本發明第一態樣之系列 A 實施例
實施例A1：化合物
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-(6-((3
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,6
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療或預防大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例A2：用於如實施例A1之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係用於治療或預防患有阿茲海默氏病之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例A3：用於如實施例A1或A2之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係用於治療或預防攜帶大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例A4：用於如實施例A3之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性為： i.唐氏症候群； ii.類澱粉蛋白前體蛋白或早老素-1之基因突變；或 iii.存在一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例A5：用於如實施例A4之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該患者攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例A6：用於如實施例A5之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該患者攜帶一個複本的ApoE4等位基因。 實施例A7：用於如實施例A5之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該患者攜帶兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例A8：用於如實施例A1至A7中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該患者係類澱粉蛋白陽性。 實施例A9：用於如實施例A8之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該類澱粉蛋白陽性係藉由PET或CSF量測測定。 實施例A10：用於如實施例A1至A9中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該患者係在60與75歲之間之年齡。 實施例A11：用於如實施例A1至A10中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係以化合物暴露兩週後導致CSF中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。 實施例A12：用於如實施例A1至A10中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係以化合物暴露兩週後導致CSF中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。 實施例A13：用於如實施例A1至A10中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係以10至30 mg/天之劑量使用。 實施例A14：用於如實施例A1至A10中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係以30至50 mg/天之劑量使用。 實施例A15：用於如實施例A1至A10中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係以15 mg/天之劑量使用。 實施例A16：用於如實施例A1至A10中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係以50 mg/天之劑量使用。 實施例A17：用於如實施例A1至A10中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係以導致血漿穩態Cmax值在70與170 ng/ml之間之日劑量使用。 實施例A18：用於如實施例A1至A10中任一例之用途之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係以導致血漿穩態Cmax值在200與500 ng/ml之間之日劑量使用。 實施例A19：化合物
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
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-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療或預防患有阿茲海默氏病之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例A20：化合物
N
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療或預防攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例A21：化合物
N
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療或預防患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例A22：化合物
N
-(6-((3
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療或預防患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變，及其中該化合物係以15或50 mg/天之劑量使用。 實施例A23：用於如實施例A1至A22中任一例之用途之化合物，其中該化合物係呈游離形式。 實施例A24：用於如實施例A1至A23中任一例之用途之化合物，其中不同時利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑治療該患者。 實施例A25：用於如實施例A1至A23中任一例之用途之化合物，其中不同時利用CYP3A4抑制劑或誘導劑治療該患者超過三個月之時間。 實施例A26：用於如實施例A24或A25之用途之化合物，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強、中度或弱抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強、中度或弱誘導劑。 實施例A27：用於如實施例A26之用途之化合物，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強誘導劑。
本發明第二態樣之系列 B 實施例
實施例B1：一種包含化合物
N
-(6-((3
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物，其用於治療或預防大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例B2：用於如實施例B1之用途之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係用於治療或預防患有阿茲海默氏病之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例B3：用於如實施例B1或B2之用途之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係用於治療或預防攜帶大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例B4：用於如實施例B3之用途之醫藥組合物，其中該大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性為： i.唐氏症候群； ii.類澱粉蛋白前體蛋白或早老素-1之基因突變；或 iii.存在一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例B5：用於如實施例B4之用途之醫藥組合物，其中該患者攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例B6：用於如實施例B5之用途之醫藥組合物，其中該患者攜帶一個複本的ApoE4等位基因。 實施例B7：用於如實施例B5之用途之醫藥組合物，其中該患者攜帶兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例B8：用於如實施例B1至B7中任一例之用途之醫藥組合物，其中該患者係類澱粉蛋白陽性。 實施例B9：用於如實施例B8之用途之醫藥組合物，其中該類澱粉蛋白陽性係藉由PET或CSF量測測定。 實施例B10：用於如實施例B1至B9中任一例之用途之醫藥組合物，其中該患者係在60與75歲之間之年齡。 實施例B11：用於如實施例B1至B10中任一例之用途之醫藥組合物，其中該化合物係以化合物暴露兩週後導致CSF中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。 實施例B12：用於如實施例B1至B10中任一例之用途之醫藥組合物，其中該化合物係以化合物暴露兩週後導致CSF中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。 實施例B13：用於如實施例B1至B10中任一例之用途之醫藥組合物，其中該化合物係以10至30 mg/天之劑量使用。 實施例B14：用於如實施例B1至B10中任一例之用途之醫藥組合物，其中該化合物係以30至50 mg/天之劑量使用。 實施例B15：用於如實施例B1至B10中任一例之用途之醫藥組合物，其中該化合物係以15 mg/天之劑量使用。 實施例B16：用於如實施例B1至B10中任一例之用途之醫藥組合物，其中該化合物係以50 mg/天之劑量使用。 實施例B17：用於如實施例B1至B10中任一例之用途之醫藥組合物，其中該化合物係以導致血漿穩態Cmax值在70與170 ng/ml之間之日劑量使用。 實施例B18：用於如實施例B1至B10中任一例之用途之醫藥組合物，其中該化合物係以導致血漿穩態Cmax值在200與500 ng/ml之間之日劑量使用。 實施例B19：一種包含化合物
N
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物，其用於治療或預防患有阿茲海默氏病之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例B20：一種包含化合物
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
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-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物，其用於治療或預防攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例B21：一種包含化合物
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
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-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物，其用於治療或預防患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例B22：一種包含化合物
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物，其用於治療或預防患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變，及其中該化合物係以15或50 mg/天之劑量使用。 實施例B23：用於如實施例B1至B22中任一例之用途之醫藥組合物，其中該化合物係呈游離形式。 實施例B24：用於如實施例B1至B23中任一例之用途之醫藥組合物，其中不同時利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑治療該患者。 實施例B25：用於如實施例B1至B23中任一例之用途之醫藥組合物，其中不同時利用CYP3A4抑制劑或誘導劑治療該患者超過三個月之時間。 實施例B26：用於如實施例B24或B25之用途之醫藥組合物，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強、中度或弱抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強、中度或弱誘導劑。 實施例B27：用於如實施例B26之用途之醫藥組合物，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強誘導劑。
本發明第三態樣之系列 C 實施例
實施例C1：一種治療或預防大腦類澱粉蛋白血管病變之方法，該方法包括對有此需要之患者投與治療上有效量之化合物
