JPH04501723A - リポソーム性放射線造影剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 名称 リポソーム性放射線造影剤 関連出願 本出願は１９８８年１１月９日に出願した係属中の米国出願番号第２６９，１９ ０号の一部継続出願である。

発明の背景 牌及び肝腫瘍の存在、位置及び程度の正確な検出は臨床において根本的な重要性 を有する。最近の腫瘍治療の進歩により、多くの悪性腫瘍はそれらの存在が敏速 且つ正確に確認されれば有効に治療することができる。長年にわたって専門医は このような診断を行おうと努力して様々な画像診断法に頼ってきた。しかしなが らこれらの多くの画像診断法はそれらの使用に関して欠点及び／又は制限がある 。

例えば放射線核種スキャンは肝臓及び膵臓内の悪性腫瘍の検出に対して早くから 用いられていた。このスキャンは肝臓及び肺臓のクツパー細胞がテクネチウムイ オウコロイドのような粒子を取り込むことによるものである。

しかしながら解像が不十分であり悪性腫瘍検出のためにこの方法を使用するには 制限があった。

高い空間解像度を得る画像診断法であるコンピューター断層撮影（ＣＴ）は肝臓 及び肺臓の悪性腫瘍の検出に広く用いられている。ＣＴは腫瘍と隣接した肝又は 牌正常組織（柔組織）の間の示差的線形減弱に依存している。

一般に悪性腫瘍は隣接柔組織より幾分減弱が低く、従ってＣＴにより検出が可能 である。しかしながらある場合には腫瘍は柔組織と同様の減弱を示し、このまま では造影しないＣＴでは可視できない。

ＣＴによる肝及び牌腫瘍の検出を改良するために、ヨウ化水溶性造影剤が使用さ れている。これらのヨウ化化合物は細胞外液中に分布して更に約１６％の悪性腫 瘍が検出できるようになる。しかしながらこの造影剤は送達を血流に依存するも のである。従って周囲の組織と同じ血流を有する肝又は牌腫瘍はしばしば造影剤 増強ＣＴを用いて検出されないことがある。全体として、肝転移の約７０％のみ がこの方法で検出されるが悪性リンパ腫に対しての検出率は更に悪い、肺臓のリ ンパ腫併発も造影剤を使用してもしなくてもＣＴによる検出は非常に困難であり 、この方法は牌リンパ腫に関しては最も良くて約５０％の感度しかない。

細胞外ヨウ素化造影剤を用いた改良が期待はずれのため、肝及び牌腫瘍のＣＴ検 出に使用する組織特異造影剤を探索することになった。多くの努力がエチオドー ル（ＥＯＥ−１３）のような油状造影剤又はマイクロカプセル化された又はリポ ソームにカプセル化されたヨウ化造影剤のよ・うな粒子造影剤に集中した。これ らの油状又は粒状ヨウ化造影剤は肝臓、肺臓及び骨髄の正常細胞、特にクツパー 細胞に優先的に蓄積される。臨床試験でこれらの薬剤がＣＴ検出能特にリンパ腫 確認が関与する場合の検出能を改善することが示された。しかしながらＣＴは差 に基づくコントラストを得るために比較的高投与量の造影剤（約１０ミリモルヨ ウ素量）を必要とし、残念ながらこのような造影剤はこの投薬量では有毒である 。

従ってコントラストを改良するのに有効でありながら毒性などの問題から、これ らの組織特異造影剤を使用するＣＴの利用は特定のセンターや実験用試験に限ら れている。

磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は肝臓及び肺臓の悪性腫瘍を確認するために最も有用 な検出技術であることがわかっている。ＭＲＩに於て腫瘍は正常及び悪性腫瘍組 織の緩和時間（Ｔ１及び／又はＴ２）の差に基いて検出される。

Ｔ、及び／又はＴ２のこの差はＭＲ両画像特異なシグナル強度をもたらし、Ｔ、 （又はＴ２）の差が大きい程、コントラストが強くなる。典型的には肝腫瘍は対 応する正常組織よりＴ１及びＴ２が長い、これは周囲の柔組織に対して腫瘍がＴ １荷重ＭＲ画像で低強度及びＴ２荷重ＭＲ画像で、高強度を示すことになる。し かしながらある場合には悪性腫瘍と正常組織はＭＨＩが同じ強さであり、従って 検出不能となる。

