JPH04503900A - フレーバー組成物およびその生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、植物が産生ずるフレーバー組成物とその生産方法に関し、特に、植物 細胞を培養することによって産生されるバニラのフレーバー組成物に関する。

２、引用文献 Ａ？−Ａｂｔａ、３．ら、Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄ、４２：　２３６．　（１９７ ９年）。

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３、発明の背景 天然のバニラは、バニラ植物の９通常バニラ・フラグランス（Ｖａｎｉｌｌａ　 ｆｒａｇｒａｎｓ）の豆から抽出されるフレーバー成分の複合（（：ｏｍｐ　ｔ ｅｘ）混合物である。その抽出工程には次の工程が含まれる。すなわち、最初に 熟成工程が行われ、その間に頁中のバニラの前駆体であるグリコシド類が分解し て、天然のバニリン（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒド）と、類 縁のフレーバー成分が形成され１次に１回以上のアルコール抽出を行って、比較 的疎水性のフレーバー成分を豆がら−取り出す。これらの各工程は、比較的時間 がかかり、費用がかかる。例えば、熟成工程は、一般に、豆の天日乾燥と醗酵を 交互に行い、続いてさらに倉庫内での熟成と脱水を行うことによって実施される 。合計４ケ月間にいたる熟成期間が。

適正なフレーバーを得るために、そしてかびを防止するのに。

水分を減少させるために必要である。熟成に続いて、豆は抽出するために粉砕さ れる。最高の結果が得られるのは、漸次希釈した一連のアルコール溶液で粉砕し た豆を抽出した場合である。各抽出には、最低約５日間必要である。

バニラ豆の栽培、収穫および抽出は、比較的費用が多くかかるので、市販されて いるほとんどのバニラフレーバー“抽出物”は合成バニリンである。これは木材 バルブのリグニンまたはチョウジ油から製造されている。しかし、バニラフレー バーの市場の約９０％を占める合成フレーバーは、天然のバニラ抽出物のフレー バーと香りの品質に寄与する多くの２次成分を欠いている。

複合バニラフレーバー組成物の可能性のある代替起源は。

培養で増殖される植物の細胞もしくは組織である。細胞もしくは組織の培養物か ら、植物のフレーバー成分を含む、二次的な植物産物を得る可能性は、すでに提 案されている（Ｓｔａｂａ；Ｚｅｎｋ；　Ｄｏｕｇａｌｌ；　Ｙｅｏｍａｎ；お よびＣｏ１１ｉｎ）　。しかしこの方法は。

培養するのに適切な細胞もしくは組織材料を得るのに問題があるので制限されて いる。特に、レモン、ハツカ、アボガド。

ならびにアニス、フェンネルおよびセージのような香料植物のようなフレーバー 精油を産生ずる種々の植物の研究は、多分未分化の植物組織が油泡を欠いている こと、および／または必須の代謝前駆体が産生されないことが理由で、未分化の 植物組織は天然の精油を産生できないということを示している（コリン）。培養 された香料植物の組織では、根や苗条に再分化した後に、フレーバー成分は再出 現した（Ｂｅｃｋｅｒ）。

セロリとタマネギの両者では、再分化とともにフレーバー成分が再出現した（Ａ Ｉ−Ａｂｔａ；　５ｅｌｂｙ；　Ｔｕｒｎｂｕｌｌ）。

上記の問題に関連して、培養によって容易に大きくなることができ、高収率で二 次産物を産生じ、長期間の培養に対して安定な細胞や組織材料を得ることが困難 である。特に分化した培養物、または部分的に分化した培養物は、一般に培養で はうまく増殖しない。このような培養物が得られる場合でも、二次産物の形成の レベルは、天然植物と比べて全く低いので、天然フレーバーの抽出法に対する競 争力は劣っている。

いくつかの植物のタイプ、特にランは、細胞増殖を続けるとともに微細の懸濁物 を産生ずることができる。真の未分化のカルスを容易に形成しないということに は留意しなければならない。バニラの植物はランの一種であるが、この植物から 懸濁物を形成することができる安定な未分化のカルスの形成はまだ報告されてい ない。

細胞培養物から容易に分離できる形態でフレーン〈−物質を得る場合に伴う問題 によって細胞培養法は制限を受けている。

い（つかの場合、フレーバー成分は、培養細胞からは分泌されず、そのためその フレーバー成分は細胞もしくは組織物質から収穫しなければならない。米国特許 第３．７１０．５１２号は。

培地中に懸濁された培養植物組繊細胞からカンゾウ抽出物様物質を製造する方法 を、実施例として記載している。この特許では、培養混合物を沸騰させて細胞か ら化合物を放出させ。

沸騰させた物質を濾過して細胞の砕片を除き、濾液を濃縮することによって、フ レーバー組成物が抽出される。細胞が失われるという理由およびフレーバー物質 を細胞抽出物質の全体から精製しなければならないという理由で、生成物の抽出 は非能率的であることは明らかである。

要約すると、植物の細胞もしくは組織の培養でフレーバー・成分が得られる可能 性が研究されているが、（ａ）培養で長期間にわたって容易に増殖でき、かつ（ ｂ）培地から単離できる形態で所望のフレーバー成分を分泌できる植物の細胞も しくは組織の物質を得ることが困難なために、この方法は厳しく制約されている 。

４、発明の要約 本発明の一般的な目的は、培養でフレーバー成分を産生じ。

分泌できる植物細胞を提供することである。

本発明のさらに特定の目的は、複合バニラフレーバー組成物を産生じ分泌するよ うな細胞を提供することである。この発明に関連する目的は、培養で長期間増殖 できて、かつフレーバー成分を、培地中に容易に単離可能な形態で産生じ分泌す るカルス細胞を得る方法を提供することにある。

この発明のさらに他の目的は、バニラフレーバー成分の効率的な生産に用いる植 物細胞培養系を提供することである。

また、細胞培養で産生される新規のバニラフレーバー組成物を提供することは、 この発明のもう一つの目的である。

本発明には、１つの態様として、バニラの植物組織物質由来で、植物液体培地中 で懸濁物として増殖する能力について選択されたカルス細胞によって培養で産生 されるバニラフレーバー組成物が含まれる。このカルス細胞は、バニラフレーバ ー成分を培地へ分泌することを促進する条件下で培養され。

次いで１分泌されたフレーバー成分が、培地がら分離される。

の成長点から採取した組織セグメントを、まず植物成長ホルモンの存在下で固体 支持体上で培養し１次に１部分的に分化したカルス様構造を示す組織セグメント を選択することによって調製することができる。

これらの構造物からの真のカルスが形成されるということは、きわめて低い頻度 でしか起らないので、このカルス様組織に、この発明の一つの特徴にしたがって 、環境ストレスを受けさせる。したがって１分化した構造物、または部分的に分 化した構造物を、長期間（例えば、１〜２ケ月間）ガス交換を制限した液体培地 に沈め９次に１組織セグメントを、適当を成長ホルモンを含有する固体寒天培地 にプレートアウトすることによって、バニラ属の種由来の真のカルス細胞が得ら れる。得られたカルス物質を次に破砕し、液体培地中に懸濁させながら培養する 。直径が１〜６ｍｍの細胞の塊が形成される。液体培養物中で急速に増殖する性 質を有する微細な懸濁物は、＠細な細胞凝集体を連続的に選択して移動させるか 。

または液体培地中のホルモンを操作することによって産生させることができる。

これらの細胞は、バニラフレーバーを産生じ、液体培地中に分泌することができ る。

由来のもので、　ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）の受託番号第４０３５４号の株の特性をもっている。細胞 は、高バニリン産生量を得るために１例えば固体寒天培地上にプレートすること によってさらに選択されうる。

この発明の他の態様によれば、フレーバー成分を培地から連続的に取出すことに よって、バニラフレーバーの産生が細胞培養物中で促進されることが見出された 。この処理は、フレーバー成分を吸着する。フェノール樹脂もしくは活性炭のよ うな吸着剤を、培地と接触させることによって効率的に実施することができる。

フレーバー成分は吸着剤からは容易に抽出することができる。

この発明によって産生された１つのバニラフレーバー組成物は、バニリルアルコ ール、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、４−ヒドロキシベンジルアルコ ール、および４−ヒドロキシベンズアルデヒドの合計量に対するバニリンの比率 が、バニラの豆から得た天然のバニラ抽出物の上記比率よりかなり大きい。また この組成物は、メタノール／酢酸勾配液で溶出するＨＰＬＣカラムでバニリンよ り後に溶出するフレーバー成分の合計量に対するバニリンの比率により特徴づけ られる。そしてこの比率はバニラの豆から得た天然のバニラ抽出物の比率よりか なり小さい。