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-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽。 實施例C2：如實施例C1之方法，其中該患者患有阿茲海默氏病。 實施例C3：如實施例C1或C2之方法，其中該患者攜帶大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性。 實施例C4：如實施例C3之方法，其中該大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性為： i.唐氏症候群； ii.類澱粉蛋白前體蛋白或早老素-1之基因突變；或 iii.存在一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例C5：如實施例C4之方法，其中該患者攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例C6：如實施例C5之方法，其中該患者攜帶一個複本的ApoE4等位基因。 實施例C7：如實施例C5之方法，其中該患者攜帶兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例C8：如實施例C1至C7中任一例之方法，其中該患者係類澱粉蛋白陽性。 實施例C9：如實施例C8之方法，其中該類澱粉蛋白陽性係藉由PET或CSF量測測定。 實施例C10：如實施例C1至C9中任一例之方法，其中該患者係超過60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75歲之年齡。 實施例C11：如實施例C1至C10中任一例之方法，其中該患者係在60與75歲之間之年齡。 實施例C12：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中投與該化合物於化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416週後導致CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低至少10、20、30、40、50、60、70或80%。 實施例C13：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中投與該化合物於化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416週後導致CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低至少70%。 實施例C14：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中投與該化合物於化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416週後導致CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低至少50%。 實施例C15：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中投與該化合物於化合物暴露2、13、26、52、78、104、130、156、182、208、234、260、286、312、338、332、390或416週後導致CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低10、20、30、40、50、60、70或80%至99、97、95、93、90、87、85、80、75、70、65、60、55或50%之範圍。 實施例C16：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中投與該化合物導致至少80、85、90、93、95、97或99%之患者或80、85或90至99、97、95或93%之患者之CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低40至70%、45至65%或50至60%或至少50%之範圍。 實施例C17：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中該化合物係以導致至少80、85、90、93、95、97或99%之患者或80、85或90至99、97、95或93%之患者之CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低65至95%、75至90%或80至90%或至少80%之範圍之日劑量使用。 實施例C18：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中該化合物之治療上有效量為5與10、10與15、15與20、20與25、25與30、30與35、35與40、45與50、50與55 mg、55與60 mg、60與100 mg、100與200、200與300 mg、15與85 mg、50與85 mg、15與300 mg或50與300 mg/天之間之劑量。 實施例C19：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中該化合物之治療上有效量為10與30 mg/天之間之劑量。 實施例C20：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中該化合物之治療上有效量為30與50 mg/天之間之劑量。 實施例C21：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中該化合物之治療上有效量為15 mg/天之劑量。 實施例C22：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中該化合物之治療上有效量為50 mg/天之劑量。 實施例C23：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中該化合物之治療上有效量為導致血漿穩態Cmax值在0與50、50與100、100與150、150與200、200與250、250與300、300與350、350與400、400與450、450與500、500與550、550與600、600與650或650與700 ng/ml之間之劑量。 實施例C24：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中該化合物之治療上有效量為導致血漿穩態Cmax值在70與170 ng/ml之間之劑量。 實施例C25：如實施例C1至C11中任一例之方法，其中該化合物之治療上有效量為導致血漿穩態Cmax值在200與500 ng/ml之間之劑量。 實施例C26：一種治療或預防大腦類澱粉蛋白血管病變之方法，該方法包括對患者投與治療上有效量之化合物
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
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-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其中該患者患有阿茲海默氏病。 實施例C27：一種治療或預防大腦類澱粉蛋白血管病變之方法，該方法包括對患者投與治療上有效量之化合物
N
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
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-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其中該患者攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例C28：一種治療或預防大腦類澱粉蛋白血管病變之方法，該方法包括對患者投與治療上有效量之化合物
N
-(6-((3
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其中該患者患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例C29：一種治療或預防大腦類澱粉蛋白血管病變之方法，該方法包括對患者投與治療上有效量之化合物
N
-(6-((3
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,6
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其中該患者患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因，及其中該化合物之治療上有效量為15或50 mg/天之劑量。 實施例C30：如實施例C1至C29中任一例之方法，其中該化合物係呈游離形式。 實施例C31：如實施例C1至C30中任一例之方法，其中化合物1係包含於醫藥組合物內。 實施例C32：如實施例C1至C31中任一例之方法，其中不同時利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑治療該患者。 實施例C33：如實施例C1至C31中任一例之方法，其中不同時利用CYP3A4抑制劑或誘導劑治療該患者超過三個月之時間。 實施例C34：如實施例C32或C33之方法，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強、中度或弱抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強、中度或弱誘導劑。 實施例C35：如實施例C34之方法，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強誘導劑。
本發明第五態樣之系列 D 實施例
實施例D1：化合物
N
-(6-((3
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於治療或預防大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例D2：如實施例D1之用途，其中該化合物係用於治療或預防患有阿茲海默氏病之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例D3：如實施例D1或D2之用途，其中該化合物係用於治療或預防攜帶大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例D4：如實施例D3之用途，其中該大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性為： i.唐氏症候群； ii.類澱粉蛋白前體蛋白或早老素-1之基因突變；或 iii.存在一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例D5：如實施例D4之用途，其中該患者攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例D6：如實施例D5之用途，其中該患者攜帶一個複本的ApoE4等位基因。 實施例D7：如實施例D5之用途，其中該患者攜帶兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例D8：如實施例D1至D7中任一例之用途，其中該患者係類澱粉蛋白陽性。 實施例D9：如實施例D8之用途，其中該類澱粉蛋白陽性係藉由PET或CSF量測測定。 實施例D10：如實施例D1至D9中任一例之用途，其中該患者係在60與75歲之間之年齡。 實施例D11：如實施例D1至D10中任一例之用途，其中該化合物係以化合物暴露兩週後導致CSF中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。 實施例D12：如實施例D1至D10中任一例之用途，其中該化合物係以化合物暴露兩週後導致CSF中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。 實施例D13：如實施例D1至D10中任一例之用途，其中該化合物係以10與30 mg/天之間之劑量使用。 實施例D14：如實施例D1至D10中任一例之用途，其中該化合物係以30與50 mg/天之間之劑量使用。 實施例D15：如實施例D1至D10中任一例之用途，其中該化合物係以15 mg/天之劑量使用。 實施例D16：如實施例D1至D10中任一例之用途，其中該化合物係以50 mg/天之劑量使用。 實施例D17：如實施例D1至D10中任一例之用途，其中該化合物係以導致血漿穩態Cmax值在70與170 ng/ml之間之日劑量使用。 實施例D18：如實施例D1至D10中任一例之用途，其中該化合物係以導致血漿穩態Cmax值在200與500 ng/ml之間之日劑量使用。 實施例D19：化合物
N
-(6-((3
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,6
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)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於治療或預防患有阿茲海默氏病之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例D20：化合物
N
-(6-((3
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,6
R
)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於治療或預防攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例D21：化合物
N
-(6-((3
R
,6
R
)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於治療或預防患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例D22：化合物
N
-(6-((3
R
,6
R
)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於治療或預防患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變，及其中該化合物係以15或50 mg/天之劑量使用。 實施例D23：如實施例D1至D22中任一例之用途，其中該化合物係呈游離形式。 實施例D24：如實施例D1至D23中任一例之用途，其中該化合物係包含於醫藥組合物內。 實施例D25：如實施例D1至D24中任一例之用途，其中不同時利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑治療該患者。 實施例D26：如實施例D1至D24中任一例之用途，其中不同時利用CYP3A4抑制劑或誘導劑治療該患者超過三個月之時間。 實施例D27：如實施例D25或D26之用途，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強、中度或弱抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強、中度或弱誘導劑。 實施例D28：如實施例D27之用途，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強誘導劑。
本發明第七態樣之系列 E 實施例
實施例E1：化合物
N
-(6-((3
R
,6
R
