CN111601643A - 用于改善溶酶体功能和治疗神经退行性疾病的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

公开了在对象中减少年龄依赖性的溶酶体损伤和/或治疗年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，所述方法包括向对象施用治疗剂；其中所述治疗剂抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)‑氧化酶(NOX)或下游NOX效应物。

Description

用于改善溶酶体功能和治疗神经退行性疾病的方法和组合物

本申请要求2017年11月15日提交的美国临时申请第62/586527号的权益，其全部内容通过引用并入本文。这项工作得到了美国国立卫生研究院授予的第RO1 AG033679号拨款的政府支持。政府拥有本发明的某些权利。

I.背景技术

与年龄有关的疾病可以说是21世纪生物医学面临的最大挑战。到2030年，65岁以上的美国人数量将达到7000万——几乎占人口的25％。越来越多的老年人将面临慢性进行性神经退行性疾病，例如帕金森病、阿尔茨海默病和其他痴呆症。到目前为止，年龄本身是所有这些迟发性神经退行性疾病的单一最大的共同风险因素。这些人口统计资料显示，神经退行性疾病的患病率正在上升，这表明治疗市场非常庞大且正在扩大。然而，造成这种与年龄相关的风险的机制仍然知之甚少，迄今为止，还没有针对这些疾病中任何一种的疾病改良疗法。

有针对帕金森病的对症疗法，但由于疾病的持续发展，这些疗法在持续治疗后失败。阿尔茨海默病的治疗方法价格昂贵，但基本上无效，主要用作家庭的安慰剂。任何能够在功能上显著减慢这些疾病中任何一种的治疗方法将是向前迈出的重要一步。需要用于神经退行性疾病的新的有效疗法。

II.发明内容

本文公开了在对象中减少年龄依赖性溶酶体损害、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或治疗与年龄有关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗剂；其中治疗剂抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)-氧化酶(NOX)或下游NOX效应物。

在一方面，本文公开了减少年龄依赖性溶酶体损害、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其中神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、1型脊髓小脑共济失调、年龄相关性痴呆、路易体痴呆、可能的血管性痴呆、额颞痴呆和肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

本文还公开了减少年龄依赖性溶酶体损害、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其中NOX是选自NOX1、NOX2、NOX3、NOX4或NOX5的NOX亚型，和/或下游NOX效应物包含活性氧物质、过氧化氢或超氧化物。因此，一方面，治疗剂可通过抑制、减少和/或消除下游NOX效应物例如ROS、过氧化氢和/或超氧化物来减少年龄依赖性溶酶体损害、改善溶酶体功能、增加自噬的起始和/或治疗与年龄有关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病。

在一方面，本文公开了减少年龄依赖性溶酶体损伤、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其中所述治疗剂是信号转导物和转录激活因子3(STAT3)抑制剂，并且其中所述治疗剂减少STAT3介导的NOX活化，从而引起NOX抑制。

本文还公开了减少年龄依赖性溶酶体损伤、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其中所述治疗剂是抗IL-6抗体或抗炎剂，并且其中所述治疗剂减少IL-6介导的NOX活化，从而引起NOX抑制。

本文还公开了减少年龄依赖性溶酶体损伤、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或治疗任何前述方面的年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其中抑制NOX或NOX下游效应物的试剂是小分子、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、肽或蛋白质，包括但不限于包含二亚苯基碘

的小分子。罗布麻宁、2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲基氨基)苯基]-5-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6-二酮(GKT-831)、雷帕霉素、歧化酶(dismutazyme)、C60的丙二酸衍生物、C60的乙酸衍生物或其任何组合。

III.附图说明

并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了几个实施方案，并且与说明书一起示出了所公开的组合物和方法。

图1A、图1B、图1C和图1D显示了WT小鼠海马中p62聚集体的年龄依赖性积累。对来自年老(1A，24个月)或年轻(1B，4个月)小鼠的切片进行p62免疫染色(红色)。图1C显示了簇所占据的海马面积％，平均值±SD，n＝8，通过t检验，*p<0.05。图1D显示了使用Imaris软件对聚集体进行的3-D重建，显示了聚集体内数百个3μm至8μm离散沉积物。底部显示了穿过聚集体中心的90°光学截面。包含Dapi(蓝色)以显示细胞核。

图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图2G和图2H显示了p62阳性聚集体与其他蛋白质的共定位。图2A、图2B、图2C、图2D和图2E显示了p62(红色)和帕金蛋白(绿色)免疫染色的年老海马。图2A显示了合并的通道，(2B)各个通道，(2C)聚集体的更高放大率，(2D)300正交视图，(2E)使用Sigmaplot 11和Sigmastat 4.0的信号之间的统计相关性(r2＝0.81，p＝0.013)。图2F和图2G显示了p62和Sumo3(2F)或lamp2(2G)的合并图像(蛋白质也涉及通过溶酶体处理的蛋白质)。图2H显示了p62和颤蛋白(神经蛋白)。p62和Sumo3与颤蛋白有大量重叠，而与lamp2仅部分重叠。

图3A、图3B、图3C、图3D、图3E和图3F显示了p62阳性蛋白聚集体和GABA能神经元纤维之间的部分重叠。大多数p62蛋白聚集体不与钙调蛋白(CR)(3A)和PV神经元(3D)结合。一些p62聚集体标记有CR(3B和3C)或PV(3E和3F)。图3B、图3C、图3E和图3F是1mm厚的光学切片的共聚焦照片。箭头和箭头标记分别表示被CR或PV标记或未被CR或PV标记的p62点。

图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G和图4H显示了星形胶质细胞与p62蛋白聚集体之间的结合。在小胶质细胞中很少观察到p62免疫反应性(由Iba标记；4A和4E)。在细胞体内，一些用GFAP标记的星形胶质细胞含有p62阳性点。有时，星形胶质细胞被p62阳性聚集体(4B和4F)包围。在GFAP-GFP小鼠中进一步证实了含有p62的聚集体与星形胶质细胞的结合，该小鼠能够显示带有GFP荧光的星形胶质细胞的精细投影(4C和4G)。同样，颤蛋白阳性聚集体也与星形胶质细胞结合或位于星形胶质细胞内部(4D和4H)。图4A、图4B、图4C和图4D是1mm厚度的5至20个切片的投影，而图4E、图4F、图4G和图4H是1μm厚的切片的对应代表，以确认是否存在共定位。

图5显示了Nox的抑制或歧化酶模拟物C3对超氧化物的减少作用，可减少p62聚集体的积累。12月龄至17月龄的雌性C57BL6小鼠在水中接受了罗布麻宁(50mg/kg)或C3(1mg/kg/天)，然后进行了灌注。将固定的脑进行切片，并对p62进行免疫染色。共聚焦图像分析了每只小鼠的6个海马/3个切片，每组4只小鼠。为了量化含p62的聚集体，由设盲的研究人员在描绘的区域中分别将聚集体圈起来，并使用Image J测量聚集体面积。显示了聚集体覆盖的面积和簇数。平均值±SEM，*p<0.05，***p<0.001，Mann-Whitney秩和检验。

图6显示了与年轻小鼠相比，年老小鼠海马神经元中的溶酶体明显更大。用针对Lamp1和小清蛋白(PV)的抗体对5月龄和20月龄的雌性小鼠的脑切片进行免疫染色，选择该抗体以分析单个神经元中的溶酶体。在老年和年轻的动物中，在PV神经元和周围的锥体神经元中，lamp1标记的溶酶体均较大。使用Image J使用分析颗粒功能在1μm厚的光学切片中定量分析PV神经元中的溶酶体；年轻n＝8，年老n＝7。*p<0.001，Mann-Whitney秩和检验。

图7显示了组织蛋白酶D(CatD)的蛋白质印迹，其显示了年老和年轻小鼠海马提取物中pre-pro-CarD的积累。Pre-pro-CatD(ppCatD)要求通过将CatD放在酸性环境中进行自溶处理，因此这些数据与衰老的脑中溶酶体酸化受损有关。

图8A、图8B、图8C、图8D和图8E显示了在p62阳性聚集体附近神经元纤维受到损伤的初步证据。图8A显示了具有表达YFP的锥体神经元的海马(绿色)显示p62聚集体附近的裸露区域(14月龄的小鼠)。对p62(红色)和PV(绿色)进行免疫染色的年轻(8B，4月龄)与年老(8C，24月龄)大脑切片的高倍图像，使单个纤维更清晰可见。图8D和图8E显示了更高倍数的放大图像，其显示了与p62阳性聚集体直接相邻的纤维损失。

图9显示了用促炎性LPS治疗和通过C3共同治疗恢复功能导致的J774A.1细胞中的溶酶体损伤。

IV.具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另外指明，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另外指明，否则不限于特定的试剂，因为它们当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在进行限制。

A.定义

如说明书和所附权利要求中所使用的，要素前面不使用数量词可以包括复数参照物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“药物载体”，其包含两种或多于两种这样的载体的混合物等。

在本文中，范围可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解的是，特定值形成另一个实施方案。还将理解的是，每个范围的端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是重要的。还应理解，本文公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值在本文中还公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“约10”。还应理解，如本领域技术人员适当理解的那样，当公开了一个值，则还公开了“小于或等于该值”、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且该数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应理解，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于和等于10和15以及10至15。还应理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

在本说明书和随后的权利要求中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和未发生的情况。

“增加”可以指导致更大的基因表达、蛋白质表达、症状的数量、疾病、组成、状况或活性的任何改变。增加可以是统计学上显著量的状况、症状、活动、组成的任何单个、中位数或平均值增加。因此，只要增加是统计上显著的，则增加可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

“降低”可以指导致更小的基因表达、蛋白质表达、症状的数量、疾病、组成、状况或活性的任何改变。当具有该物质的基因产物的遗传输出相对于不具有该物质的基因产物的输出较少时，也将物质理解为降低基因的遗传输出。同样，例如，降低可以是病症症状的改变，使得症状小于先前观察到的症状。降低可以是统计学上显著量的状况、症状、活动、组成的任何单个、中位数或平均值降低。因此，只要降低是统计上显著的，则降低可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

术语“抑制”是指活性、反应、状况、疾病或其他生物学参数的降低。这可以包括但不限于活动、反应、状况或疾病的完全消融。这还可包括例如与天然或对照水平相比，活性、反应、状况或疾病减少10％。因此，减少可以是与天然或对照水平相比，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或任何两者之间的减少量。

如本文所使用的，“对象”是指个体。因此，“对象”可以包括家畜(例如猫、狗等)、牲畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟类。“对象”还可以包括哺乳动物，例如灵长类动物或人类。

“减少”或其他形式的词语，例如“减小”或“缩小”是指减少事件或特征(例如，肿瘤生长)。可以理解，这通常是与某个标准或期望值有关的，换句话说，这是相对的，但是并非总是需要参考标准值或相对值。例如，“减少肿瘤生长”是指相对于标准或对照降低肿瘤的生长速率。

“预防”或其他形式的词(例如“防止”或“阻止”)表示停止特定事件或特征，以稳定或延迟特定事件或特征的发展或进展，或最小化特定事件或特征将发生的机会。预防不需要与对照进行比较，因为它通常例如比减少更绝对。如本文所使用的，可以减少但没有预防某些事情，但是也可以预防被减少的某些事情。同样，可以预防但没有减少某些事情，但是也可以减少被预防的某些事情。应当理解，在使用减少或预防的情况下，除非另外特别指出，否则还明确公开了使用另一个词。

本文所使用的术语“治疗”、“处理”和“治疗方法”包括部分或完全延迟、缓解、减轻或减少一种或多于一种伴随疾病的症状的强度和/或缓解、减轻或阻碍一种或多于一种疾病的原因。根据本发明的治疗可以预防地、预防性地、姑息性地或补救地应用。在发病之前(例如，在明显的疾病迹象之前)、发病初期(例如，在出现疾病的初始迹象和症状之后)或在疾病确定发展之后，对对象进行预防性治疗。在感染症状出现之前，预防性施用可以持续数天至数年。在一些情况下，术语“治疗”、“处理”包括与对象的治疗之前或与一般或研究人群中这种症状的发生率相比，部分或完全挽救了溶酶体降解和/或增加的自噬。减少可以为5％、10％、20％、30％、40％或多于40％。

对对象的“施用”包括将治疗剂引入或递送至对象的任何途径。可以通过任何合适的途径进行施用，包括口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道内、通过吸入、通过植入式储液器、肠胃外(例如皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹膜内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所使用的，“同时施用”或“联合施用”是指化合物在相同的时间点施用或基本上紧接着施用。在后一种情况下，两种化合物的施用时间应足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点施用时所获得的结果没有区别。“全身施用”是指通过将药剂引入或递送至对象身体广泛区域(例如大于身体的50％)的途径，例如通过进入循环系统或淋巴系统，将药剂引入或递送至对象。相反，“局部施用”是指通过将药剂引入或递送至区域或紧邻施用点的区域并且不以治疗显著量全身性引入药剂的途径将药剂引入或递送至对象。施用包括自身施用和由他人施用。

应该理解的是，在整个说明书中，标识符“第一”和“第二”仅用于帮助区分所公开主题的各种组分和步骤。标识符“第一”和“第二”不旨在暗示对这些术语所修饰的组分或步骤的任何特定顺序、数量、偏好或重要性。

在整个申请中，参考了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本文，以便更全面地描述其所属的技术水平。对于在引用参考文献的句子中所讨论的该参考文献中所包含的材料，所公开的参考文献也被单独地和具体地通过引用并入本文。

治疗神经退行性疾病的方法

与年龄有关的疾病可以说是21世纪生物医学面临的最大挑战。到2030年，65岁以上的美国人数量将达到7000万——几乎占人口的25％。美国疾病预防控制中心(CDC)目前的数据表明多达30％的65岁以上的老年人和50％的85岁以上的老年人会发展为痴呆。越来越多的老年人将面临慢性进行性神经退行性疾病，例如帕金森病、阿尔茨海默病和其他痴呆症。到目前为止，年龄本身是所有这些迟发性神经退行性疾病的最大的共同风险因素。

阿尔茨海默病(AD)是痴呆症的主要原因，影响了八分之一的美国人。尽管仅占患者2％的AD的遗传形式强烈暗示了一系列事件，包括β-淀粉样蛋白(Aβ)积累(斑块)和AD中异常磷酸化的tau沉积(缠结)，但是针对散发性AD患者的针对Aβ的最新临床试验却令人失望。然而，很明显，衰老本身是AD发展的单一最大风险因素。

所有主要的与衰老相关的神经退行性疾病的特征为蛋白质病，大脑中一种或多于一种蛋白质的异常沉积(例如，阿尔茨海默病(AD)中的淀粉样蛋白β和tau蛋白，路易体痴呆中的α-突触核蛋白和额颞痴呆/肌萎缩侧索硬化症变体痴呆中(FTD)的TBP43)。尽管具有这些疾病遗传形式的早发性家庭十分罕见，但绝大多数患者发展为散发性、迟发性疾病。美国疾病预防控制中心(CDC)目前的数据表明多达30％的65岁以上的老年人和50％的85岁以上的老年人会出现痴呆；统计数据为年龄本身是这些迟发性神经退行性疾病(LO-ND)的单一最大风险因素提供了支持。

大脑已经开发出一套精巧的系统来降解和除去过多或受损的蛋白质。蛋白质可通过泛素-蛋白酶体系统或自噬-溶酶体途径(“自食”)在细胞内降解。有趣的是，似乎随着衰老而下降的一种基本生物学过程是自噬，这是高度设计并在进化上保守的过程，真核细胞通过该过程将细胞质成分传递至溶酶体进行降解和再循环。自噬(特别是此处的大自噬)是响应营养物质剥夺和其他类型的细胞应激而激活的，以使大分子得以循环利用，并使受损的细胞器被降解和除去。

自噬体/溶酶体系统还可以将其未消化的内容物释放到细胞外空间，在那里它们可以被星形胶质细胞表达和分泌的蛋白酶降解，或者被神经胶质细胞吸收到细胞内降解，或者输出到血液或淋巴中。这些过程中的任何一个的损伤都可能导致细胞内内含物、细胞外聚集体和潜在的神经退行性的形成。