他の態様において、この発明には、（ａ）細胞培養で増殖することができ、（ｂ ）細胞培養で選択された植物フレーバー成分を産生じて分泌し、（Ｃ）好ましく は未分化であるカルス細胞が含まれる。バニラ植物組織物質由来のカルス細胞の １つの態様では、細胞培養で分泌されたフレーバー物質の量は９分泌されたフレ ーバー物質が産生さるときに物理的な吸着より培地から取り出すことによって増 大する。代表的なバニラ植物カルス細胞は、　ＡＴＣＣ寄託番号第４．０３５４ 号の特性を有する。

またこの発明には、植物フレーバー組成物の生産方法と植物フレーバー組成物を 生産する細胞培養系が含まれる。この培養系には、細胞の増殖とフレーバー成分 の産生が起こる培養チェンバーと、フレーバー成分を培地から抽出する別の抽出 チェンバーとを備え、後者の抽出は、培養チェンバーからの培地を抽出チェンバ ー内の吸着剤を通じて循環させることによって行われる。細胞は培養チェンバー 内に残しておくのが好ましく７例えば多孔性物質に細胞を固定化して行われる。

本発明の上記およびその他の目的と特徴は、この発明の以下詳細な説明を、添付 図面を参照して読めば、より一層明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 第１Ａ〜ＩＥ図は、液体培養で、バニラフレーバー成分を産生じ分泌することが できるカルス細胞粒子を生産するのに利用する植物組織操作工程を示す。

第２図は、この発明の１つの態様による。バニラフレーバー成分の生産に用いら れる反応器系の概略図である。

第３Ａ図と３Ｂ図は、それぞれ、この発明のバニラフレーバー成分と、バニラ豆 から得た天然のバニラ抽出物のＨＰＬＣりロマトグラムである。

第４図は、培地の組成と活性炭濃度との相関関係として。

バニラの懸濁培養物によるバニリン産生量の時間経過を示す。

下記のＡ項と実施例１と２とは、この発明の新規のカルス誘導法による。滅菌植 物の成長中の根の先端からのカルス細胞の調製を示す。Ｂ項と実施例３には、滅 菌したバニラ豆からのカルス細胞の調製が記載されている。高生産性の細胞の選 択法は、０項で検討されている。

種がカルス細胞の調製に使用できるが、ブイ・フラグランスとブイ・フィアンタ とが好ましい。これらの植物は、ｔｌ、Ｓ、Ｄ。

Ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ　（プエルトリコ）またはサンフランシ スコ州立大学のような商業的供給先から入手できる。

その上、この発明を裏付けるために実施し、実施例１３に記載した試験は、ある 種の果物を産生ずる植物由来の組織も。

バニリンと類縁フレーバー成分を培養で産生ずることを示した。

これらの生成物は、桃、いちご、ぶどう、りんごおよびアンズの植物の発育性（ Ｖｅｇｅｔａｔ　１ｖｅ）部分および非発育性部分由来のカルス組織の培養物中 に観察された。

一般に、これらの果物産生植物由来のカルス物質は、バニラ植物からカルスを得 るために本願で用いるカルスストレス工程を必ずしも含まない通常の方法で得る ことができる。したがって、この発明には、さらに、果物産生植物由来のカルス を培養することによるバニリンおよび類縁生成物の産生量が含まれる。

滅菌された。細菌なしのバニラ植物を得るには、植物は。

実施例１に記載したような制御された温室条件下で栽培して成熟させる。大きく なった葉を取除いた植物から採取した発育技（ｓｈｏｏｔ）を滅菌し、適切な増 殖培地と抗生物質を含有する寒天プレート上に繰返し移しかえて培養した。汚染 の徴候を全く示さない外植片を、外来公序（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ ）の形成を促進する条件下で増殖させる。この方法によって約８０％の細菌なし の外植片が得られたが、この方法の詳細を実施例１に示す。

この発明によるカルス細胞を得る１つの方法を実施例２に詳述し、第１図に示す 。この方法では、気根の先端を上記滅菌外植片から切取り（第１Ａ図）、滅菌し 、３〜４ｍｔｎの根の切片に切断し１次いで１選択された成長ホルモンを含有す る固体寒天培地上で、別々に培養される。最適培地には、２．４−ジクロロ酢酸 ＜２．４−〇）とベンジル酢酸（ＢＡ）を各１　ｐｐｍずつ補充したＭｕｒａｓ ｈ　ｉｇｅ−３ｋｏｏｇ　（ＭＳ）培地（Ｄｏｄｄｓ）を含有している。

根の切片を同じ培地に２〜３度移し変えて、カルスの形成についてセグメントを 検査した。このカルスの形成は、第１Ｂ図に示すように、セグメントの切断面に 不定形の細胞の塊が形成することによって明らかにされる。一般に、この方法で 処理した根の切片の０．１％未満が真のカルス形成の証拠を示した。

上記の根の切片から真のカルスが形成される頻度を充分に改善するために、カル ス様膨張またはカルス様構造を有する根の切片を長期間（例えば１〜２ケ月間） 、所定の組成の液体培地内に沈める（第１Ｃ図）。この期間２組織の増殖はごく わずかかまたは全くない。この物質を類似の組成の固体培地上にプレートアウト すると、真の未分化カルスが形成される（第１Ｄ図）。したがって真のカルス形 成の頻度が０．１％未満から１００％まで改善される。

上記の液体内に沈めた段階（第１Ｃ図）と、この段階に続いて固体培地に移し変 える場合（第１Ｄ図）に用いる代表的な培地の組成は、実施例２に記載されてい る。成長ホルモン混合物例としては、ｌｐｐｍの２．４−〇とＢＡを含有してい る。

気体の移送を制限した液体内浸漬法（ｌｉｑｕｉｄ　ｓｕｂｍｅｒｇｅｎｃｅ） は２分化されて組織化した植物組織を脱分化させるストレス刺激であることに留 意すべきである。このような反応を誘導する可能性のある他の刺激には、液体内 に沈めた段階と組合わせて用いられる場合、または別々に用いられる場合２温度 ショックと栄養ストレスが含まれる。

液体培地内で、活発に分裂する細胞培養物を得るために。

上記のカルスも比較的小さな細片に切り刻むなどによって砕き２次いで固体培地 培養に用いたような液体増殖培地内に懸濁させ（第１Ｅ図）、カルスが徐々に、 一般に５〜２０の細胞を有する小さな多細胞の塊に変化するまで、上記細片を撹 拌しながらインキュベートする。この段階での目的は、細胞のバイオマスを急速 に増大させることであるから、その栄養培地は十分な炭素と窒素源と、前記の２ ．４−ＤとＢＡのような成長ホルモンのオーキシンとサイトカイニンとを含有し ている。

得られた細胞を、対数増殖期の最後に至るまで、一般に細胞濃度が約７〜８ｇ／ １２になるまで、標準の植物培養条件下で培養する。得られた細胞を、蛍光染料 前駆体の取り込みと開裂によって細胞生存度について試験する。約２５％を上回 る細胞が生存している場合は、細胞は遠心分離によって減少させて、約２〜３　 ｇ　／　（！の濃度で、新しい増殖培地に再懸濁される。この方法で調製した１ つの細胞系は、米国、メリーランド州、ロックビルにある Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに、受託 番号ＡＴＣＣＮｎ４０３５４として寄託されている。

この方法で得られた細胞は、（ａ）培養によって急速な細胞増殖をすることと、 （ｂ）光学顕微鏡による検査で観察した場合。

同定可能な分化した細胞構造を欠いていることから、未分化細胞に分類される。

（以下余白） Ｂ１種子からのカルスの調製 上記の種を含むバニラ植物類からの豆は、本発明の方法に適切なものであり、上 記名称のソースから得ることができる。

まず豆を滅菌し、半分に切断し、実施例４に使用されているような適切な発芽寒 天培地上で増殖させる。これらの種子の一部、一般に約５〜１０％が発芽する。

種子の一部の発芽は。

胚が生成し次いで円錐形のプロトコーム（ｐｒｏｔｏｃｏｒｍ）が生成すること が証拠である。

発芽した種子を、実施例４に記載したような適切なホルモンを補充した増殖培地 を含有する新鮮な寒天板に移して連続的に増殖させると、胚の表皮細胞から形成 された多数の仮根と、円錐形のプロトコームの先端に葉の原子細胞が生成する。