)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防大腦類澱粉蛋白血管病變之藥劑。 實施例E2：如實施例E1之用途，其中該化合物係用於治療或預防患有阿茲海默氏病之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例E3：如實施例E1或E2之用途，其中該化合物係用於治療或預防攜帶大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變。 實施例E4：如實施例E3之用途，其中該大腦類澱粉蛋白血管病變發展之遺傳預先傾向性為： i.唐氏症候群； ii.類澱粉蛋白前體蛋白或早老素-1之基因突變；或 iii.存在一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例E5：如實施例E4之用途，其中該患者攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例E6：如實施例E5之用途，其中該患者攜帶一個複本的ApoE4等位基因。 實施例E7：如實施例E5之用途，其中該患者攜帶兩個複本的ApoE4等位基因。 實施例E8：如實施例E1至E7中任一例之用途，其中該患者係類澱粉蛋白陽性。 實施例E9：如實施例E8之用途，其中該類澱粉蛋白陽性係藉由PET或CSF量測測定。 實施例E10：如實施例E1至E9中任一例之用途，其中該患者係在60與75歲之間之年齡。 實施例E11：如實施例E1至E10中任一例之用途，其中該化合物係以化合物暴露兩週後導致CSF中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。 實施例E12：如實施例E1至E10中任一例之用途，其中該化合物係以化合物暴露兩週後導致CSF中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。 實施例E13：如實施例E1至E10中任一例之用途，其中該化合物係以10與30 mg/天之間之劑量使用。 實施例E14：如實施例E1至E10中任一例之用途，其中該化合物係以30與50 mg/天之間之劑量使用。 實施例E15：如實施例E1至E10中任一例之用途，其中該化合物係以15 mg/天之劑量使用。 實施例E16：如實施例E1至E10中任一例之用途，其中該化合物係以50 mg/天之劑量使用。 實施例E17：如實施例E1至E10中任一例之用途，其中該化合物係以導致血漿穩態Cmax值在70與170 ng/ml之間之日劑量使用。 實施例E18：如實施例E1至E10中任一例之用途，其中該化合物係以導致血漿穩態Cmax值在200與500 ng/ml之間之日劑量使用。 實施例E19：化合物
N
-(6-((3
R
,6
R
)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防患有阿茲海默氏病之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變的藥劑。 實施例E20：化合物
N
-(6-((3
R
,6
R
)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變的藥劑。 實施例E21：化合物
N
-(6-((3
R
,6
R
)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變的藥劑。 實施例E22：化合物
N
-(6-((3
R
,6
R
)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防患有阿茲海默氏病且攜帶一或兩個複本的ApoE4等位基因之患者之大腦類澱粉蛋白血管病變的藥劑，及其中該化合物係以15或50 mg/天之劑量使用。 實施例E23：如實施例E1至E22中任一例之用途，其中該化合物係呈游離形式。 實施例E24：如實施例E1至E23中任一例之用途，其中該藥劑為醫藥組合物。 實施例E25：如實施例E1至E24中任一例之用途，其中不同時利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑治療該患者。 實施例E26：如實施例E1至E24中任一例之用途，其中不同時利用CYP3A4抑制劑或誘導劑治療該患者超過三個月之時間。 實施例E27：如實施例E25或E26之用途，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強、中度或弱抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強、中度或弱誘導劑。 實施例E28：如實施例E27之用途，其中該CYP3A4抑制劑為CYP3A4之強抑制劑；且該CYP3A4誘導劑為CYP3A4之強誘導劑。
定義
如本文中所用，術語「化合物1」或「Cmpd 1」係指
N
-(6-((3
R
,6
R
)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2
H
-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺且具有下列結構式：
於實例1中，使用替代化學命名格式，「化合物1」亦稱作3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-羧酸[6-((3R,6R)-5-胺基-3,6-二甲基-6-三氟甲基-3,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基)-5-氟-吡啶-2-基]-醯胺。 貫穿本發明之描述可交換使用術語「化合物1」、「Cmpd 1」及其對應全化學名稱。除非上下文中明確指明意欲僅一種形式之化合物，否則希望該術語係指呈游離形式或醫藥上可接受之鹽形式之化合物。化合物1述於WO 2012/095469 A1，實例34中。WO 2012/095469 A1之全文以引用之方式併入本文中，特定言之有關於實例34之合成之揭示內容。 如本文中所用，術語「大腦類澱粉蛋白血管病變」或「CAA」係指以β-類澱粉蛋白(Aβ)蛋白於皮質及軟腦膜血管壁中積累為特徵之疾病。CAA為老年人血管壁破壞及血管功能障礙之常見原因，其使CAA成為致命或致殘大腦內出血(ICH)以及局部缺血性損傷及癡呆症之主要貢獻者(Gurol ME
等人
，2016)。 如本文中所用，術語「CAA之治療」係指對患者投與化合物1以減慢或阻止CAA或CAA之臨床症狀(例如，ICH、局部缺血性損傷或癡呆症)中之至少一者之發展。可藉由使用正電子發射斷層掃描(PET)示蹤劑，例如，
18
F-氟比他匹(Florbetapir)量測Aβ於皮質及軟腦膜血管壁中之積累來評估CAA之發展(Gurol ME
等人
，2016)。或者，可藉由監測作為CAA之出血性標記之大腦微出血(CMB)來評估CAA之發展(Greenberg SM
等人
，2014)。監測CMB之適宜技術包括，例如，磁共振造影(MRI)敏感加權成像(SWI)及MRI T2*-加權梯度回波成像(GRE)，且其等述於Cheng AL
等人
，2013。此外，白質高亮度訊號(WMH)於經診斷患有CAA之患者中較於健康年老個體或患有AD或輕度認知障礙(MCI)之患者中以更大體積發生(Greenberg SM
等人
，2014)。因此，可藉由使用MRI量測WMH體積來監測CAA之發展(Chen YW
等人
，2006)。預期「CAA之治療」將具有減少經歷CAA治療之患者之大腦局部缺血性事件之可能性之由此產生的效益。因此，於本發明之一個實施例中，術語「CAA之治療」等同於術語「大腦內出血之治療」。於本發明之另一實施例中，術語「CAA之治療」等同於術語「CAA及/或大腦內出血之治療」。於本發明之另一實施例中，術語「CAA之治療」等同於術語「CAA及與之相關聯之大腦內出血之治療」。 如本文中所用，術語「CAA之預防」係指CAA之預防性治療、延遲CAA之發作或進展或延遲CAA之臨床症狀中之至少一者之發作或進展。例如，延遲CAA之發作或進展至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。於本發明之一實施例中，術語「CAA之預防」等同於術語「大腦內出血之預防」。於本發明之另一實施例中，術語「CAA之預防」等同於術語「CAA及/或大腦內出血之預防」。於本發明之另一實施例中，術語「CAA之預防」等同於術語「CAA及與之相關聯之大腦內出血之預防」。 如本文中所用，術語「CAA發展之遺傳預先傾向性」包括但不限於遺傳預先傾向性係歸因於下列之情況：唐氏症候群；類澱粉蛋白前體蛋白或早老素-1之基因突變；或存在一或兩個複本的ApoE4等位基因。 如本文中所用，除非上下文中明確意指僅臨床前阿茲海默氏病或僅臨床阿茲海默氏病，否則術語「阿茲海默氏病」或「AD」涵蓋臨床前及臨床阿茲海默氏病二者。 如本文中所用，術語「臨床阿茲海默氏病」或「臨床AD」涵蓋歸因於AD之輕度認知障礙(MCI)及歸因於AD之癡呆症二者，除非上下文中明確意指僅歸因於AD之MCI或僅歸因於AD之癡呆症。歐洲藥品局(EMA；European Medicines Agency)於其「用於治療AD及其他癡呆症之藥劑之臨床研究的準則草案」 (EMA/人用醫藥產物委員會(CHMP；Committee for Medicinal Products for Human Use)/539931/2014)中概述國家老化研究所(National Institute on Aging)關於診斷歸因於AD之MCI及AD癡呆症之準則，如下所闡述。 歸因於AD之MCI之診斷需要個體內下降之證據，其藉由以下各項表現： a)認知與先前達到水平之變化，如由自己表示或消息人士通報及/或臨床醫生之判斷。 b)相對於與年齡及教育匹配之標準值至少一個域中之認知受損(但未必是情景記憶)；一個以上認知域之受損係許可的。 c)功能能力保持獨立性，雖然該準則亦接受進行工具性日常生活活動(IADL)中之「輕度問題」，即使當此係僅在幫助下時(即，由於功能喪失，與其堅持獨立性，該準則允許輕度依賴)。 d)無癡呆症，其名義上為c(以上)之功能。 e)在其他潛在癡呆症不存在下，臨床表現與AD之表現型一致。增加的診斷信心可藉由以下表明： 1)最優：陽性Aβ生物標記及陽性退化生物標記 2)不到最優： i.無退化生物標記之陽性Aβ生物標記 ii.未測試Aβ生物標記之陽性退化生物標記 AD癡呆症之診斷需要： a)癡呆症之存在，如藉由認知及功能之個體內下降所確定。 b)起病隱襲及認知逐漸下降。 c)兩個或多於兩個認知域受損；雖然健忘表現係最常見，但是準則允許基於非健忘表現(例如，執行功能及視覺空間能力受損)之診斷。 d)不存在與其他癡呆症相關聯之突出特徵。 增加的診斷信心可藉由以上歸因於AD之MCI部分中討論之生物標記演算法表明。 如本文中所用，術語「臨床前阿茲海默氏病」或「臨床前AD」係指在不存在臨床症狀時存在AD之活體內分子生物標記。國家老化研究所及阿茲海默氏病協會(Alzheimer’s Association)提供下表1中顯示之方案，其闡述臨床前AD之不同階段(Sperling RA
等人
，2011)。 表1：臨床前AD階段類別
sMRI=結構磁共振造影 如本文中所用，術語「患者」係指人類個體。 如本文中所用，術語「類澱粉蛋白陽性」係指具有可檢測水平之腦中之Aβ積累之患者。於一實施例中，若基於CSF中之Aβ或類澱粉蛋白PET成像或二者之評估，患者具有可檢測水平之腦中Aβ積累，則該患者係「類澱粉蛋白陽性」。 如本文中所用，術語「藉由PET確定之類澱粉蛋白陽性」係指相較於背景增加類澱粉蛋白PET示蹤劑保留量。用於類澱粉蛋白陽性量測之適宜PET示蹤劑包括
18
F-氟比他匹(Florbetapir) (Palmqvist S
等人
，2015)、
18
F-氟比他班(florbetaben) (NeuraCeq)及
18
F-富特米他(flutemetamol) (Vizamyl)。例如，腦
18
F-氟比他匹(Florbetapir) PET掃描(各掃描260 MBq)之1.1或更高之SUVR可用作類澱粉蛋白陽性診斷閾值(Schreiber S
等人
，2015)。亦可使用1.2或1.3之SUVR作為閾值。 如本文中所用，術語「藉由CSF量測確定之類澱粉蛋白陽性」係指相較於健康對照組中所觀察者減少之CSF Aβ 1-42值。例如，可藉由CSF中192 ng/L或更低之Aβ 1-42值確定類澱粉蛋白陽性(Mattsson N
等人
，2015)。然而，用於確定類澱粉蛋白陽性之CSF Aβ 1-42截止值將取決於所使用之特定技術而變(Forlenza OV
等人
，2015)。類澱粉蛋白陽性亦可藉由CSF中低於0.09之Aβ 1-42/Aβ 1-40比率確定(Janelidze S
等人
，2016)。於一個實施例中，該Aβ 1-42/Aβ 1-40或Aβ42/Aβ40比率係小於0.20、0.15、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06或0.05或在0.20與0.01之間、0.15與0.01之間、0.10與0.01之間或0.05與0.01之間。可使用標準免疫檢定技術，例如使用Luminex平臺上之單株單抗體夾心酶聯免疫吸附(ELISA)檢定(Herskovitz AZ
等人
，2013)或Meso Scale Discovery(MSD)96孔多陣列(MULTI-ARRAY)人類/齧齒動物(6E10) Aβ40及42夾心免疫檢定(Meso Scale Discovery, Rockville, MD, USA)來量測Aβ 1-40及Aβ 1-42值。 如本文中所用，術語「CYP3A4」係指細胞色素P450 3A4。CYP3A4為於多種藥物之代謝中起主要作用之酵素(Luo G
等人
，2004)。 如本文中所用，術語「CYP3A4之誘導劑」係指引起CYP3A4活性水平增加之藥物。CYP3A4誘導劑之實例包括(但不限於)卡馬西平(carbamazepine)、苯妥英(phenytoin)、利福平(rifampicin)及聖約翰草(St John’s wort)。適於量測CYP3A4活性之技術係熟知的(參見例如Sevrioukova IF, Poulos TL, 2015)。CYP3A4之「強」、「中度」及「弱」誘導劑分別為使化合物1之血漿曲線下面積(AUC)(以自0至無限大之曲線下面積(AUCinf)計算)減少≥80%、≥50%至＜80%、及≥20%至＜50%之藥物。於一個實施例中，該「CYP3A4之誘導劑」為「CYP3A4之強誘導劑」。CYP3A之強誘導劑之實例包括(但不限於)卡馬西平、恩紮魯胺(enzalutamide)、米托坦(mitotane)、苯妥英、利福平(rifampin) (亦稱作rifampicin)及聖約翰草。CYP3A之中度誘導劑之實例包括(但不限於)波生坦(bosentan)、依法韋侖(efavirenz)、依曲韋林(etravirine)及莫達非尼(modafinil)。CYP3A之弱誘導劑之實例包括(但不限於)阿莫達非尼(armodafinil)及盧非醯胺(rufinamide)。參見http://www.fda.gov/Drugs/ DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractions Labeling/ucm093664.htm#table3-3 (上次訪問2016年10月11日)。 如本文中所用，術語「CYP3A4之抑制劑」係指引起CYP3A4活性水平降低之藥物。適於量測CYP3A4活性之技術係熟知的(參見例如Sevrioukova IF，Poulos TL，2015)。CYP3A4抑制劑之實例包括，但不限於，克拉黴素(clarithromycin)、葡萄柚汁及伊曲康唑(itraconazole)。CYP3A4之「強」、「中度」及「弱」抑制劑分別為使化合物1之血漿AUC(根據自0至無限大之曲線下面積(AUCinf)計算) 增加≥5倍、≥2至＜5倍及≥1.25至＜2倍之藥物。於一實施例中，該「CYP3A4之抑制劑」為「CYP3A4之強抑制劑」。CYP3A之強抑制劑之實例包括，但不限於，博賽潑維(boceprevir)、可比司他(cobicistat)、考尼伐坦(conivaptan)、丹諾普韋(danoprevir)與利托那韋(ritonavir)、埃替拉韋(elvitegravir)與利托那韋、葡萄柚汁、印地那韋(indinavir)與利托那韋、伊曲康唑、酮康唑(ketoconazole)、洛匹那韋(lopinavir)與利托那韋、帕利普韋(paritaprevir)與利托那韋及(奧米他韋(ombitasvir)及/或達塞布韋(dasabuvir))、泊沙康唑(posaconazole)、利托那韋、沙奎那韋(saquinavir)與利托那韋、特拉匹韋(telaprevir)、替拉那韋(tipranavir)與利托那韋、醋竹桃黴素(troleandomycin)、伏立康唑(voriconazole)、克拉黴素、地爾硫卓(diltiazem)、艾代拉裡斯(idelalisib)、奈法唑酮(nefazodone)及那非那韋(nelfinavir)。