等強度の場合を減少させ、この画像診断法の全体の検出率を増加させる試みとし て組織及び腫瘍コントラストを増強することができる薬剤を探索した。この努力 の結果として開発された主なＭＨＩ剤はワインマン（Ｗｅｉｎｍａｎｎ）等、Ａ 、Ｊ、Ｒ，第１４２巻、６１９〜６２４頁（１９８５年）、プラッシュ（Ｂｒａ ｓｃｈ）等、Ａ、Ｊ、Ｒ。

第１４２巻、６２５〜６３０頁（１９８４年）及びストリッチ（Ｓｔｒｉｃｈ） 等、二之オロジー第１５４巻、７２３〜７２６頁（１９８５年）に述べられる常 磁性化合物ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）であっ た。ある種の条件下では、遊離Ｇｄ−ＤＴＰＡはミクロモル範囲で良好なコント ラスト強調を得ることができ、ＣＴによるヨウ化コントラスト増強に必要とされ るより濃度が約２桁程度低い。有効に使用される場合、Ｇｄ−ＤＴＰＡは正常組 織Ｔ１とＴ２あるいは腫瘍Ｔ１とＴ２を（両方ということはない）濃度依存性的 減少させる。組織に到達する造影剤の濃度が高いほどＴ１とＴ２による測定効果 は大きくなる。測定Ｔ工（又はＴ２）は式１式％（） によって示される。式中１／Ｔ□（組織）は造影剤を含まない組織のＴ１であり 、１　／　Ｔ　１（造影剤）は造影剤による組織Ｔ、に対するものである。前述 の式が示す通り、緩和速度は相加的である。ガジアン（Ｇａｄｉａｎ）等、Ａ、 Ｊ。

盈、第１４３巻、２１５〜２２４頁（１９８５年）及びブラウン（Ｂｒｏｗｎ） 等、９も」伽１．第１１巻、６７−７２頁（１９８４年）。

残念ながら肝臓及び肺臓を含む診断に於て遊離Ｇｄ−ＤＴＰＡを用いてその使用 を評価するヒト試験は期待外れであった。１つの問題点は、ＣＴに使用するヨウ 化造影剤と同じく遊離Ｇｄ−ＤＴＰＡは血流に比例する細胞外液間隙に分布する 細胞外物質である。緩和速度が相加的であるため、造影剤の作用は短い緩和時間 を有する組織より長い緩和時間を有する組織の方が比例して強くなる。腫瘍は正 常組織より長い緩和時間を示す傾向がある。

ダマジアン（Ｄａｍａｄｉａｎ）等、サイエンス、第１７１巻、１１５１〜１１ ５３頁（１９７１年）、従って造影剤が腫瘍と正常組織で平衡に達した場合、そ の作用は正常組織Ｔ１（及びＴ２）よりも腫瘍Ｔ１（及びＴ２）を減少させるこ とになり、組織間のコントラストが弱くなる。従って腫瘍が周囲の組織と同じ血 流を有する場合、腫瘍Ｔ１（及びＴ２）も影響され、このような腫瘍はしばしば 検出されない。

ＭＲＩ造影剤としてＧｄ−ＤＴＰＡの有効性を増大させる研究はカプセル化する ためにリポソームを使用することと肝及び牌柔組織へ選択的にＧｄ−ＤＴＰＡを 送達することに集中した。リポソームは肝臓、肺臓及び骨髄によって主に取り除 かれ、従ってこのような組織によって優先的に蓄積されることになる。これらの 組織内で一次的に取り込む細胞は食作用クツパー細胞である。しかしながら腫瘍 は一般にこのような細胞を含有しない。従゛　って理論的には血流に関係なくリ ポソームを用いて正常な肝、牌及び骨髄組織を造影剤の選択的目標とすることが でき、肝、牌又は骨髄及び腫瘍細胞間のコントラストを増強することができる。