葉の原子細胞と仮根の先端との両者のセグメントを、上記Ａ項に記載したのと類 似の培地を含有する寒天プレート上で、別々に培養する。

組織片を、各々、寒天培地上で３〜４週間、２〜３世代培養を行い、４〜８週間 液体培地内に沈め、次いで類似の組成の個体培地にプレートバックして真のカル スを形成させる。

得られたカルスをはがしとって、上記のような植物液体増殖培地中で直接培養す る。あるいは、細胞の増殖が遅い場合、カルスのもろさは、中間の液体培養段階 と固体培地培養段階によって一層改善される。活発に増殖しているカルス細胞を 液体培養すると（懸濁培養と呼称する）、定常期まで増殖を行い、上記のように 細胞生存度についての試験を行う。生成細胞の培養物を、液体培地内で所望の細 胞密度になるまで継代培養する。

Ｃ０高フレ一バー成分産生体の選択 上記の産生されたカルス細胞は、バニリンおよび／またはその他の選択されたバ ニラフレーバー成分の高産生体を得るためにさらに選択される。選択法は、選択 されたフレーバー成分、例えばバニリンを同定するために放射能標識抗体法もし くは蛍光標識抗体法を用いる公知のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法（Ｗｅｉ ｌｅｒ）による方法である。この方法では、フレーバー成分は、例えばキーホー ルリンベットヘモシアニンのような担体タンパクに結合され、接種された動物内 に抗体を誘発するのに用いられ、上記アッセイ用試薬のひとつを形成する血清抗 体画分が得られる。第２の試薬は、第１試薬の抗体に対して特異的な、蛍光標識 をつけた抗１ｇＧ抗体である。したがって血清抗体画分がヤギから得られる場合 は、第２試薬、は、標識された抗ヤギＩｇＧ抗体である。この第２試薬は市販さ れている。

アッセイの手順において、上記の細胞または細胞の塊は、第■章で検討される、 バニリン産生用の適切な栄養素を含有する固体寒天培地上にプレートされる。プ レート上で１〜２日間培養した後、細胞の塊を上記の第１試薬の血清抗体と反応 させて、抗体を、プレートされた細胞に、細胞が生成したバニリンの量に比例し て結合させる。第２試薬の蛍光標識抗体を細胞に添加すると、蛍光タグを有する バニリン産生体に標識がつく。高産生体は、高蛍光レベルで同定される。

他の種類の細胞選択は、寒天プレート上で、バニリンもしくは他のバニラ類縁生 成物を直接検出して行われる。バニラの好ましい１つの検出法は、バニラのフラ ボノイド類についての試験法を変形した方法によるものである。酸性溶液で、バ ニラをプロトン化して弱い電子性ラジカルを形成させる。

このラジカルは、カテキンのようなフラボノイドとそのリングの６もしくは８位 で反応して、脱水反応によって赤色もしくはピンク色になる化合物を生成するこ とができる（Ｓａｒｋａｒ）。

このアッセイは、本発明に利用される。すなわちまず細胞の塊を、適切な濃度で 、固体寒天栄養培地（下記定義のもの）上にプレートし、次にバニリン産生の条 件下で細胞を培養させて行われる。１〜２日間の培養期間の後、プレートを、濾 紙にプロットして細胞生成物を移す。次いでこの濾紙に、産生溶液のカテキンを 含有するカテキン試薬をスプレーし、約８０℃以下の温度まで加熱乾燥する。脱 水されて濾紙上の赤色スポットの強さが、対応する細胞の塊によるバニリン産生 の程度を示す。次いで、最高のバニラ産生量であると同定されたスポットを寒天 プレートから採取し、さらに増殖および／または細胞選択を行う。

上記の細胞選択法は、ツマクローナル差異によって得られる、または化学的にも しくは放射能で誘発させる突然変異誘発法や特異的な生化学的選択ルートによっ て人工的に誘発された、天然の高バニラフレーバー産生変異体を検出するのに用 いることができる（Ｚｅｎｋ、　Ｗｉｄｈｏｌｍ）。

バニラフレーバー組成物を生産するために、上記のカルス細胞を、バニリンの産 生量を最大にし、および／またはバニリン：１種以上のその他のバニラフレーバ ー成分の好ましい比率が得られるように選択された条件下で、液体培地内で培養 する。所望のバニラ組成物の収率を改善するために調節できる培地中の主な変量 は（ａ）栄養素、（ｂ）植物ホルモンおよびバニラ成分の前駆体である。培養に おける二次的な植物産物の形成の論題を概説する文献は、培養産生に影響する因 子のより詳細な考察がなされ参照することができる（Ｃｏｌｌｉｎｓ、　Ｄｏｄ ｄｓ）。

培地に存在する栄養素には、炭素源、窒素源、主要な塩類、少量の塩類、ビタミ ン類およびホルモン類が含まれる。これらの栄養素は、通常の植物組織培地によ って供給される栄養素であってもよい。バニリン産生は、上記培地の存在下で起 こるが、好ましい産生培地は、炭素源、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムを 除いて、すべての栄養素を制限するかまたは排除している（これを最少培地と呼 ぶ）。窒素のようないくつかのかぎ栄養素の利用を制限することは、細胞の増殖 を阻害する効果があるので、細胞の資源は細胞増殖だけについやされる。同時に 、バニラフレーバー成分は窒素を含有しないので、所望の成分の産生は阻害され ない。

所定の培地内の炭素源の濃度と品質も、バニラフレーバーの産生に影響する。グ ルコース、スクロース、フルクトースまたはマルトースのようないくつかの炭素 源は、細胞増殖、または組合せた細胞の増殖およびバニラフレーバーの産生に好 ましく、一方リボース、ガラクトース、マンノースおよびキシロースのような他 のものは、増殖しない細胞からのバニラフレーバーの産生に対して好ましいもの である。

バニラ成分の生産と組成に対する植物ホルモンの影響は通常の方法で知ることが できる。本発明を裏付けるために行われる実験は、カルス細胞の産生と増殖に用 いられる２、　４−ＤとＢＡを含有するホルモン混合物が、培地でのバニラフレ ーバーの産生に適切なものであることを示している。他の好ましいホルモン組成 物を確認するために、ホルモン混合物は、既存の個々のホルモンを、１つ以上の 補助的な植物ホルモンで補充したりまたは取替えて系統的に調節することができ る。例えば２．４−Ｄは、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）などのオーキシン類 で取替えることができる。同様にＨＡは、カイネチン、ゼアチンなどのシトキニ ン類で置換できる。ジベレリン類とエチレンを含むその他の植物ホルモンの影響 は同様にして検査することができる。

細胞を、変化させたホルモン培地で２〜３世代世代基養させた後、その細胞を、 選択した期間、一般に７〜１４日間増殖させ、次いで゛細胞の増殖と、バニリン および／または選択されたバニラフレーバー成分の産生について検査される。な おＨＰＬＣ法によるバニラフレーバー成分の産生についての検査については以下 に詳細に述べられ、実施例５に記載されている。

ホルモン類が、細胞増殖には必須のものであり、細胞増殖とフレーバー産生とを 組合せた系でのバニラフレーバー成分の量と組成に対して影響することは認識す べきである。しかし、細胞増殖とバニリン産生を分離している系では、増殖培地 中のホルモンの性質は、その後の産生培地中のバニラフレーバーの組成に影響す る。最終産生培地自体、ホルモンの補充を必要とせず、先に示したように、糖（ 炭素源）、塩（塩化ナトリウム）および塩化カルシウムの混合物であってもよい 。

バニラ成分産生に影響する第３の因子は、培地内のバニラ成分前駆体の性質と濃 度である。

ヒドロシキミ酸、バニリルアルコールが含まれ、これらは遊離形もしくはグリコ ジル化化合物である。また細胞培養法は。

−即時型前駆体もしくは代謝阻害剤を培地に添加することによって９選択された バニラフレバー成分の誘発もしくは阻害もそれぞれ調べることができる。

温度、光、　ｐＨおよび基体混合物も、バニラフレーバーのレベルもしくは組成 を変えるために変化させることができることが分かる。

要するに１本発明が、植物抽出法をまさる利点は、培養条件を容易に操作し、フ レーバー組成物の純生産量および／または濃度を最適化できることである。

Ｂ、フレーバー成分の抽出 上記のように、カルス細胞は、液体培養法で、培地に、所望のフレーバー成分を 産生じ分泌し、成分が培養細胞のロスなしで抽出され、必要な精製が最小限にな る。本発明の他の重要な態様によれば、フレーバー成分が産生されるとすぐに吸 着させることによって培地からこれを取出すと、バニラ成分が著しく促進される ということが発見されたのである。フレーバーを培養物から連続的に取出した時 に、一層大量の産生が観察されるのは、一部は、産物が培地内で不安定なこと。