CYP3A之中度抑制劑之實例包括，但不限於，阿瑞吡坦(aprepitant)、西咪替丁(cimetidine)、環丙沙星(ciprofloxacin)、克黴唑(clotrimazole)、克唑替尼(crizotinib)、環孢黴素(cyclosporine)、決奈達隆(dronedarone)、紅黴素(erythromycin)、氟康唑(fluconazole)、氟伏沙明(fluvoxamine)、伊馬替尼(imatinib)、托非索泮(tofisopam)及維拉帕米(verapamil)。CYP3A之弱抑制劑之實例包括，但不限於，氯唑沙宗(chlorzoxazone)、西洛他唑(cilostazol)、福沙吡坦(fosaprepitant)、伊曲茶鹼(istradefylline)、依伐卡托(ivacaftor)、洛美他派(lomitapide)、雷尼替丁(ranitidine)、雷諾嗪(ranolazine)、他克莫司(tacrolimus)及替卡格雷(ticagrelor)。參見http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm#table3-2 (上次訪問2016年10月11日)。 如本文中所用，術語「同時利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑治療」係指患者經受利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑之治療協定同時亦經受化合物1之治療協定之情況。於一實施例中，不同時利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑及化合物1治療該患者超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16週。於另一實施例中，不同時利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑及化合物1治療該患者超過1、2、3、4、5、7、10或12個月。於某些實施例中，不同時利用CYP3A4之抑制劑或誘導劑及化合物1治療該患者超過3個月。 如本文中所用，術語「醫藥上可接受之鹽」係指保持本發明之化合物之生物有效性且通常並非在生物上或其他方面所不期望之鹽(Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, 第二修訂版(2011) P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth)。 如本文中所用，「醫藥組合物」包含本發明之化合物或其醫藥上可接受之鹽及至少一種醫藥上可接受之載劑，其呈適於口服之固體形式(通常明膠膠囊)。醫藥上可接受之載劑之清單可見於Remington’s Pharmaceutical Sciences。本文實例2中提供適用於治療或預防CAA之醫藥組合物之一個實例及其製備方法。 術語本發明之化合物之「治療上有效量」係指如由CSF或血漿Aβ 1-40水平相對於初始基線值降低證明將引起患者中之BACE-1之抑制之本發明之化合物的量。 為清楚起見，當本文中提供一範圍時，該範圍意欲包括端點。例如， 30與50 mg/天之間之劑量範圍亦包括30及50 mg/天之劑量。
略語表 實例
下列實例說明可如何製備化合物1 (
實例 1
)；顯示化合物1於APOE4轉殖基因小鼠模型中之PK/PD效應(
實例 2
)；顯示化合物1於首次人類中臨床研究中之PD效應(
實例 3
)；證實化合物1於3個月臨床研究中之安全性及耐受性(
實例 4
)；顯示3個月臨床研究中ApoE4基因型對化合物1 PD回應之影響(
實例 5
)；證實化合物1於減少APP23 AD小鼠模型中之CAA之治療有效性(
實例 6
)；證實化合物1於減少年老APP23小鼠之腦微出血之明顯治療有效性(
實例 7
)；顯示當與CYP3A4之強抑制劑或誘導劑組合給與時，化合物1之AUC如何受影響(
實例 8
)；及說明可如何於ApoE4純合子高危患者內進行用於治療CAA及與之相關聯之大腦內出血的化合物1功效研究(
實例 9
)。
實例 1 ：製備化合物 1
化合物1之製備述於WO 2012/095469 A1中(實例34)。亦可如下所述製備化合物1。
NMR 方法
除非另作指明，否則在Bruker 400 MHz 超屏蔽(ultrashield)光譜儀上記錄質子光譜。以相對於甲醇(δ 3.31)、二甲亞碸(δ 2.50)或氯仿(δ 7.29)之ppm記錄化學位移。將少量乾燥樣品(2至5 mg)溶解於適宜氘代溶劑(0.7 mL)中。自動勻場及按照一般熟習此項技術者熟知之程序獲得光譜。
一般層析訊息 HPLC 方法 H1 (RtH1
):
HPLC-管柱尺寸：3.0 x 30 mm HPLC-管柱類型：Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶離劑：A)水+ 0.05體積% TFA；B) ACN + 0.05體積% TFA HPLC-梯度：30至100 % B於3.25 min中，流速= 0.7 ml / min
LCMS 方法 H2 (RtH2
):
HPLC-管柱尺寸：3.0 x 30 mm HPLC-管柱類型：Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶離劑：A)水+ 0.05體積% TFA，B) ACN + 0.05體積% TFA HPLC-梯度：10至100 % B於3.25 min中，流速= 0.7 ml / min
UPLCMS 方法 H3 (RtH3
):
HPLC-管柱尺寸：2.1 x 50 mm HPLC-管柱類型：Acquity UPLC HSS T3, 1.8 µm HPLC-溶離劑：A)水+ 0.05體積%甲酸+ 3.75 mM乙酸銨 B) ACN + 0.04體積%甲酸 HPLC-梯度：2至98 % B於1.4 min中，98% B 0.75 min，流速= 1.2 ml / min HPLC-管柱溫度：50℃
LCMS 方法 H4 (RtH4
):
HPLC-管柱尺寸：3.0 x 30 mm HPLC-管柱類型：Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶離劑：A)水+ 0.05體積% TFA；B) ACN + 0.05體積% TFA HPLC-梯度：70至100 % B於3.25 min中，流速= 0.7 ml / min
LCMS 方法 H5 (RtH5
):
HPLC-管柱尺寸：3.0 x 30 mm HPLC-管柱類型：Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶離劑：A)水+ 0.05體積% TFA；B) ACN + 0.05體積% TFA HPLC-梯度：80至100 % B於3.25 min中，流速= 0.7 ml / min
LCMS 方法 H6 (RtH6
):
HPLC-管柱尺寸：3.0 x 30 mm HPLC-管柱類型：Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶離劑：A)水+ 0.05體積% TFA；B) ACN + 0.05體積% TFA HPLC-梯度：40至100 % B於3.25 min中，流速= 0.7 ml / min
a) 2- 溴 -5- 氟 -4- 三乙基矽烷基 - 吡啶
在-75℃下利用乾冰丙酮浴將含於370 ml THF中之二異丙胺(25.3 g，250 mmol)之溶液冷卻。逐滴添加BuLi (100 ml，250 mmol，2.5 M含於己烷)同時保持溫度在-50℃以下。於混合物之溫度再次達到-75℃後，逐滴添加含於45 ml THF中之2-溴-5-氟吡啶(36.7 g，208 mmol)之溶液。將混合物在-75℃下攪拌1小時。迅速添加三乙基氯矽烷(39.2 g，260 mmol)。使溫度保持在-50℃以下。移除冷卻浴並允許反應混合物升溫至 -15℃，倒入NH
4
Cl (10%)水溶液。添加TBME並分離層。將有機層用鹽水洗滌，經MgSO
4
.H
2
O乾燥，過濾及蒸發得到棕色液體，使其在0.5 mm Hg下蒸餾得到呈微黃色液體之標題化合物(沸點105至111℃)。HPLC: Rt
H4
= 2.284 min; ESIMS: 290, 292 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 8.14 (s, 1H), 7.40 (d, 1H), 1.00-0.82 (m, 15H)。
b) 1-(6- 溴 -3- 氟 -4- 三乙基矽烷基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮
將含於500 ml THF中之二異丙胺(25.4 g，250 mmol)之溶液冷卻至 -75℃。逐滴添加BuLi (100 ml，250 mmol，2.5 M含於己烷)同時保持溫度在-50℃以下。於反應溫度再次達到-75℃後，逐滴添加含於60 ml THF中之2-溴-5-氟-4-三乙基矽烷基-吡啶(56.04 g，193 mmol)之溶液。將混合物於乾冰浴中攪拌70分鐘。迅速添加N,N-二甲基乙醯胺(21.87 g，250 mmol)，反應溫度上升至-57℃。將反應混合物於乾冰浴中攪拌15分鐘並接著允許其升溫至-40℃。將其倒在2M HCl水溶液(250 ml，500 mmol)、250 ml水及100 ml鹽水之混合物上。將混合物用TBME萃取，用鹽水洗滌，經MgSO
4
.H
2
O乾燥，過濾及蒸發得到黃色油，使其在矽膠管柱上藉由利用己烷/0至5% TBME溶離純化得到58.5 g呈黃色液體之標題化合物。TLC (Hex/TBME 99/1): R
f
= 0.25; HPLC: Rt
H4
= 1.921 min; ESIMS: 332, 334 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 7.57 (d, 1H), 2.68 (s, 3H), 1.00-0.84 (m, 15H)。 c)
(S)-2-(6- 溴 -3- 氟 -4- 三乙基矽烷基 - 吡啶 -2- 基 )-2- 三甲基矽烷基氧基 - 丙腈
首先，藉由溶解水(54 mg，3.00 mmol)於100 ml無水DCM ( ≦0.001%水)中來製備觸媒溶液。將此濕的DCM (44 ml，1.32 mmol水含量)添加至經充分攪拌的含於20 ml無水DCM中之丁醇鈦(IV)(500 mg，1.47 mmol)之溶液中。將所得澄清溶液回流1小時。接著將此溶液冷卻至室溫並添加2,4-二-第三丁基-6-{[(E)-(S)-1-羥甲基-2-甲基-丙基亞胺基]-甲基}-苯酚[CAS 155052-31-6] (469 mg，1.47 mmol)。將所得黃色溶液在室溫下攪拌1小時。將此觸媒溶液(0.023 M，46.6 ml，1.07 mmol)添加至含於223 ml無水DCM中之1-(6-溴-3-氟-4-三乙基矽烷基-吡啶-2-基)-乙酮(35.53 g，107 mmol)及三甲基氰矽烷(12.73 g，128 mmol)之溶液中。將混合物攪拌2天並蒸發得到47 g呈橙色油之粗標題化合物。HPLC: Rt
H5
= 2.773 min; ESIMS: 431, 433 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 7.46 (d, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.00 (t, 9H), 1.03-0.87 (m, 15H), 0.20 (s, 9H)。 d)
(R)-1- 胺基 -2-(6- 溴 -3- 氟 -4- 三乙基矽烷基 - 吡啶 -2- 基 )- 丙 -2- 醇鹽酸鹽
添加硼烷二甲基硫醚複合物(16.55 g, 218 mmol)至含於470 ml THF中之粗(S)-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基矽烷基-吡啶-2-基)-2-三甲基矽烷基氧基-丙腈(47 g，109 mmol)之溶液中。將混合物回流2小時。移除加熱浴並藉由小心且逐滴添加MeOH來中止反應混合物。於氣體之排放停止後，緩慢添加6M HCl水溶液 (23.6 ml，142 mmol)。蒸發所得溶液及將殘餘物溶解於MeOH中並蒸發(兩次)得到44.5 g黃色發泡體，其足夠純淨可用於進一步反應。HPLC: Rt
H1
= 2.617 min; ESIMS: 363, 365 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 7.93 (s, br, 3H), 7.53 (d, 1H), 6.11 (s, br, 1H), 3.36-3.27 (m, 1H), 3.18-3.09 (m, 1H), 1.53 (s, 3H), 0.99-0.81 (m, 15H)。 e)
(R)-N-(2-(6- 溴 -3- 氟 -4-( 三乙基矽基 ) 吡啶 -2- 基 )-2- 羥丙基 )-4- 硝基苯磺醯胺
向含於335 ml THF中之粗(R)-1-胺基-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基矽烷基-吡啶-2-基)-丙-2-醇鹽酸鹽(43.5 g，109 mmol)之溶液中添加含於500 ml水中之NaHCO
3
(21.02 g，250 mmol)之溶液。將混合物冷卻至0至5℃並逐滴添加含於100 ml THF中之4-硝基苯磺醯氯(26.5 g，120 mmol)之溶液。將所得乳液攪拌過夜同時允許溫度達到室溫。將混合物用TBME萃取。有機層經MgSO
4
.H
2
O乾燥，過濾及蒸發得到橙色樹脂，使其在矽膠管柱上藉由利用己烷/10至20% EtOAc溶離純化得到37.56 g呈黃色樹脂之標題化合物。TLC (Hex/EtOAc 3/1): R
f
= 0.34; HPLC: Rt
H4
= 1.678 min; ESIMS: 548, 550 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): 8.40 (d, 2H), 8.06 (t, 1H), 7.97 (d, 2H), 7.45 (d, 1H), 5.42 (s, 1H), 3.23 (d, 2H), 1.44 (s, 3H) 0.97-0.81 (m, 15H); 對掌性HPLC (Chiralpak AD-H 1213, UV 210 nm)：90% ee。
f) 6- 溴 -3- 氟 -2-[(S)-2- 甲基 -1-(4- 硝基 - 苯磺醯基 )- 氮丙啶 -2- 基 ]-4- 三乙基矽烷基 - 吡啶
將含於510 ml THF中之三苯基膦(21.55 g，82 mmol)及(R)-N-(2-(6-溴-3-氟-4-(三乙基矽基)吡啶-2-基)-2-羥丙基)-4-硝基苯磺醯胺(37.56 g，69 mmol)之溶液冷卻至4℃。逐滴添加含於甲苯中之偶氮二甲酸二乙酯(40重量%，38.8 g，89 mmol)之溶液同時保持溫度在10℃以下。移除冷卻浴並將反應混合物在室溫下攪拌1小時。將反應混合物用約1000 ml甲苯稀釋並藉由旋蒸蒸發移除THF。將所得粗產物之甲苯溶液在矽膠管柱上藉由利用己烷/5至17% EtOAc溶離來預純化。將最純溶離份合併，蒸發並自TBME/己烷結晶得到29.2 g呈白色晶體之標題化合物。HPLC: Rt
