(表27，图19)。

此外，小+中等大小血管的CAA频率随小鼠年龄增加约2倍，并且通过高剂量的化合物1治疗降低了这种增加(表32、表35，图23)。同样，对于低剂量的化合物1没有显著的治疗效果。总血管相关的Aβ区域归一化为总CD31+小+中等大小血管面积的分析揭示了相对于高剂量化合物1的媒介物，显著的治疗效果(表32、表35，图25)。在观察到的大血管中高剂量和低剂量化合物1对CAA频率没有治疗效果(表33、表36，图25)。

低剂量化合物1的弱效且有时不显著的效果并不令人惊讶，因为与wtAPP转基因小鼠相比，在携带“瑞典”突变的小鼠模型中需要高剂量的BACE抑制剂以实现显著的BACE-1抑制。

表25：化合物1治疗对CAA、CD31阳性血管中的淀粉样物质-β的影响，将其归一化为总样本面积或CD31+血管的总数(值是平均值和SEM)

表26：化合物1治疗对CAA、小+中等CD31阳性血管中的淀粉样物质-β的影响，将其归一化为总或小+中等CD31+血管的数量(值是平均值和SEM)

由于血管尺寸评估中的技术原因，已经在0.03g/kg治疗组中移除了一只动物。

表27：化合物1治疗对CAA、大CD31阳性血管中的淀粉样物质-β的影响，将其归一化为总或大CD31+血管的数量(值是平均值和SEM)

表28：治疗效果和CD31阳性血管中归一化的淀粉样物质-β的统计(邓尼特 (Dunnett)多重比较测试)

n.s.：不显著

表29：治疗效果和小+中等CD31阳性血管中归一化的淀粉样物质-β的统计(邓尼特 (Dunnett)多重比较测试)

n.s.：不显著

表30：治疗效果和大CD31阳性血管中归一化的淀粉样物质-β的统计(邓尼特 (Dunnett)多重比较测试)

n.s.：不显著

表31：化合物1治疗对CAA频率和CD31阳性血管中的淀粉样物质-β的影响，将其归一化为总样本面积或总CD31+面积(值是平均值和SEM)

表32：化合物1治疗对CAA频率和小+中等CD31阳性血管中的淀粉样物质-β的影响，将其归一化为总样本面积或总小+中等CD31+血管面积(值是平均值和SEM)

表33：化合物1治疗对CAA频率和大CD31阳性血管中的淀粉样物质-β的影响，将其归一化为总样本面积或总大CD31+血管面积(值是平均值和SEM)

表34：治疗效果，以及CAA频率和CD31阳性血管中归一化的淀粉样物质-β的统计 (邓尼特(Dunnett)多重比较测试)

n.s.：不显著

表35：治疗效果，以及CAA频率和小+中等CD31阳性血管中归一化的淀粉样物质-β 的统计(邓尼特(Dunnett)多重比较测试)

n.s.：不显著

表36：治疗效果，以及CAA频率和大CD31阳性血管中归一化的淀粉样物质-β的统计 (邓尼特(Dunnett)多重比较测试)

n.s.：不显著

实例7：在带有斑块的转基因APP23小鼠中进行为期13周的口服安全性研究

研究目的

该研究的主要目的是用有效剂量的化合物1治疗后，评估老年APP23小鼠的微出血性病变(通过MRI和脑组织病理学)，并且比较微出血形成的程度与阳性对照(即，用β1抗体被动免疫的小鼠)(PaganettiPA等人，1996)。先前在文献Beckmann N等人，2016中描述了相似的研究。选择APP23小鼠品系是因为老年动物中存在微出血。选择雌性是因为雌性具有远远更高的总Aβ负荷、更高的Aβ40/Aβ42比率，并因此具有更显著的微出血。

材料和方法

测试品：

化合物1；经口给药形式：任意饲料混合物(颗粒)中的0.3g/kg食物

β1抗体(在柠檬酸盐缓冲液50mM/140nM NaCl中4.12mg/mL；聚集率0.24％)

β1抗体剂型：用90nM NaCl/50nM Tris pH 7.1稀释β1抗体；浓度：稀释1.236倍至最终浓度3.33mg/mL

β1抗体给药：腹膜内，每周一次。剂量体积：0.15mL/小鼠(最大10mL/kg)