衰老的另一个基本特征是低度炎症。越来越多的证据表明老年人的不良健康后果与这种促炎状态的发展密切相关。衰老的大脑中炎性细胞因子白细胞介素6(IL-6)水平升高与认知功能较差和认知能力急剧下降有关。另外，已经将IL-6基因和IL-6受体基因鉴定为AD风险基因。在数十项研究中，包括IL-6的炎性途径激活的循环标志物也与虚弱、肌少症、残疾和早期死亡的风险增加有关。在这种背景下，本文表明在衰老的大脑中NADPH氧化酶(Nox)也增加，并且该上调依赖于IL-6。由于活性氧物质(ROS)已显示通过蛋白酶体、自噬体/溶酶体系统和溶酶体胞吐作用影响蛋白质清除，有人提出老化大脑中的海马蛋白聚集体是否包含p62和来自自噬体/溶酶体系统的其他蛋白，以及它们的积累是否是由于Nox衍生的ROS引起的蛋白清除缺陷所致。本文显示，与年龄相关的溶酶体衰竭是由于IL-6介导的NADPH氧化酶活化所致。

大脑老化中的炎症会导致溶酶体进行性衰竭，从而导致细胞外未消化内容物积聚。应当理解并且在本文中预期，溶酶体或其功能的任何损伤的抑制可以显著降低细胞内内含物、细胞外聚集体和潜在的神经退行性的数量和大小。由于Nox产生的ROS在年老的大脑中增加，并且已知ROS通过蛋白酶体和自噬体/溶酶体系统以及溶酶体胞吐作用影响蛋白质清除，应当理解并在本文中预期，一方面，对溶酶体损伤的抑制以及最终与年龄相关的神经退行性疾病的治疗可包括抑制至少一种NOX亚型(例如Nox1、Nox2、Nox3、Nox4和/或Nox5)或下游Nox亚型效应物(例如超氧化物或过氧化氢等活性氧物质(ROS))。因此，本文公开了在对象中减少年龄依赖性的溶酶体损伤和/或治疗年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，所述方法包括向对象施用治疗剂；其中所述治疗剂抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)-氧化酶(NOX)或下游NOX效应物。

如本文所使用的，所公开的方法可用于治疗或抑制任何前述方面的任何年龄依赖性溶酶体损伤(例如，海马锥体神经元和小清蛋白中间神经元中存在的溶酶体损伤)和/或与年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病，包括但不限于神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、1型脊髓小脑共济失调、年龄相关性痴呆、路易体痴呆、可能的血管性痴呆、额颞痴呆和肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

由于溶酶体或溶酶体效应物活性的损伤不仅会在疾病的病理症状显现后发生，而且会在疾病的任何病理表现出现前的几天、几周、几个月甚至几年内发生，可以预期上述方法不仅可以在治疗上用于减少或治疗现有的神经退行性疾病，而且可以预防性抑制、延迟或降低其大小和/或抑制或延迟疾病临床表现的发作。因此，在一个方面，本文公开了在对象中减少年龄依赖性的溶酶体损伤和/或治疗年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗剂；其中治疗药物抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)-氧化酶(NOX)或下游NOX效应物，并且其中所述治疗剂在任何疾病的临床表现之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年或长于30年的时间至少施用一次。本文还公开了在对象中减少年龄依赖性的溶酶体损伤和/或治疗年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗剂；其中治疗药物抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)-氧化酶(NOX)或下游NOX效应物，并且其中所述治疗剂在任何疾病的临床表现之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年或长于30年的时间至少施用一次。

应当理解并在本文中预期治疗剂的功效可以采取多次施用才有效。因此，本文公开了在对象中减少年龄依赖性的溶酶体损伤和/或治疗年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗剂；其中治疗剂抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)-氧化酶(NOX)或下游NOX效应物，并且其中所述治疗剂被施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次、25次、26次、27次、28次、29次、30次、31次、32次、33次、34次、35次、36次、37次、38次、39次、40次、41次、42次、43次、44次、45次、46次、47次、48次、49次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次、100次或多于100次。可以每年、每半年、每季度、每月、每两周、每周、每天、每12小时、每8小时、每6小时、每5小时、每4小时、每3小时、每2小时、每小时进行一次施用或连续不断地作为自动投放装置的一部分进行施用。

公开的方法可以使用能够抑制Nox的下游效应物或酶活性或抑制Nox亚型组装或执行其酶活性的任何小分子、抗体、siRNA、反义寡核苷酸或肽或其任何组合。例如，一方面，试剂可以是包含二亚苯基碘

的小分子。罗布麻宁、2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲基氨基)苯基]-5-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6-二酮(GKT-831)、雷帕霉素、歧化酶、羧基富勒烯(例如，C60)的丙二酸衍生物、羧基富勒烯(例如，C60)的乙酸衍生物或其任何组合。因此，一方面，本文公开了在对象中减少年龄依赖性溶酶体损伤和/或治疗与年龄相关的神经退行性疾病、纤维变性疾病或风湿病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗剂；其中所述治疗剂抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)-氧化酶(NOX)或下游NOX效应物，并且其中所述治疗剂包括二亚苯基碘

罗布麻宁、2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲基氨基)苯基]-5-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6-二酮(GKT-831)、雷帕霉素、歧化酶、羧基富勒烯(例如，C60)的丙二酸衍生物、羧基富勒烯(例如，C60)的乙酸衍生物或其任何组合。

对溶酶体具有有害作用的Nox的主要效应物之一是活性氧物质(ROS)，还应理解并在本文中预期几种Nox抑制剂(例如歧化酶、羧基富勒烯(例如，C60)的丙二酸衍生物、羧基富勒烯(例如，C60)的乙酸衍生物和/或其任何组合)是有效的，因为它们抑制作为下游Nox效应物的ROS。然而，这种抑制不仅限于Nox引发的ROS，还包括任何ROS，无论其来源如何。ROS的这种抑制、减少和/或消除可以改善溶酶体功能。因此，本文中预期改善对象的溶酶体功能的方法，其包括向对象施用治疗剂(例如，歧化酶、羧基富勒烯(例如，C60)的丙二酸衍生物、羧基富勒烯(例如，C60)的乙酸衍生物和/或其任何组合)；其中治疗剂减少、抑制和/或消除活性氧物质。

在一方面，应当理解并且在本文中预期IL-6在年老的人、小鼠、大鼠和猴子的脑中增加。此外，IL-6的增加对于诱导Nox既必要又充分。因此，可以抑制Nox的酶活性或其组装的一种方式是防止其诱导。因此，一方面，本文公开的是在对象中减少年龄依赖性溶酶体损伤、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或治疗对象中与年龄有关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿性疾病，其包括向对象施用治疗剂；其中所述治疗剂抑制Nox组装和/或酶活性，并且其中治疗剂减少海马锥体神经元和小清蛋白中间神经元中IL-6的含量、抑制海马锥体神经元和小清蛋白中间神经元中IL-6的增加、或抑制IL-6对Nox的诱导(即减少IL-6介导的NOX活化，从而引起NOX抑制)。例如，治疗剂可以是IL-6抗体或小分子。例如，IL-6抗体可以是托珠单抗、sarilumab、奥洛珠单抗、elsilimommab、CPSI-2364、galiellaclactone和/或sirukumab。

在一方面，应当理解并且在本文中预期IL-6通过激活STAT3激活NOX。因此，一方面，本文公开的是减少任何前述方面的年龄依赖性溶酶体损伤、改善溶酶体功能、增加自噬起始和/或治疗与年龄相关的神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其中所述治疗剂是信号转导物和转录激活因子3(STAT3)抑制剂，并且其中所述治疗剂减少STAT3介导的NOX激活，从而引起NOX抑制。例如，治疗剂可以是抗STAT3抗体或小分子STAT3抑制剂，例如烟酰胺、STAT3抑制剂VI(S31-201)、STA-21、WP1066、葫芦素I、姜黄素、金诺芬和/或硝呋齐特。

1.抗体

(1)一般抗体

术语“抗体”在本文中以广义使用，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子外，术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或多聚体，以及人或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段，只要选择它们与下游NOX效应物(例如超氧化物、过氧化氢或其他活性氧物质)或NOX亚型(例如NOX1、NOX2、NOX3、NOX4或NOX5)相互作用的能力，从而抑制NOX的组装或执行其酶促活性即可。可以使用本文所述的体外测定法或通过类似的方法来测试抗体的所需活性，然后根据已知的临床测试方法来测试其体内治疗和/或预防活性。人免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(亚型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员可以认识到小鼠的可比较类别。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，群体中的各个抗体是相同的，除了可能存在于抗体分子的小亚类中的可能的天然突变。本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的拮抗活性即可。

所公开的单克隆抗体可以使用产生单克隆抗体的任何方法来制备。例如，公开的单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，例如由Kohler和Milstein在Nature，256：495(1975)中描述的那些。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂对小鼠或其他合适的宿主动物进行免疫以引发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫获得淋巴细胞。

单克隆抗体也可以通过重组DNA方法制备。编码所公开的单克隆抗体的DNA可以使用常规方法容易地分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。抗体或活性抗体片段的文库也可以使用噬菌体展示技术产生和筛选，例如，如Burton等人的美国专利第5804440号和Barbas等人的美国专利第6096441号中所述。

体外方法也适用于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术消化抗体以制备其片段，特别是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例在1994年12月22日公开的WO94/29348和美国专利第4342566号中进行了描述。木瓜蛋白酶消化抗体通常会产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每个片段均具有一个抗原结合位点，以及一个残留的Fc片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的片段。

如本文所使用的，术语“抗体或其片段”涵盖具有双重或多个抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，以及片段，例如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、scFv等，包括杂合片段。因此，提供了保留结合其特异性抗原的能力的抗体片段。例如，在术语“抗体或其片段”的含义中包括维持对下游NOX效应物(例如超氧化物、过氧化氢或其他活性氧物质)活性或NOX亚型(例如NOX1、NOX2、NOX3、NOX4或NOX5)的抑制，从而抑制NOX的组装或进行其酶促活性的抗体片段。这样的抗体和片段可以通过本领域已知的技术来制备，并且可以根据实施例中所述的方法以及一般的生产抗体的方法和针对特异性和活性的筛选抗体的通用方法进行特异性和活性的筛选(参见Harlow和Lane.Antibodies,A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Publications,纽约,(1988))。

抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物也包括在“抗体或其片段”的含义内。

所述片段，无论是否与其他序列连接，还可以包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、置换或其他选择的修饰，条件是与未修饰的抗体或抗体片段相比，抗体或抗体片段的活性没有明显改变或受损。这些修饰可以提供一些其他属性，例如删除/添加能够进行二硫键键合的氨基酸，以增加其生物寿命，以改变其分泌特性等。在任何情况下，抗体或抗体片段必须具有生物活性，例如与其同源抗原的特异性结合。可以通过诱变蛋白质的特定区域来鉴定抗体或抗体片段的功能或活性区域，然后表达和测试表达的多肽。这样的方法对于本领域技术人员而言是明显的，并且可以包括编码抗体或抗体片段的核酸的位点特异性诱变(Zoller,M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3:348-354,1992)。

如本文所使用的，术语“抗体”也可以指人抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(例如，源自小鼠、大鼠或兔的抗体)在人类中具有天然抗原性，因此在施用于人类时会引起不良的免疫反应。因此，在该方法中使用人类抗体或人源化抗体可减少向人施用抗体引起不良免疫反应的可能。

(2)人类抗体

公开的人类抗体可以使用任何技术来制备。公开的人类抗体也可以获自转基因动物。例如，已经描述了能够响应免疫而产生人抗体全集的转基因突变小鼠(参见例如Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551-255(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等人,Year in Immunol.,7:33(1993))。具体而言，这些嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失会完全抑制内源性抗体的产生，从而人种系抗体基因阵列成功转移到这种种系突变小鼠中，导致抗原攻击后产生人类抗体。使用本文所述的Env-CD4-共受体复合物选择具有所需活性的抗体。

(3)人源化抗体

抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一条或多于一条多肽链的DNA序列。因此，非人源抗体的人源化形式(或其片段)是嵌合抗体或抗体链(或其片段，例如sFv、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合部分)，其包含来自整合到人源(受体)抗体框架中的非人源(供体)抗体的一部分抗原结合位点。

为了产生人源化抗体，将来自受体(人类)抗体分子的一个或多于一个互补决定区(CDR)的残基替换为来自供体(非人类)抗体分子的一个或多于一个CDR的残基，该残基已知具有所需的抗原结合特性(例如，对靶抗原的某种程度的特异性和亲和力)。在一些情况下，人类抗体的Fv构架(FR)残基被相应的非人类残基替代。人源化抗体还可包含在受体抗体或输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多于一个氨基酸残基。在实践中，人源化抗体通常是人类抗体，其中一些CDR残基和可能的某些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。人源化抗体通常包含抗体恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类抗体的抗体恒定区(Fc)的一部分(Jones等人,Nature,321:522-525(1986),Reichmann等人,Nature,332:323-327(1988)和Presta,Curr.Opin.Struct.Biol.,2:593-596(1992))。

使非人类抗体人源化的方法是本领域众所周知的。例如，可以根据Winter和同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986),Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988),Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人抗体的相应序列来产生人源化抗体。在美国专利第4816567号(Cabilly等人)、美国专利第5565332号(Hoogenboom等人)、美国专利第5721367号(Kay等人)、美国专利第5837243号(Deo等人)、美国专利第5939598号(Kucherlapati等人)、美国专利第6130364号(Jakobovits等人)和美国专利第6180377号(Morgan等人)中也描述了可用于产生人源化抗体的方法。

2.药物载体/药物产品的递送

如上所述，组合物也可以用药学上可接受的载体中进行体内施用。“药学上可接受的”是指不是生物学上或其他方面不期望的物质，即，该物质可以与核酸或载体一起施用给对象，而不会引起任何不希望的生物学作用或以有害的方式与其中包含该药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知的，自然地选择载体以使活性成分的任何降解最小化并且使对象中的任何不利副作用最小化。

所述组合物可以口服施用、肠胃外(例如静脉内)施用、通过肌内注射、通过腹膜内注射、透皮施用、体外施用、局部施用等，包括局部鼻内施用或通过吸入施用。如本文所用，“鼻内局部施用”是指将组合物通过一个或两个鼻孔递送至鼻子和鼻腔，并且可以包括通过喷雾机制或液滴机制或通过核酸或载体的雾化进行递送。组合物的吸入施用可以通过喷雾或液滴机制通过鼻或口进行。也可以通过插管直接递送到呼吸系统(例如，肺)的任何区域。所需组合物的确切量将因对象而异，这取决于对象的种类、年龄、体重和一般状况、所治疗的过敏性疾病的严重程度、所使用的特定核酸或载体、其给药方式等等。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。然而，给定本文的教导，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定合适的量。

如果肠胃外施用组合物，通常以注射为特征。注射剂可以常规形式制备，可以是液体溶液剂或混悬剂，也可以是适于在注射前悬浮溶解在溶液中的固体形式，也可以是乳剂。肠胃外施用的最新修订方法涉及使用缓慢释放或持续释放系统，以便维持恒定剂量。参见，例如，美国专利第3610795号，其通过引用并入本文。