H4
= 2.546 min; ESIMS: 530, 532 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 8.40 (d, 2H), 8.19 (d, 2H), 7.39 (d, 1H), 3.14 (s, 1H), 3.02 (s, 1H), 2.01 (s, 3H) 1.03 - 0.83 (m, 15H); α[D] -35.7° (c = 0.97, DCM)。
g) 6- 溴 -3- 氟 -2-[(S)-2- 甲基 -1-(4- 硝基 - 苯磺醯基 )- 氮丙啶 -2- 基 ]- 吡啶
添加氟化鉀(1.1 g，18.85 mmol)至含於25 ml THF中之6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺醯基)-氮丙啶-2-基]-4-三乙基矽烷基-吡啶(5 g，9.43 mmol)及AcOH (1.13 g，9.43 mmol)之溶液中。添加DMF (35 ml)並將懸浮液在室溫下攪拌1小時。將反應混合物倒入飽和NaHCO
3
水溶液及TBME之混合物中。分離層並用鹽水及TBME洗滌。合併之有機層經MgSO
4
.H
2
O乾燥，過濾及蒸發得到黃色油，使其自TBME/己烷結晶得到3.45 g呈白色晶體之標題化合物。HPLC: Rt
H6
= 2.612 min; ESIMS: 416, 418 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 8.41 (d, 2H), 8.19 (d, 2H), 7.48 (dd, 1H), 7.35 (t, 1H), 3.14 (s, 1H), 3.03 (s, 1H), 2.04 (s, 3H); α[D] -35.7° (c = 0.89, DCM)。
h) (R)-2-[(R)-2-(6- 溴 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2-(4- 硝基 - 苯磺醯胺基 )- 丙氧基 ]-3,3,3- 三氟 -2- 甲基 - 丙酸乙酯
將含於DMF (158 ml)中之(R)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基-丙酸乙酯(11.93 g，64.1 mmol)之溶液用氮氣排空/沖洗兩次。逐滴添加含於DMF (17 ml)中之KOtBu (6.21 g，55.5 mmol)之溶液同時使用水浴冷卻保持約25℃之反應溫度。於15分鐘後，添加固體6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺醯基)-氮丙啶-2-基]-吡啶(17.78 g，42.7 mmol)並繼續攪拌3小時。將反應混合物倒入1M HCl (56 ml)、鹽水及TBME之混合物中。分離層，用鹽水及TBME洗滌。合併之有機層經MgSO
4
.H
2
O乾燥，過濾及蒸發。粗反應產物經由矽膠上之層析法(己烷/25至33% TBME)純化得到16.93 g呈黃色樹脂之標題化合物，其經同分異構副產物(比率70:30，藉由
1
H-NMR)污染。 HPLC: Rt
H6
= 2.380 min; ESIMS: 602, 604 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 8.32 (d, 2H), 8.07 (d, 2H), 7.46 - 7.41 (m, 1H), 7.30 - 7.23 (m, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.39 - 4.30 (m, 2H), 3.95 (d, 1H), 3.84 (d, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 1.40-1.34 (m, 3H) +同分異構副產物。
i) (R)-2-[(R)-2-(6- 溴 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2-(4- 硝基 - 苯磺醯胺基 )- 丙氧基 ]-3,3,3- 三氟 -2- 甲基 - 丙醯胺
在50℃下於密封容器中將含於NH
3
/MeOH (7M，482 ml)中之(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺醯胺基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酸乙酯(16.93 g，28.1 mmol)之溶液攪拌26小時。蒸發反應混合物並將殘餘物自DCM結晶得到9.11 g呈無色晶體之標題化合物。 HPLC: Rt
H6
= 2.422 min; ESIMS: 573, 575 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 8.33 (d, 2H), 8.06 (d, 2H), 7.42 (dd, 1H), 7.30 - 7.26 (m, 1H), 7.17 (s, br, 1H), 6.41 (s, 1H), 5.57 (s, br, 1H), 4.15 (m, 2H), 1.68 (s, 3H), 1.65 (s, 3H)。
j) N-[(R)-1-(6- 溴 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2-((R)-1- 氰基 -2,2,2- 三氟 -1- 甲基 - 乙氧基 )-1- 甲基 - 乙基 ]-4- 硝基 - 苯磺醯胺
將含於85 ml DCM中之(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺醯胺基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙醯胺(8.43 g，14.70 mmol)及三乙胺(5.12 ml，36.8 mmol)之懸浮液冷卻至0至5℃。於30分鐘內逐滴添加三氟乙酸酐(2.49 ml，17.64 mmol)。添加額外的三乙胺(1.54 ml，11.07 mmol)及三氟乙酸酐(0.75 ml，5.29 mmol)以完成反應。藉由添加14 ml氨水(25%)及14 ml水來中止反應混合物。將乳液攪拌15分鐘，添加更多水及DCM並分離層。有機層經MgSO
4
H
2
O乾燥，過濾及蒸發。藉由在矽膠上之管柱層析(己烷/10至25% EtOAc)純化得到8.09 g呈黃色樹脂之標題化合物。 HPLC: Rt
H6
= 3.120 min; ESIMS: 555, 557 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 8.35 (d, 2H), 8.11 (d, 2H), 7.50 (dd, 1H), 7.32 (dd, 1H), 6.78 (s, 1H), 4.39 (d 1H), 4.22 (d, 1H), 1.68 (s, 6H)。
k) (2R,5R)-5-(6- 溴 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2,5- 二甲基 -2- 三氟甲基 -5,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基胺
將含於92 ml乙醇中之N-[(R)-1-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-((R)-1-氰基-2,2,2-三氟-1-甲基-乙氧基)-1-甲基-乙基]-4-硝基-苯磺醯胺(9.18 g，16.53 mmol)及N-乙醯半胱胺酸(5.40 g，33.10 mmol)之溶液用氮氣排空並沖洗。添加K
2
CO
3
(4.57 g，33.1 mmol)並將混合物在80℃下攪拌3天。將反應混合物於真空中濃縮至原始體積之約1/4並在水與TBME之間分配。將有機層用10% K
2
CO
3
水溶液洗滌，經Na
2
SO
4
乾燥，過濾及蒸發得到黃色油。在矽膠上之管柱層析(己烷/14至50% (EtOAc:MeOH 95:5))得到4.55 g呈灰白色固體之標題化合物。 HPLC: Rt
H2
= 2.741 min; ESIMS: 370, 372 [(M+H)
+
, 1Br];
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): 7.71 - 7.62 (m, 2H), 5.97 (s, br, 2H), 4.02 (d 1H), 3.70 (d, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.47 (s, 3H)。
l ) (2R, 5R)-5-(6- 胺基 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2,5- 二甲基 -2- 三氟甲基 -5,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基胺
將玻璃/不銹鋼高壓釜用氮氣沖洗，添加Cu
2
O (0.464 g，3.24 mmol)、氨水(101 ml，25%水溶液，648 mmol，30當量)及含於乙二醇(130 ml)中之(2R,5R)-5-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基胺(8 g，21.6 mmol)。關閉高壓釜並將懸浮液加熱至高達60℃及將溶液攪拌約48小時(最大壓力0.7 bar，內部溫度59至60℃)。將反應混合物用乙酸乙酯及水稀釋。將有機相用水洗滌及用12%氨水洗滌4次及最後用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾及蒸發。未經進一步純化即將粗產物(7 g，含有一些乙二醇，定量產量)用於下一步驟。 HPLC: Rt
H3
= 0.60 min; ESIMS: 307 [(M+H)
+
]。
m) [(2R, 5R)-5-(6- 胺基 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2,5- 二甲基 -2- 三氟甲基 -5,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基 ]- 胺基甲酸第三丁酯
將含於二氯甲烷(185 ml)中之(2R, 5R)-5-(6-胺基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基胺(6.62 g，21.6 mmol)、Boc
2
O (4.72 g，21.6 mmol)及Hünig’s鹼(5.66 ml，32.4 mmol)之溶液在室溫下攪拌18小時。將反應混合物用飽和NaHCO
3
水溶液及鹽水洗滌。將水層用二氯甲烷反萃取及將合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾及蒸發得到淺綠色固體(14 g)。粗產物經矽膠層析(環己烷:乙酸乙酯95:5至60:40)得到7.68 g標題化合物。 TLC (環己烷:乙酸乙酯3:1): R
f
= 0.21; HPLC: Rt
H3
= 1.14 min; ESIMS: 408 [(M+H)
+
];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): 11.47 (br. s, 1H), 7.23 (dd,
J
=10.42, 8.78 Hz, 1H), 6.45 (dd,
J
=8.78, 2.64 Hz, 1H), 4.50 (br. s, 2H), 4.32 (d,
J
=2.38 Hz, 1H), 4.10 (d,
J
=11.80 Hz, 1H), 1.69 (s, 3H, CH3), 1.65 (s, 3H, CH3), 1.55 (s, 9H)。
n) ((2R, 5R)-5-{6-[(3-氯-5- 三氟甲基 - 吡啶 -2- 羰基 )- 胺基 ]-3- 氟 - 吡啶 -2- 基 }-2,5- 二甲基 -2- 三氟甲基 -5,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基 )- 胺基甲酸第三丁酯
於DMF (81 ml)中在室溫下將[(2R, 5R)-5-(6-胺基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基]-胺基甲酸第三丁酯(3.3 g，8.12 mmol)、3-氯-5-三氟甲基吡啶甲酸(2.2 g，9.74 mmol)、HOAt (1.99 g，14.62 mmol)及EDC鹽酸鹽(2.33 g，12.18 mmol)之混合物攪拌48小時。將反應混合物用乙酸乙酯稀釋及用水及鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾及蒸發。粗產物(12 g)經矽膠層析(環己烷至環己烷:乙酸乙酯1:1)得到5.2 g標題化合物。 TLC (矽石，環己烷:乙酸乙酯3:1): R
f
=0.47; HPLC: Rt
H3
= 1.40 min; ESIMS: 615, 616 [(M+H)
+
, 1Cl];
1
H-NMR (400 MHz, CDCl
3
): 11.68 (s, 1H), 10.41 (s, 1H), 8.81 (dd,
J
=1.82, 0.69 Hz, 1 H), 8.45 (dd,
J
=8.91, 3.14 Hz, 1 H), 8.19 (dd,
J
=1.88, 0.63 Hz, 1 H), 7.59 (dd,
J
=9.79, 9.16 Hz, 1 H), 4.38 (d,
J
=2.13 Hz, 1 H), 4.18 (d,
J
=11.80 Hz, 1 H), 1.75 (s, 3H), 1.62 (s, 3H), 1.60 (s, 9H)。
o) 3-氯-5- 三氟甲基 - 吡啶 -2- 羧酸 [6-((3R,6R)-5- 胺基 -3,6- 二甲基 -6- 三氟甲基 -3,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基 )-5- 氟 - 吡啶 -2- 基 ]- 醯胺
將含於二氯甲烷(81 ml)中之((2R, 5R)-5-{6-[3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-羰基)-胺基]-3-氟-吡啶-2-基}-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基)-胺基甲酸第三丁酯(4.99 g，8.13 mmol)及TFA (6.26 ml，81 mmol)之混合物在室溫下攪拌18小時。蒸發溶劑並將殘餘物用適宜有機溶劑(諸如乙酸乙酯及氨水)稀釋。添加冰並將有機相用水及鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾及蒸發得到3.78 g之標題化合物。 HPLC: Rt
H3
= 0.87 min; ESIMS: 514, 516 [(M+H)
+
, 1Cl];
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-
d 6
): δ 11.11 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.13 (dd,
J
= 8.8, 2.6 Hz, 1H), 7.80 - 7.68 (m, 1H), 5.88 (br. s, 2H), 4.12 (d,