および産物合成に対するフィードバック阻害の除去とが原因である。培養法でフ レーバー成分を除去する好ましい方法は。

バニラフレーバー成分を選択的に吸着する活性炭もしくは疎水性樹脂のような吸 着剤と培地を連続的に接触させる方法である。

成分抽出に用いる適切な樹脂には、バニラフレーバー成分を吸着することができ る無極性フェノール基を有する。　ＸＡＤ−４およびＸＡＤ−７（ＰＡ、ペンシ ルヴエニア州、フィラデルフィア。

Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａｓｓ社）のような高分子の疎水性吸着剤が含まれる。各 種発売元由来の活性炭も、バニリンと他のバニラフレーバー成分の蓄積量が大き く増大することになる優れた吸着剤である。

実施例８と９は、塩類、ビタミン類、ホルモン類、ｖｒｉ量栄養素および栄養素 の不足した最少培地で十分補足された完全培地での、バニラフレーバー成分の産 生量に対する活性炭の影響を示す。

最も単純な形態は、樹脂もしくは活性炭が培養反応容器に入っている形態である 。培養後、樹脂ビーズを蒸留水で数回洗浄し１次いでアルコール溶液、一般に５ ０％のアルコール溶液で抽出し、バニラフレーバー成分を取出す。あるいは、樹 脂をカラムに充填し１次いでフレーバー成分を溶媒勾配液で溶離して、別々に産 生成分が得られる。次に、溶出されたフレーバー成分は、所望により、溶媒を蒸 発させることによってさらに濃縮した形態で回収することができる。この発明に よる代表的な培養製造法で得たフレーバー成分の特性について以下に述べる。

第２の一般的な方法では、細胞培養生産と生成物の抽出は。

物理的に別個になっており、培地を、定期的に吸着剤と接触させて蓄積されたフ レーバー生成物を取出す。単純な不連続系で、上記の方法は次のようにして行う ことができる。すなわち細胞培養混合物を定期的に樹脂カラムに注入し、蒸留水 で数回洗浄して未結合物質を洗い出し９次いで、結合している上記のフレーバー 物質をアルコール溶液もしくは勾配液で溶出することによって行われる。連続系 では、カルス細胞が反応チェンバー内に固定化され、培地が連続的に樹脂床を循 環しており７以下で説明する。

またバニラフレーバー物質は、培養細胞混合物もしくは細胞の入っていない培地 から、直接溶媒で抽出して単離してもよい。

Ｃ０連続培養システム 第２図は、この発明の方法を用いてバニラフレーバー組成物の連続大規模生産す るのに設計された培養システム１０を。

単純化した形態で示す。このシステム内のカルス細胞、ここでは１２で示される が、培養室１４内に固定化もしくは保持され。

培地がこの室内を通じて循環される。細胞をチェンバー内に固定化するのに各種 の方法を利用することができる。ひとつの好ましい態様では、細胞（もしくは細 胞の塊）は、アルギン酸ナトリウム、アガロース、寒天、カッパー力ラゲーニン もしくはキトサンのような高分子マトリックスを用いて封入もしくは保持するこ とができる。

他の態様では、細胞は、適切な濾過手段によってチェンバー内に閉じ込められる 。この方法には、小孔のフィルターを培養室の流入口と流出口に置くとか、また は米国特許第４，４４２、２０６号公報に記載されているように細胞培養に中空 繊維を用いる方法が含まれる。

またこのシステムには、培養チェンバーとバルブ１８を介して直列に接続された 樹脂チェンバー１６があり、これは、培地内に運ばれた産物を抽出するためにあ る。樹脂チェンバー１６内の樹脂は９通常の方法で固体担体に固定化されている 。培地の樹脂チェンバーからの流出はバルブ２０を通じて行われる。

樹脂に結合した細胞産生物質は、バルブ１８と２０を閉じ、抽出溶液を、抽出口 ２４と２６を通じて樹脂チェンバーを通過させることによって定期的に抽出され る。

樹脂チェンバー内での産物の抽出に続いて、培地の一部を取出し、残りの培地を 、混合容器２８に送り１図に示すように。

送られた培地はその容器内で、このシステムに供給される新鮮な培地と混合され る。混合溶液から、培地は、システム内に培地を循環させるポンプ３０を通じて 培養チェンバーに戻されるが、培地は１時間ごとに約８０％の比率で循環するの が好ましい。このシステムには１選択された環境条件にシステムを保持するため の温度制御装置と気体供給装置とが、設置されていることが分かる。

■、バニラフレーバーの組成物 第３Ｂ図は、実施例５で詳述する。この発明によって製造された代表的なバニラ フレーバー組成物のＨＰＬＣクロマトクラムを示す。ＩＩＰＬｃクロマトグラフ の条件は実施例７に記載されている。図に見られるように、この組成物は、優勢 なバニリンのピーク　（ピーク５）と、バニリンより早く溶出する４つのピーク 、すなわち３．４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（ピーク１）、４−ヒドロキ シ安息香酸（ピーク２）、４−ヒドロキシベンズアルデヒド（ピーク３）および バニリン酸（ピーク４）として同定されるピークとを含んでいる。さらにこの組 成物には、いくつかの遅れて溶出される成分が含まれている。

バニラ豆から得た天然のバニラエキスのＨＰＬＣ曲線を第３Ｂ図にしめす。この 組成物も優勢なバニリンのピークを有し。

第３Ａ図のピーク１〜４で同定される成分を含有している。

２つの組成物を比較すると、この発明のバニラ豆エキスより大きいことを示して いる。一方、遅れて溶出する成分（ＨＰＬＣカラムでバニリンの後から溶出する 成分）に対するバニリンの比率は、この発明の組成物の方が天然のバニラエキス より小さい。これらの比率の比較は、実施例７に詳述して用いた）ＩＰＬＣクロ マトグラフィーの条件について行った。

１１ＰＬｃ分析法は、培地中のホルモン、代謝前駆体もしくは栄養素の変化のよ うな培養条件の変化による。バニラ組成物中の成分の相対量の変化をたどるのに 便利な方法を提供する。

例えば９選択された成分の相対的濃度を増大させるために。

培地に前駆体もしくは阻害剤の化合物が補充され、成分の相対的組成に対する効 果は容易に評価される。さらに所望のひりつのフレーバー化合物を分泌する細胞 は、その産物のＨＰＬＣ曲線に基づいて選択することができる。また組成物を所 望どおりに精製するため１例えば主要のバニリンのピークの後に溶離するすべて のピークもしくは選択されたピークを除くため、クロマトグラフィを使用するこ とができる。

この発明のバニリン組成物は、好ましくは、市販されている天然のおよび人工の バニラフレーバー組成物と類似のエタノール溶液に、バニラフレーバー組成物と してし処方することができる。またそのフレーバー成分は、ベータした品物。

飲料、アイスクリームなどのような加工食品に、天然のバニラフレーバーの代わ りに添加することもできる。

上記のことから、この発明のいかに各種の目的と特徴が達成されたかが分かる。

第１章に記載の新規な植物組織培養法を用いて得られたカルス細胞は、培養植物 細胞もしくは培養植物組織による二次産物の産生に関する以前のような有利な特 徴をもっている。

Ａ、バニラフレーバーを産生ずるバニラの細胞は、実質的に未分化であり、それ 故、細胞培養で迅速に細胞を増大し、大規模なバニラフレーバー生産に充分なバ イオマスを得ることができる。

Ｂ、バニラカルス細胞は、細胞増殖条件とバニラ産生条件下。

液体培地中で安定である。この発明を裏付けるのに実施された研究は、バニラ細 胞が、数ケ月後の継代培養バニラフレーバー成分を産生じ続けるごとができると いう性質を示し、その細胞は、バニラフレーバーの産生能を失うことなく、増殖 培地内で繰返し膨張することができる。