该物质可以在溶液剂、混悬剂中(例如，掺入微粒、脂质体或细胞中)。这些可以通过抗体、受体或受体配体靶向特定的细胞类型。以下参考资料是使用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Senter等人,Bioconjugate Chem.,2:447-451,(1991)；Bagshawe,K.D.,Br.J.Cancer,60:275-281,(1989)；Bagshawe等人,Br.J.Cancer,58:700-703,(1988)；Senter等人,Bioconjugate Chem.,4:3-9,(1993)；Battelli等人,CancerImmunol.Immunother.,35:421-425,(1992)；Pietersz和McKenzie,Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992)和Roffler等人,Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。载体诸如“stealth”和其他抗体缀合的脂质体(包括针对结肠癌的脂质介导的药物靶向)，通过细胞特异性配体的受体介导的DNA靶向、淋巴细胞导向的肿瘤靶向以及在体内对鼠神经胶质瘤细胞的高度特异性的治疗性逆转录病毒靶向。以下参考资料是使用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Hughes等人,Cancer Research,49:6214-6220,(1989)和Litzinger和Huang,Biochimica et Biophysica Acta,1104:179-187,(1992))。通常，受体参与结构性或配体诱导的内吞途径。这些受体聚集在网格蛋白包被的凹坑中，通过网格蛋白包被的囊泡进入细胞，经过酸化的内体，在该内体中对受体进行分选，然后循环到细胞表面，在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，例如营养吸收，去除活化蛋白，清除大分子、病毒和毒素的机会性进入，配体的解离和降解以及受体水平的调控。许多受体遵循一种以上的细胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价和配体浓度。受体介导的内吞作用的分子和细胞机制已有综述(Brown和Greene,DNA and Cell Biology 10:6,399-409(1991))。

a)药学上可接受的载体

包含抗体的组合物可以与药学上可接受的载体组合治疗性地使用。

合适的载体及其制剂描述于Remington:The Science and Practice ofPharmacy(第19版)A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,PA 1995。通常，在制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，更优选为约7至约7.5。其他载体包括持续释放制剂，例如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质呈定型制品的形式，例如膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员显而易见的是，取决于例如施用途径和所施用组合物的浓度，某些载体可以是更优选的。

药物载体是本领域技术人员已知的。这些最典型地将是用于向人施用药物的标准载体，包括诸如无菌水、盐水的溶液以及在生理pH下的缓冲溶液。所述组合物可以肌内或皮下施用。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序来施用。

除了选择的分子之外，药物组合物还可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包含一种或多于一种活性成分，例如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。

取决于是否需要局部或全身治疗以及取决于待治疗的区域，可以以多种方式施用药物组合物。施用可以是局部(包括眼科、阴道、直肠、鼻内)施用、口服施用、吸入施用或肠胃外施用，例如通过静脉内滴注、皮下、腹膜内或肌内注射。所公开的抗体可以静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或透皮施用。

肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液剂、混悬剂和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

用于局部施用的制剂可以包括软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和散剂。常规药物载体、水性基质、粉末基质或油性基质、增稠剂等可能是必需的或需要的。

用于口服施用的组合物包括散剂或颗粒剂，在水或非水介质中的混悬剂或溶液剂，胶囊，香囊或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或黏合剂可能是需要的。

一些组合物可能以药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐的形式施用，该盐是通过与无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸和有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸反应或者通过与无机碱例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾和有机碱例如单、二、三烷基和芳基胺和经取代的乙醇胺反应形成。

b)治疗用途

可以凭经验确定施用组合物的有效剂量和时间表，并且进行这种确定是在本领域技术范围内的。施用组合物的剂量范围是足够大的剂量范围，以产生期望的效果，在该效果中疾病的症状可以受到影响。剂量不应太大而引起不利的副作用，例如不必要的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、状态、性别和疾病程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在有禁忌症的情况下，剂量可由个体医师调整。剂量可以变化，并且可以每天一次或多于一次剂量给药，持续一天或几天。对于给定类别的药品，可以在文献中找到适当剂量的指南。例如，可以在有关抗体的治疗用途的文献中找到选择抗体的合适剂量的指南，文献例如Handbook of Monoclonal Antibodies,Ferrone等人,eds.,Noges Publications,Park Ridge,N.J.,(1985)ch.22和pp.303-357；Smith等人,Antibodies in Human Diagnosis and Therapy,Haber等人,eds.,RavenPress,New York(1977)pp.365-389。取决于上述因素，单独使用的抗体的典型每日剂量范围可能为每天约1μg/kg体重至最高100mg/kg体重或高于100mg/kg。

B.实施例

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和评价本文要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，其仅是示例性的并不旨在限制本公开。已经尽力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，温度以℃为单位或是在环境温度下，压力为大气压或接近大气压。

1.实施例1：NADPH氧化酶抑制作用减少了小鼠海马中蛋白质聚集体的年龄依赖性积累

大脑已经开发出一套精巧的系统来降解和除去过多或受损的蛋白质。蛋白质可通过泛素-蛋白酶体系统或自噬-溶酶体途径在细胞内降解。自噬体/溶酶体系统还可以将其未消化的内容物释放到细胞外空间，在那里它们可以被星形胶质细胞表达和分泌的蛋白酶降解，或者被神经胶质细胞吸收到细胞内降解，或者输出到血液或淋巴中。这些过程中的任何过程的损伤都可能导致细胞内内含物、细胞外斑块和潜在的神经退行性过程的形成。

越来越多的证据表明，在衰老和神经退行性疾病中，蛋白质的清除，特别是通过溶酶体的降解的效率逐渐降低。全基因组关联研究(GWAS)已将溶酶体基因(包括CLU、BIN1和PICALM)鉴定为阿尔茨海默病(AD)风险基因，许多其他与溶酶体相关的基因也被鉴定为帕金森病(PD)的风险基因。对脑源性外泌体(分泌的膜定性囊泡)的研究发现，在距AD发病十年前的患者中，溶酶体蛋白(Lamp2和泛素)的水平升高。这些结果表明，在这些神经退行性疾病的特征性病理变化发作之前，溶酶体功能障碍可能发生在衰老的脑中。从正常跨物种的年老动物的脑中观察到的细胞内脂褐素和细胞外蛋白质聚集体可以推断，蛋白质清除率的下降似乎也发生在正常衰老过程中。细胞外蛋白聚集体首先被鉴定为高碘酸希夫阳性颗粒，随后被证明起源于神经元和神经胶质细胞。在这些聚集体中检测到的蛋白质中有p62/sequestosome-1，p62/sequestosome-1是一种参与蛋白质运输和自噬的多功能蛋白质。p62可以结合并隔离泛素化的蛋白质，后者可以随后释放以进行蛋白酶体降解或通过自噬途径降解。蛋白聚集体中p62的存在表明年老的小鼠海马不能有效消除自噬体的内容物，这很可能是由于溶酶体蛋白降解下降所致。这种年龄相关的蛋白质清除率下降可能是正常衰老和神经退行性疾病的共同主题。

衰老的另一个基本特征是低度炎症。越来越多的证据表明，老年人的不良健康后果与这种促炎状态的发展密切相关。炎性细胞因子白细胞介素6(IL-6)水平升高与认知功能较差和认知能力急剧下降有关。另外，已经将IL-6基因和IL-6受体基因鉴定为AD风险基因。在数十项研究中，包括IL-6的炎性途径激活的循环标志物也与虚弱、肌少症、残疾和早期死亡的风险增加有关。在这种背景下，本文表明在衰老的大脑中NADPH氧化酶(Nox)也增加，并且该上调依赖于IL-6。由于活性氧物质(ROS)已显示通过蛋白酶体、自噬体/溶酶体系统和溶酶体胞吐作用影响蛋白质清除，有人提出老化大脑中的海马蛋白聚集体是否包含p62和来自自噬体/溶酶体系统的其他蛋白，以及它们的积累是否是由于Nox衍生的ROS引起的蛋白清除缺陷所致。

a)方法

(1)材料

使用了以下抗体：兔抗小清蛋白(Swant，PV-25)、小鼠单克隆抗小清蛋白(Swant，PV-235)、兔抗钙网膜蛋白(Swant，7699/4)、兔抗p62(Sigma，P0067)、兔抗LC3B(Sigma，L7543)、小鼠单克隆抗体抗帕金蛋白(Abcam，ab77924)、兔抗pink1(Abcam，ab 23707)、兔单克隆抗体抗lamp2b(Abcam，ab125068)、小鼠单克隆抗体抗细胞色素P450(EMD Millipore，mab 10037)、小鼠单克隆抗体抗颤蛋白(EMD Millipore，mab5364)、小鼠单克隆抗体抗GAD67(EMD Millipore，mab5406)、兔抗α突触核蛋白(EMD Millipore，ab5038)、兔抗Iba(Wako，019-19741)和大鼠单克隆抗体抗GFAP(Calbiochem，345860)。具有DAPI安装介质的VECTASHIELD和VECTASHIELD来自Vector Labs(加利福尼亚州伯灵格姆)。信号扩增系统(TSA)加荧光素和花青3试剂盒来自PerkinElmer(Waltham，MA)。

(2)小鼠

动物研究已获得加利福尼亚大学圣地亚哥分校动物保护计划和范德比尔特大学医学中心的批准，并且符合PHS的实验动物的护理和使用指南、USDA规定以及AVMA安乐死小组的要求。实验使用了年轻的(3月龄至5月龄)和年老的(17月龄至27月龄)C57BL/6小鼠，Tam-Thy1-YFP-Cre，tdTomato或24月龄的GFAP/GFP转基因小鼠(JAX，010835)。具有Tam-Thy1-YFP-Cre的品系在Thy1启动子的控制下表达Cre重组酶和YFP，Thy1启动子驱动大多数海马和皮层兴奋性神经元的表达，但不驱动抑制性神经元的表达。Tam-Thy1-YFP-Cre:Stat3flox/flox(TF)小鼠已经产生，并且还与Rosa26-tdTomato报告基因小鼠系杂交，产生Tam-Thy1-YFP-Cre:Stat3flox/flox:tdTom(TFTD)小鼠。这些报告基因小鼠将响应他莫昔芬表达tdTom荧光。在用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行心脏灌注之前，用异氟烷深度麻醉小鼠。PBS冲洗后，将小鼠进一步用0.01M PBS中4％的PFA溶液灌注10分钟。取出全脑，并在4℃下于4％PFA中固定过夜，然后使用Vibratome切成50μm切片。将切片在-20℃下保存在30％蔗糖、30％乙二醇和1％PVP-40中，直到准备好进行免疫染色。

(3)用罗布麻宁处理

从12月龄开始持续5个月，通过在饮用水中添加罗布麻宁处理小鼠(初始剂量为5mg/kg，然后逐渐增加至100mg/kg)。然后向小鼠灌注PBS，然后灌注PFA，并在17月龄时收获大脑。

(4)免疫荧光

通过在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中于90℃加热10分钟，对大多数抗原的切片进行抗原修复。然后将切片用PBS中的3％H2O2和10％乙醇处理15分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性，然后在室温下于PBS中的2％牛血清白蛋白(BSA)和0.3％Triton X-100中封闭1小时，然后在封闭缓冲液中与一抗(稀释为1:500至1:6000以通过荧光二抗检测，或稀释为1:5000至100000用于TSA检测)在4℃下孵育过夜至72小时。然后清洗切片，并在室温下用2％BSA和0.3％Triton X-100的PBS中的Alexa Fluor 488或568偶联二抗(1μg/ml)或HRP偶联二抗(1:3000)染色2小时。使用结合了HRP的二抗，使用荧光素或花青3TSA扩增系统产生了荧光。为了使用相同物种的一抗对小鼠大脑切片进行双荧光染色，使用高度稀释的抗体通过TSA检测一种抗原，然后通过常规荧光免疫染色检测第二抗原，通常是p62。洗涤切片并用具有DAPI的VECTASHIELD固定介质将切片固定在干净的显微镜载玻片上。

(5)显微镜和图像分析

使用Zeiss LSM 510或LSM 810多光子激光共聚焦显微镜捕获图像。对于硫黄素S，用458nm激光线激发，并在480nm至520nm检测到荧光。对于Alexa Fluor 488和荧光素TSA，使用488nm激光线实现了激发，并检测到500nm至550nm的荧光。对于Alexa Fluor 568或花菁3TSA，使用543nm激光线实现了激发，并检测到波长大于560nm的荧光。对于脂褐素，用458nm激光线激发，并检测到571nm至606nm之间的荧光。对于每个实验，共聚焦显微镜设置保持恒定。然后使用Metamorph或Fiji软件对图像进行分析和处理。为了量化包含p62的聚集体的簇，从每只小鼠的三个切片中拍摄6个海马区的图像，每组4只小鼠。将海马区分为不同的亚区，并计数p62簇。在对图片进行阈值处理后，将各个簇圈起来，并使用Fiji测量有效面积。然后将每个子区域中聚集体的簇面积相加。显示了突出显示的子区域的聚集体面积和簇计数(图5A)，因为聚集体主要形成于该子区域的年纪较小的小鼠中。分析者对样品未知。

(6)免疫印迹

从速冻海马组织中制备组织裂解物。将组织融化，并在冷的Super RIPA缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4，150mM NaCl、1mM EGTA、1％Ipegal-630、1％脱氧胆酸、0.5％SDS、1mM钼酸和1mM DTT)中加蛋白酶抑制剂混合物(Roche，04 493124001)匀浆。通过以12000RPM离心10分钟来清除组织裂解液。蛋白浓度通过BCA蛋白测定试剂盒(ThermoScientific，23225)确定。对20μg至40μg蛋白质进行SDS-PAGE，转移至PVDF膜，在室温下用0.1％TBS-吐温中的5％脱脂牛奶封闭1小时，然后在4℃下用一抗探测过夜。一抗孵育后，将印迹与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下探测一小时，并用Pierce ECL蛋白质印迹底物(32106)可视化。

(7)统计学分析

所有统计数据均使用SigmaPlot 11.0进行。

b)结果

(1)老年小鼠海马中聚集的蛋白质聚集体

如下所示，衰老小鼠表现出沉积溶酶体蛋白的大的(100μm至300μm)簇/聚集体，包括p62(图1)。在整个海马中都观察到了这些聚集体，并且在年老动物中，该聚集体覆盖了该结构的很大一部分。以前在年老大鼠、人类和无脊椎动物中(即在果蝇中，p62直系同源物，Ref(2)P)都曾报道过p62聚集体在大脑中的积累。为了可视化小鼠脑中的自噬，用抗p62的抗体对大脑切片进行染色，p62是一种参与自噬的蛋白质，在自噬体中富集。在海马的锥体神经元和局部中间神经元中观察到p62荧光，在后者中强度更高。在高放大倍数下，在年轻和年老小鼠的锥体神经元和中间神经元的体中均观察到点状荧光。这些点与在衰老小鼠中明显的脂褐素体不同。在老年小鼠海马中，p62的整体水平以及脂化的LC3B形式的LC3BII的整体水平均略有增加。此外，在年轻小鼠和年老小鼠海马提取物中，LC3BII的含量均低于完整的LC3BI的含量。两者合计，虽然衰老的大脑中自噬体的总体水平没有显著增加，但在衰老过程中小清蛋白神经元中的自噬体可能会优先增加。

年老小鼠和年轻小鼠之间p62染色的显著差异是在年老小鼠中观察到的聚集的颗粒状聚集体，其在年轻小鼠中不能观察到(图1A、图B和图C)。一岁龄小鼠中也可见到它。在海马和梨状皮层中观察到这种特定模式。高分辨率成像(图1D)表明这些聚集体由3μm至8μm的小沉积物组成。因为p62被溶酶体优先降解，并且在溶酶体蛋白水解活性受损时迅速积累，这表明溶酶体没有有效地降解其内容物，其他蛋白质“货物”也可以逃脱降解。

(2)p62阳性聚集体中的其他自噬相关蛋白

通过免疫染色进一步检查了这些聚集体的可能来源。p62和帕金蛋白(Parkin)，一种参与线粒体自噬和PD的蛋白质。帕金蛋白基本上存在于所有p62阳性聚集体中(图2A、图2B、图2C、图2D和图2B)。聚集体中还发现了许多其他蛋白质，包括颤蛋白、小清蛋白(PV)、pink1、p450、钙网膜蛋白和α-突触核蛋白。这与货物蛋白普遍的溶酶体降解缺陷相一致。为了量化聚集体内蛋白质的共定位程度，使用了可用的Imaris CoLoc图像分析软件以及皮尔逊相关系数(PCC)。p62和帕金蛋白的计算如图2F和图2G所示。