リポソームを作製するために多くの方法が当業界に於て利用できる０例えば単ラ メラ脂質小胞は、溶媒稀釈（ディーマー（Ｄｅａｍｅｒ）等、Ｂｉｏｃｈｉｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ。

第４４３巻、６２９〜６３４頁（１９７６年）及びクレーマー（ｋｒｅ＠ｅｒ） 等、バイオケミストリー、第１６巻、３９３２〜３９３５頁（１９７７年））又 は溶媒蒸発（ツカ（Ｓｚｏｋａ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、、　Ａｅａｄ、　 Ｓｃｉ、第７９巻、４１９４〜４１９８頁（１９７８年））を含む逆相技術によ って有機溶媒から調製することができる。これらの方法は全ての脂質が全ての有 機溶媒に同様に可溶性でないため、使用される溶媒は脂質組成が変わる場合変更 しなければならないという共通の制約を受ける（シーエン（Ｓｃｈｉｅｒｅｎ　 ）等、Ｂｉｏｃ旦ｙｎ、　Ｂｉｏｐｈ　ｓ、ｅｔａ、第５４２巻、１３７〜１５ ３頁、１９７８年）及びディーマー（Ｄｅａｍｅｒ）リポソームテクノロジー、 第１巻、（ＣＲＣ出版１９８４年）（ブレグリアジス（Ｇｒａｇｕｒｉａｄｉｓ ）、Ｇ０編集））。

更に脂質調製物から残留溶媒を除去するためにクロマトグラフィー又は透析技術 によって除去する必要がある。

このような方法で作製された小胞は多重ラメラ及び単ラメラ小胞の不均質混合物 である傾向がある。従ってポリカーボネートフィルターによる押出などの種々の 手法を用いて小胞のサイズを決める必要がある。オルソン（Ｏｌｓｏｎ）等、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈｙｓ、　Ａｃｔａ、第５５７巻、９〜２３頁（１９ ７８年）、米国特許第４，７５２，４２５号はこの溶媒稀釈と押出手法によって 作製したリポソームを開示している。更に米国特許第４，７３７，３２３号は種 々の手法から調製された不均質リポソーム懸濁液のサイズ処理法を記載している 。記載される処理はリポソームサイズが主として約１μ以上である不均質サイズ のリポソームの懸濁液を内側の表層ポアサイズ約１μを有する非対称セラミック フィルターを通過させることを含む。

界面活性剤除去はリポソーム小胞形成のもう一つの一般方法を代表している。こ の方法では脂質材料あるいは予備形成小胞を界面活性剤に可溶化して混合ミセル を形成する１次いで界面活性剤を透析により除去し、ミセルを合体して二重層小 胞を形成する。この手法による１つの問題点は有効に使用することができる個々 の透析法が使用する特定の脂質によって非常に異ることである。例えば異なった 脂質は界面活性剤に対する脂質の異なる比率の使用を必要としくミムス（Ｍｉ＋ ｍｍ５）等、バイオケミストリー、第２０巻、８３３〜８４０頁（１９８１年） 、二ノック（Ｅｎｏｅｈ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 第７６巻、１４５−１４９頁（１９７９年）及びウェダー（ｌｌｅｄｅｒ）等、 リポソームチクノロオニ第１巻（ＣＲＣ出版１９８４年）（グレゴリシアジス、 Ｇ０編集））、透析又はゲルも一過による界面活性剤除去速度は再現性のある製 剤を得るために変えることを必要とする（ミムス等、旦オケミストユニ、第２０ 巻、８３３〜８４０頁（１９８１年）及びシュ（Ｓｃｈｕｈ）等、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　Ｂｅｔａ、第６８７巻、２１９〜２２５頁（１９８２年））、この方法に おけるもう一つの大きな問題は残存する界面活性剤をすべて除去するのが困難な ことである（マッデン（Ｍａｄｄｅｎ）。