J
= 11.5 Hz, 1H), 3.72 (d,
J
= 11.4 Hz, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.49 (s, 3H)。
實例 2 ：化合物 1 於 APOE4-TR 小鼠中之 急性 PK/PD 劑量 - 反應研究
為研究化合物1對人類APOE4環境中之APP代謝之影響，進行攜帶人類APOE4等位基因之轉殖基因小鼠中之PK/PD研究(小鼠Apoe基因經人類APOE4、APOE4-TR置換(Knouff C
等人
，1999))。 於此研究中，將3至5個月齡之雄性及雌性APOE4-TR動物用不同劑量(3、10、30 u mol/kg)之化合物1急性治療並於治療後4 h及24 h犧牲。
動物
自Taconic獲得雄性及雌性轉殖基因純合子APOE4-TR (B6.129P2-
Apoetm3(APOE*4)Mae
N8，Taconic，型號001549，3至5個月大，n=48)。
劑量選擇
化合物1以3、10及30 µmol/kg投與。
化合物形式、調配物及給藥
化合物1經調配為懸浮液。藉由一次10 ml/kg之體積之口服投與提供媒劑或化合物。媒劑：0.1% Tween80含於含0.5 %甲基纖維素之水中。
表 2 ：治療組 體重
在給藥前稱取一次體重。
活體外樣品及樣品收集方法
使用血液樣品來分析全血化合物含量且其係在驗屍當天自軀幹血獲得置入EDTA Eppendorf管(Milian SA, CatNoTOM-14, Fisher Scientific, Wohlen, Switzerland)或置入血清管(CB300Z, Sarstedt, Nümbrecht, Germany)中。 藉由EDTA血液之離心(8000 rpm/6800xg, 15 min, 4℃)收集用於類澱粉蛋白-β(Aβ)分析之血漿並將其收集入蛋白Lo-Bind Eppendorf管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。 將所有血液/血漿/血清樣品在乾冰上冷凍並在-80℃下儲存直至分析。 於斬首後立即移除腦，用鹽水沖洗並沿中線進行矢狀切片。使用左側小腦來分析化合物含量並將其放入玻璃管(Chromacol, 125 x 5-SV T051, Welwyn Garden City, United Kingdom)中，稱重並於乾冰中冷凍，將前腦(無嗅球)之左半邊用於Aβ分析，及在金屬板上在乾冰上冷凍並放入蛋白Lo-bind管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。將右腦固定於4%多聚甲醛中，用PBS洗滌及接著包埋於石蠟中用於將來可能的組織學分析。 在研究結束時收集尾巴並在-20℃下儲存。
表 3 ：化合物含量分析 小鼠腦中之 A β 40 及 CSF 中之 A β 40 及 A β 42 分析 腦均質化
將冷凍小鼠前腦稱重並藉由音波振動處理(90%工作循環，輸出控制5，40至55個脈衝[Sonifier 450，Branson])於9體積(w/v)之冰冷TBS-Complete (20 mM Tris-HCl pH 7.4，137 mM NaCl，1x Complete [蛋白酶抑制劑混合錠劑：1 836 145，Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany])中均質化。於均質化後，製備若干50 µl等分試樣用於分析並在 -80℃下儲存。
製備合成的 Aβ1-40 溶液作為標準品
使用人類Aβ肽(1-40)三氟乙酸鹽(H 1194.1000，Bachem, Bubendorf, Switzerland)作為Aβ1-40之校準曲線。在室溫(RT)下將其以1 mg/ml之濃度溶解於無水DMSO (41647，Fluka)中約30分鐘及接著目視檢查完全溶解。 於LoBind管(0030 108.094，Eppendorf, Hamburg, Germany)中製備20 x 5 µl等分試樣及剩餘溶液之100 µl等分試樣，用氮氣覆蓋以保護Aβ肽避免氧化並在-80℃下儲存。關於校準曲線，僅使用5 µl等分試樣一次並接著丟棄。
測定小鼠腦中之 A β 40
利用Meso Scale Discovery (MSD) 96孔多陣列人類/齧齒動物(4G8) Aβ40超靈敏檢定(#K110FTE-3，Meso Scale Discovery, Gaithersburg, USA)測定小鼠中之內源性Aβ40。除校準曲線及樣品製備之外，根據製造商之說明進行該檢定。利用1% TX-100使用各1:10前腦勻漿之50 μl等分試樣與50 μl含2% TX-100之TBS complete (20 mM Tris-HCl pH 7.4，137 mM NaCl，1x Complete [蛋白酶抑制劑混合物錠劑：1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg Germany])混合自前腦提取TritonX-100 (TX-100)可溶性Aβ40，以達到1% TX-100之終濃度及1:20前腦稀釋。將該等樣品在冰上培育15分鐘並每隔5分鐘進行渦旋。將該等樣品超離心(100000xg，4℃，15 min)並將50 μl清澈上清液轉移至新鮮管中。關於Aβ40檢定，將該等上清液以1:5進一步稀釋於3%阻斷劑A溶液(來自套組)中達到1:100之最終前腦稀釋並將其施覆至板上。 除了非轉殖基因小鼠腦樣品之外，以摻入合成的Aβ1-40肽(1.56至100 pg/ml)之1%阻斷劑A溶液之對應稀釋製備校準曲線：於此情況中，以摻入合成的Aβ1-40肽(1.56至100 pg/ml)之經對應稀釋之APP基因剔除小鼠前腦製備校準曲線。針對所有樣品及標準品，每孔施覆25 μl。針對各測定，製作重複孔。將來自重複孔之平均值用於計算。由於MSD不提供定量軟體，因此將樣品及標準品之相對單位輸入SOFTmax PRO 4.0用於計算標準曲線及定量樣品。
結果
利用BACE抑制劑化合物1之三種不同劑量(3、10及30 µmol/kg)急性治療APOE4-TR小鼠(小鼠Apoe基因經人類APOE4置換)。於最後劑量後4小時及24小時犧牲動物及分離前腦。用於各種組之Aβ1-40及Aβ1-42之濃度概述於圖1、2及3及表5、6及7中。計算相對媒劑治療組之減少百分比。所有治療於最後劑量後4小時及24小時導致顯著及劑量依賴性的Aβ40減少，效應範圍在4小時時為43至77%及在24小時時為20至66%。針對兩個較低劑量組(3及10 µmol/kg)，在4小時及24小時時Aβ40的降低效應顯著減少，但於最後劑量後24小時時實質上接近基線水平。化合物1之高劑量(30 µmol/kg)顯示在整個24小時時間過程中具有77至66% Aβ40減少之幾乎平坦曲線。
表 4 ：化合物 1 治療對 APOE4-TR 小鼠腦 (n=6 (n=3 雄性， n=3 雌性) ) 中之 A β 40 水平之效應
n.a.：不適用，媒劑：所有組合之媒劑
表 5 ：化合物 1 治療對 APOE4-TR 小鼠 CSF(n=6 (n=3 雄性， n=3 雌性) ) 中之 Aβ 40 水平之效應
n.a.：不適用，媒劑：所有組合之媒劑，ns：不顯著
表 6 ：化合物 1 治療對 APOE4-TR 小鼠 CSF(n=6 (n=3 雄性， n=3 雌性) ) 中之 Aβ 42 水平之效應
n.a.：不適用，媒劑：所有組合之媒劑，ns：不顯著 針對血液及腦中之急性給藥4小時及24小時之PK資料顯示於圖4及表7中。表8中概述化合物1於血液及腦中歷時24小時之暴露，表示為AUC
0-24h
。化合物1於血液及腦中之暴露係與劑量成比例及於24小時後顯示化合物含量之預期較小下降，該下降再次係與劑量成比例。化合物於腦中之暴露較於血液中更高。腦血液比率針對3、10及30 µmol/kg劑量組係類似的，其中分別地在4小時時為5、3及4及在24小時時為9、4及3。計算4h/24h之暴露比率，其容許比較不同劑量下之化合物暴露之下降(表7)。化合物1具有適度2至5倍的暴露減少，在不同劑量之間及在血液與腦之間無大的差異。
表 7 ： APOE4-TR 小鼠 (n=6 (n=3 雄性， n=3 雌性) ) 之血液及腦中之化合物 1 水平 表 8 ： APOE4-TR 小鼠之血液及腦中之化合物 1 AUC0 - 24h
AUC自4小時至24小時時間點。 圖5顯示針對所有劑量組之個別動物之腦藥物動力學/藥效動力學關係。針對化合物1存在明顯之清晰PK/PD關係；在低化合物含量下Aβ減少功效係最小，而在高化合物含量下檢測到最大功效效應。 圖6顯示針對不同劑量之平均值之PK/PD關係。再次，對Aβ減少之暴露依賴效應係明顯的，其具有明確最小及最大功效效應。
結論
於此實驗實例中展示之研究證實化合物1係APOE4-TR小鼠活體內之BACE之可口服、中樞活性及強效抑制劑。使用自小鼠內源性Apoe位點表現人類APOE4之APOE4-TR小鼠來研究化合物1之PK/PD關係。已暗示ApoE4為阿茲海默氏病及CAA之高風險因素。 APOE4-TR小鼠中之化合物1之PK性質與於野生型小鼠中所觀察得者並無不同。觀察到血液及腦中之劑量依賴性化合物1暴露，其中腦含量更高。此外，於24小時後之暴露減少係類似於於野生型小鼠中所觀察得者。30 µmol/kg之化合物1導致對APOE4-TR之腦中之Aβ減少(＞70%)的最大效應，其具有針對急性給藥持續超過24小時之類似程度。該PK/PD關係對野生型小鼠及大鼠非常類似。明顯於APOE4-TR小鼠中於最高劑量(30 µmol/kg)下對腦中之Aβ減少存在稍低的最大功效效應。此可係歸因於在APOE-4 TR小鼠中觀察到之類澱粉蛋白-β之較低清除率(Castellano JM
等人
，2011)。
實例 3 ：首次人類中研究
此研究已在臨床上完成且為隨機、雙盲、安慰劑對照、單一及多重上升口服劑量研究，以初步評估化合物1於健康成人及年老個體中之安全性及耐受性以及藥物動力學及藥效動力學。此研究之目的為使用CSF中之Aβ作為主要PD生物標記來確定化合物1之單一及多重最大耐受劑量及評估藥物動力學/藥效動力學(PK/PD)關係。 於≥60歲年齡之健康年老個體中，歷時兩週之750 mg單一劑量及300 mg QD之最高測試劑量經確定係安全及可耐受的。亦將使用CSF中之Aβ濃度作為藥物作用之主要生物標記之藥效動力學評估應用於健康年老個體。Aβ40濃度之劑量依賴性降低於單一及多重給藥後分別經確定高達約80%及90%(表9及10，圖7)。
表 9 ： CSF 中之 A β 40- 跨時間自基線之百分比變化之概述 表 10 ： CSF 中之 A β 40- 在第 15 天 ( 最後劑量後 24 h) 自基線之百分比變化之概述 實例 4 ： 3 個月劑量範圍安全性及耐受性研究
於I階段臨床劑量範圍安全性及耐受性研究中，對60歲或超過60歲的健康年老個體投與化合物1。此研究在NCT02576639識別碼下列入ClinicalTrials.gov。 此隨機、雙盲、安慰劑對照研究具有平行組設計且化合物1係以每日一次的口服劑量投與五個治療組 (化合物1：2mg、10mg、35mg或85mg QD及安慰劑)。 此研究之主要目的為擴大先前在首次人類中研究中歷時2週及4週期間獲得之安全性及耐受性資料及從而允許於有AD及CAA風險之個體中開始將來長期功效試驗。此外，獲得有關於藥物動力學/藥效動力學模型之資料以支援將來功效研究之劑量選擇決定。 於此研究中，發現化合物1以2、10、35及85mg之每日一次劑量歷時三個月係安全及可耐受的。表11及圖8中顯示化合物1投與對CSF Aβ水平之藥效動力學影響。Aβ降低程度係隨著時間穩定，其中於約2至3週後達到PD穩態。
表 11 ：第 3 個月 CSF 中之 A β -A β 38 、 A β 40 及 A β 42 自基線之百分比變化分析
經調整之Ls平均、Ls平均之差值、90% CI及P-值係獲自以治療作為固定效應及基線AB水平作為共變量之ANCOVA模型。 表12中顯示化合物1在三個月(91天)2、10、35及85mg之日劑量後之藥物動力學參數。
表 12 ：第 91 天之化合物 1 藥物動力學參數
Cmax,ss值表示化合物1在91天每日一次(qd)以指定劑量給藥後之最大血漿穩態濃度。「CV%」表示變化之百分比係數。基於此等結果，預期15 mg化合物1之每日一次劑量導致血漿Cmax,ss值在70與170 ng/ml之間，及預期50 mg化合物1之每日一次劑量導致血漿Cmax,ss值在200與500 ng/ml之間。 基於實例3及4展示之資料，藥物計量學模型預測於90%個體中，50 mg之日劑量達成CSF Aβ40降低80%及15 mg之劑量達成CSF Aβ40降低60%。
實例 5 ： ApoE4 基因型對利用化合物 1 治療之反應的影響
於實例3及4中描述之完成的首次人類中及3個月劑量範圍安全性及耐受性臨床研究中，在第一劑量(基線)之前及分別於多次給藥2週及3個月後藉助腰椎穿刺獲得CSF中之Aβ濃度。亦於同意之個體中獲得ApoE4基因型。於進行該研究治療及對藥效動力學效應之評估之潛在影響無主要協議偏離之個體中計算Aβ40及Aβ42濃度自基線之百分比變化。下表13至16提供治療組及ApoE基因型(E4雜合子相對E4非載體)自基線之百分比變化之概述統計。僅一個具有CSF資料之個體為E4純合子(來自3個月劑量範圍安全性及耐受性研究)。此個體經安慰劑治療及顯示Aβ40及Aβ42濃度均減少11%且不包含於下表中。該資料顯示CSF Aβ40及Aβ42對利用化合物1治療之反應在ApoE4載體與非載體之間不存在差異。
表 13 ： 在 3 個月時 ApoE 基因型及化合物 1 治療組 自基線之 A β 40 變化 % 表 14 ： 在 3 個月時 ApoE 基因型及化合物 1 治療組 自基線之 Aβ42 變化 % 表 15 ： 於首次人類中臨床研究中在 2 週 時 ApoE 基因型及化合物 1 治療組 自基線之 Aβ40 變化 % 表 16 ： 於首次人類中臨床研究中在 2 週 時 ApoE 基因型及化合物 1 治療組 自基線之 Aβ42 變化 % 實例 6 ：利用 BACE 抑制劑化合物 1 之生有斑塊雄性 APP23 小鼠之慢性療法治療及 CAA 評估 概述
以兩種劑量對生有斑塊年齡(12個月)之APP23轉殖基因小鼠慢性投與化合物1持續6個月。與僅接受媒劑之組相比，以0.03 g/kg食物投與化合物1導致類澱粉蛋白-β 40及42相較於媒劑組之輕微降低，及0.3 g/kg食物之投與導致強降低。小鼠腦中之Aβ之量類似於基線之小鼠(12個月齡)。血漿及CSF中之可溶性Aβ僅於高劑量組中顯著減少。CD31之共定位/鄰近分析及類澱粉蛋白-β陽性免疫反應性顯示具有25至50%及50至75% Aβ覆蓋之腦血管藉由高劑量化合物1減少。
方法 動物及劑量選擇
利用含於食物顆粒中之0.3 g/kg或0.03 g/kg化合物1治療雄性轉殖基因、雜合APP23(B6,D2-Tg(Thy1App)23Sdz (Sturchler-Pierrat C
等人
，1997)，12至14個月大，n=64)。
表 17 ：治療組
3個治療組，每個治療組小鼠n=18；1個基線組，n=10
活體外樣品及樣品採集方法