(3)小鼠海马中蛋白质聚集体的细胞来源

研究表明，颤蛋白包含在相似的蛋白质聚集体中。由于颤蛋白是从钙网膜蛋白神经元合成和分泌的，因此有人提出是否含有p62的聚集体也与钙网膜蛋白神经元相关。虽然大多数p62阳性聚集体不含钙网膜蛋白，但一些p62阳性聚集体中钙网膜蛋白也呈阳性(图3A至图3C)。因此，钙网膜蛋白神经元也有助于p62阳性蛋白聚集体。由于p62囊泡在小清蛋白神经元中最为明显，这可能是自噬体内容物清除能力受损的迹象，因此有人提出它们是否有助于蛋白质聚集体的形成。大多数p62阳性聚集体不含小清蛋白。然而，在小清蛋白阳性纤维中观察到一些p62阳性聚集体(图3D至图3F)。此外，与p62阴性小清蛋白纤维(圆度＝0.44536±0.1802，n＝18)相比，p62阳性小清蛋白纤维显得更圆、更肿胀(圆度＝0.7069±0.121(平均值±标准偏差)，n＝23，p<0.001)，这与年轻小鼠的小清蛋白阳性纤维(圆度＝0.5306±0.2023，n＝25)没有不同。因此，钙网膜蛋白和小清蛋白神经元都可以促进蛋白质聚集体的形成。

几组研究表明，这些蛋白质聚集体既在细胞外又在细胞内，约60％与星形胶质细胞有关(Jucker等人，1994；Kuo等人，1996)。虽然在Iba阳性小胶质细胞中未观察到明显的p62阳性聚集体，但在某些GFAP标记的星形胶质细胞内部可以观察到较小的p62点(图4A至图4B和图4E至图4F)。另外，一些p62阳性聚集体似乎聚集在星形胶质细胞周围。由于GFAP不能标记星形胶质细胞的所有精细投射，因此用GFAP启动子驱动的GFP表达检查了小鼠大脑中的p62染色(GFAP-GFP小鼠)。在GFAP-GFP小鼠中经常观察到p62与GFP标记的星形胶质细胞相关(图4C和图4G)。大多数p62阳性簇与GFP标记的星形胶质细胞不相关，但由于在这些小鼠中并非所有星形胶质细胞都表达GFP，因此蛋白质聚集体与星形胶质细胞之间的相关性可能高于此处显示的水平。与先前的观察结果一致，还观察到颤蛋白阳性聚集体与星形胶质细胞相关联并在星形胶质细胞内部(图4D和图4H)。这些观察结果与星形胶质细胞可以吸收来自神经元的蛋白质聚集体的主张是一致的。

(4)有证据表明，Nox的激活与溶酶体货物的加工受损有关。

如上所述，衰老的野生型(WT)小鼠的脑中Nox2表达和活性增加。Nox是一种多聚酶复合物，最初被描述为嗜中性粒细胞的呼吸爆发氧化酶。Nox氧化酶家族可产生大量主要的超氧化物(分子氧的一种电极还原产物)，既可杀死病原体，又可通过多种氧化还原机制用于细胞内信号传导。Nox家族的蛋白质被广泛表达，在啮齿动物的脑中表达Nox1、Nox2和Nox4，而所有这些以及Nox5在人脑中表达。然而，啮齿动物中不存在依赖钙的Nox5。各种应激源和损伤条件可能会增加Nox表达。IL-6和信号转导及转录激活因子3(Stat3)参与Nox2的激活。Nox2、Nox4和调节亚基p22phox在衰老的大脑中被诱导，表明Nox2活性在正常衰老的野生型小鼠中高度上调。

此处通过长期用Nox抑制剂、罗布麻宁(50mg/kg/天)或超氧化物歧化酶模拟物(C3，1mg/kg/天)治疗小鼠，阐明了Nox活性是否导致溶酶体功能障碍，并通过减少p62阳性聚集体(图5)(和帕金蛋白阳性聚集体)的数量和大小证明了溶酶体功能的显著改善。图5显示了来自雌性的数据，但是第二组衰老雄性小鼠显示了相似的作用，表明Nox损害了两种性别中蛋白质的清除。这些数据非常重要，因为它们将Nox活性与物质的溶酶体清除率缺陷直接联系在一起。以非遗传方式修饰溶酶体功能和清除货物的能力可以研究整个寿命中与年龄相关的溶酶体功能障碍的机制。

(5)为受损的溶酶体降解而增强细胞物质的递送会恶化溶酶体功能。

负担过重而不能正常工作的溶酶体会导致组织损伤。他们发现，尽管自噬体形成增加和溶酶体生物发生增强，但LC3b-II、SWQTM1/p62和较大的膨胀溶酶体在大脑中逐渐积累。作者得出结论，面对底物的溶酶体清除率下降，自噬的持续上调不仅导致越来越多的溶酶体缺陷，而且实际上导致了神经元损伤。雷帕霉素之类的药物可激活自噬的初始步骤，以促进受损的大分子/细胞器向溶酶体的递送，在许多疾病模型中均是有益的，但是最近人们意识到，增加功能障碍溶酶体的物质负荷可能会使自噬恶化而不是增强自噬。实际上，最近在AD小鼠模型中使用雷帕霉素的论文显示了治疗后的某些行为改善，但斑块或缠结清除率无差异，表明雷帕霉素无法克服溶酶体蛋白水解受损。这些结果表明，要获得雷帕霉素或雷帕霉素类似物引起的自噬增强的全部益处，首先使溶酶体功能正常化可能很重要。

在这种情况下，有人提出，在年老小鼠中，是否可以认为溶酶体内容物的无效降解视为溶酶体增大(大概是发红的)(图6)。这一发现与拟议的溶酶体酸化受损相一致，因为众所周知，溶酶体v-ATP酶抑制剂巴氟霉素对溶酶体酸化的直接抑制作用会在数小时内迅速增加溶酶体的大小，表明溶酶体大小是有效溶酶体功能的动态指标。如图所示(图6)，年老动物神经元中Lamp1阳性溶酶体的平均大小和累积大小均明显较大。与水相比，使用罗布麻宁处理的衰老小鼠中，使用lamp1(图6)和CatD免疫染色均能使Nox抑制的神经元细胞内溶酶体大小显著正常化(减少)。根据这些结果，p62聚集体的大小、数量和所占海马区的百分比用作静态长期溶酶体功能障碍的量度，并使用神经元溶酶体的大小和数量(以lamp1和CatD为标记)作为溶酶体活性动态变化的量度。

c)讨论

已经用针对各种抗原的抗体检测到了衰老海马中的蛋白质聚集体，但是这些聚集体的重要性尚不清楚。研究表明，这些聚集体中还包括了自噬体/溶酶体货物蛋白，例如p62、帕金蛋白、Pink1和Lamp2B。这些观察结果表明，海马组织无法有效地从自噬-溶酶体途径中去除或降解蛋白质，可导致蛋白质聚集体的年龄依赖性积累。此外，小清蛋白或钙网膜蛋白GABA能神经元以及星形胶质细胞可有助于这些聚集体的形成。Nox抑制作用减弱了衰老过程中蛋白质聚集体的积累，这表明Nox衍生的ROS可以影响小鼠海马体中蛋白质的清除。

(1)年老小鼠海马体中自噬溶酶体途径可能的缺陷

自噬主要具有细胞保护作用，可以回收大分子，并降解和除去受损的细胞器。自噬功能受损会诱发炎症并缩短寿命，而自噬功能的激活会减少多种疾病模型的疾病病理并延长寿命。据信自噬在衰老过程中受损，但是衰老动物中自噬通量的增加和减少均有报道。似乎更一致的是衰老细胞中的溶酶体功能下降。通过用针对LC3B和p62的抗体进行免疫染色，可以观察到一些类似自噬体的点，但是其在年老海马中没有明显的整体增加。这与蛋白质印迹实验的结果相吻合，该实验证明与完整的LC3BI相比，LC3BII的数量微不足道。然而，蛋白质印迹显示，年老小鼠中p62和LC3BII的轻微增加可以解释为自噬溶酶体途径能力下降的结果。最后，小清蛋白中间神经元中的囊泡样p62免疫反应性比锥体神经元中的更大、更丰富，这表明自噬或溶酶体可优先受损于这些细胞中。

(2)年老小鼠中的蛋白质聚集体包含来自自噬-溶酶体途径的蛋白质，并且具有神经元和神经胶质起源。

用p62免疫染色检测到的蛋白质聚集体与高碘酸希夫氏阳性颗粒相似。这些颗粒包含硫酸肝素蛋白聚糖和层黏连蛋白以及颤蛋白，并且已提出它们既来自神经元又来自神经胶质细胞。本文证明了这些聚集体包含帕金蛋白、Pink1和Lamp2B以及细胞色素P450，这表明自噬或线粒体吞噬可使衰老小鼠的蛋白质降解受损。这些聚集体似乎也起源于神经元和神经胶质细胞。GFAP-GFP小鼠实验显示，某些p62阳性聚集体与星形胶质细胞相关。在含有小清蛋白或钙网膜蛋白的纤维中也观察到一些p62阳性聚集体。如果这些标记物标记相似的蛋白质聚集体，则与星形胶质细胞相关的颗粒中也含有神经元分泌的颤蛋白，这被GFAP和颤蛋白双重免疫染色所证实。这些观察结果还暗示星形胶质细胞能够摄取神经元来源的蛋白质。神经元组分向星形胶质细胞的这种输送并不少见。例如，已显示星形胶质细胞介导去除Aβ沉积物和突触成分。由于星形胶质细胞趋向于拥有自己的领地，聚集在特定星形胶质细胞周围的这些聚集体的积累可以反映出它摄取或降解细胞外蛋白质聚集体的能力下降。这些蛋白质聚集体长时间暴露于细胞外空间会导致ROS或细胞外酶的进一步修饰，使其对随后的降解和去除更具抵抗力。

(3)Nox衍生的ROS和蛋白质清除

用Nox抑制剂罗布麻宁对中年小鼠进行5个月的治疗可减少海马聚集体，这与以下认识一致：Nox衍生的ROS会损害海马蛋白质的清除。已知ROS对蛋白酶体系统具有复杂的作用。尽管氧化的蛋白质是该系统的较好底物，并且急性ROS暴露可通过该系统减少或增加蛋白质降解，但尚未报道长期ROS暴露对衰老过程中发生的蛋白质降解的影响。同样，ROS也影响溶酶体中自噬起始以及自噬货物的后续降解。具体而言，参与溶酶体蛋白降解的酶例如组织蛋白酶B和L具有可被ROS灭活的活性半胱氨酸残基。此外，ROS还调节V-ATP酶在自噬体和溶酶体上的组装和活性，从而导致这些细胞器的碱化。这导致溶酶体货物的低效消化。最后，ROS还可以促进溶酶体胞吐作用，从溶酶体中释放未消化的蛋白质。所有这些都可以促进衰老大脑海马中蛋白质聚集体的形成。总而言之，此处呈现的结果表明，蛋白质聚集体是通过从衰老小清蛋白和钙网膜蛋白中间神经元中挤出未消化的蛋白质而形成的，这是对自噬体/溶酶体系统降解蛋白质的反应，这是由Nox产生的ROS升高引起的。

2.实施例2：当前的抗炎药并未针对适当的途径

为了解决为什么确定负责与年龄有关的溶酶体货物清除的机制对于开发新的治疗方法至关重要的问题，请注意以下几点。没有药物可以直接激活溶酶体。常用的非甾体类抗炎药不会降低IL-6的表达，在某些情况下，实际上可以增加IL-6/Stat3级联的激活。因此，需要新药来治疗涉及该途径的炎症以及下游介质，例如NADPH氧化酶。

现在有3种临床批准的抗IL-6免疫疗法，专门批准用于类风湿性关节炎，这种疗法对其他治疗方法无能为力。这些可以作为一种干预手段。然而，这些免疫疗法针对IL-6膜受体(IL-6R)，并且由于许多IL-6信号传导通过与gp130而不是IL-6R结合的可溶性受体，因此这些免疫疗法并未靶向许多IL-6信号传导。此外，两种制剂均被证明具有不良反应，尤其是持续治疗的不良反应，没有穿过任何血脑屏障，这些制剂仅用于难治性类风湿关节炎患者，不适用于健康的老年患者。小分子Nox抑制剂的开发是许多制药公司研究的活跃领域，在一项或多于一项临床试验中具有一系列应用。然而，每种抑制剂都靶向特定的Nox亚型，并且炎性细胞因子可以诱导一种以上的亚型。最后，迄今为止，对Nox5的关注很少，Nox5由于其对钙的依赖性而可以在中枢神经系统中起关键作用。

3.实施例3：正常衰老期间的溶酶体功能异常是由于NADPH氧化酶通过增加的IL-6和/或Stat3途径激活而引起的炎症激活。

本文提供了令人兴奋的新数据，通过证明用NADPH氧化酶(Nox)抑制剂罗布麻宁治疗的小鼠在整个大脑中的未降解溶酶体物质含量均得到了大幅降低(图5)。这些是第一个表明抑制Nox活性可以改善体内脑溶酶体功能的数据。分析还表明，罗布麻宁的存在可显著降低溶酶体的大小，溶酶体的大小在年老动物中会增大(图6)，而在年轻动物中恢复大小。基于本文的观察结果，IL-6负责衰老大脑中的Nox2诱导，因此，本文确定IL-6是否介导溶酶体功能障碍。此外，由于IL-6调节Stat3，并且Nox亚基的启动子区域具有GAS(Stat3靶标)序列，因此Stat3可能参与了Nox介导的溶酶体缺陷。IL-6基因敲除小鼠具有神经元Stat3的靶向缺失，其药理学抑制Nox衍生的超氧化物的产生可用于测试这些可能性。为此，通过qRT-PCR、蛋白质印迹和脑切片免疫染色法测定，连续两天注射IL-6(5g/kg)的4月龄和24月龄的C57Bl/6小鼠具有Nox2、Nox4和p22phox的诱导。这种增加不仅发生在小胶质细胞中，还发生在皮层和海马神经元以及突触小体中。为了确认抗Nox2Ab的特异性，总是将来自gp91_phox-/-(Nox2_-/-)小鼠的切片和组织作为对照。

a)小鼠体内研究。

为了检验对Nox来源的超氧化物会导致衰老大脑中溶酶体功能失调的理解，一组小鼠接受药物治疗，用于测试Nox对溶酶体功能的影响。这些药物及其原理均包含在此处；1)Nox抑制剂罗布麻宁(100mg/kg/天，如图5所示，提高了货物清除率)，2)超氧化物歧化酶模拟物(C3，1mg/kg/天)以降低组织中的超氧化物水平，以及3)N-乙酰半胱氨酸(10mg/kg/天)，以增加细胞内谷胱甘肽的水平并逆转组织蛋白酶的硫醇氧化。所有药物均在饮用水中施用，对照组(两个)接受常规饮用水作为对照组。在3个年龄开始对小鼠的治疗或控制；5月龄(成年)、12月龄(观察到早期的聚集体沉积)和18月龄(年老)，每个年龄5只雄性和5只雌性，所有这些都可以在22月龄(当发现大量沉积物以及与年龄有关的认知障碍时)处死。因此，每个治疗组招募了30只小鼠进行成像研究。结果指标包括p62簇大小、数量、和海马面积百分比(图5)、使用lamp1的神经内溶酶体大小(图6)以及其他蛋白质与聚集体共定位的证据(例如图2)。治疗的开始可以交错，这样三个年龄组在处死时都22月龄，因此可以同时进行处理。为了分析蛋白质表达和组织蛋白酶活性，需要第二组相似的治疗组，并且如上所述可以交错进行治疗。因此，需要额外的小鼠进行蛋白质和组织蛋白酶活性分析。

b)小鼠脑切片的免疫染色程序。

可以用异氟烷麻醉小鼠，并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行心内灌注1分钟，然后用冷的10μMPBS中的4％多聚甲醛(PFA)灌注5分钟。取出全脑并在4℃下于4％PFA中固定过夜，然后再切换至2％PFA再固定24小时，然后在振动切片机上切片以产生50μm切片，将其在-20℃下保持在30％蔗糖、30％乙二醇、1％PVP-40中，直到准备好进行免疫染色。然后将漂浮的部分封闭，用一抗进行免疫染色，洗涤，用荧光二抗标记，然后安装在载玻片上的Vectashield安装介质中进行成像。所有分析均由不了解治疗信息的个人执行。使用的抗体包括(供应商，CAT#，稀释)：兔抗p62(Sigma，P0067，1:4K)、小鼠单克隆抗体抗帕金蛋白(Abcam，ab77924，1:1K)、兔抗pink1(Abcam，ab23707、1:5K带TSA)、兔单克隆抗体抗lamp2b(Abcam，ab125068、1:5K(带TSA)和兔抗LC3B(Sigma，L7543，1:1至2K)。免疫染色切片在Zeiss LSM 880 2-光子共聚焦系统上成像。切片在不成像时被存储在黑暗中。给定自噬标记的免疫荧光可以通过Zeiss Zen Blue分析软件或Image J进行定量。溶酶体衰竭可以定义为p62的增加，以及在LC3b-II含量增加的情况下lamp2的沉积，所有这些都通过免疫染色进行。

c)衰老和炎症性大脑的Nox亚型变化。

在小胶质细胞中观察到了年老大脑中Nox2和Nox4表达的增加，但在神经元中也广泛观察到。在这些实验中，可以确定Nox2和Nox4改变在衰老小鼠大脑中的作用。Nox的表达水平可以通过qPCR和常规的蛋白质印迹进行初步定量，其分布可以通过与特定的神经元、神经胶质、内体和溶酶体标记物共免疫染色来检查。中枢神经系统炎症可通过定量PCR、ELISA和蛋白质印迹定量包括TNFα、IL1β、IL6、Nox2和Nox4的炎性标志物进行检查。