並憇ユ乃−■２１裏蛙並、第４０巻、２０７〜２２１頁（１９８６））。

また単ラメラ脂質小胞は多重ラメラ小胞（又は凍結及び融解多重ラメラ小胞）か ら空洞減少やせん断（フレンチプレス）（レルケス（Ｌｅｌｋｅｓ）、リポソー ムｆ　９　／　０−−２ニー、第１巻、５１〜６５頁（ＣＲＣ出版１９８４年） （ブレグリアジス、Ｇ１編集））、音波処理（メイヒュー（Ｍａｙｈｅｗ）等、 リポソームテクノロジー、第２巻、１９〜３１頁ＣＣＲＣ出版１９８４年）（ブ レグリアジス、Ｇ、））又はフィルター押出（メイヤー（Ｍａｙｅｒ）等、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、第８５８巻、１６１〜１６８頁（ １９８６年））方法を含む機械的手法によって作製することができる。

当業者が認めている通り前述の音波処理法はいくつかの制約を有している。まず 、音波処理を完全に再現性のある方法にすることは困難である。これは一部には 音波処理がトランスデユーサ−から音波処理される媒質へエネルギーの移動を含 むという事実による７トランスデユーサーと音波処理音波処理される物質量のエ ネルギー移動効率は多くの要因に依存している。これらは音波処理される脂質分 散液の濃度、脂質が分散される媒質のイオン強度、プローブ又はバスタイブの音 波処理装置を使用するかどうか並びに他の他の要因を含む、音波処理装置のプロ ーブ尖端と音波処理され、る物質の物理的接触を含む音波処理の場合には１分散 液中のプローブ尖端の物理的位置が音波処理過程に影響する。音波処理される媒 質が例えばバスタイブの音波処理装置の場合のようにエネルギートランスデユー サ−から物理的に離れている場合には、エネルギー移動は音波処理される物質を 含む容器の形と壁厚によって変調する。また約１００　ｍ　ｇ　／　ｍ　２以上 の脂質濃度で音波処理過程を行っても均一サイズ分布を得ることが困難であるこ とは十分に認められる。脂質濃度が低いため、水溶性溶質に対する捕捉効率も低 い傾向がある。別の欠点は均一サイズ分布を得るために長時間音波処理する必要 があることである。更にその上、音波処理過程に於て音波処理物に用いられるエ ネルギーは一部熱として放出される。従って不安定な脂質の熱分解を避けるため に音波処理下の試料を冷却する必要がある。その上規模を拡大することも困難な 方法である。プ゛ローブタイプの音波処理装置を使用する場合、例えば音波処理 物にプローブの尖端からの金属粒子が混入する可能性がある。これは検査するか あるいは音波処理物から粒子を除去するために音波処理物を遠心分離しなければ ならず、１１′Ｍ！操作を更に複雑にする。最後に音波処理によって調製される 脂質小胞は不安定であり、融合する傾向があることが報告されている（バエンテ （Ｐａｒｅｎｔｓ）等、バイオケミストＩＪ−１第２３巻、２３５３〜２３６２ 頁（１９８４年））。これは脂質小胞の全体のサイズが生物分布に影響すること が知られていることから望ましくない（グリス（Ｃｕｌｉｓ）等、リポソーム、 ｌ、３９〜７２頁（マーセルデツカ−１９８３年）オストロ（Ｏｓｔｒｏ、　Ｍ 、）編集）。

上で述べたフレンチプレス法は高圧（約２０，０００ｐｓｉ）下車さなオリフィ スから脂質を押出すことを含むものである。この方法は迅速且つ有用であるが比 較的低濃度の脂質（＜５０ｍｇ／ｍＱ）に限定され、この手法の捕捉効率を制限 する。