Ｃ，バニラ植物の豆もしくは成長部分由来の細胞は１．複雑な熟成過程を経た後 の天然バニラ豆だけが産生ずるフレーバー成分のすべてもしくはほとんどを含有 する複雑なフレーバー混合物を産生ずる。

Ｄ、バニラカルス細胞は、フレーバー成分を分泌し、その組成物を、生産培養に おいて細胞培地と細胞のいずれも使いはだすことなく１組成物を単離し精製する ことができる。

この発明の他の重要な特徴によれば、産生されるフレーバー組成物の量は、フレ ーバー成分が産生されている時に、フレーバー成分を培地から取出すことによっ て著しく増大させることができる。この方法は、充分に混合し通気された。細胞 、培地および吸着剤を有する培養系、または疎水系生産物化合物を培地から吸着 するよう構成された吸着床を通じて細胞培地を循環する別の系で行われる。次い で、吸着された物質は、樹脂から容易に抽出することができる。上記の特徴と。

培養で迅速にかつ安定して細胞を増殖させる性能とによって。

培養でバニラフレーバー化合物の効率的な大規模生産を行うことができる。さら に、フレーバー組成物の性質は、培養条件を変えることによって２選択されたフ レーバーを増大させおよび／または他のフレーバーを阻害するように変化させる ことができる。

最後に、カルス細胞は、細胞を選択することによって、特定のフレーバー成分の 高生産および／または強化された生産を行うために選択することができる。

以下の実施例で、培養でバニラ組成物を生産するためのカルス組織の各種調製方 法、生産を達成するための培養条件およびエキスを得る方法を例示する。これら の方法は１例示を目的とするものであり、この発明の範囲を限定するものではな い。

（以下余白） 実施例１ 土壌、泥炭、粉砕樹皮（容量比１　：　２　：　２）の混合物中に２種のバニラ 植物；つまりブイ・フラグランスとブイ・フィアンタを植えた。つる草は上方に 生育し、気根はミズゴケ壁の支持体に付着していた。散水装置により、毎日つる 草に霧吹きし９月に一度、完全肥料を与えた。温室の湿度を約４０〜８０％の間 に維持し、温度を約２０〜２９℃の間とし、直接日光に曝さないように注意した 。

Ｂ、植物組織の滅菌 長さ約５　ｃｍの発育枝を温室植物から採取し、広がった葉をその発育技から除 いた。時々振盪しながら１発育枝を１％アルコノックス（Ａｌｃｏｎｏｘ）に２ ０分間浸し、蒸留水で３回洗浄したのち、３ｍｍの発育枝片を切断して除き２残 りの枝を、各断−片が１個の結節を有するように約１．５ＣＩｌ＋の結節セグメ ントに切断した。ＢＡ　（Ａ培地）　１ｐｐｌｆｆおよびセフオドキシム（ｃｅ ｆｏｔｏｘｉｍｅ）　５００ｐｐｍを補充したＭＳ　（Ｍｕｒａｓｈ　ｉｇｅ− ３ｋｏｏｇ）培地を含有する１％寒天中に発育枝片と結節セグメントとを垂直に おいた。

この段階で結節セグメントの表皮層を除くことによって、得られる無菌組織セグ メントの数を増加させた。約２８℃で７〜１０日間培養した後１発育技片と結節 セグメントを、セフオドキシム２５０ＰｐＩｌ＋を補充した新鮮なＡ培地寒天プ レートに移した。この移植操作を３回繰返した。

Ｃ，インビトロでの滅菌植物の増殖 雑菌混入の形跡を示さない外植片を、カゼイン加水分解物５００ｐｐｍとＢＡ　 Ｏ，５〜、１．０ｐｐｍとを補充したＭＳ培地を含有する寒天上で増殖させて、 不定芽を増殖させた（Ｄｏｄｄｓ）。得られた各々の芽を、　ＮＡＡと、　ＢＡ またはカイネチンをそれぞれ０．１５ｐｐｍ補充したＭＳ培地を含有する。植物 発育用の寒天上で培養した。

上記消毒（ｄ　ｉｓ　１ｎｔｅｓｔａｔ　１ｏｎ）操作により約８０％無菌外植 片を得た。

実施例１の滅菌外植片から１〜２ｃｍ長さの気根片を切り出し、その表面を１〜 ２分間１０％Ｃ１ｏｒｏｘ■溶液で滅菌し、３回滅菌蒸留水で洗浄した。根の切 片を３〜４　ｍｍのセグメントに切断し、２．４−ＤおよびＢＡをそれぞれ１　 ｐｐｍ補充した貼培地を含む０．８％寒天上でセグメントを個々に培養した。ブ イ・フラグランス植物体およびブイ・フィアンタ植物体の各々から全部で約３０ ００個の根セグメントを培養した。

２８℃、大気中で約４週間培養したのち、大部分のセグメントに機片の伸長が見 られた。これらの膨潤した根セグメントを、約２〜３週間ごとに、　ＭＳおよび ２．４−ＤとＢＡとをそれぞれｉ　ｐｐｍ含有する新鮮な固形媒地に２〜３回移 した。真のカルスの形成を示す少数の根断片（培養した全３．０００個から約３ 個）を得た。上記の方法に用いたブイ・フラグランスおよびブイ・フィアンタの カルス形成率はともに約０．１％であった。

実施例３ ブイ・フラグランスおよびブイ・フィアンタ外植片から得られる根セグメントを 、２８℃にて、　２．４−ＤとＢＡとをそれぞれ１　ｐｐｍ補充した東培地およ びＥ、ビタミン類（表１参照）を含有する０、８％寒天上で培養した。８週間後 に、生育する根切片をさらに４週間同じ培地組成をもつ新鮮な寒天プレートに移 した。次いで、膨潤し分化した根構造物（６〜８片）を１２５〜１５〇−液体培 地を含有する２５０胴フラスコに移した。液体媒地の組成は寒天を除けば固形（ ｓｏｌｄ）培地と同一であった。

上記断片を完全に液体内に浸漬させ、温度２８℃、１５０回転／分の速度で回転 式振盪機にて２力月間振盪した。次いで、各断片を４切片に切断し、前記と同じ 栄養添加物を含む固形媒地上にプレート化した。１２日後に、上記断片のす入て から。

砕は易い「真の」カルスを得た。カルス形成率は、１００％であった。各カルス 片は４〜５個のさらに小さい断片に切断され、新鮮な寒天培地に移された。各プ レート上で迅速なカルスの成長が認められた。４週間で組織新鮮型は５〜６倍に 増加することが認められた。上記で生成したカルスを４〜６週間の間隔で継代培 養した。各継代培養において、その増殖速度が維持されていた。

（以下余白） 表Ｉ　Ｅ、ビタミン組成 ミオイノシトール　１００　Ｄ−パントテン酸カルシウム　０．５ニコチン酸　 ２．５　リボフラビン　０．２５ピリドキシン、ＨＬＣ１，０アスコルビン酸０ ．５チアミン、）ＩＬＣ１０，０コリンクロライド　０．１グリシン　０．５　 Ｌ−システィン　ＩＩｃＬ　１．０葉酸０．５　リンゴ酸（モノナトリウム塩） 　１０．ＯＤ−ビオチン　０．０５　カゼイン加水分解物　５０．０表２　ホル モン組成 ５　ｕＭ　２．４−Ｄ　＋　５　ｕＭ　ＢＡ５　ｕＭ　２．４−Ｄ　＋　１　ｕ Ｍ　ＢＡ２０　ｕＭ　２．４−ｒｌ　＋　５　ｕＭカイネチン１０　ｕＭ　２， ４−［１＋　１　ｕＭカイネチンブイ・フラグランスとブイーフィアンタの各版 を蒸留水で十分に洗浄したのち、ときどき振盪しながら２０分間１％アルコノッ クス溶液に浸した。蒸留水で３回洗浄したのち１種子を、ときどき振盪しながら ２０分間１０％［：Ｉｏｒｏｘ■溶液に浸し。

次いで、滅菌蒸留水で３回洗浄した。

滅菌した種子を半分の長さに切断し、胎盤残留物およＵ、１０％新鮮ココナツ水 （ｃｏｃｏｎｕｔ　ｗａｔｅｒ）を補充したヌドソン（Ｋｎｕｄｓｏｎ）媒地中 の９５％アルコールを含有する粉性脂肪物質にて培養した。種子培養物は、暗所 に３２℃で４力月まで保存した。