一种可诱导的低度IL-6介导的炎症模型，是将AAV注射到腹部脂肪中，对于衰老研究具有有效性。小鼠IL-6可以亚克隆到具有低免疫原性和良好安全性的腺相关病毒(AAV)载体中，并转导分裂细胞和非分裂细胞，从而在具有低增殖率的组织中驱动长期基因表达(长达数年)。可以使用AAV8或9，因为在将其施用于成年小鼠后，它们可以将有效的基因和长期的基因转移到脂肪组织。小鼠可以用3％的异氟烷麻醉，每只小鼠接受2X10¹⁰至1X10¹²病毒基因组进入表皮内脂肪。使用汉密尔顿注射器，每个腹股沟脂肪组织接受四次10μL的AAV溶液注射。然后通过ELISA测量血清IL-6水平，以确定转基因表达和病毒滴定的时间过程。

d)v-ATP酶活性的变化。

同样，v-ATP酶的溶酶体酸化也受其组装和运输的调节。虽然在体内测量溶酶体的pH值不切实际，但可以通过细胞分级分离、蛋白质印迹和免疫荧光检查导致溶酶体碱化的v-ATP酶组装和靶向的可能变化。当观察到这种变化时，可以进一步检查诸如半胱氨酸氧化的潜在机制。

e)组织裂解物中溶酶体活性的变化。

溶酶体酶的氧化修饰和随后的失活可以在组织裂解物中检测到。可以解剖海马、大脑皮层和其他大脑区域，将其冷冻在干冰上，并保持在-80℃直至在适当的缓冲液中超声处理均质化。可以使用几种基于荧光的，对CatD、CatB和CatL活性具有特异性的可商购获得的试剂盒(Thermo Fisher)，在有或没有还原试剂的缓冲液中测定衰老和炎症性脑匀浆组织蛋白酶的活性。19月龄和5月龄的小鼠的皮质组织的结果表明，组织蛋白酶活性可以可靠地测量。

f)蛋白质印迹分析CatD的自溶蛋白水解裂解。

由于CatD从其高分子量(HMW)的前体形式到其较小的活性形式的处理需要溶酶体酸化，因此可以对各种实验组进行组织提取物的蛋白质印迹分析，如图7所示。未切割的HMW形式的积累可能是溶酶体功能障碍的另一个指标。

4.实施例4：IL-6缺失改善溶酶体功能

在动物模型和人类中的多项研究表明，衰老与慢性低度炎症有关。在人类中，在数十项研究中发现，促炎性细胞因子白介素6(IL-6)的循环水平升高与年龄相关的疾病和更差的健康结果有关。有许多因素可以系统地激活老年人大脑的炎症途径，包括心血管疾病、高血压、激素状态变化甚至饮食等慢性疾病。更重要的是，IL-6和受IL-6转录调节的C-反应蛋白升高可预测老年人的急性和慢性认知能力下降、轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病和谵妄。为了支持当前的提议，甚至在健康的老年人中进行的临床研究也表明，在神经心理测验中，IL-6升高与较差的认知表现之间存在显著的统计学相关性。在大多数这些研究中，仅IL-6升高，而其他促炎性介质(如IL-1β和TNFα)则没有升高。

为了直接测试IL-6在衰老受损的自噬中的作用，可以使用WT和IL-6-/-小鼠的大脑。本文显示，与WT相比，年老的IL-6-/-小鼠大脑具有较低的Nox2表达和活性。可以检查来自本研究的年轻(4月龄，n＝8)和年老(22月龄，n＝12)的WT以及年轻(n＝10)和年老(n＝12)的IL-6-/-小鼠的先前冷冻保存的大脑。将大脑用PFA固定，收获并保存在-20℃冷冻保护剂中，因此没有提议将新小鼠用于这些研究。可以对脑切片进行p62、lamp2、帕金蛋白、pink1、LC3B、lamp1和组织蛋白酶D和L的免疫染色。在这些储存的大脑中，PV、p62和MAP2染色保持完整。如果IL-6参与了溶酶体抑制作用，则p62聚集体的数量可能会比WT脑中的数量少和/或更小(例如，图5)。

5.实施例5：Stat3的神经元缺失可改善溶酶体功能？

这些研究可以在专门为此提案生成的两个小鼠品系中进行，也可以在年龄和性别相匹配的WT小鼠中进行，所有这些都在C57BL6背景上进行了十代以上的研究。第一品系是Thy1-YFP-Cre:tdTomato报告基因小鼠。这些小鼠在Thy1启动子的控制下，在95％的海马锥体细胞和90％的皮质神经元中具有黄色荧光蛋白(YFP)的组成型表达。在这些小鼠中用他莫昔芬治疗一周以激活Cre重组酶，在95％的海马神经元中产生红色荧光蛋白tdTomato的高水平表达，并且近100％的tdTomato与YFP阳性神经元共定位在。因此，可以在他莫昔芬(Tam)治疗一周后研究小鼠。这些小鼠充当最终转基因品系Thy1-YFP-Cre:Stat3flox/flox:tdTomato小鼠的Tam诱导对照，它们还具有Tam诱导的海马和皮层神经元Stat3切除的功能，再次允许在任何年龄都能够诱导性地切除锥体和皮质神经元中的Stat3。

根据专门为此申请获得的数据，可以对5月龄、12月龄和22月龄的小鼠(相等数量的雄性和雌性)进行研究。可以使用相等数量的雄性和雌性。在WT小鼠正常衰老过程中，Nox2在神经元衰老的大脑中被诱导，而小胶质细胞数量有限，并进一步证明IL-6介导了这种诱导作用。可以对脑切片进行WT和Tam-Thy1-YFPCre:Stat3floxed:tdTomato(TFtdTom)小鼠的Nox2免疫染色，该小鼠先前在4月龄至5月龄时用他莫昔芬治疗以切除海马主要神经元中的Stat3。如果Stat3是诱导Nox表达所必需的，则年老海马和皮质中的大多数神经元在WT动物中表达Nox，而在TFtdTom小鼠中并非如此。此外，可以同时研究没有tdTom的Thy1-YFP-Cre:Stat3floxed小鼠，以确认tdTom的表达不会影响结果。为了进一步测试Stat3在Nox诱导中的作用，根据研究，可以进行IVC注射IL-6(1μg于4μl盐水中)，然后在48小时后进行Nox2免疫染色，以期在Stat3基因敲除小鼠的神经元中不诱导Nox表达。如果在没有Stat3的情况下炎症仍然诱导Nox2表达，则表明通过替代因子对Nox进行转录调控。

(1)数据分析

使用ANOVA与Tukey事后分析比较各组之间p62聚集体占据的海马面积百分比以及聚集体簇的绝对数量；如果比较了超过4组，则进行Bonferoni校正，其显著性设为p<0.05。然而，聚集体的大小是一种分布，可以使用非参数分析例如Kruskal-Wallis或Mann-Whitney秩和检验来比较组之间的大小分布。通过抑制Nox2(如果还包括Nox1)的罗布麻宁以及合成的超氧化物歧化酶(SOD)模拟物(C3，可降低Nox产生的超氧化物的水平)都可以减少聚集体的数量和大小。如果还涉及Nox4，SOD模拟可能会更有效，因为它也可以减少Nox4产生的过氧化物至过氧化氢。即使当Nox的激活不是溶酶体衰竭的主要原因时，通过调节其他炎症途径起作用的IL-6也可能参与脑衰老过程中的溶酶体功能受损。

6.实施例6：炎症导致溶酶体功能障碍和溶酶体内容物降解受损。

全基因组关联研究(GWAS)反复显示了两个基因网络，这些基因网络增加了LO-ND发病的风险，在某些情况下还使疾病更早发作。这两个网络中的第一个包括与炎症和大脑中先天免疫调节相关的基因，其中许多基因是大脑中的单核细胞小胶质细胞特有的。在LO-阿尔茨海默病(LO-AD)中确定的风险基因尤其包括PU.1(单核细胞谱系转录因子)、CD33、CR1、ABCA7、MS4A和TREM2(活化的小胶质细胞上的细胞表面蛋白)以及白介素6受体(IL-6R)等。PD和FTD中的其他GWAS已鉴定出许多相同的风险基因。来自正常健康成年人的大脑的基因阵列图谱还显示，炎症性基因包括CD33、IL-6R和CR1的表达增加，表明在全身性炎症暴露后数月，大脑中固有免疫力的持续激活。因此，多种证据支持衰老的大脑中炎症激活先天免疫的作用。

a)通过炎症调节其氧化还原位点抑制v-ATP酶。

小鼠皮质培养物暴露于IL-6会破坏包括p62在内的蛋白质的溶酶体降解。同样，IL-6可以通过经典的pTyr-Stat3转录和非经典的Stat3NFκB转录诱导包括TNFα、IL-6、IL-1β、Nox2和Nox4的炎症介质的表达。在这里，可以按照上述方法在盖玻片上制备原代小鼠培养物，并每天用IL-6(10ng/ml和100ng/ml)或载剂对照(培养基)处理4天。可以在某些培养皿中加入巴佛洛霉素(100nM)作为直接抑制v-ATP酶的阳性对照。可用4％多聚甲醛(PFA)固定培养物并进行免疫染色。根据这些数据，可以观察到在IL-6和BAF处理的细胞中大lamp1和p62阳性溶酶体的积累。为了评估氧化还原作用对v-ATP酶的作用，可将培养物与三种抗氧化剂TEMPOL(一般自由基清除)、C3化合物(催化型超氧化物歧化酶，可减少源自Nox的超氧化物，而与造成危害的亚型无关)和N-乙酰基半胱氨酸之一共同处理(以增加谷胱甘肽水平)。当v-ATP酶通过其氧化还原位点被抑制时，抗氧化剂处理可以防止未消化的内容物积聚(p62，lamp1)，并防止溶酶体增大。另外，如果在用IL-6处理的培养物中，通过v-ATP酶的氧化还原失活，溶酶体的酸化和组织蛋白酶的活性已经受损，则BAF不会进一步恶化溶酶体的功能，因为v-ATP酶已被抑制。相反，用抗氧化剂处理可以保留v-ATP酶的活性，从而使BAF对v-ATP酶和溶酶体货物降解产生抑制作用。

如果上述实验表明v-ATP酶是Nox衍生的活性氧物质(ROS)的靶标，可诱导神经元培养物中的溶酶体功能障碍，则可以进一步研究导致v-ATP酶失活的机制。V-ATP酶是一个多亚基复合物，由水解ATP的外围V1域和使质子易位的完整V0域组成。在哺乳动物细胞中，PI-3激酶、ERK和mTOR促进其装配，而PKA活化则促进其向质膜的转运。它对氧化抑制也非常敏感，在哺乳动物中，这似乎是通过ATP6VA1亚基的Cys254或Cys277氧化，尽管确切的机理尚有争议。高水平的ROS还导致非哺乳动物细胞中的囊泡中的外围V1结构域解体。为了确定由Nox激活和上述提议的处理诱导的培养物中v-ATP酶的变化，可以使用试剂盒(SigmaAldrich)分离溶酶体。ATP酶活性可以通过与孔雀石绿(Sigma Aldrich)的比色反应定量的磷酸盐释放来测量。v-ATP酶活性可以通过不存在和存在巴佛洛霉素的差异来定义。如果检测到失活并通过DTT预处理将其逆转，则失活很可能是由于半胱氨酸氧化或二硫键的形成。

b)溶酶体的直接化学碱化导致组织蛋白酶酸性蛋白酶活性的抑制。

类似地，可以如上所述将培养物暴露于IL-6，并且可以监测对溶酶体pH的影响。可以在玻璃底96孔板上培养原代神经元培养物，用IL-6处理以诱导Nox活化，然后加载LysoTracker绿(ThermoFisher，L7526)，其在溶酶体中的积累取决于溶酶体的pH值。荧光强度可以通过荧光酶标仪定量，或者用共聚焦显微镜成像。Nox的激活会导致溶酶体的碱化，并产生荧光降低，这种降低可以被Nox抑制和ROS清除剂逆转。LysoTracker染料的积累也可能受到诸如细胞质pH值等条件的影响，为排除这种可能性，在可行的情况下，比例探针(如LysoSensor^TM黄/蓝DND-160)也可以用于重复上述实验。长时间孵育后，神经元可以将葡聚糖偶联的俄勒冈绿和若丹明摄取到溶酶体中，俄勒冈绿与若丹明的比例也可以反映溶酶体pH的变化。当这些染料通过不同的途径标记溶酶体时，可以使用这些染料重复上述实验。对于某些盘，可以固定成像细胞后，对溶酶体标记物(包括lamp1)进行免疫染色，并重新定位视野，以进一步确认先前已针对pH变化成像的溶酶体的身份。

为了评估在培养细胞中的溶酶体蛋白质降解，这取决于溶酶体pH和蛋白酶活性，可以将细胞与DQ绿BSA(ThermoFisher Scientific)孵育，然后洗涤，并可以在不同的时间点监测荧光。荧光增加与DQ绿BSA的降解有关。由于该测定法依赖于内吞作用，因此还可以用葡聚糖偶联的若丹明同时评估治疗对内吞作用的影响。或者，不同溶酶体蛋白酶的细胞渗透性底物，如基于若丹明110的双肽底物(ThermoFisher Scientific，例如，用于丝氨酸蛋白酶的Bis-(CBZ-Arg)-R110，用于组织蛋白酶B和L的Bis-(CBZ-Phe-Arg)-R110)，可用于监测其在细胞中的降解。预期这些测定既依赖于溶酶体pH值，又依赖于蛋白酶活性；后者可以用活性依赖性探针例如BMV109(Vergent Bioscience)进行进一步评估，BMV109是一种泛组织蛋白酶探针，已用于检测细胞裂解液、完整细胞和体内的组织蛋白酶活性3。可以通过显微镜或荧光板读数器检测荧光。这些测定法与本文所述的实验相结合，提供了关于蛋白酶降解变化是否是由于pH值或蛋白酶活性改变引起的了解。

(1)分析与解释：

当Nox负责溶酶体的碱化时，在Nox诱导后观察到更高的溶酶体内pH值，可以通过抑制Nox来阻止或使其正常化。用事后两两比较的方差分析可用于将每种Nox诱导治疗与对照以及Nox抑制进行比较。溶酶体pH值随Nox诱导而变化不充分，表明可能导致诱导水平或诱导持续时间不足，或导致溶酶体衰竭的其他机制，如下所述。本文的研究显示，随着Nox的诱导，pH值更高，因此，基于这些数据，可以确认Nox依赖性的pH变化。同样，如果pH的变化不能预测对蛋白酶效率的影响，则可能存在其他机制，下面将进行探讨。

c)溶酶体内蛋白包括组织蛋白酶的氧化修饰导致蛋白水解受损。

组织蛋白酶，特别是半胱氨酸蛋白酶，例如组织蛋白酶B、L和S，具有易于氧化导致失活的半胱氨酸残基。为了评估ROS对组织蛋白酶活性的影响，可以在有或没有还原剂的缓冲液中收集暴露的培养物，并使用适当的底物[来自Anespec的Z-FR-AMC用于组织蛋白酶B(对CA-074敏感)和L(对CA-074不敏感)，来自EMD Millipore的组织蛋白酶S底物，来自Enzo的组织蛋白酶D&E底物]测量组织蛋白酶活性。天冬氨酰组织蛋白酶(CatD或CatE)可能受到的氧化影响较小，而半胱氨酰组织蛋白酶B、L和S的活性可能优先受损。