使用血液樣品來分析全血化合物含量且其係在驗屍當天自軀幹血獲得置入EDTA Eppendorf管(Milian SA, CatNoTOM-14, Fisher Scientific, Wohlen, Switzerland)或置入血清管(CB300Z, Sarstedt, Nümbrecht, Germany)中。 藉由EDTA血液之離心(8000 rpm/6800xg, 15 min, 4℃)收集用於類澱粉蛋白-β(Aβ)分析之血漿並將其收集入蛋白Lo-Bind Eppendorf管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。 所有血液/血漿/血清樣品係在乾冰上冷凍並在-80℃下儲存直至分析。 於斬首後立即移除腦，用鹽水沖洗並沿中線進行矢狀切片。使用左半邊的腦來分析化合物含量並將其放入玻璃管(Chromacol, 125 x 5-SV T051, Welwyn Garden City, United Kingdom)中，稱重並於乾冰中冷凍，使用前腦(無嗅球)之左半邊來進行Aβ分析，及在金屬板上在乾冰上冷凍並放入蛋白Lo-Bind管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。 在研究結束時收集尾巴並在-20℃下儲存。
化合物含量分析
藉由液相層析法/串聯質譜法(HPLC/MS/MS)於血液及腦中定量生物樣品中之化合物1
水平
。使用Covaris®裝置將腦樣品與2體積之KH2PO4緩衝液混合並均質化。將30 µL血液或腦勻漿摻入結構相關之內標準品及接著與至少6倍過量體積之乙腈混合用於蛋白質沉澱。將上清液直接注射入LC/MS/MS系統中進行分析。
表 18 ：用於血液及腦樣品之儀器條件 小鼠組織中之 Aβ40 及 Aβ42 分析 腦均質化
將冷凍的小鼠前腦稱重並於9體積(w/v)之冰冷TBS-Complete (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1x Complete [蛋白酶抑制劑混合錠劑：1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany])中藉由音波振動處理(90%工作循環，輸出控制5，40至55個脈衝，[Sonifier 450, Branson])均質化。於均質化後，製備若干50 µl等分試樣用於分析並在-80℃儲存。
製備合成的 A β 溶液作為標準品
使用人類Aβ肽(1-40)三氟乙酸鹽(H 1194.1000, Bachem, Bubendorf, Switzerland)作為Aβ1-40之校準曲線。在室溫(RT)將其以1 mg/ml之濃度溶解於無水DMSO(41647, Fluka)中約30分鐘及接著目視檢查完全溶解。 於LoBind管(0030 108.094, Eppendorf, Hamburg, Germany)中製備剩餘溶液之20 x 5 µl等分試樣及100 µl等分試樣，用氮氣覆蓋以保護Aβ肽避免氧化並在-80℃儲存。關於校準曲線，僅使用5 µl等分試樣一次並接著丟棄。
測定 APP23 小鼠腦中之 Triton X-100 可溶性 A β
如[RD-2010-00284]中所述利用Meso Scale Discovery (MSD) 96孔多陣列人類/齧齒動物(6E10) Aβ40/42檢定(Meso Scale Discovery, Rockville, MD, USA)測定小鼠中之人類Aβ40及42。除校準曲線及樣品製備之外，根據製造商之說明進行該檢定。利用1% TX-100自前腦提取TritonX-100 (TX-100)可溶性Aβ40及42，使用各1:10前腦勻漿之50 μl等分試樣與50 μl含2% TX-100之TBS complete (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1x Complete [蛋白酶抑制劑混合錠劑：1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg Germany])混合以達到1% TX-100之終濃度及1:20前腦稀釋。將該等樣品在冰上培育15分鐘並每隔5分鐘進行渦旋。將該等樣品超離心(100000xg, 4℃, 15 min)並將50 μl清澈上清液轉移至新鮮管中。將該等上清液進一步以1:5於3%阻斷劑A溶液(來自套組)中稀釋至1:100之最終前腦稀釋並施加至板上。 除了非轉殖基因小鼠腦樣品之外，以摻入合成的Aβ1-40肽(1.56至100 pg/ml)之1%阻斷劑A溶液之對應稀釋製備校準曲線：於此情況中，以摻入合成的Aβ1-40肽(1.56至100 pg/ml)之對應稀釋之APP基因剔除小鼠前腦製備校準曲線。針對所有樣品及標準品，每孔施加25 μl。針對各測定，製作重複孔。使用來自重複孔之平均值用於計算。將樣品及標準品之相對單位輸入SOFTmax PRO 4.0用於計算標準曲線及定量樣品。
測定 APP23 小鼠腦中之甲酸可溶性 A β
將五十微升前腦勻漿與116.6 μl 100%甲酸混合，產生70%之最終甲酸濃度。將樣品儲存在冰上並每隔5分鐘進行渦旋。為了中和，將50 μl混合物用吸量管移入新管中，並添加含有1x完整蛋白酶抑制劑之950 µl之1 M Tris鹼。將該等管在室溫下儲存過夜及接著於Eppendorf Microzentrifuge中在4℃下以14000 rpm離心15分鐘。自頂層移除100 µl並與100 µl之3%阻斷劑A溶液(MesoScale檢定套組之部分)混合。將此樣品直接施覆於檢定板(稀釋1:1332)或進一步於1%阻斷劑A溶液中稀釋。
小鼠 CSF 中之 A β 40 分析
將小鼠CSF樣品(3 µl)用57 µl 1%阻斷劑A(MSD)稀釋及將25 µl施覆於檢定板。
小鼠 血漿 中之 A β 40 分析
將血漿樣品(30 µl)與30 µl之3%阻斷劑A(MSD)混合及將25 µl施覆於檢定板。
使用雙螢光免疫組織化學分析類澱粉蛋白 -β斑塊 及血管內皮細胞
使用識別類澱粉蛋白肽之C末端部分之兔抗-Aβ一級抗體(NT12)將類澱粉蛋白斑塊染色(如Schrader-Fischer G及Paganetti PA, 1996及Schrader-Fischer G
等人
, 1997中所述提取抗體)。使用來自Dianova GmbH (Hamburg, Germany)之大鼠抗-CD31抗體(參考DIA310)來檢測血管內皮細胞。使用全自動儀器Ventana Discovery® Ultra (Roche Diagnostics Schweiz AG, Rotkreuz, Switzerland)進行所有染色。所有化學品係由Roche Diagnostic提供。 使用所有研究動物及鮮切3微米之腦組織切片並收集在SuperFrost+載玻片上。將組織切片脫蠟並在無溶劑條件(EZprep溶液)下再水化，接著藉由EDTA基緩衝液(CC1溶液)中之熱修復循環32分鐘進行抗原修復(解蔽)。隨後，使用DISCOVERY抑制劑(參考07017944001 (Roche))封阻載玻片4分鐘。將含於抗體稀釋劑中以1/10’000稀釋之一級抗體手工添加在組織切片上並在室溫下培育1小時。在施用多聚體UltraMap-抗兔HRP即用抗體(參考05269717001)之前進行短的後固定(0.05%之戊二醛)16分鐘。 使用DISCOVERY FITC®按照製造商之建議進行檢測。接著使載玻片在92℃下熱變性20分鐘，然後手工施用第二一級抗體(含於抗體稀釋劑中以1/1’000稀釋之大鼠抗-CD31)並培育1小時。使用多聚體UltraMap-抗兔HRP抗體(參考05891884001)20分鐘以與DISCOVERY羅丹明(Rhodamine)套組(參考07259883001)組合來檢測CD31。 將載玻片用Prolong® Gold抗螢光衰減封片試劑(參考P36931, ThermoFisher, Switzerland)洗滌並安裝及利用Hamamatsu載玻片掃描器儀器(NanoZoomer 2.0 HT，掃描軟體NDP-Scan Vers. 2.5, Hamamatsu Photonics France, Swiss Office, Solothurn, Switzerland)在40x物鏡下進一步掃描。掃描設置如下：將利用DAPI濾鏡之曝光時間設置在28.5 ms同樣用於FITC濾鏡及TRITC濾鏡(檢測羅丹明)。
影像分析
為基於影像分析進行定量斑塊及血管相關聯之類澱粉蛋白-β評估，基於MS視覺化工作室(Visual Studio) 2010及來自Matrox MIL V9圖書館(Matrox Inc, Quebec, Canada)之許多功能開發專有影像分析平臺(ASTORIA，自動存儲影像分析(Automated Stored Image Analysis))。 關於β-類澱粉蛋白斑塊及血管分析，進行以下序列步驟： -利用Hamamatsu Nanozoomer以40x放大率掃描載玻片。針對各螢光標記(DAPI、FITC及TRITC)，建立個別影像 -手工勾畫ROIs (受關注區域)以界定腦切片中之皮質用於在綠色FITC通道影像上之Aβ斑塊評估，接著使用產生之輪廓亦用於其他兩個通道影像(複製產生xml檔案) -執行內部開發之ImageScope (V12.1.0.5029, Aperio Inc., USA)外掛程式用於建立及輸出3個螢光通道各*.tif影像檔案(在10x放大率下) 影像批量處理： -通過存取各個別螢光通道影像獲得針對各切片之組合真彩色影像(DAPI、FITC、TRITC) -自黑色未染色背景分割有效樣品(在勾畫之ROI內) -應用適應定限技術來分割綠色通道影像中之目標(FITC-標記之Aβ斑塊) 特定針對CD31 -通過形態學頂帽轉換(tophat transformation)(設置在10、15及20)及定限，接著藉由尺寸過濾(設置在15、30、50及200)來分割紅色通道(特定針對指示血管之CD31染色)中TRITC-標記之目標 - 使用頂帽10及尺寸15之組合來進行此報告中之詳細分析 -通過初始目標之擴大及減除在分割之血管周圍產生一個環以表徵用於Aβ評估(鄰近血管)之有效範圍，即所謂「影響區」 -根據先前確定之影響區內之NT12陽性之比率分類血管 CD31+NT12 評估5類血管之NT12陽性(CD31陽性) - 0% (血管中無Aβ) - 1…10%血管相關聯之Aβ - 11…25%血管相關聯之Aβ - 26…50%血管相關聯之Aβ - 51…75%血管相關聯之Aβ - 76…100%血管相關聯之Aβ 下列之附加計算： - ROI內之總NT12信號 - ROI內之總CD31信號 -血管相關聯之Aβ面積(即，如上述之總「影響區」面積內之NT12信號)之比率
結果 表 19 ：腦及血液中之化合物 1 水平
於給藥2及4個月後及在6個月之研究結束時測定化合物1之血液濃度。如表19中所示，在研究過程中存在在動物之間具有可接受變化(平均18% (8至36%))之持續暴露。平均化合物1血液濃度針對0.03 g/kg食物給藥組為0.25 ± 0.13 µM (平均 ± SD)，及針對0.3 g/kg給藥組為2.10 ± 0.47 µM，與化合物劑量之10倍差異良好一致。於此研究中觀察到之暴露大致對應於化合物1之5及45 mg/kg日口服劑量。在實驗結束時測定之腦/血液比率針對0.03 g/kg組為2.7及針對0.3 g/kg組為3.3。
APP 代謝產物之生物化學測定：來自小鼠腦之 Triton TX-100- 可溶性 APP 代謝產物
利用含1% Triton X-100之緩衝液提取腦勻漿及將所得上清液視為代表APP代謝產物之可溶形式。除Aβ40及42之外，吾人測定N-末端APP片段sAPPα (α-分泌酶之直接裂解產物)及sAPPβ (Swe) (BACE1裂解之直接產物)。如表24中所示，在研究過程中於非治療組中可溶性Aβ40及42適度(少於2倍)增加。由於已知在此年齡期間APP表現及Aβ生成中無變化發生，因此假設媒劑組(18至20月齡)中增加之值係自Aβ沉積物之「滲漏」產生(該等值增加數倍，參見以下)。非治療組中可溶性APP代謝產物sAPPα及β之值亦無顯著變化。 利用化合物1以低劑量(0.03 g化合物1/kg食物)治療之小鼠顯示可溶性Aβ40及42之弱且不顯著的降低及sAPPα之適度增加(表20及21，圖9至11)。可溶性APPβ (Swe)顯著降低29%(表20及21，圖12)。利用0.3 g/kg劑量之化合物1治療之小鼠顯示Aβ二者及sAPPβ (Swe)之顯著降低，以及sAPPα之3倍增加(表20及21，圖9至12)。 總而言之，化合物1治療導致所有可溶性BACE1裂解產物之劑量依賴性降低及sAPPα之劑量依賴性增加。
表 20 ：利用化合物 1 治療後之小鼠腦 A β 40 及 42 水平 表 21 ：組之間變化之比較 ( 鄧尼特 ( Dunnett) 多重比較測試 ) CSF 中之 APP 代謝產物
在驗屍時自所有小鼠收集CSF。將來自基線組之樣品儲存約6個月並在研究結束時與其餘樣品一起分析。表22之數據及圖13顯示雖然CSF Aβ於基線組(12個月齡之APP23小鼠)中係最高，但是於媒劑組(18個月齡之APP23小鼠)中下降。與此媒劑組相比，CSF Aβ40於0.03 g化合物1/kg食物治療組中未顯著降低，及於0.3 g化合物1/kg食物治療組中顯著降低。目前未知高基線值之原因。假定此為長期儲存時，Aβ之低聚物形式之解離可導致更高單體濃度之結果。超過來自腦提取物之Triton TX-100溶解Aβ之CSF Aβ代表直接回應於Aβ生成之變化之可溶性類澱粉蛋白-β之穩態濃度。低化合物1劑量下之小且無顯著治療效果(-4.6至-20%)以及高化合物1劑量下之明顯及顯著效果(-43.7至-77%)在自腦組織單離之可溶性Aβ物種及CSF中之Aβ40非常相當。
表 22 ： CSF A β 40 之結果之 概述 前腦中之甲酸可溶性類澱粉蛋白 - β 肽
於利用甲酸提取不可溶Aβ物種後研究化合物1對APP23小鼠腦中之沉積形式之類澱粉蛋白-β之治療效果。如表23與24及圖14至17中所示，相較於基線，於媒劑組中觀察到沉積Aβ之大量增加。類澱粉蛋白-β42增加超過Aβ40 (於媒劑組中Aβ42/40比率增加55%)，與其更高聚集傾向一致。於利用低劑量之化合物1治療後，Aβ40及Aβ42顯示相較於媒劑降低約17%，但並未達到統計顯著性。經提取物質之Aβ42/40比率未改變。於高化合物1治療組中觀察到沉積Aβ40及42之強且高度顯著(約80%相對媒劑)的降低，且Aβ42/40比率返回至0.07之基線值。總而言之，利用高劑量之化合物1治療幾乎完全阻斷APP23小鼠中之類澱粉蛋白β之增加。
表 23 ：小鼠前腦中之甲酸可溶性類澱粉蛋白 - β 肽 表 24 ：組比較及統計 ( 鄧尼特多重比較測試 ) 對 CAA 之影響
年老APP23動物顯示穩健程度之CAA，其藉由CD31之共定位/鄰近分析及共免疫螢光中之類澱粉蛋白-β (NT12)陽性免疫反應性評估。CD31(亦稱作血小板內皮細胞黏著分子-1 (PECAM-1))為I型完整膜醣蛋白，其在早期及成熟內皮細胞、血小板及大部分白血球亞群上以高水平表現。經常使用CD31免疫反應性作為標記以視覺化腦血管之內皮細胞。關於定量影像分析，檢測皮質之CD31陽性結構，界定此等結構周圍之影響區及定量此等影響區內之Aβ。評估CD31+血管之總數目(針對總樣品面積歸一化)及具有不同Aβ覆蓋之CD31+血管之% (表25)。將CD31+血管之Aβ覆蓋分成不同類別：0%、1-10%、10-25%、25-50%、50-75%及＞75% Aβ覆蓋(表25)。此外，將具有＞10% Aβ覆蓋之所有CD31+血管加總(表25)，由於此將確保消除潛在非特異性Aβ信號。如所述(Winkler DT
等人