实验动物：

动物物种和品系：小鼠；转基因APP23(B6.D2-Tg(Thy1App)23/1Sdz)

性别：雌性(雌性具有远远更高的总Aβ负荷、更高的Aβ40/Aβ42比率，并因此具有更显著的微出血)

分配到给药阶段的研究动物数量：APP23：60只雌性小鼠

年龄：约17-18月龄(开始给药时)

体重范围：26g至36g(开始给药时)

磁共振成像(MRI)

对于MRI研究，将小鼠用1.5％异氟烷(雅培公司(Abbott)，卡姆(Cham)，瑞士(Switzerland))在氧气/N₂O(2:1)的混合物中通过面罩给药进行麻醉，并置于Plexiglas托架中。通过动物床中的集成水管将小鼠的体温保持在36.5℃±0.5℃。没有使用立体定向保持。在整个采集过程中监测呼吸。成像期的持续时间约为15分钟，包括小鼠的定位。

用在7.0T下操作的Biospec 70/30光谱仪(布鲁克医疗系统公司(Bruker MedicalSystems)，埃特林根(Ettlingen)，德国(Germany))进行测量，该光谱仪配备有主动屏蔽的梯度系统。扫描仪的操作软件是Paravision 5.1(布鲁克)。使用具有以下成像参数的三维(3D)T2*-加权梯度回波序列获得图像：重复时间19.3ms；回波时间10ms；矩阵256x128x192；视野1.5x1.5x2.0cm3，2个平均值。具有像素尺寸59x117x104μm3的图像的总采集时间为11.86min。

由盲法研究者进行MRI数据的采集和分析。在整个脑中分析皮层和丘脑中呈现最小直径70μm(病变)的信号衰减的位点。为了确保同一位点(病变)未多次计算，在3D数据集的几个连续切片上仔细控制其存在。使用基于IDL(交互式数据语言研究系统公司(Interactive Data Language Research Systems)，博尔德市(Boulder)，科罗拉多州(Colorado)，美国)的软件ImgTool评估病变的总体积。首先使用高斯分布滤波器(Gaussianprofile filter)对图像进行弱低通滤波，然后使用自适应罗依-麦斯(Lloyd-Max)直方图量化将图像转化为一组四个灰度级类。由于在每个图像上任意选择阈值水平，该方法避免了操作者偏差。该软件的详细描述可以在Babin AL等人，2012或在Egger C等人，2013中找到。对于3D数据集的每个切片，通过应用图像分割算法确定外部边界内的信号衰减位点的面积。已经针对3D数据集的每个切片重复了该分析。然后通过将病变区域的总和乘以切片厚度(104μm)来计算病变的总体积。

组织的取样和组织学处理

在对所有预定动物进行尸检时收集脑切片。对第7水平后的最后一片小脑进行取样，以确定化合物1的脑浓度(用于描述脑切片水平，参见Bolon B等人，2013)。脑的其余部分用10％中性缓冲福尔马林固定。

处理四个脑切片并用苏木精和伊红(H&E)以及Perls'普鲁士蓝对含铁血黄素沉积物(第2水平、第3水平、第4水平、如Bolon B等人，2013所述)和在下丘脑水平上的另一个切片(第2’水平)进行染色。

脑收集程序：将小脑与大脑分离。将剩余的大脑(从前面到第5水平)转移到福尔马林中用于病理学。

显微镜检查

在光学显微镜下检查用苏木精和伊红以及用Perls’普鲁士蓝染色的脑切片。基于表37中的分级方案，评估Perls’普鲁士蓝染色切片中含铁血黄素沉积物的分布、大小和染色强度。