(1)来自iPSC细胞的人类神经元培养物。

建立了源自特征明确的人诱导型多能干细胞(iPSC)系CC-3的神经元培养物，可用于确认小鼠培养实验中的关键发现。从CC-3种系分化出来的人类神经元具有60％的兴奋性和40％的抑制性(5％PV阳性)。由于对于调节培养的人神经元中炎症所需的药物浓度知之甚少，因此可以首先进行剂量寻找实验。iPSC向神经元的分化需要5周的时间，因此这些培养物最适合用于确认小鼠培养物中的关键观察结果。使用人类神经元的另一个令人信服的理由是，Nox5基因存在于人类中，但啮齿动物中不存在。有证据表明，依赖Ca2+的Nox5可能是人类中ROS的重要来源，并且已知Nox5在人神经元中表达。为了确定Nox5是否会影响溶酶体，可以使用细胞可渗透的Ca2+螯合剂BAPTAAM(Thermofisher)抑制Nox5。这些研究提供了令人兴奋的新方法来研究溶酶体功能如何受到人类神经元炎症的影响。

7.实施例7：Nox激活、IL-6和Stat3激活在神经元培养物中的溶酶体功能障碍中的作用。

为了将Nox包含在溶酶体损伤中，可以将IL-6(10ng/ml和100ng/ml)处理的细胞与所述的1)前药Nox抑制剂罗布麻宁(100μM)，2)选择性抑制Nox的p22phox阻断抗体或3)p22phox shRNA共同处理。在人类神经元中，可以测试Nox5shRNA的作用。可以通过对Nox进行免疫染色以及通过用针对小鼠和/或人类样品验证的抗体的蛋白质印迹法对Nox的亚单位表达进行监测。通过EPR检测超氧化物的生成来监测Nox活性。为了确定IL-6的作用，可以将IL-6的封闭抗体与药物一起施用，如所述。

为了确定Stat3在溶酶体功能障碍中的作用，可以从具有他莫昔芬(TAM)可诱导的Stat3缺失的小鼠(“TF”小鼠)制备神经元。Stat3从95％的海马锥体神经元中缺失。将这些小鼠饲养在PI的栖息地中。可以从这些小鼠和WT C57BL6小鼠制备海马培养物。接种后3天，用TAM或玉米油载剂处理WT和TF培养物，以除去TF中的Stat3，但不去除WT培养物中的Stat3。然后在培养的第14天研究培养物，使用如上所述的NMDA(10μM)暴露22小时以诱导Nox活化。如果Stat3对于溶酶体抑制是必需的，则用TAM处理的TF培养物具有改善的溶酶体功能和较少的Nox活化作用，而WT培养物或用载剂处理的培养物不具有。基于此，Stat3缺失仍然可以减少炎症信号传导和Nox诱导。值得注意的是，Jak2抑制剂仅阻止酪氨酸磷酸化，因此不会阻止U-Stat3或p-SerStat3的作用。AG490是一种抑制Stat3活化的Jak抑制剂，尽管它不能抑制Stat3的全部活性，但它可以作为抑制Stat3的第二种手段，因为Stat3可以在丝氨酸和酪氨酸上被磷酸化，因此基因缺失实验可以提供与AG0490处理不同的结果。

a)数据分析和解释。

如果氧化通过形成二硫键或亚磺酰化而使组织蛋白酶失活，则可以通过加入还原剂来恢复其活性。用抗氧化剂处理细胞可以至少部分逆转炎症诱导的组织蛋白酶失活。使用事后两两比较进行方差分析可以确定直接的氧化还原作用是否正在抑制组织蛋白酶活性。

8.实施例8：未降解的溶酶体货物，包括活性蛋白酶，损伤附近的神经元，以及未消化的溶酶体物质是否具有促炎性。

从神经系统外部如心脏和骨骼的研究中可以明显看出，无效的溶酶体可以将活性蛋白酶释放到细胞外空间，然后破坏附近的组织。数据还表明，在溶酶体物质聚集体附近，神经元纤维受到了损伤(图8)。在神经元子集中表达tdTom红色荧光报告蛋白的小鼠可用于通过共聚焦荧光显微镜观察神经元过程和突触。可以使用Sigmastat和Excel统计数据包中的非参数分布检验，对年轻和年老小鼠以及用罗布麻宁治疗的小鼠进行回归分析，以确定与聚集体的接近程度是否可预测纤维损失。可以绘制局部聚集体与纤维损耗之间的关系，并进行线性回归分析以确定相关系数(r)，可以在各组之间进行统计比较。如果挤出的溶酶体物质对局部神经元纤维造成损害，则r接近1.0，否则，r接近0.5。类似地，本文显示了与聚集体的接近是否增加局部炎症，其以小胶质细胞和星形胶质细胞活化进行评估。

a)溶酶体功能障碍对神经元完整性的影响。

为了使单个神经元轴突、树突和突触——所有潜在的损伤目标——易于观察，可以使用PV-Cre:tdTomato报告基因小鼠，其在表达Palvalbumin的抑制性(PV)神经元中表达红色荧光蛋白tdTomato(tdTom)。之所以选择这些小鼠，是因为这些神经元非常稀少，以至于可以详细看到单个神经元、它们的细胞体和它们的过程。使用MAP-2、β-Tub、SMI32(纤维)和PSD95、突触素(突触)的免疫染色，可以使用已发布的方法分析神经元纤维密度和突触数量。

如果溶酶体功能受损，并且仍然活跃的组织蛋白酶被挤出，会对神经元纤维/突触的周围造成伤害，那么减少聚集体的治疗只能减少聚集体附近的神经元的损伤。如果治疗能使纤维损失总体减少，则认为聚集体是造成纤维损坏的原因。

b)溶酶体聚集体诱导局部炎症反应

星形胶质细胞和小胶质细胞的激活可以作为炎症的两种测量方法进行分析。要评估经挤出的溶酶体附近星形胶质细胞和小胶质细胞的炎症激活，可以对GFAP和Iba1进行IF，并寻找聚集体附近表明星形胶质细胞的局部激活的GFAP阳性星形胶质细胞增加。同样，可以对切片进行Iba1免疫染色，以寻找局部小胶质细胞炎症反应。可以通过观察小胶质细胞和星形胶质细胞的活化以及促炎性标志物包括HLA-DR4α、MHC II和Iba-1的诱导来类似地监测炎症的局部诱导。星形胶质细胞激活可以跟随GFAP表达。可以使用GFAP-tdTom和Cx3cr1-eGFP报告基因小鼠，如果需要，可以对来自年轻和年老小鼠的脑切片进行成像。已知小胶质细胞和星形胶质细胞的激活增加发生在衰老的大脑中，包括人类。然而，迄今为止，尚不知道溶酶体内容物和未消化的溶酶体内容物在多大程度上激活了脑衰老中的局部炎症。本文还确定了星形胶质细胞激活定义为GFAP和IL-6表达与20μm约2个细胞直径之内的p62阳性聚集体之间的统计相关性。同样，p62聚集体簇与小胶质细胞上促炎标记物包括IL-6受体、MHC II和Iba-1的诱导之间存在显著相关性，表明对聚集体有局部炎症反应。

9.实施例9：溶酶体功能的拯救

为了显示NOX抑制可恢复溶酶体功能的功效，将J774A.1细胞用促炎分子LPS处理以削弱溶酶体功能。如图9所示，在用1μg/mL LPS刺激时，p62和NOX 2被上调，表明溶酶体受损。然而，在50μM C3存在下用1gg/mL LPS处理的细胞未显示p62或NOX2的增加，即拯救了溶酶体功能。

C.参考文献

Abd El Mohsen，M，M.，Iravani，M.M.，Spencer.J.P.，Rose，S.，Fahim，A.T.，Motawi，T.M.，Ismail，N.A.，and Jenner，P.(2005).Age-associated changes in proteinoxidation and proteasome activities in rat brain：modulation byantioxidants.Biochem Biophys Res Commun 336，386-391.

Abeliovich，A.&Gitler，A.D.Defects in trafficking bridge Parkinson’sdisease pathology and genetics.Nature 539，207-216，doi：10.1038/nature20414(2016).

Abeliovich，A.&Rhinn，H.Parkinson’s disease：Guilt by geneticassociation.Nature 533，40-41，doi：10.1038/nature 17891(2016).

Abeliovich，A.Parkinson′s disease：pro-survival effects of PINK1.Nature 448，759-760，doi：10.1038/448759a(2007).

Akiyama，H.，Kameyama，M.，Akiguchi，I.，Sugiyama，H.，Kawamata，T.，Fukuyama，H.，

Kimura，H.，Matsushita，M.，and Takeda，T.(1986).Periodic acid-Schiff(PAS)-positive，granular structures increase in the brain of senescenceaccelerated mouse(SAM).Acta Neuropathol 72，124-129.

Ali，S.S.et al.A biologically effective fullerene(C60)derivative withsuperoxide dismutase mimetic properties.Free Radic Bioi Med 37，1191-1202，(2004).

Ali，S.S.et al.Initial evidence linking synaptic superoxide productionwith poor short-term memory in aged mice.Brain Res 1368，65-70，doi：10.1016/j.brainres.2010.11.009(2011).

Ali，S.S.，Hardt，J.I.&Dugan，L.L.SOD activity of carboxyfullerenespredicts their neuroprotective efficacy：a structure-activitystudy.Nanomedicine：nanotechnology，biology，and medicine 4，283-294，doi：10.1016/j.nano.2008.05.003(2008).

Bagh，M.B.et al.Misrouting of v-ATPase subunit V0a1 dysregulateslysosomal acidification in a neurodegenerative lysosomal storage diseasemodel，Nature communications 8,14612，doi：10.1038/ncomms 14612(2017).

Bao，J.X.，Jin，S.，Zhang，F.，Wang，Z.C.，Li，N.，and Li，P.L.(2010).Activationof membrane NADPH oxidase associated with lysosome-targeted acidsphingomyelinase in coronary endothelial cells.Antioxid Redox Signal 12，703-712.

Barth，S.，Glick，D.&Macleod，K.F.Autophagy：assays and artifacts.J Pathol221，117-124，doi：10.1002/path.2694(2010).

Bartlett，B.J.et al.p62，Ref(2)P and ubiquitinated proteins areconserved markers of neuronal aging，aggregate formation and progressiveautophagic defects.Autophagy 7，572-583(2011).

Bedard，K.&Krause，K.H.The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases：physiology and pathophysiology.Physiol Rev 87，245-313(2007).

Bedard，K.，Lardy，B.&Krause，K.-H.NOX family NADPH oxidases：Not just inmammals.Biochimie 89，1107-1112，(2007).

Behrens，M.M.et al.Ketamine-induced loss of phenotype of fast-spikinginterneurons is mediated by NADPH-oxidase.Science 318，1645-1647，doi：10.1126/science.1148045(2007).

Behrens，M.M.，Ali，S.S.，and Dugan，L.L.(2008).Interleukin-6 mediates theincrease in NADPHoxidase in the ketamine model of schizophrenia.J Neurosci28，13957-13966.

Bento，C.F.et al.Mammalian Autophagy：How Does It Work？Annu Rev Biochem85，685-713，doi：10.1146/annurev-biochem-060815-014556(2016).

Bento.C.F.，Ashkenazi，A.，Jimenez-Sanchez，M.&Rubinsztein，D.C.TheParkinson’s disease-associated genes ATP13A2 and SYT11 regulate autophagy viaa common pathway.Nature communications 7，11803，doi：10.1038/ncomms11803(2016).

Bettcher，B.M.et al.Interleukin-6，age，and corpus callosumintegrity.PLoS One 9，e 106521，doi：10.1371/journal.pone.0106521(2014).

Bordi，M.et al.Autophagy flux in CA1 neurons of Alzheimer hippocampus：Increased induction overburdens tailing lysosomes to propel neuriticdystrophy.Autophagy 12，2467-2483，doi：10.1080/15548627.2016.1239003(2016).

Canzoniero，L.M.et al.nNOS(+)striatal neurons，a subpopulation sparedin Huntington’s Disease，possess functional NMDA receptors but fail togenerate mitochondrial ROS in response to an excitotoxic challenge.Frontiersin physiology 4，112，doi：10.3389/fphys.2013.00112(2013).

Chapin，H.C.，Okada，M.，Merz，A.J.，and Miller，D.L.(2015).Tissue-specificautophagy responses to aging and stress in C.elegans.Aging 7，419-434.

Cheng，G.，Cao，Z.，Xu，X.，Meir，E.G.V.&Lambeth，J.D.Homologs of gp91phox：cloning and tissue expression of Nox3，Nox4，and Nox5.Gene 269，131-140(2001).

Chung，W.S.，Clarke，L.E.，Wang，G.X.，Stafford，B.K.，Sher，A.，Chakraborty，C.，Joung，J.，Foo，L.C.，Thompson，A.，Chen，C.，et al.(2013).Astrocytes mediatesynapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways.Nature 504，394-400.

Conti，F.et al.Biological therapies in rheumatic diseases.Clin Ter164，e413-428，doi：10.7417/CT.2013.1622(2013).

Corrada，M.M.，Brookmeyer，R.，Paganini-Hill，A.，Berlau，D.&Kawas，C.H.Dementia incidence continues to increase with age in the oldest old：the90+study.Ann Neurol 67，114-121，doi：10.1002/ana.21915(2010).

Cotter，K.，Stransky，1..，McGuire，C.&Forgac，M.Recent Insights into theStructure，Regulation.and Function of the V-ATPases.Trends Biochem Sci 40，611-622，doi：10.1016/j.tibs.2015.08.005(2015).

Cuervo，A.M.&Macian，F.Autophagy and the immune function in aging.CurrOpin Immunol 29，97-104，doi：10.1016/j.coi.2014.05.006(2014).

Cuervo，A.M.Autophagy and aging：keeping that old broom working，TrendsGenet 24，604-612，doi：10.1016/j.tig.2008.10.002(2008).

Dahal，D.et al.An NIR-emitting lysosome-targeting probe with largeStokes shift via coupling cyanine and excited-state intramolecular protontransfer.Chem Commun(Camb)53，3697-3700，doi：10.1039/c7cc00700k(2017).

Dik，M.G.et al.Seram inflammatory proteins and cognitive decline inolder persons.Neurology 64，1371-1377(2005).

Doehner，J.，Genoud，C.，Imhof，C.，Krstic，D.，and Knuesel，I.(2012).Extrusion of misfolded and aggregated proteins--a protective strategy ofaging neurons？Eur J Neurosci 35，1938-1950.

Doehner，J.，Madhusudan，A.，Konietzko，U.，Fritschy，J.M.，and Knuesel，I.(2010).Co-localization of Reelin and proteolytic AbetaPP fragments inhippocampal plaques in aged wild-type mice.J Alzheimers Dis 19，1339-1357.

Dschida，W.J.&Bowman，B.J.The vacuolar ATPase：sulfite stabilization andthe mechanism of nitrate inactivation.J Biol Chem 270，1557-1563(1995).

Dugan，L.L.etal.IL-6 mediated degeneration of forebrain GABAergicinterneurons and cognitive impairment in aged mice through activation ofneuronal NADPH oxidase.PLoS ONE 4，e5518(2009).

Dugan，L.L.et al.Mitochondrial production of reactive oxygen speciesin cortical neurons following exposure to N-methyl-D-aspartate.J Neurosci 15，6377-6388(1995).