前述のフレンチプレス法に関係のあるものとして規定された孔サイズのフィルタ ーにより脂質分散液を押出す方法がある。メイヤー等、且三坦１」…羽■虹」因 シ第８５８巻、１６１〜１６８頁（１９８６年）８国際出願ＰＣＴ／ＵＳ　８５ １０１１６１は実質的に均一なサイズ分布と基ラメラ構造を有する種々の脂質配 合のリポソームを作製するのに適する押出手法を記載している。均一なサイズ分 布は各々が同一孔サイズを有する１個またはそれ以上のフィルターに予め調製し たリポソームを繰り返し通過させることから生じる。基ラメラ構造は約１１００ ｎ以下の孔サイズを有するフィルターを使用することによって得られる。脂質ペ レット又は粉末と緩衝剤から直接リポソームを調製すること従って溶媒、界面活 性剤等の夾雑物の添加を避けていること、リポソームの捕捉液量を増加するため に押出前に凍結−融解サイクルを使用することも述べられている。こうして調製 されたリポソームは捕捉した物質を生体内で送達するのに有用であると述べられ ている。メイヤー等、バイオキミカエトバイオフィシカアクタ第８５８巻、１６ １〜１６８頁（１９８６年）、ホープ（）ｔａｐｅ）等、バイオキミカエトバイ オフィシカアクタ第８１２巻、５５〜６５頁（１９８５年）、およびメイヤー等 、バイオキミカ　エトバイオフィジカ　８１７巻、１９３〜１９６頁（１９８５ 年）はＰＣＴ／ＵＳ１０１１６１と同様の開示を含んでいる。

前述のいくつかの方法は造影剤として使用するＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームを 製造するために使用されており、その成果は文献に報告されている。例えばウン ガー（Ｕｎｇｅｒ）等、ラジオロジー、第１５７（Ｐ）巻、３１４頁（１９８５ 年）（抜粋）（１９８５年１１月１９日イリノイ州、シカゴ、北アメリカ科学会 第７１回放射線学会に於て発表）は造影剤を肝臓及び肺臓に選択的に送達するた めに音波処理法によって作製したＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームの使用を試験し ている。

米国特許第４，７２８，５７５号はＮＭＲ画像診断に造影剤どして有用であるＧ ｄ−ＤＴＰＡのような常磁性物質を含むリポソーム小胞を開示している。この特 許によれば、ＧＤ−ＤＴＰＡ含有小胞は均質化、キレート透析、音波処理等の方 法を用いて調製することができる。外部のＧ　ｄ　−Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａはゲルを濾 過、限外チ過又は類似の方法によって小胞から除去することができる。示される 調製実施例では、常磁性小胞を音波処理法次いでゲル濾過を用いて形成している 。この開示は記載されるリポソーム造影剤が正常組織よりむしろ腫瘍組織を目標 としているが、事実であれば理論的には、特に肝臓に使用した場合、正常組織と 腫瘍組織のコントラストを増加ではなく減少させることを示唆している。

１９８８年２月３日に公告された英国特許出願第２１９３０９５Ａ号は、巨大分 子に結合させたＧｄ−ＤＴＰＡのような常磁性イオンを含むリポソームとＮＭＲ 造影剤としての用途を述べている。実施例で記載されるリポソームは音波処理タ イプの方法を用いて作製している。

（Ｐ）巻、３１４頁（１９８５年）（要旨）（１９８５年１１月１９日イリノイ 州、シカゴ、北アメリカ科学会第７１回放射線学会で発表）、米国特許第４，７ ２８，５７５号及び英国特許出願第２１９３０９５Ａ号等に報告されたリポソー ムカプセル化造影剤が肝臓及び肺臓の悪性腫瘍を検出するのに使用するのにふさ れしいＭＲＩ造影剤の要件を解決すべきであるにもかかわらず、実際にはこれら の使用に関しては、相当な問題および制限がある。

まずこれらの生成物に見られるコントラスト増強（特異的緩和現象）は所望され るものより低い、更にこのようなリポソームは比較的不安定であり、常磁性造影 剤を漏出する傾向があることがわかっている。その上、現在までに開発された前 述のリポソーム／造影剤系のカプセル化効率は極めて低い、更にその上極めて著 しい毒性の問題に直面している。これらの並びに他の欠点はこのリポソーム的に カプセル化された常磁性物質の使用を希望したものより望ましくないものにして いる。