種子の発芽は、黒色種子膜の破壊に続いて、胚が突起し１球状から円錐状になり 、続いて円錐状のプロトコームが形成されることによって、まず明らかになる。

発芽した種子の割合は約６％であった。

Ｂ、カルス形成 発芽後、上記の種子を、上記の表１に示すビタミン混合物および２．４−ＤとＢ Ａとの種々の組合わせを含有する成長ホルモン混合物を補充したヌドソン培地を 含有する。新鮮な寒天プレート上に移す。種子を大気中３２℃にて抑制した（ｓ ｕｂｄｕｅｄ）光の下で約４週間生育させる。成長と発達の期間中、多数の載板 が１円錐形プロトコームの頂点の胚の表皮細胞および原葉基から形成された表皮 から形成された。

プロトコームの頂点から切り出した原葉基のセグメントと発達中のプロトコーム から切り出した載板の先端セグメント（それぞれ長さ約２ｍｍ）を、　２．４− ＤとＢＡとをそれぞれ１　ｐｐｍ補充したＭＳ培地を含有する０、８％寒天上で 個々に培養する。

約４週間の培養後、原葉基および載板のセグメントを、約２〜３週間ごとにＭＳ 、および２．４−ＤとＢＡとをそれぞれ１　ｐｐｍ含有する新鮮な固形培地に２ 〜３回移す。このことによって。

カルス様の構造を示す少数のセグメントが生成する。固形培地培養から得られる これらのカルス様構造物をコンシスチンシーに応じて、約領５〜１ｇ断片に細か く裂くか、あるいは切断し、２５０ｍ１エルレンマイヤーフラスコに移し、これ を。

寒天を使用しないことを除いて上記培地と同じ液体培地１００〜１５０　ｍｌで 、１力月より長い期間覆う。同一組成の固形培地に移すと、その断片は真の未分 化カルスを形成する。

実施例３で得られたカルスを、　ＭＳ培地、３％シヨ糖、下記の表１に記載のビ タミン混合物および表２に示す植物成長ホルモンの組合わせのいずれかを含有す る０、８％寒天に移した。

カルスを、大気巾約２８℃にて抑制された光の下で培養し、はぼ４〜６週間ごと に、全部で１〜４回継代培養した。

これらのカルスを、コンシスチンシーに応じて、細かく裂くか、あるいは切断し て約０．５−１．、Ｏｇ断片とし、これらの断片を２５０ｍ１のエルレンマイヤ ーフラスコに移し、寒天を使用しないこと以外上記と同じ液体培地５０ｍｊ２で 覆った。フラスコを滅菌キャップで覆い、大気下３０日間攪拌しながらインキュ ベートした。攪拌速度は約１５０ｒｐｍ、　インキュベーション温度は約２４〜 ３０℃の間とした。カルスの塊をこのような条件下で９ゆっくりと、１粒子当り 約１０細胞より少ない細胞を含有する小さな多細胞粒子にする。

定常期（液体培養で約２週間）に達する前に、下記の方法により細胞生存度を調 べた。細胞生存度が約２５％より大きく。

細胞懸濁液が細胞密度の増加を示すならば、微小多細胞粒子をピペットにより除 去し、低速遠心分離により濃縮し、上記条件下に継代培養のために新鮮な液体培 地に添加した。もとの培地に残るより大きな細胞の塊は、フラスコに残る塊に新 鮮な培地を添加して、さらに同じ培養条件下で攪拌することによって破砕された 。この細胞を上記のようにして生存度について分析し、２種の継代培養群由来の 小さな多細胞粒子を上記のようにして取り出し、濃縮し、新鮮な培地中で縫代培 養した。細胞の微小粒子懸濁液はこの方法で高い細胞密度にまで継代培養するこ とができた。

カルス細胞懸濁液の細胞生存度を蛍光染料の染料排除法によって試験した。フル オレセインジアセテー）　（ＦＤＡ）　染色剤（５■ＦＤＡ／ｄアセトン）の原 液を細胞培養培地で１＝５０に希釈し、顕微鏡スライド上で希釈染色剤１滴を細 胞懸濁液１滴に加えた。蛍光顕微鏡検査によって生存細胞と非生存細胞をカウン トした。

実施例５で得たブイ・フラグランスの培養懸濁液を１β培地容量当り乾操重量約 １２ｇの細胞濃度まで増殖させ、細胞１０顧を１２５　ｍ、１．エルシンマイヤ ーフラスコ中でビタミン混合物（表Ｉ）　、５ｕＭ　２，４−Ｄ、　−５ｕＭ　 ＢＡおよび３０ｇ／Ａシヨ糖を含有するＭＳ培地５０雁に加えた。樹脂（ＸＡＤ −４樹脂５ｇ）をフラスコに加えた。樹脂は使用前にメタノールで洗浄し、減圧 乾燥した。フラスコを攪拌速度１５０ｒｐｍ、　２６℃の暗所にて６日間インキ ュベートした。フラスコ内容物を採取し、実施例１２に記載の方法でバニリンと 他のバニラフレーバー成分について分析した。培地６０−中に約５５ｍｃｇのフ レーバー物質を検出した。これに対して、　ＸＡＤ−４樹脂を添加していないフ ラスコでは９倍少ない量のフレーバー物質が得られた。

実施例５で得たブイ・フラグランスの培養細胞を、５ｕＭの２、４−Ｄと５ｕＭ のＢＡとのホルモン補充物を用いて、細胞密度が約１２ｇ／ＩＩとなるまで増殖 させた。細胞１０ｍ１を、　ＭＳ培地５０　ｍｆ　。

ビタミン混合物（表■）およびラクトース３０ｇ／ｌを含有する１２５ｒｎｌの エルレンマイヤーフラスコに添加した。洗浄したＸＡ［）−４樹脂５ｇを培地に 加えた。フラスコを攪拌速度１５０ｒｐｍで攪拌しながら２６℃の暗所にて２９ 日間インキュベートした。

２９日目に分析用に５ｍｆの培養樹脂混合物を取り出し、洗浄したＸＡＤ−４樹 脂５ｇを代わりに加えた。３８日目に第２のサンプルを取り出し、さらに５ｇの ＸＡＤ−４樹脂を加えた。４７日目に最終サンプルを取り出して、培養を終えた 。バニリンおよびバニラフレーバー成分の分析を実施例７と同様にして実施した 。培養培地５０ｍ１中にフレーバー物質的９００ｍｃｇを検出した。

結果は次のとおりであった： 時間（日）　バニリン（ｍｇ／Ａ） ４７　１８．０ 実施例８ 実施例５で得たブイ・フラグランスの培養懸濁液を、２．４−Ｄ　２０℃Ｍとカ イネチン５ｕＭのホルモン補充物を用いて、振盪速度１５０ｒｐｍにて培地２０ ０ｍｊ２を含有する５００ｍ１のエルシンマイヤーフラスコ中で２８℃にて７〜 ８期間（ｐｅｒ　１ｏｄ）にわたり、細胞密度が１２ｇ／ｊ２となるまで増殖さ せた。４個のこのようなフラスコの内容物を１βのエルシンマイヤーフラスコ中 で完全に混合した。この培養物７０ｍ１を５００−フラスコ中の培地９０ｍ１に 加えた。１０個のこのようなフラスコを準備した。活性炭粉末（Ｓｉｇ＋ｎａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、モンタナ州セントルイス）を、１、ｇ／１２．３ｇ ／Ｌ　１０ｇ／Ｉｌおよび４０ｇ／Ｅの濃度で、２個１組のフラスコのそれぞれ の組に加えた。活性炭を添加しない２個のフラスコを対照として使用した。フラ スコを温度２６℃にて１５０　ｒｐｍで振盪した。６日後にフラスコ内容物を取 出し、下記のようにしてバニリンおよび他のバニラフレーバー成分について分析 した。表３は種々の活性炭濃度で６日間の培養によるバニＩＪン収量を示す。

７１％１τΔ−−１ 表３ 種々の活性炭濃度におけるブイ−フラグランス細胞懸濁液中のバニリンの蓄積量 活性炭を混合した細胞懸濁液からバニリンおよび他のバニラフレーバー成分の抽 出と定量のための分析操作を下記に示した：懸濁したバニラ細胞、活性炭および 栄養培地を含む。