表37：脑中含铁血黄素沉积的分级量表

所有其他脑部变化的评估是在苏木精和伊红染色切片上进行的，其中出血、淀粉样斑块和血管炎症分级如下：

·使用与用于对含铁血黄素进行分级的标准相同的标准，评估脑中出血的分布、大小和染色强度。

·任意给予对照组中淀粉样斑块的程度中度值(3级)，并且将任何斑块明显减少的脑评级为轻度(2级)。

·血管炎症的严重程度被评为最小(1级)，其中识别出<5个受影响的血管/脑；或轻度(2级)，其中识别出>6个受影响的血管/脑。

化合物1的血浆和脑浓度

在尸检时从所有动物处获得血液。安乐死之后，从腔静脉收集约0.3mL全血到含有EDTA作为抗凝血剂的管中。在取样期间将管置于冰水中。之后通过离心(10min，1270G，+4℃)分离血浆,并转移至一个独特标记的透明管(来自赛默科技公司的1.8mL NUNC 2D编码管)中并在-70℃或更低温度下冷冻。使用LC-MS/MS方法测量血浆中化合物1浓度。

使用LC-MS/MS方法在脑样品(第7水平)中确定化合物1的脑浓度。收集约100mg至200mg的脑组织，称量至来自赛默科技公司的1.8mL NUNC 2D编码管中，并在-70℃或更低温度下冷冻。

化合物1的饲料颗粒浓度测定

将每个单独的颗粒在50mL管中称重并破碎成碎片。添加2mL-3mL提取溶剂(ACN/水8:2(v/v))并将所得混合物在600rpm下振荡5h。然后将混合物在离心瓶+过滤器(具有低结合durapore PVDF膜0.45um的离心过滤器)中以2500rpm离心10min，并通过超高效液相色谱法(UPLC)分析，每瓶注射2次(注射1μL-5μL)。

统计分析

计算相应指示的平均值和标准偏差(SD)、平均值的标准误差(SEM)和变异系数(CV)，并进行方差分析(ANOVA)。为了分析体重，使用GraphPad Prism 6进行具有Turkey多重比较测试的双因素ANOVA。使用Systat版本13对MRI数据进行具有随机效应统计分析的ANOVA(Systat软件公司(Systat Software,Inc.)，圣何塞(San Jose)，加利福尼亚州，美国)。

结果

体重

所有治疗组在研究期间均显示体重增加，并且没有迹象表明与治疗有关的任何体重减轻(图26)。

磁共振成像

在实验开始时(基线)和治疗第1个月、第2个月和第3个月时，测量总病变体积(图27)。还确定了归一化为基线(转化为自然对数)的总病变体积(图28)，如同相对于基线测量值计算的病变体积增加因子(图29)。在对照组中，观察到由于衰老导致的病变体积增加。如预期的那样，β1抗体治疗组在研究期间显示出病变体积增加加剧。尽管没有达到显著性，但与对照APP23小鼠相比，用化合物1治疗的小鼠存在归一化病变体积减小的趋势(图28和29)。观察到与年龄相关的病变数量增加。然而，病变数量在治疗组之间没有差异(第3个月的病变数量(平均值±SEM)，对照：11.2±1.5，化合物1：11.5±2.0，β1抗体：12.4±1.6)。

总之，化合物1治疗没有加剧由MRI检测到的病变体积，并且观察到归一化病变体积减小的趋势。

毒代动力学

在第2组动物的研究结束时，在小鼠血浆和脑组织中确定化合物1浓度。血浆中的平均化合物1浓度为1210ng/mL，具有中度的动物间变异性(变异系数为15.9％)。

脑组织中的平均化合物1浓度为4034ng/g，具有中度的动物间变异性(变异系数为29.4％)。脑与血浆比率的平均值为3.3。与第96天的血浆相比，在脑中发现的化合物1浓度范围在2.2倍和6.1倍之间。

验尸调查

在用化合物1或β1抗体治疗3个月后，在研究结束时进行验尸分析。

肉眼可见结果

在任何动物的尸检中都没有明显的治疗相关的肉眼可见观察结果。

显微镜检查结果(脑)

表38总结了脑中的显微镜观察结果。

表38：脑显微观察结果的总结

*＝由于脑中不存在淀粉样斑块，单一动物退出评估。

1级＝最小，2级＝轻度，3级＝中度。

在所有组中的许多动物中鉴定通过其与Perls'普鲁士蓝的蓝色染色反应鉴定的含铁血黄素沉积物。通常这些沉积物发现于脑的大脑皮层的小血管附近。不太常见的是，它们存在于脑膜血管附近或与脑中的淀粉样斑块相关。在化合物1治疗的小鼠中，发病率和严重程度与未治疗的对照相似，受影响的脑中仅存在一个或两个病灶。相反，给药β1抗体与100％发病率相关。