そこで本発明に於て凍結融解押出法によって作製され、ＧＤ−ＤＴＰＡのような 常磁性及び／又は超常磁性物質をカプセル化しているリポソームが従来当業界で 知られているもより著しく良好で、より有用なＭＲＩ造影剤を提供することが見 い出された。これらの造影剤は高緩和現象と良好なコントラスト増強を提供し、 腫瘍検出速度の付随的増加をもたらす。その上、これらの薬剤は認め゛　られる 毒性を示さず、非常に安定であり、長期の貯蔵後でさえも完全な状態を維持して いる。

また本発明に於て、どのように作製されたリポソームであっても直径約５０ｎｍ を有し常磁性及び／又は超常磁性物質をカプセル化しているリポソームが優れた ＭＨＩ造影剤であることが見い出された。驚くべきことにこれらの小さなサイズ のリポソームはより優れた緩和現象とコントラスト増強を示し、腫瘍検出の著し い増加をもたらし、また血液プール画像診断剤としても特に有効である。

月１夏！豊 本発明は血液プール画像診断剤として且つ肝臓及び肺臓の腫瘍組織の存在を診断 するのに特に有用である磁気共鳴映像法（ＭＨＩ）のための造影剤を提供する。

詳細には５本発明は凍結融触押出法によって作製され、常磁性及び超常磁性物質 をカプセル化しているリポソームを包含しているＭＨＩ造影剤を提供する。更に 本発明は作製されたリポソームであっても直径約５０ｎｍ以下を有し、常磁性及 び／又は超常磁性物質をカプセル化しているリポソームを包含しているＭＨＩ造 影剤を提供する。

本発明はまた（ｉ）前述のＭＲＩ造影剤の１種以上を患者に投与し、（ｉｉ）Ｍ ＨＩを用いて患者を走査して腫瘍組織の可視画像を得ることを特徴とする患者に 於ける腫瘍組織の存在を診断する方法を包含する。更に本発明は（ｉ）請求項１ ９記載のリポソームを患者に投与し。

（ｉｔ）ＭＲＩを用いて患者を走査して血液プールの位置の可視画像を得ること を特徴とする患者の血液プールの位置を画像診断する方法を包含する。

本発明は以下で更に詳細に記載される。

懸の詳細な説明 １実施態様に於て本発明は凍結−融解押出法によって作製され常磁性及び／又は 超常磁性物質を包囲しているリポソームを包含しているＭＲＩ造影剤を提供する 。

本明細書で用いられる“凍結−融解押出”とはリポソームの凍結と融解を１サイ クル以上行い、次いで押出機に１回以上通過させる方法を用いることを示す、詳 細には凍結−融解押出法は次の通り行なうことができる。

まず常磁性及び／又は超常磁性物質を含むリポソームを種々の通常のリポソーム 調製手法のいずれかを用いて最初に作製する。当業者に容易に明らかな通り、こ のような常法は音波処理、キレート透析、均質化、押出と組合せた溶媒注入等を 包含する。これらの手法等は例えば米国特許第４，７２８，５７８号、英国特許 出願第２１９３０９５号、米国特許第４，７２８，５７５号、米国特許第４，７ ３７，３２３号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１１６Ｌ、メイヤー等、バイオ キミヵエトバイオフィシカ　アクタ　第８５８巻、１６１〜１６８頁（１９８６ 年）、ホープ等、バイオキミヵエトバイオフィシカアクタ第８１２巻、５５〜６ ５頁（１９８５年）、米国特許第４，５３３，２５４号、メイヒュー等、メソッ ズインエンザイモロジー第１４９巻、６４〜７７頁（１９８７年）、メイヒュー 等、バイオキミヵエトバイオフィシカ　アクタ　第７７５巻、１６９〜１７４頁 （１９８４年）及びチェング（Ｃｈｅｎｇ）等インベスチゲイティブラジオロ！ 二第２２巻、４７〜５５頁（１９８７年）に述べられている。これらの発表の各 々の開示をそのまま本明細書に引用する。好適な手法として国際出願ＰＣＴ／Ｕ Ｓ　８５１０１１６１に記載されるものと同様な溶媒を含まない系を最初にリポ ソーム構造を調製するのに使用する。この手法を用いて脂質粉末又はベレットを 本発明の常磁性及び／又は超常磁性物質を含む緩衝水溶液に入れる。