培養物サンプルの懸濁液５ｄを１１００Ｏｘにて５分間遠心分離した。液体を捨 て、固形分をメタノールとＩＮＫＯ）ｌとの４７１混合物２ｍ１．にて３回抽出 した。メタノールを除去した後、抽出物を塩酸でｐＨ２に滴定した。次いで、酸 性とした抽出物をメチルブチルエーテル３ｍｊ２で３回抽出した。メチルブチル エーテルを０．５Ｎ　ＮａＯＨ４００μｐで逆抽出した。この水層を酸性にした のち、高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。

実施例９ 実施例８に記載のブイ−フラグランスの培養懸濁液を１β容量の反応容器４個に 入れて使用した。反応容器は逆さにした２１エルレンマイヤーフラスコから組立 て、温度調節のためカバーで覆った。各反応容器に滅菌空気を送るために内径２ 胴の空気管を使用した。各反応容器の培地７５０＋ｙｔｊ２に懸濁液４５０ｍ１ （７−８日経過、定常期、おおよその密度＝１２ｇル）を加え、初期細胞濃度を ４．５ｇ／Ｉｌ　（乾燥重量基準）とした。次いで、活性炭粉末を各反応容器に 下記の量で添加した：反応器Ｉ−活性炭１０ｇ／Ｌを含有する完全培地反応器■ −活活性炭４０八八含有する完全培地反応器■−活活性炭１０八八含有する最少 培地反応器■−−性炭４０ｇ／Ｌを含有する最少培地培養物を、毎分０．５空気 容量／培養物容量の流速で、滅菌して湿った空気に曝した。Ｏ日目、３日目、６ 日目、９日目。

１１１日目、１日目、そして１９日目にサンプル５−をそれぞれの反応容器から 無菌状態で取出し、実施例９に記載み方法により、バニリンおよび他のバニラフ レーバー成分の含有量を分析した。結果を第４図に示す。このようにして、１９ 日間の培養期間にわたって１反応器１〜■で生成されたバニリンの最大量はそれ ぞれ１４■／Ｌ、　４５ｍｇ／Ｌ、　２１■几および９９■／Ｌであった。すな わち、最少培地の使用により最少培地に比べて５０％〜１２０％高いバニリン蓄 積量が達成された。

（以下余白） 完全培地と最少培地の組成は次のとおりであった：完全培地　最少培地 ＭＳ塩類　ＣａＣ１□２Ｈ２００，５１ｇ／Ｌ表１のビタミン類　ＮａＣ１２， ９ｇ／Ｌ２．４−Ｄ　２０ｕｍ　ショ糖　３０ｇ／Ｌカイネチン５ｕｍ　ｐＨ＝ ５．８ シヨ糖３０ｇ／Ｌ ｐＨ＝５．８ 実施例８および９に記載のブイ・フラグランスの培養懸濁液を７日間で細胞密度 １１〜１２ｇ／Ｌまで増殖させた。細胞懸濁液２５ｍｊ２を遠心分離によりほぼ ２倍に濃縮した。濃縮した懸濁液１５ｍＪ２を２．４％アルギン酸ナトリウム溶 液２０ｍｆと混合し、２Ｗ／Ｖ％塩化カルシウム溶液１００ｍｆ中にピペットで 滴下した。アルギン酸カルシウムのビーズ（バニラ細胞を含有する）の形成がお こり；これらのビーズを塩化カルシウム溶液中で２時間硬化させた。ビーズを、 リン酸塩欠損ＭＳ培地中で２回洗浄した。

ビーズを、１２５ｍ１フラスコ内で、リン酸塩を欠損し粉末活性炭５００　ｍｇ を含むＤ／に＝２０１５培地５０ｍ１に懸濁させた。そして。

２８℃で１５０ｒｐｍにて８日間振盪した。培地−活性炭混合物のサンプル２− を無菌状態で取出し、実施例８の記載の方法によりバニリンと他のバニラフレー バー成分について分析した。

実施例５で得られた培養カルス細胞を実施例８と同様にして増殖させた。おおよ その密度が７〜８％の７日間培養細胞懸濁液約７５ｒｒ１１を２．４％アルギン 酸ナトリウム溶液３５ｒＩＬｌと混合し、３ｗ／ｖ％塩化カルシウム溶液２５０ ｍｊ２中にピペットで滴下し”た。アルギン酸カルシウムビーズ（細胞を含有す る）の形成がおこり；これらビーズを３ｗ／ｖ％塩化カルシウム溶液中で２時間 硬化させた。ビーズを（リン酸塩欠損）　ＭＳ培地中で２回洗浄した。

ビーズを、直径２．５ｅ＋ｎの反応器中に最終高さ８印となるまで充填した。３ ％シヨ糖、ビタミン混合物を含むが、リン酸カリウムを含まない２通気した培地 を流速１００ＴｒＬ１／分にて反応器床を通して循環させた。循環ループには、 　ＸＡＤ−４樹脂１３ｇを含むカラムを含めた。

５日目の終わりに、　ＸＡＤ−４の最初のカラムからＸＡＤ−４樹脂を含む第２ の同じカラムに循環経路を変えた。循環は８日間続けた。

バニリンとバニラフレーバー成分の分析は実施例７に記載の方法で行った。結果 を以下に示す： カラム１　（ｍｃｇ）　カラム２　（ｍｃｇ）１、　バニリン　５２　４１ ４、４−ヒドロキシ安息香酸　４．９ ５、　バニリン酸　６．０ 実施例７で得られたバニラフレーバー物質の）ＩＰＬｃ分析は。

オクタデシルシリル逆相充填材料を充填した４、６ｍｍ＜内径）Ｘ１５ｃｍ　Ｈ ＰＬＣカラムを用いて、　ＨＰＬＣで実施した。抽出したバニラ物質を５０５メ タノールに溶解して最終濃度１０■／ｄとし。

その溶液１０ラムダをカラムにかけた。５％メタノール〜０．５％酢酸を含む２ ５％メタノールまでの線型匂配法にて物質を溶出した。カラムビークは２８０ｎ ｍにてモニターした。

クロマトグラムを第３図Ｂに示す。比較のため、１：２０に希釈した。市販のバ ニラ豆抽出物の、同じＨＰＬＣ分析によって得られるクロマトグラムを第３図Ａ に示す。スペクトル特性と外部標準によって決定された。ビークが示す物質を図 中に示す。

図面から明らかなように、バニラフレーバー抽出物は、高率のバニリン、ビーク １−４の比較的少ない量の化合物および比較的大きい量のより遅く溶出する物質 を含有する。

イチゴ、ブドウ、桃、リンゴおよびアンズの種々の部分から誘導されたカルス培 養物を４週間所定の培地上で増殖させ。

バニラフレーバー成分の存在について分析した。使用された植物の種類、特定の 植物部分、培地の組成および特定のバニラフレーバー成分の濃度を表４に示す。

表に示すように、各果実由来のカルスはバニリンおよび少なくとも１種の他の関 連したフレーバー成分を産生した。

（以下余白） 繰 本発明は特定の方法と生成物に関して記載しているが１本発明を逸脱することな く９種々の変更や修正が可能であることは明らかである。

ＦＩＧ、３Ａ ＦＩＧ、３８ −一一伽叶明ＣＥ＞ ＦＩＧ、　４ 国際調査報告 ｌ崗ｌＡｌｌ１ａｎｔＡｌ＾””””Ｏｌｌ”　Ｐ（”で／Ｔ１１８１ｎ７’； Ｉ；Ｉ’１ＰＣＴ／ＩＪＳ８８７０２５６Ｂ ＶａｎｉｌＬａＨｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅＨｃｕｌｔｕｒ＠　ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ；Ｖｌ、０ｂ１１＠ｒｖａＦ＋１ｏｎｓ　ｗｈｅｒｅ　ｕｎｚｔ　ｏｆ　 １ｎｖｅｎｔｔｏｎ　ｉｓ　１ａｃｋｉｎ　＋Ｇｒｏｕｐ　Ｉ：　Ｃｌａｚｍｓ 　ニーＬ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｖａｎｉｌｌａ　ｆｌａｖｏｒｃｏｍｐｏｓ ｚｔｉｏｎ＋　Ｃ１ａｓｓ　４２６１５３４゜Ｇｒｏｕｐ　ＩＩｒ＋ＣＬａ１ｍ 　１１．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａｎｏｔｈｅｒ　ｖａｎｉｌｌａ　ｆｌａｖｏｒｏ ｆ　ａ　ｄ＋、ｔｆｅｒａｎｅ　ｃｏｍｐｏｓｔｔｉｏｎ＋　Ｃ１ａｓｓ　４２ ６１５３４゜Ｇｒｏｕｐ　ＩＶ＋　Ｃｌａｉｍｓ　１２−ｈａ、２９　ａｎｄ　 ３０．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｃａｌｌｕｓｃ＠ＬＬｓ＋　Ｃ１ａｓｓ　４３５／２ ４０．４８゜Ｇｒ：Ｏｌ、１ｐ　Ｖｊ　ＣｌａＬＯｌｇ　１９−２５１＋　ｄｒ ａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｎａｗｕｒａｌ　 ｐｌａｎセｆｌａｖｏｔ　ｃｏｒｎｐｏｎｅｎｔｍ：　Ｃ１ａｓｓ　４３５／４ λ。