在H&E染色切片中鉴定出血，其频率低于含铁血黄素的存在。在某些情况下，出血与含铁血黄素存在于同一病灶中，但在近期出血的病灶中，不存在含铁血黄素。与未治疗的对照和β1抗体-治疗组相比，化合物1治疗的小鼠中出血较少见。

在脑膜中最常观察到小血管的炎症，仅偶尔在脑本身中观察到这种炎症。形态从单核细胞向外膜的浸润变化为伴随坏死和血管壁透明化的更明显的炎症。血管炎症在化合物1治疗的小鼠中最不显著，在β1抗体治疗组中最显著。

非常偶尔地，在受影响的血管中会出现血栓形成，或者邻近脑组织的先前坏死(梗塞)的小区域存在于未治疗的对照和β1抗体治疗的小鼠中，但不存在于化合物1治疗的小鼠中。

与在其他三组的那些相比，在一些化合物1治疗的小鼠中斑块形成的程度似乎减少。

每组中的两只动物显示丘脑中斑块的矿化，没有表明化合物1或β1抗体对该变化的影响。

结论

在老年APP23小鼠中进行这项安全性研究的目的是评估基于淀粉样物质-β的疗法对脑微出血的影响。化合物1以0.3g/kg的剂量用于饲料给药，因为先前在该剂量下观察到APP23小鼠中淀粉样物质-β降低的最大药效学作用。基于Pfeifer M等人，2002,显示出现微出血增加的结果，将用β1抗体进行的被动免疫作为阳性对照。

用化合物1以及β1抗体的长期治疗不会导致体重的任何变化。饲料颗粒分析揭示了化合物1的值比预期的0.3g/kg低29％，这可能是由于大规模的制造过程。然而，在研究结束时的毒代动力学分析中，在向所有治疗的动物饲料给药化合物1后，化合物1在血浆中是可测量的，具有中度的动物间变异性。血浆中的化合物1水平与预期一致，并且与剂量归一化基础上的先前研究相当。尸检时，在饲料给药化合物1后，化合物1在脑中是可测量的，具有中度的动物间变异性。同样，脑中的化合物1水平与预期一致并且与先前研究相当。脑/血浆比率为3.3。

在基线和治疗第1个月、第2个月和第3个月时，通过MRI测量脑中的微出血病变体积。在衰老期间，如对照组中观察到的，病变体积一直增加。如预期的那样，β1抗体治疗加剧了研究过程中病变体积的增加(Pfeifer M等人.2002,Beckmann N等人.2016)。然而，化合物1治疗未显示由MRI检测到的病变体积的任何恶化。此外，尽管没有达到显著性，但与对照APP23小鼠相比，用化合物1治疗的小鼠存在归一化病变体积减小的趋势。

在组织病理学检查中，与未治疗的对照相比时，给药化合物1似乎减少了脑中的近期微出血和小血管炎症的发生率，但没有影响含铁血黄素形成的程度(指示历史性微出血)。阳性对照β1抗体增加了微出血和血管炎症两者。尽管该研究不是为了量化淀粉样斑块形成的程度而设计的，但是在一些化合物1治疗的小鼠中这似乎减少了。

实例8：在单独给予和联合强CYP3A4抑制剂伊曲康唑或强CYP3A4诱导剂利福平给予时，化合物1的药代动力学的人体研究

在健康志愿者的药物-药物相互作用(DDI)研究中，评价了强CYP3A4抑制剂(伊曲康唑)和强CYP3A4诱导剂(利福平)对化合物1的PK的影响。图30概述了DDI研究设计。与单独给予化合物1时相比，当与化合物1一起给予时，剂量为200mg q.d.的伊曲康唑使化合物1的平均AUC增加2至3倍并且使化合物1的平均C最大增加25％(表39)。与单独给予化合物1时相比，当与化合物1一起给予时，剂量为600mg q.d.的利福平使化合物1的平均AUC减小5至6倍并且使化合物1的平均C最大减小2.5倍(表40)。总之，在1期研究中，强CYP3A4诱导剂和强CYP3A4抑制剂对化合物1暴露的影响已经表明CYP3A4对于消除化合物1是非常重要的。