Edgington-Mitchell，L.E.，Bogyo，M.&Verdoes，M.Live Cell Imaging andProfiling of Cysteine Cathepsin Activity Using a Quenched Activity-BasedProbe.Methods Mol Biol 1491，145-159，doi：10.1007/978-1-4939-6439-0_11(2017).

El Chemaly，A.，Nunes，P.，Jimaja，W.，Castelbou，C.，and Demaurex，N.(2014).Hvl proton

channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophagephagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit thedelivery of vacuolar ATPases.J Leukoc Biol 95，827-839.

Feng，Y.，and Forgac，M.(1994).Inhibition of vacuolar H(+)-ATPase bydisulfide bond formation between cysteine 254 and cysteine 532 in subunit A.JBiol Chem 269，13224-13230.

Fiandaca，M.S.，Kapogiannis.D.，Mapstone，M.，Boxer，A.，Eitan，E.，Schwartz，J.B.，Abner，E.L.，Petersen，R.C.，Federoff，H.J.，Miller，B.L.，et al.(2015).Identification of preclinical Alzheimer’s disease by a profile of pathogenicproteins in neurally derived blood exosomes：A case-control study.AlzheimersDement 11，600-607 e601.

Flaig，T.ct al.Tocilizumab-induced pancreatitis：case report and reviewof data from the FDA Adverse Event Reporting System.J Clin Pharm Ther 41，718-721，doi：10.1111/jcpt.12456(2016).

Franceschi，C.&Campisi，J.Chronic inflammation(inflammaging)and itspotential contribution to age-associated diseases.J Gerontol A Biol Sci MedSci 69 Suppl 1，S4-9，doi：10.1093/gerona/glu057(2014).

Freund，A.，Orjalo，A.V.，Desprez，P.Y.&Campisi，J.Inflammatory networksduring cellular senescence：causes and consequences.Trends Mol Med 16，238-246，doi：10.1016/j.molmed.2010.03.003(2010).

Gan-Or，Z.，Dion，P.A.&Rouleau，G.A.Genetic perspectiveon the role of theautophagy-lysosome pathway in Parkinson disease.Autophagy 11，1443-1457，doi：10.1080/15548627.2015.1067364(2015).

Gan-Or，Z.，Dion，P.A.，and Rouleau，G.A.(2015).Genetic perspective on therole of the autophagylysosome pathway in Parkinson disease，Autophagy 11，1443-1457.

Gao，J.et al.Glucocorticoid impairs cell-cell communication byautophagy-mediated degradation of connexin 43 in osteocytes.Oncotarget 7，26966-26978，doi：10.18632/oncotarget.9034(2016).

Garcia-Prat，L.，Martinez-Vicente，M.，Perdiguero，E.，Ortet，L.，Rodriguez-Ubreva，J.，Rebollo，E.，Ruiz-Bonilla，V.，Gutarra，S.，Ballestar，E.，Serrano，A.L.，etal.(2016).Autophagy maintains stemness by preventing senescence.Nature 529，37-42.

Gavilán，E.，Pintado，C.，Gavilan，M.P.，Daza，P.，Sánchez-Aguayo，I.，

A.，and Ruano，D.(2015).Age-related dysfunctions of the autophagy lysosomalpathway in hippocampal pyramidal neurons under proteasome stress.Neurobiologyof Aging 36，1953-1963.

Giuliani，N.et al.Serum interleukin-6，soluble interleukin-6 receptorand soluble gp130 exhibit different patterns of age-and menopause-relatedchanges.Exp Gerontol 36，547-557(2001).

Godbout，J.P.&Johnson，R.W.Age and neuroinflammation：a lifetime ofpsychoneuroimmune consequences.Neurol Clin 24,521-538(2006).

Godbout，J.P.&Johnson，R.W.Interleukin-6 in the aging brain.JNeuroimmunol 147，141-144(2004).

Goetzl，E.J.，Boxer，A.，Schwartz，J.B.，Abner，E.L.，Petersen，R.C.，Miller，B.L.，and Kapogiannis，D.(2015).Altered lysosomal proteins in neural-derivedplasma exosomes in preclinical Alzheimer disease.Neurology 85，40-47.

Goldberg，M.P.，Strasser，U.&Dugan，L.L.Techniques for assessingneuroprotective drugs in vitro.Int Rev Neutrobiol 40，69-93(1997).

Gottlieb，R.A.，Andres，A.M.，Sin，J.&Taylor，D.P.Untangling autophagymeasurements：all fluxed up.Circ Res 116,504-514，doi：10.1161/CIRCRESAHA.116.303787(2015).

Griciuc，A.et al.Alzheimer’s disease risk gene CD33 inhibitsmicroglial uptake of amyloid beta.Neuron 78，631-643，doi：10.1016/j.neuron.2013.04.014(2013).

Guenette，S.Y.(2003).Astrocytes：a cellular player in Abeta clearanceand degradation，Trends Mol Med 9，279-280.

Gurney，M.A.et al.Measuring cardiac autophagic flux in vitro and invivo.Methods in molecular biology 1219，187-197，doi：10.1007/978-1-4939-1661-0_14(2015).

Hall，D.，Han，S.&Dugan，L.L.In vivo optical imaging of dihydroethidiumoxidation in the mouse brain employing fluorescence intensity and lifetimecontrast.(2009).

Harold，D.et al.Genome-wide association study identifies variants atCLU and PICALM associated with Alzheimer’s disease.Nat Genet 41，1088-1093，doi：10.1038/ng.440(2009).

Heid，M.E.，Keyel，P.A.，Kamga，C.，Shiva，S.，Watkins，S.C.，and Salter，R.D.(2013).

Mitochondrial reactive oxygen species induces NLRP3-dependentlysosomal damage and inflammasome activation.J Immunol 191，5230-5238.

Hohn，A.，Konig，J.，and Grune.T.(2013).Protein oxidation in aging andthe removal of oxidized proteins.J Proteomics 92，132-159.

Hohn，A.，Konig，J.，and Jung，T.(2016).Metabolic Syndrome，Redox State，andthe Proteasomal System.Antioxid Redox Signal 25，902-917.

Howcroft，T.K.et al.The role of inflammation in age-relateddisease.Aging(Albany NY)5，84-93，doi：10.18632/aging.100531(2013).

Huang.K.L.e.a.A common haplotype lowers PU.1 expression in myeloidcells and delays onset of Alzheimer’s disease.Nature Neuroscience In Press.，(2017).

Iking-Konert，C.et al.ROUTINE-a prospective，multicentre，non-interventional，observational study to evaluate the safety and effectivenessof intravenous tocilizumab for the treatment of active rheumatoid arthritisin daily practice in Gerrnany.Rheumatology 55，624-635，doi：10.1093/rheumatology/kev372(2016).

Jaishy，B.，Zhang，Q.，Chung，H.S.，Riehle，C.，Soto，J.，Jenkins，S.，Abel，P.，Cowart，L.A.，Van Eyk，J.E.，and Abel，E.D.(2015).Lipid-induced NOX2 activationinhibits autophagic flux by impairing lysosomal enzyme activity.J Lipid Res56，546-561.

Jones.L.et al.Genetic evidence implicates the immune system andcholesterol metabolism in the aetiology of Alzheimer’s disease.PLoS One 5，e13950， doi：10.1371/journal.pone.0013950(2010).

Jordans，S.，Jenko-Kokalj，S.，Kuhl，N.M.，Tedelind，S.，Sendt，W.，Bromme，D.，Turk，D.，and Brix，K.(2009)，Monitoring compartment-specific substrate cleavageby cathepsins B，K，L，and S at physiological pH and redox conditions.BMCBiochem 10，23.

Jucker，M.，Walker，L.C.，Martin，L.J.，Kitt，C.A.，Kleinman，H.K.，Ingram，D.K.，and Price，D.L.(1992)，Age-associated inclusions in normal and transgenicmouse brain.Science 255，1443-1445.

Jucker，M.，Walker，L.C.，Schwarb，P.，Hengemihle，J.，Kuo，H.，Snow，A.D.，Bamert，F.，and Ingram，D.K.(1994).Age-related deposition of glia-associatedfibrillar material in brains of

C57BL/6 mice.Neuroscience 60，875-889.

Jun，G.，Naj，A.C.，Beecham，G.W.，Wang，L.S.，Buros，J.，Gallins，P.J.，Buxbaum，J.D.，Ertekin-Taner，N.，Fallin，M，D.，Friedland，R.，et al.(2010).Meta-analysisconfirms CR1，CLU，and PICALM as alzheimer disease risk loci and revealsinteractions with APOE genotypes.Arch Neurol 67，1473-1484.

Kawahara，T.，Ritsick，D.，Cheng，G.&Lambeth，J.D.Point mutations in theproline-rich region of p22phox are dominant inhibitors of Nox1-and Nox2-dependent reactive oxygen generation.J Biol Chem 280，31859-31869(2005).

Klionsky，D.J.et al.Guidelines for the use and interpretation ofassays for monitoring autophagy.Autophagy 8，445-544(2012).

Klionsky，D.J.et al.Guidelines for the use and interpretation ofassays for monitoring autophagy(3rd edition).Autophagy 12，1-222，doi：10.1080/15548627.2015.1100356(2016).

Knuesel，I.，Nyffeler，M.，Mormede，C.，Muhia，M.，Meyer，U.，Pietropaolo，S.，Yee，B.K.，Pryce，C.R.，LaFerla，F.M.，Marighetto，A.，et al.(2009).Age-relatedaccumulation of Reelin in amyloid-like deposits.Neurobiol Aging 30，697-716.

Kop，W.J.et al.Inflammation and coagulation factors in persons＞65years of age with symptoms of depression but without evidence of myocardialischemia.Am J Cardiol 89，419-424(2002).

Krabbe，K.S.，Pedersen，M.&Bruunsgaard，H，Inflammatory mediators in theelderly.Exp Gerontol 39，687-699(2004).

Kukull，W.A.et al.Dementia and Alzheimer disease incidence：aprospective cohort study.Arch Neurol 59，1737-1746(2002).

Kuo，H.，Ingram，D.K.，Walker，L.C.，Tian，M.，Hengemihle，J.M.，and Jucker，M.(1996).Similarities in the age-related hippocampal deposition of periodicacid-schiff-positive granules in the senescence accelerated mouse P8 andC57BL/6 mouse strains.Neuroscience 74，733-740.Lambert，J.C.et al.Implicationof the immune system in Alzheimer’s disease：evidence from genome-wide pathwayanalysis.Journal of Alzheimer’s disease：JAD 20，1107-1118，doi：10.3233/JAD-2010-100018(2010).

Lambert，J.C.et al.Meta-analysis of 74，046 individuals identifies 11new susceptibility loci for Alzheimer’s disease.Nat Genet 45，1452-1458，doi：10.1038/ng.2802(2013).

Lambeth，J.D.NOX enzymes and the biology of reactive oxygen.Nat RevImmunol 4，181-189(2004).

Lane，N.E.&Yao，W.Glucocorticoid-induced bone fragility.Ann N Y AcadSci 1192，81-83，doi：10.111l/j.1749-6632.2009.05228.x(2010).

Lane，N.E.et al.Glucocorticoid-treated mice have localized changes intrabecular bone material properties and osteocyte lacunar size that are notobserved in placebo-treated or estrogen-deficient mice.Journal of bone andmineral research：the official journal of the American Society for Bone andMineral Research 21，466-476，doi：10.1359/JBMR.051103(2006).

LeBrasseur，N.K.，Tchkonia，T.&Kirkland，J.L.Cellular Senescence and theBiology of Aging，Disease，and Frailty.Nestle Nutr Inst WorkshopSer 83，11-18.doi：10.1159/000382054(2015).

Lefaki，M.，Papaevgeniou，N.，and Chondrogianni，N.(2017).Redox regulationof proteasome function.Redox Biol 13，452-458.

Li，X.，Gulbins，E.，and Zhang，Y.(2012).Oxidative stress triggers Ca-dependent lysosome trafficking and activation of acid sphingomyelinase.CellPhysiol Biochem 30，815-826.

Licastro，F.，Grimaldi，L.M.，Bonafe，M.，Martina，C.，Olivieri，F.，Cavallone，L.，Giovanietti，S.，Masliah，E.，and Franceschi，C.(2003).Interleukin-6 genealleles affect the risk of Alzheimer’s disease and levels of the cytokine inblood and brain.Neurobiol Aging 24，921-926.

Lindmo，K.et al.The PI 3-kinase regulator Vps15 is required forautophagic clearance of protein aggregates.Autophagy 4，500-506(2008).

Lipinski，M.M.，Zheng，B.，Lu，T.，Yan，Z.，Py，B.F.，Ng，A.，Xavier，R.J.，Li，C.，Yankner，B.A.，Scherzer.C.R.，et al.(2010).Genome-wide analysis revealsmechanisms modulating autophagy in normal brain aging and in Alzheimer’sdisease.Proc Natl Acad Sci U S A 107，14164-14169.

Loos，B.，du Toit，A.&Hofmeyr，J.H.Defining and measuring autophagosomeflux-concept and reality.Autophagy 10，2087-2096，doi：10.4161/15548627.2014.973338(2014).

Lu，T.et al.Gene regulation and DNA damage in the ageing humanbrain.Nature 429，883-891(2004).

Lubbe，S.，and Morris，H.R.(2014).Recent advances in Parkinson’s diseasegenetics.J Neurol 261，259-266.

Maggio，M.，Guralnik，J.M.，Longo，D.L.，and Ferrucci，L.(2006).Interleukin-6 in aging and chronic disease：a magnificent pathway.J Gerontol A Biol SciMed Sci 61，575-584.

Manich，G.，del Valle，J.，Cabezon， I.，Camins，A.，Pallas，M.，Pelegri，C.，andVilaplana，J.(2014).Presence of a neo-epitope and absence of amyloid beta andtau protein in degenerative hippocampal granules of aged mice.Age(Dordr)36，151-165.

Mann，D.M.，Yates，P.O.，and Stamp，J.E.(1978).The relationship betweenlipofuscin pigment and ageing in the human nervous system.J Neurol Sci 37，83-93.

Martin，I.＆Grotewiel，M.S.Oxidative damage and age-related functionaldeclines.Mech Ageing Dev 127，411-423(2006).

McAuley，T.，Yap，M.，Christ，S.E.&White，D.A.Revisiting inhibitorycontrolacross the life span：insights from the ex-Gaussian distribution.DevNeuropsychol 29，447-458(2006).

McDonald，J.H.&Dunn，K.W.Statistical tests for measures ofcolocalization in biological microscopy.J Microsc 252，295-302，doi：10.1111/jmi.12093(2013).

McLaughlin，M.&Ostor，A.Safety of subcutaneous versus intravenoustocilizumab in combination with traditional disease-modifying antirheumaticdrugs in patients with rheumatoid arthritis.Expert opinion on drug safety 14，429-437，doi：10.1517/14740338.2015.998198(2015).

Medina，D.L.，Fraldi，A.，Bouche，V.，Annunziata，F.，Mansueto，G.，Spampanato，C.，Puri，C.，Pignata，A.，Martina，J.A.，Sardiello，M.，et al.Transcriptionalactivation of lysosomal exocytosis promotes cellular clearance.Dev Cell 21，421-430.

Mehra，S.et al.Clinical significance of cathepsin L and cathepsin B indilated cardiomyopathy.Mol Cell Biochem 428，139-147，doi：10.1007/s11010-016-2924-6(2017).

Mehrjoo，Z.et al.Association Study of the TREM2 Gene andIdentification of a Novel Variant in Exon 2 in Iranian Patients with Late-OnsetAlzheimer’s Disease.Med Princ Pract 24，351-354，doi：10.1159/000430842(2015).

Menzies，F.M.et al.Autophagy and Neurodegeneration：PathogenicMechanisms and Therapeutic Opportunities.Neuron 93，1015-1034，doi：10.1016/j，neuron.2017.01.022(2017).

Mooijaart，S.P.，Sattar，N.，Trompet，S.，Lucke，J.，Stott.D.J.，Ford，I.，Jukema，J.W.，Westendorp，R.G.，de Craen，A.J.，and Group，P.S.(2013).Circulatinginterleukin-6 concentration and cognitive decline in old age：the PROSPERstudy.J Intern Med 274，77-85.