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．次の工程により製造されるバニラフレーバー組成物：（ａ）バニラ植物組織 材料から誘導され，そして（ｂ）植物液体培養培地中で増殖する性質について選 択されたカルス細胞を提供する工程； バニラフレーバー成分の産生と培地への分泌を促進させる条件下で，該細胞を液 体培養培地中で培養する工程；および分泌されたフレーバー成分を培地から分離 する工程。
2. ２．請求項１に記載の組成物であって，前記提供する工程は，（ａ）バニラ植物 の成長点から植物組織セグメントを得ること；（ｂ）該組織セグメントを植物成 長ホルモンの存在下で固形培地上および液体培地中で培養すること；（ｃ）組織 セグメントを他の固形培地上にプレートすること；および（ｄ）固形培地上で継 続した増殖および液体培地中で微小細胞懸濁物を形成し得る，真の未分化カルス 細胞を誘発すること；を包含する。
3. ３．請求項２に記載の方法であって，前記誘発は，まず，固形培地上で選択した 組織セグメントを培養すること，該組織を液体培地液面下に浸漬すること，そし て次に，植物成長ホルモンを含む固形寒天培地上で該セグメントを再培養するこ とを包含する。
4. ４．請求項１に記載の組成物であって前記植物組織材料は，ブイ・フラグランス （Ｖ．ｆｒａｇｒａｎｓ）またはブイ・フィアンタ（Ｖ．ｐｈａｅａｎｔｈａ） の気生根片から得られる。
5. ５．請求項４に記載の組成物であって，前記カルス細胞はＡＴＣＣＮｏ．４０３ ５４の特性を有する。
6. ６．請求項１に記載の組成物であって，前記提供する工程は，選択したカルス細 胞を固形増殖培地上にプレートすること，および該プレートされた細胞から最高 のバニリン生産レベルを示す細胞を選抜することを包含する。
7. ７．請求項６に記載の組成物であって，前記選択は，該プレートされた細胞の生 産物を酸性フラバノイド試薬と反応させて赤色バニリンコンプレックスを製造す ることを包含する。
8. ８．請求項１に記載の組成物であって，前記分離は，前記培養培地を高分子疎水 性吸着剤を接触させて該樹脂にバニラ成分を吸着させること，および該樹脂から 結合したバニラフレーバー成分を分離することを包含する。
9. ９．請求項１に記載の組成物であって，該組成物はメタノール／酢酸グラジエン トを用いてＨＰＬＣで分析したときに，第３図に示すような成分のプロフィール を有する。
10. １０．３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド，４−ヒドロキシ安息香酸，４− ヒドロキシベンズアルデヒドおよびバニリン酸の合計量に対するバニリンの割合 がバニラ豆から得られる天然バニラ抽出物の場合よりも実質的に大きい，バニラ フレーバー組成物。
11. １１．ＨＰＬＣカラムでメタノール／酢酸グラジエントで溶出されるバニリンよ りも遅れて溶出するフレーバー成分の合計量に対するバニリンの割合が，バニラ 豆から得られる天然バニラ抽出物よりも実質的に小さい，バニラフレーバー組成 物。
12. １２．（ａ）細胞培養で増殖させることが可能であり，そして，（ｂ）細胞培養 物中に選択された植物フレーバー組成物を分泌する，カルス細胞。
13. １３．請求項１２に記載の細胞であって，該細胞は，実質的に未分化である。
14. １４．請求項１２に記載の細胞であって，細胞培養物中に分泌されるフレーバー 物質の量は，それが生産される培地から，分泌される該フレーバー物質を除去す ることにより増加し得る。
15. １５．請求項１２に記載の細胞であって，該細胞は，複合（ｃｏｍｐｌｅｘ）フ レーバー混合物を分泌し得る。
16. １６．請求項１５に記載の細胞であって，該細胞は，バニラ植物組織材料由来で あって，バニリン，および３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド，４−ヒドロ キシ安息香酸，４−ヒドロキシベンズアルデヒドおよびバニリン酸でなる群から 選択される他のバニラフレーバー成分を含む，複合バニラフレーバー組成物を分 泌する。
17. １７．請求項１６に記載の細胞であって，該細胞は，（ａ）バニラ植物の成長点 から植物セグメントを得ること，（ｂ）該組織セグメントを，植物成長ホルモン の存在下にて固形支持体上で培養すること，（ｃ）部分的に分化しカルス様構造 体の生成を示す組織セグメントを選択すること，および（ｄ）まず，該選択した 組織セグメントを液体培地中で長期間培養し，次に該セグメントを植物成長ホル モンを含む固体寒天上で該セグメントを培養することによって，連続して増殖す ることが可能で微細な懸濁物を形成し得る真のカルスを誘発することにより調製 される。
18. １８．請求項１７に記載の細胞であって，調製されたカルス細胞はＡＴＣＣＮｏ ．４０３５４の特性を有する。
19. １９．天然植物フレーバー成分を製造する方法であって，該方法は， フレーバー成分を産生する植物から得られる組織材料からフレーバー成分を産生 し培地中に分泌するカルス細胞を誘導すること， 培地中で該細胞を培養すること，および分泌されたフレーバー成分を該増殖培地 から分離すること，を包含する。
20. ２０．請求項１９に記載の方法であって，該カルス細胞は実質的に未分化である 。
21. ２１．バニラフレーバー成分を製造するのに使用される，請求項１８に記載の方 法であって，該カルス細胞はバニラ植物の成長点からの植物セグメントから誘導 され，そして該誘導は，（ａ）該組織セグメントを植物成長ホルモンの存在下で 固形支持体上にて培養すること，（ｂ）部分的に分化したカルス様構造体の生成 を示す組織セグメントを選択すること，および（ｃ）まず選択された組織セグメ ントを液体培地の液面下にて長期間培養し，次に該セグメントを植物成長ホルモ ンを含む固体寒天上で培養することによって真のカルスを誘導すること，を包含 する。
22. ２２．請求項２１に記載の方法であって，前記調製されたカルス細胞は，ＡＴＣ ＣＮｏ．４０３５４の特性を有する。
23. ２３．請求項２１に記載の方法であって，前記分離は，培養培地に活性炭または 高分子疎水性吸着剤のような吸着剤を接触させること，および結合したバニラフ レーバー成分を該吸着剤から除去することを包含する。
24. ２４．請求項２３に記載の方法であって，該方法においては，前記培養中に前記 吸着剤が培地に接触し，培養期間中において培養培地からバニラフレーバー成分 が除去される。
25. ２５．請求項２３に記載の方法であって，該方法においては前記カルス細胞が培 養チェンバーに入れられ，吸着剤が抽出チェンバーに入れられ，そして，該培養 の間，培地が一方のチェンバーから他のチェンバーへ循環する。
26. ２６．請求項２５に記載の方法であって，前記カルス細胞は，前記培養チェンバ ーにおいて多孔性マトリックス内に固定化される。
27. ２７．バニラフレーバー組成物を生成するのに用いられる請求項１９に記載の方 法であって，前記カルスは，果実生成植物由来である。
28. ２８．請求項２７に記載の方法であって，前記カルスは，モモ，イチゴ，ブドウ ，リンゴおよびアンズの組織でなる群から選択される組織由来である。
29. ２９．（ａ）培養で増殖することが可能であり，（ｂ）フレーバー成分を生成し ，そして，（ｃ）果実生産植物由来である，カルス細胞。
30. ３０．請求項２９に記載の細胞であって，前記カルスは，モモ，イチゴ，ブドウ ，リンゴおよびアンズの組織でなる群から選択される組織由来である。