，2001)計算CAA頻率(針對總樣品面積歸一化之具有＞10% Aβ覆蓋之CD31+血管) (表27)，差別在於使用電腦輔助定量影像分析來評估受Aβ影響之CD31+血管。最後，分析總血管相關聯之Aβ面積並針對總CD31+面積歸一化(表27)。 於APP23小鼠中，受Aβ影響之血管(＞10% Aβ覆蓋)之百分比隨著小鼠年齡增加約2倍及此增加藉由高劑量之化合物1治療降低(表26，圖19)。低劑量之化合物1治療不使受Aβ影響之血管(具有＞10% Aβ覆蓋之血管)之百分比降低。相比具有其他Aβ覆蓋百分比之血管，大部分具有25至50%及50至75% Aβ覆蓋之血管藉由高劑量化合物1治療降低(表26)。重要的是，所有治療組中之總CD31+血管數目類似(表26，圖18)。有趣的是，僅低劑量之化合物1顯著降低不具有Aβ覆蓋之血管之數目並同時增加具有低Aβ覆蓋(＜10% Aβ覆蓋)之血管之數目，然而高化合物1劑量在此等參數上明顯無年齡依賴性差異及無治療效果(表26)。 此外，CAA頻率隨著小鼠年齡增加約2倍及此增加藉由高劑量之化合物1治療減低(表28，圖20)。再次，針對低劑量之化合物1無顯著治療效果。針對總CD31+面積歸一化之總血管相關聯之Aβ面積之分析揭示在高劑量化合物1下相對於媒劑之小的治療效果，雖然此效果並非統計上顯著的，然而此參數之年齡依賴性增加稍微顯著(表28，圖21)。 低劑量化合物1之弱及有時不顯著的效果並非驚人的，由於需要高劑量之BACE抑制劑於攜帶「瑞典型」突變之小鼠模型中達成相較於wtAPP轉殖基因小鼠顯著的BACE-1抑制。
表 25 ：化合物 1 治療對針對總樣品面積或 CD31+ 血管之總數目歸一化之 CAA 、 CD31- 陽性血管中之類澱粉蛋白 - β 的效應 ( 值為平均及 SEM) 表 26 ：針對 CD31- 陽性血管中之歸 一 化的類澱粉蛋白 - β 之治療效果及統計 ( 鄧尼特多重比較測試 )
n.s.：不顯著
表 27 ：化合物 1 治療對針對總樣品面積或總 CD31+ 面積歸一化之 CAA 頻率及 CD31- 陽性血管中之類澱粉蛋白 - β 的影響 ( 值為平均及 SEM) 表 28 ：針對 CAA 頻率及 CD31- 陽性血管中之歸一化的類澱粉蛋白 - β 之治療效果及統計 ( 鄧尼特多重比較測試 )
n.s.：不顯著
實例 7 ：於帶有斑塊之轉殖基因 APP23 小鼠中之 13 週 口服安全性研究 研究目的
該研究之主要目的為於利用有效劑量之化合物1治療後評價年老APP23小鼠中之微出血病變(藉由MRI及腦組織病理學)並與陽性對照(即，利用β1抗體被動免疫之小鼠(Paganetti PA
等人
，1996))比較微出血形成之程度。先前於文獻Beckmann N等人，2016中描述類似研究。由於年老動物中存在微出血，因此選擇APP23小鼠品系。由於雌性具有更高總Aβ負荷、較高Aβ40/Aβ42比率及因此更明顯的微出血，因此選擇雌性。
材料及方法 測試物品：
化合物1；口服投藥形式：0.3 g/kg隨意呈飼料混合物(顆粒)之食物 β1抗體(4.12 mg/mL含於檸檬酸鹽緩衝液50 mM/140 nM NaCl；聚集0.24%) β1抗體劑型：利用90 nM NaCl/50 nM Tris pH 7.1稀釋β1抗體；濃度：1.236倍稀釋至3.33 mg/mL之最終濃度 β1抗體投與：腹膜內，每週一次。劑量體積：0.15 mL/小鼠(最大值10 mL/kg)
實驗動物：
動物物種及品系：小鼠；轉殖基因APP23 (B6.D2-Tg(Thy1App)23/1Sdz) 性別：雌性(雌性具有更高總Aβ負荷，較高Aβ40/Aβ42比率及因此更明顯的微出血) 分配至給藥階段之研究動物之數目：APP23：60隻雌性動物 年齡：約17至18個月(在給藥開始時) 體重範圍：26至36 g (在給藥開始時)
核磁共振造影 (MRI)
關於MRI研究，將小鼠利用經由面罩投與之含1.5 %異氟醚(Abbott, Cham, Switzerland)之氧/N
2
O (2:1)之混合物麻醉並放入Plexiglas搖籃中。經由動物床中之整合水軟管使小鼠之體溫保持在36.5±0.5℃。未使用立體定向保持。整個擷取過程中監測呼吸。造影期持續時間係約15分鐘，包括定位小鼠。 利用裝備有主動遮罩梯度系統之Biospec 70/30分光儀(Bruker Medical Systems, Ettlingen, Germany)在7.0 T下操作進行量測。掃描器之操作軟體為Paravision 5.1 (Bruker)。使用三維(3D) T2*-加權梯度-回波序列利用下列造影參數獲得影像：重複時間19.3 ms；回波時間10 ms；矩陣256x128x192；視野1.5x1.5x2.0 cm3，兩次平均。具有59x117x104 µm3之像素大小之影像之總擷取時間為11.86 min。 藉由盲法研究者進行MRI資料之擷取及分析。貫穿整個大腦分析呈現信號衰減具有最小直徑70 µm(病變)之皮質及丘腦位點。為確保相同位點(病變)不被計數多次，其存在在來自3D資料集之若干連續切片內仔細控制。使用ImgTool(一種基於IDL (互動式資料語言研究系統，Boulder, Colorado, USA)之軟體)評估病變之總體積。影像首先經高斯(Gaussian)分佈濾波器微弱地低通過濾及接著使用適應Lloyd-Max長條圖量化轉換成一組四灰度等級。此方法避免由於任意選擇各影像之閥值水平所致之操作員偏差。該軟體之詳細描述可見於Babin AL等人, 2012或Egger C等人, 2013。針對3D資料集之各切片，藉由應用影像分割演算法來測定外部邊界內之信號衰減位點之面積。針對3D資料集之每個切片重複此分析。接著藉由將病變面積之和乘以切片厚度(104 µm)來計算病變之總體積。
組織之取樣及組織學處理
於驗屍時自所有預定動物收集腦切片。取樣小腦(層級7後之最後一片)用於測定化合物1之腦濃度(關於腦切片層級之描述參見Bolon B等人，2013)。將其餘腦固定於10%中性緩衝福馬林中。 將四個腦切片處理並用蘇木精(hematoxylin)與曙紅(H&E)及珀爾斯氏普魯士藍(Perls’ Prussian blue)染色用於含鐵血黃素沉積，層級2、3、4，如Bolon B等人, 2013中所述，及一個附加載玻片在下丘腦層級(層級2’)。 腦收集程序：自大腦分離小腦。將剩餘大腦(自前部至層級5)轉移入福馬林中用於病理學。
微觀檢查
在光學顯微鏡下檢查利用蘇木精與曙紅及利用珀爾斯氏普魯士藍染色之腦切片。基於表29中之分級計畫評估經珀爾斯氏普魯士藍染色之切片中之含鐵血黃素沉積之分佈、大小及染色強度。
表 29 ：腦中之含鐵血黃素沉積之分級量表
在經蘇木精與曙紅染色之切片上作出所有其他腦變化之評估，其中如下分級出血、類澱粉蛋白斑塊及血管炎症： · 使用與用於分級含鐵血黃素之彼等相同的標準來評估腦中出血之分佈、大小及染色強度。 · 任意給定對照中類澱粉蛋白斑塊之程度為中度(3級)值及將任何具有明顯較少斑塊之腦分級為輕微(2級)。 · 將血管炎症之嚴重度分級為最小(1級)，其中識別
＜
5個受影響之血管/腦；或輕微(2級)，其中識別
＞
6個受影響之血管/腦。
化合物 1 之血漿及腦濃度
自驗屍之所有動物獲得血液。於安樂死後自腔靜脈收集約0.3 mL全血至含有EDTA作為抗凝劑之管中。在取樣週期期間將管放入冰水中。其後藉由離心(10 min, 1270 G, +4℃)分離血漿並轉移至一個經獨特標記的透明管(來自Thermo之1.8 mL NUNC 2D編碼管)中及在-70℃或以下冷凍。使用LC-MS/MS方法量測血漿中化合物1之濃度。 使用LC-MS/MS方法於腦樣品(層級7)中測定化合物1之腦濃度。收集約100至200 mg腦組織，稱重至來自Thermo之1.8 mL NUNC 2D編碼管中，及在-70℃或以下冷凍。
化合物 1 之飼料顆粒濃度測定
將各個別顆粒於50 mL管中稱重並破碎成片。添加2至3 mL提取溶劑(ACN/水8:2 (v/v))並將所得混合物以600 rpm震動5小時。接著將混合物於離心小瓶+過濾器(具有低結合微孔(durapore) PVDF膜0.45 um之離心過濾器)中以2500 rpm離心10分鐘，並藉由超高效液相層析(UPLC)分析，其中每個小瓶2次注射(1至5µL注射)。
統計分析
計算如相應指示之平均值及標準差(SD)、平均值之標準誤差(SEM)及變異係數(CV)並進行方差分析(ANOVA)。針對體重分析，使用GraphPad Prism 6進行利用杜克(Turkey)多重比較測試之2因素ANOVA。使用Systat版本13(Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA)在MRI資料上進行利用隨機效應統計分析之ANOVA。
結果 體重
在研究期間所有治療組顯示體重增加且無有關於治療之任何體重減少之指示(圖22)。
磁共振造影
在實驗開始(基線)及在治療1、2及3個月時量測總病變體積(圖23)。亦測定針對基線歸一化(轉換為自然對數)之總病變體積(圖24)，如相對於基線測量計算的病變體積增加因數(圖25)。於對照組中，觀察到歸因於老化之病變體積增加。如預期在研究期間β1抗體治療組顯示加劇病變體積增加。儘管未達到顯著，然利用化合物1治療之小鼠相較於對照APP23小鼠存在朝向歸一化病變體積減少之趨勢(圖24及25)。觀察到年齡有關之病變數目增加。然而，病變數目在治療組之間並無不同(3個月時之病變數目(平均± SEM)，對照：11.2 ± 1.5，化合物1：11.5 ± 2.0，β1抗體：12.4 ±1.6)。 總結來說，化合物1治療並未加劇藉由MRI檢測之病變體積且觀察到朝向歸一化病變體積減少之趨勢。
毒物動力學
在研究結束時於第二組動物中於小鼠血漿及腦組織中測定化合物1濃度。血漿中之平均化合物1濃度為1210 ng/mL且具有中度的動物間變異性(變異係數15.9%)。 腦組織中之平均化合物1濃度為4034 ng/g且具有中度的動物間變異性(變異係數29.4%)。腦對血漿之平均比率為3.3。測得在第96天相較於血漿，腦中化合物1濃度在2.2與6.1倍間之範圍內。
事後 研究
在經過利用化合物1或β1抗體之3個月治療之研究結束時進行事後分析。
宏觀發現
在驗屍時在任何動物中無明顯治療有關之宏觀觀察。
微觀發現 ( 腦 )
表30中概述腦中之微觀觀察。
表 30 ：腦微觀觀察之概述
於所有組中於許多動物中識別含鐵血黃素沉積，該等沉積係藉由其與珀爾斯氏普魯士藍之藍色染色反應識別。通常於腦之大腦皮層中靠近小血管發現此等沉積。較不常地，該等沉積存在於靠近腦膜血管或與腦中之類澱粉蛋白斑塊相關聯。在經化合物1治療之小鼠中，發病率及嚴重度與未經治療對照類似，其中僅一或兩個病灶存在於受影響之腦中。相比之下，β1抗體投與係與100%發病率相關聯。 於H&E染色切片中較含鐵血黃素之存在較地頻率地識別出血。於一些情況下，雖然出血存在於與含鐵血黃素相同之病灶中，但是於最近出血之病灶中，不存在含鐵血黃素。經化合物1治療之小鼠中之出血相較於未經治療對照及經β1抗體治療組中之出血係較不常見。 最常於腦膜中及僅偶爾於腦本身中觀察到小血管之炎症。形態自單核細胞之浸潤至外膜中變化至伴隨血管壁壞死及玻璃變性之更明顯的炎症。血管炎症於經化合物1治療之小鼠中最不明顯及於經β1抗體治療組中最明顯。 於受影響之血管中非常偶爾地見到血栓形成或鄰近腦組織之小面積先前壞死(梗塞)存在於未治療之對照及經β1抗體治療之小鼠中但不存在於經化合物1治療之小鼠中。 於一些經化合物1治療之小鼠中斑塊形成之程度相較於其他三組中之彼等顯現減少。 每組中之兩隻動物顯示丘腦中斑塊之礦化，無藉由化合物1或β1抗體對此變化之影響之指示。
結論
此於年老APP23小鼠中之安全性研究之目的為評價基於類澱粉蛋白-β之療法對腦中微出血之後果。化合物1係以0.3 g/kg之劑量於飼料給藥中使用，由於先前已於此劑量下觀察到對降低APP23小鼠中之類澱粉蛋白-β之最大藥效動力學效應。基於Pfeifer M等人, 2002之結果，利用β1抗體作為陽性對照之被動免疫顯示微出血之增強發生。 利用化合物1以及β1抗體之慢性治療未導致體重之任何變化。飼料顆粒分析揭示化合物1較預期0.3 g/kg低29%之值，可能係歸於大規模製造過程。然而，於研究結束時之毒物動力學分析中，化合物1可在於具有適度動物間變異性之所有治療動物中採食投與化合物1之後於血漿中量測。血漿中之化合物1
水平
係如預期及與根據劑量歸一化基礎之先前研究相當。於驗屍時，化合物1可在採食投與具有適度動物間變化之化合物1之後於腦中量測。再次，腦中之化合物1
水平
係如預期及與先前研究相當。該腦/血漿比率為3.3。 在基線及在治療之1、2及3個月時藉由MRI量測腦中之微出血病變體積。在老化期間，病變體積如於對照組中所觀察係漸增的。如預期(Pfeifer M等人, 2002, Beckmann N等人, 2016)在研究過程期間，β1抗體治療加劇病變體積增加。然而，化合物1治療藉由MRI檢測未顯示任何病變體積之加劇。此外，儘管未達到顯著，然利用化合物1治療之小鼠相較於對照APP23小鼠存在朝向歸一化病變體積減少之趨勢。 在組織病理學檢查中，當相較於未治療之對照時，化合物1投與顯現降低最近微出血及腦中小血管之炎症之發病率，但不影響含鐵血黃素形成(歷史性微出血之指示)之程度。陽性對照β1抗體使微出血及血管炎症二者增加。雖然未設計該研究以定量類澱粉蛋白斑塊形成之程度，但是該程度於一些經化合物1治療之小鼠中顯現減少。
實例 8 ：當單獨及與強 CYP3A4 抑制劑伊曲康唑或強 CYP3A4 誘導劑利福平組合給與時，化合物 1 之藥物動力學之人類中研究
於健康志願者之藥物-藥物相互作用(DDI)研究中，評價強CYP3A4抑制劑(伊曲康唑)及強CYP3A4誘導劑(利福平)對化合物1之PK之影響。圖26中概述DDI研究設計。伊曲康唑，以200 mg每天之劑量，當與化合物1一起給與時相較於當單獨給與化合物1時，使化合物1之平均AUC增加2至3倍及使化合物1之平均Cmax增加25%(表31)。利福平，以600 mg每天之劑量，當與化合物1一起給與時相較於當單獨給與化合物1時，使化合物1之平均AUC減少5至6倍及使化合物1之平均Cmax 減少2.5倍(表32)。綜上所述，強CYP3A4誘導劑及強CYP3A4抑制劑對階段1研究中之化合物1暴露之影響顯示CYP3A4對於化合物1之消除係至關重要。
表 31 ：藥物動力學結果 - 伊曲康唑對化合物 1 之血漿 PK 參數之影響的 統計分析：化合物 1 30 mg SD + 伊曲康唑 200 mg QD 相對化合物 1 30 mg SD
n* =具有非缺失值之個體之數目 將具有針對治療及個體之固定效應之ANOVA模型擬合至各對數變換之PK參數。反轉換結果以獲得'經調整之幾何平均'、'幾何平均比率'及'90% CI'。
表 32 ：藥物動力學結果 - 利福平對化合物 1 之血漿 PK 參數之影響的統 計分析：化合物 1 100 mg SD + 利福平 600 mg QD 相對化合物 1 100 mg SD
n* =具有非缺失值之個體之數目 將具有針對治療及個體之固定效應之ANOVA模型擬合至各對數轉換之PK參數。反轉換結果以獲得'經調整之幾何平均'、'幾何平均比率'及'90% CI'。
實例 9 ：用以評價化合物 1 於有 AD 及 CAA 之臨床症狀發作風險之參與者中之功效之隨機、雙盲、安慰劑對照研究之概述
本文於表33中描述之臨床試驗中，採用ApoE4純合子之識別作為預兆富集策略，以選擇於CAA(及隨後微出血或大腦內出血)之認知及/或發展中於合理時間框架中具有可於臨床試驗之設置內實際上評估之實質惡化之更大可能性之個體。此研究列於NCT02565511識別碼下之ClinicalTrials.gov。於替代選擇中，可利用認知上未受損害之ApoE4載體(純合子；或具有例如，藉由PET或CSF量測測定針對腦類澱粉蛋白之額外富集(「類澱粉蛋白陽性」)之雜合子)，年齡60至75歲，以15或50 mg 化合物1之口服劑量每日一次實施此實例。此研究列於NCT03131453識別碼下之ClinicalTrials.gov。 於提出之臨床試驗中持續至少5年之治療期間內，預期顯著比例之參與者將被診斷患有歸因於AD之輕度認知障礙(MCI)、癡呆症及/或發展CAA或CAA之惡化。
表 33 ：用以評價化合物 1 於有 AD 及 / 或發展 CAA 之臨床症狀發作風險之參與者中之功效之隨機、雙盲、安慰劑對照研究之概述 參考文獻
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