表39：药代动力学结果-伊曲康唑对化合物1血浆PK参数的影响的统计分析：化合物1 30mg SD+伊曲康唑200mg QD相比于化合物130mg SD

n*＝无值缺失的受试者数量。

将以治疗和受试者作为固定效应的ANOVA模型拟合到每个对数变换的PK参数。对结果进行反向转换以获得“经调整的几何平均值”、“几何平均值比”和“90％CI”。

表40：药代动力学结果-利福平对化合物1血浆PK参数的影响的统计分析：化合物1 100mg SD+利福平600mg QD相比于化合物1 100mg SD

n*＝无值缺失的受试者数量。

实例9：用于评价化合物1在处于AD和CAA临床症状发作风险中的参与者中的功效的随机、双盲、安慰剂对照研究的总结

在本文表41所述的临床试验中，ApoE4纯合体的鉴定被用作预后富集策略，以在合理的时间范围内选择认知显著恶化和/或CAA发展(以及随后的微出血或脑内出血)可能性更高的个体，可在临床试验的环境中对这些个体进行实际评估。本研究列于ClinicalTrials.gov中的NCT02565511标识码下。在该替代方案中，该实例可以用60岁至75岁认知未受损的ApoE4携带者(纯合体；或者例如通过PET或CSF测量，确定有脑淀粉样物质额外富集(“淀粉样物质阳性”)的杂合体)，按每天一次15mg或50mg化合物1的口服剂量来进行。本研究列于ClinicalTrials.gov中的NCT03131453标识码下。

在提出的临床试验中，在至少5年的治疗持续时间期间，预计相当大比例的参与者将被诊断为患有由AD和/或发展CAA或CAA的恶化引起的轻度认知损害(MCI)、痴呆。

表41：用于评价化合物1在处于AD和/或发展CAA的临床症状发作风险中的参与者中的功效的随机、双盲、安慰剂对照研究的总结

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本文引用的所有参考文献，例如科学出版物或专利申请公开，通过援引整体并入本文并用于所有目的，其程度如同具体且单独地指出每个参考文献通过援引整体并入本文以用于所有目的一样。尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和举例的方式相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的传授内容，对本领域普通技术人员容易清楚的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可以对本发明进行某些变化和修改。

Claims

1.化合物N-(6-((3R,6R)-5-氨基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于在脑淀粉样血管病的治疗或预防中使用。

2.根据权利要求1所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物用于治疗或预防患有阿尔茨海默病的患者的脑淀粉样血管病。

3.根据权利要求1或权利要求2所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物用于治疗或预防患者的脑淀粉样血管病，该患者携带发展脑淀粉样血管病的遗传倾向。

4.根据权利要求3所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该发展脑淀粉样血管病的遗传倾向为：

i.唐氏综合征；

ii.淀粉样前体蛋白或早老素-1的基因突变；或者

iii.存在ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

5.根据权利要求3所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个或两个拷贝。

6.根据权利要求5所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的一个拷贝。

7.根据权利要求5所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者携带ApoE4等位基因的两个拷贝。

8.根据权利要求1至7中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者呈淀粉样物质阳性。

9.根据权利要求8所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该淀粉样物质阳性是通过PET或CSF测量确定的。

10.根据权利要求1至9中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者在60岁与75岁之间。

11.根据权利要求1至10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少70％的日剂量使用该化合物。

12.根据权利要求1至10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中按化合物暴露两周后导致CSF中的Aβ1-40降低至少50％的日剂量使用该化合物。

13.根据权利要求1至10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中按15mg/天的剂量使用该化合物。

14.根据权利要求1至10中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中按50mg/天的剂量使用该化合物。

15.根据权利要求1至14中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该患者不同时用CYP3A4抑制剂或诱导剂进行治疗。

16.根据权利要求1至15中任一项所述使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中该脑淀粉样血管病是CAA-1型。