Nagele，R.G.，D’Andrea.M.R.，Lee.H.，Venkataraman，V.，and Wang，H.-Y.(2003).Astrocytes Naj，A.C.et al.Common variants at MS4A4/MS4A6E，CD2AP，CD33and EPHA1 are associated with late-onset Alzheimer’s disease.Nat Genet 43，436-441.doi：10.1038/ng.801(2011).

Naj，A.C.et al.Effects of multiple genetic loci on age at onset inlate-onset Alzheimer disease：a genome-wide association study.JAMA Neurol 71，1394-1404，doi：10.1001/jamaneurol.2014.1491(2014).

Nemes，Z.，Devreese，B.，Steinert，P.M.，Van Beeumen， J.，and Fesus，L.(2004). Cross-linking of ubiquitin，HSP27，parkin，and alpha-synuclein by gamma-glutamyl-epsilon-lysine bonds in Alzheimer’s neurofibrillary tangles.FASEB J18，1135-1137.

Nezis，I.P.et al.Ref(2)P，the Drosophila melanogaster homologue ofmammalian p62，is required for the formation of protein aggregates in adultbrain.J Cell Biol 180，1065-1071，doi：10.1083/jcb.200711108(2008).

Nixon，R.A.New perspectives on lysosomes in ageing andneurodegenerative disease.Ageing Res Rev 32，1，doi：10.1016/j.arr.2016.11.001(2016).

Nixon，R.A.The role of autophagy in neurodegenerative disease.Nat Med19，983-997，doi：10.1038/nm.3232(2013).

Nurmohamed，M.T.Newer biological agents in the treatment of rheumatoidarthritis：do the benefits outweigh the risks？Drugs 69.2035-2043，doi：10.2165/11318290-000000000-00000(2009).

Pearson，K.Determination of the Coefficient of Correlation.Science 30，23-25，doi：10.1126/science.30.757.23(1909).

Perez，S.E.et al.Hippocampal endosomal，lysosomal，and autophagicdysregulation in mild cognitive impairment：correlation with abeta and taupathology.J Neuropathol Exp Neurol 74，345-358，doi：10.1097/NEN.0000000000000179(2015).

Poulose，S.M.，Bielinski，D.F.&Shukitt-Hale.B.Walnut diet reducesaccumulation of polyubiquitinated proteins and inflammation in the brain ofaged rats.J Nutr Biochem 24，912-919，doi：10.1016/j.jnutbio.2012.06.009(2013).

Qi，Y.et al.Combined small-molecule inhibition accelerates thederivation of functional cortical neurons from human pluripotent stemcells.Nat Biotechnol 35，154-163，doi：10.1038/nbt.3777(2017).

Ray，R.S.，Mujtaba，S.F.，Dwivedi，A.，Yadav，N.，Verma，A.，Kushwaha，H.N.，Amar，S.K.，Goel，S.，and Chopra，D.(2013).Singlet oxygen mediated DNA damageinduced phototoxicity by ketoprofen resulting in mitochondrial depolarizationand lysosomal destabilization.Toxicology 314，229-237.

Reichel，W..Hollander，J.，Clark，J.H.，and Strehler.B.L.(1968).Lipofuscinpigment accumulation as a function of age and distribution in rodent brain，JGerontol 23，71-78.

Reyes，R.C.，Brennan，A.M.，Shen， Y.，Baldwin，Y.&Swanson，R.A.Activation ofneuronal NMDA receptors induces superoxide-mediated oxidative stress inneighboring neurons and astrocytes.J Neurosci 32，12973-12978，doi：10.1523/JNEUROSCI.1597-12.2012(2012).

Riaz，S.，Zeidan，A.&Mraiche，F.Myocardial proteases and cardiacremodeling.J Cell Physiol，doi：10.1002/jcp.25884(2017).

Rodier，F.&Campisi，J.Four faces of cellular senescence.J Cell Biol192，547-556，doi：10.1083/jcb.201009094(2011).

Rubinsztein，D.C.，Marino，G.，and Kroemer，G.(2011).Autophagy andaging.Cell 146，682-695.

Rybicka，J.M.，Balce，D.R.，Khan，M.F.，Krohn，R.M.，and Yates，R.M.(2010).NADPH oxidase activity controls phagosomal proteolysis in macrophagesthrough modulation of the lumenal redox environment of phagosomes.Proc NatlAcad Sci U S A 107，10496-10501.

Saitoh，Y.et al.p62 plays a protective role in the autophagicdegradation of polyglutamine protein oligomers in polyglutamine disease modelflies.J Biol Chem 290，1442-1453，doi：10.1074/jbc.M114.590281(2015).

Salminen，A.，Kaarniranta，K.，Haapasalo，A.，Hiltunen，M.，Soininen，H.，andAlafuzoff，I.(2012).Emerging role of p62/sequestosome-1 in the pathogenesis ofAlzheimer’s disease.Prog Neurobiol 96，87-95.

Schneider，J.L.&Cuervo，A.M.Autophagy and human disease：emergingthemes.Curr Opin Genet Dev 26，16-23.doi：10.1016/j.gde.2014.04.003(2014).

Seidel，K.et al.The p62 antibody reveals various cytoplasmic proteinaggregates in spinocerebellar ataxia type 6.Clin Neuropathol 28.344-349(2009).

Seredenina，T.，Demaurex，N.&Krause，K.H.Voltage-Gated Proton Channels asNovel Drug Targets：From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology.AntioxidRedox Signal 23，490-513，doi：1 0.1089/ars.2013.5806(2015).

Serrander，L.et al.NOX4 activity is determined by mRNA levels andreveals a unique pattern of ROS generation.Biochem J 406，105-114(2007).

Shin，J.(1998).P62 and the sequestosome，a novel mechanism for proteinmetabolism.Arch Pharm Res 21，629-633.

Soontornniyomkij，V.，Risbrough，V.B.，Young，J.W.，Soontornniyomkij，B.，Jeste，D.V.，and Achim，C.L.(2011).Increased hippocarnpal accumulation ofautophagosomes predicts short-term recognition memory impairment in agedmice.Age(Dordr)34,305-316.

Spinas，G.A.，Bloesch，D.，Keller，U.，Zimmerli，W.&Cammisuli，S.Pretreatmentwith ibuprofen augments circulating tumor necrosis factor-alpha，interleukin-6，and elastase during acute endotoxinemia.J Infect Dis 163，89-95(1991).

Stout，M.B.，Justice，J.N.，Nicklas，B.J.&Kirkland，J.L.PhysiologicalAging：Links Among Adipose Tissue Dysfunction，Diabetes，and Frailty.Physiology(Bethesda)32，9-19，doi：10.1152/physiol.00012.2016(2017).

Sun，N.，Yun，J.，Liu，J.，Malide，D.，Liu，C.，Rovira，II，Holmstrom，K.M.，Fergusson，M.M.，Yoo，Y.H.，Combs，C.A.，et al.(2015).Measuring In VivoMitophagy.Mol Cell 60，685-696.

Tang，Q.et al.(2012).Gerontologist 52，290-290.

Tarasoff-Conway，J.M.，Carare，R.O.，Osorio，R.S.，Glodzik，L..，Butler，T.，Fieremans，E.，Axel，L.，Rusinek，H.，Nicholson.C.，Zlokovic，B.V.，et al.(2015).Clearance systems in the brain-implications for Alzheimer disease.Nat RevNeurol 11，457-470.

Taylor CA，G.S.，McGuire LC，Lu H，Croft JB.2017：.Deaths from Alzheimer’sDisease-United States，1999-2014..MMWR Morb Mortal Wkly Rep 66：521-526.(2017).

Tidball，A.M，et al.Genomic Instability Associated with p53 Knockdownin the Generation of Huntington’s Disease Human Induced Pluripotent StemCells.PLoS One 11，e0150372，doi：10.1371/journal.pone.0150372(2016).

Tracy，R，P.Emerging relationships of inflammation，cardiovasculardisease and chronic diseases of aging，Int J Obes Relat Metab Disord 27 Suppl3，S29-34(2003).

Triplett，J.C.，Tramutola，A.，Swomley，A.，Kirk，J.，Grimes，K.，Lewis，K.，Orr，M.，Rodriguez，K，，Cai，J.，Klein，J.B.，et al.(2015).Age-related changes in theproteostasis network in the brain of the naked mole-rat：Implicationspromoting healthy longevity.Biochim Biophys Acta 1852，2213-2224.

Troncoso，J.C.et al.Neuropathology of preclinical and clinical late-onset Alzheimer’s disease.Ann Neurol 43，673-676，doi：10.1002/ana.410430519(1998).

U.S.Census Bureau DIS.2012 National Population Projections：SummaryTables.Available at：Accessed May 6.(2017.).

Walston，J.et al.Research agenda for frailty in older adults：toward abetter understanding of physiology and etiology：summary from the AmericanGeriatrics Society/National Institute on Aging Research Conference on Frailtyin Older Adults.J Am Geriatr Soc 54，991-1001(2006).

Wang，M.，Song，H.，and Jia，J.(2010).Interleukin-6 receptor genepolymorphisms were associated with sporadic Alzheimer’s disease in ChineseHan.Brain Res 1327，1-5.

Wendeln，A.C.et al.Innate immune memory in the brain shapesneurological disease hallmarks.Nature，doi：10.1038/s41586-018-0023-4(2018).

Westhoff，D.et al.Preoperative cerebrospinal fluid cytokine levels andthe risk of postoperative delirium in elderly hip fracture patients.JNeuroinflammation 10，122，doi：10.1186/1742-2094-10-122(2013).

Wilcock，D.M.，Munireddy，S.K.，Rosenthal，A.，Ugen，K.E.，Gordon，M.N.，andMorgan，D.(2004).Microglial activation facilitates Abeta plaque removalfollowing intracranial anti-Abeta antibody administration.Neurobiol Dis 15，11-20.

Wu，X.et al.IL-4 administration exerts preventive effects viasuppression of underlying inflammation and TNF-alpha-induced apoptosis insteroid-induced osteonecrosis.Osteoporosis international：a journalestablished as result of cooperation between the European Foundation forOsteoporosis and the National Osteoporosis Foundation of the USA 27，1827-1837，doi：10.1007/s00198-015-3474-6(2016).

Wyss-Coray，T.，Loike，J.D.，Brionne，T.C.，Lu，E.，Anankov，R.，Yan，F.，Silverstein，S.C.，and Husemann，J.(2003)，Adult mouse astrocytes degade amyloid-βin vitro and in situ.Nature Medicine 9，453-457.

Xia，X.et al.Glucocorticoid-induced autophagy in osteocytes.Journal ofbone and mineral research：the official journal of the American Society forBone and Mineral Research 25，2479-2488，doi：10.1002/jbmr.160(2010).

Xu，M.et al.JAK inhibition alleviates the cellular senescence-associated seeretory phenotype and frailty in old age.Proc Natl Acad Sci USA112，E6301-6310，doi：10.1073/pnas.1515386112(2015).

Yao，W.et al.Sclerostin-antibody treatment of glucocorticoid-inducedosteoporosis maintained bone mass and strength.Osteoporosis international：ajournal established as result of cooperationbetween the European Foundationfor Osteoporosis and the National Osteoporosis Foundation of the USA 27，283-294，doi：10.1007/s00198-015-3308-6(2016).

Yao，W.，Dai，W.，Jiang，J.X.&Lane，N.E.Glucocorticoids and osteocyteautophagy.Bone 54，279-284，doi：10.1016/j.bone.2013.01.034(2013).

Ye，S.M.&Johnson，R.W.Increased interleukin-6 expression by microgliafrom brain of aged mice.J Neuroimmunol 93，139-148(1999).

Yerbury，J.J.，Ooi，L.，Dillin，A.，Saunders，D.N.，Hatters，D.M.，Beart，P.M.，Cashman，N.R.，Wilson，M.R.，and Ecroyd.H.(2016).Walking the tightrope：proteostasis and neurodegenerative disease.J Neurochem 137，489-505.

Yin，K.J.，Cirrito，J.R.，Yan，P.，Hu，X.，Xiao，Q.，Pan，X.，Bateman，R.，Song，H.，Hsu，F.F.，Turk，J.，et al.(2006).Matrix metalloproteinases expressed byastrocytes mediate extracellular amyloid-beta peptide catabolism.J Neurosci26，10939-10948.

Yip，Y.P.，Capriotti，C.，Magdaleno，S.，Benhayon，D.，Curran，T.，Nakajima，K.，and Yip，J.W.(2004).Components of the reelin signaling pathway are expressedin the spinal cord.J Comp Neurol 470，210-219.

Zhang，J.et al.Microglial CR3 activation triggers long-term synapticdepression in the hippocampus via NADPH oxidase.Neuron 82，195-207，doi：10.1016/j.neuron.2014.01.043(2014).

Zhang，X.，Cheng，X.，Yu，L.，Yang，J.，Calvo，R.，Pamaik，S.，Hu，X.，Gao，Q.，Yang，M.，Lawas，M.，et al.(2016).MCOLN1 is a ROS sensor in lysosomes that regulatesautophagy.Nature communications 7，12109.

Zhu，Y.et al.Inflammation and the depot-specific secretome of humanpreadipocytes.Obesity(Silver Spring)23，989-999，doi：10.1002/oby.21053(2015).

Claims (20)

1.一种在对象中治疗神经退行性疾病、纤维化疾病或风湿病的方法，其包括向所述对象施用治疗剂；其中所述治疗剂抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)-氧化酶(NOX)或下游NOX效应物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、1型脊髓小脑共济失调、年龄相关性痴呆、路易体痴呆、可能的血管性痴呆、额颞痴呆和肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述NOX是选自NOX1、NOX2、NOX3、NOX4或NOX5的NOX亚型。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂是信号转导物和转录激活因子3(STAT3)抑制剂，其中所述治疗剂减少STAT3介导的NOX活化，从而引起NOX抑制。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂是抗IL-6抗体或抗炎剂，并且其中所述治疗剂减少IL-6介导的NOX活化，从而引起NOX抑制。

6.根据权利要求1所述的方法，其中下游NOX效应物包括活性氧物质、过氧化氢或超氧化物。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是小分子、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、肽或蛋白质。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗剂是包含二亚苯基碘

罗布麻宁、2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲基氨基)苯基]-5-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6-二酮(GKT-831)、雷帕霉素、歧化酶、C60的丙二酸衍生物、C60的乙酸衍生物或其任意组合的小分子。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在神经退行性疾病的特征性病理变化发作之前施用所述药剂。

10.一种减少对象中年龄依赖性溶酶体损伤和/或增加自噬起始的方法，其包括向所述对象施用治疗剂；其中所述治疗剂抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)-氧化酶(NOX)或下游NOX效应物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述溶酶体损伤存在于海马锥体神经元和小清蛋白中间神经元中。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述NOX是选自NOX1、NOX2、NOX3、NOX4或NOX5的NOX亚型。

13.根据权利要求10所述的方法，其中下游NOX效应物包括活性氧物质、过氧化氢或超氧化物。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗剂是信号转导物和转录激活因子3(STAT3)抑制剂，其中所述治疗剂STAT3介导的NOX活化，从而引起NOX抑制。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗剂是抗IL-6抗体或抗炎剂，并且其中所述治疗剂减少IL-6介导的NOX活化，从而引起NOX抑制。

16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是小分子、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、肽或蛋白质。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述药剂是包含二亚苯基碘

罗布麻宁、2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲基氨基)苯基]-5-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6-二酮(GKT-831)、雷帕霉素、歧化酶、C60的丙二酸衍生物、C60的乙酸衍生物或其任意组合的小分子。

18.一种改善对象的溶酶体功能的方法，其包括向所述对象施用治疗剂；其中所述治疗剂减少活性氧物质(ROS)、过氧化氢或超氧化物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中通过抑制ROS、过氧化氢或超氧化物来改善溶酶体功能的药剂是小分子、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、肽或蛋白质。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述药剂是包含歧化酶、C60的丙二酸衍生物、C60的乙酸衍生物或其任意组合的小分子。

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