こうして調製したリポソームを今度は凍結し次に融解する凍結−融解サイクルに 少なくとも１回かける。サイクルの凍結部分ではリポソームを適当なバイアルに 入れ、次いで液体窒素で好ましくは約３０秒から約５分間処理する。液体窒素は 好ましい冷却媒体であるが、他の冷却方法も使用することができる０例えばリポ ソームの入ったバイアルを好ましくは約−２０〜−９０℃の温度のフリーザーに 好ましくは約１時間以内入れることができる。

さらに、アセトン／ドライアイス、メタノール／ドライアイス又はエタノール／ ドライアイス等の冷却混合液を液体窒素の代替物として使用することができる。

サイクルの融解部分は凍結リポソームを含むバイアルを冷却媒体から約０℃以上 の温度を有する媒体に移して行なわれる。典型的にはバイアルを約３０〜７０℃ の温水に入れる。温度は融解において特に重要ではないが、リポソーム懸濁液が 完全に融解するまでバイアルを高温に保持することが重要である。

この凍結及び融解全サイクルは少なくとも１回又は約１０回以上行なう。

凍結−融解サイクルが完了した後、融解したリポソームは次に加圧下で孔サイズ の直径が約１５〜６００ｎｍであるフィルターを有する押出機に少なくとも１回 から約２０回以上まで通過させる。２個以上のフィルターを例えば直列にして使 用することができる。圧力は窒素、アルゴン又は他の不活性ガスの形で加えるか 又は機械的ポンプ又は直接置換によって加えることができる。当業者に認められ る通り、フィルター孔サイズは相対サイズ、ラメラ性、捕捉量、及び生成した脂 質小胞のサイズ分布を決定する。当業者に明らかな通り、孔サイズが小さい程、 リポソームサイズ、捕捉量及びサイズ分布は小さく、ラメラ性は少ない。外部熱 源（ヒートプレート、ヒートガン等）からあるいはサーモスタットジャケットに よって押出装置に熱を加えると脂質膜が更に変形可能となりより低い圧力で押出 が起こる。更に、このような熱を加えることによってより小さサイズの小胞がよ り簡単に作製することができる。リポソームの押出を促進するために脂質がゲル 状態よりむしろ液晶状態にある温度で脂質小胞を押出すことが好ましい、適温は 標準的脂質のテキストによって当業者に容易に明らかになるであろう。

約１５〜６００ｎｍのフィルター孔サイズを使用することができるが、好適なフ ィルター孔サイズは約１５〜３０　ｎ　ｒｎであり、一般し：直径約２０〜５０ 　ｎ　ｍのリポソ・−ムを生じる。更に好ましくは一般に直径約２０〜３０ｎｍ のリポソームを生じる孔サイズ約１５〜２５ｎｍ、最も好ましくは一般に直径約 ３５ｎｍのリポソームを生じる孔サイズ約２５ｎｍを使用する。より小さな孔サ イズはそれに対応してより小さなリポソーム並びに対応してよりラメラ性の少な いリポソームを生じるため好ましい、より小さなリポソームは緩和現象が大きく 及び／又はコントラストの改良により有効であることがわかった。

このより大きな緩和現象は内部容量に対して比例して大きい表面の存在によると 考えられ脂質膜を越えて水の拡散をより大きくし、従ってより良好なコントラス ト強調が可能である。緩和現象が１　／　ｒと直線関係をもつことを見い出しさ れていることは意味あることである。式中ｒは半径である。更により小さなリポ ソームは循環の半減期が長いことがわかった。更にラメラの少ないリポソーム小 胞特に単ラメラリポソーム小胞もまた高い緩和現象を示すことが見い出され、恐 らくラメラ性が少ないことにより、脂質膜を越える高い水輸送率が生じるためで あることと考えられる。

所望される場合、リポソームを押出し１次いで凍結−融解し、更に押出し凍結− 融解サイクルに続けることができる。凍結−融解押出の全過程は所望される回数 行なうことができる。リポソームの作製に使用される凍結−融解押出技術は当業 界で既知であり１例えば国際出願１６８頁（１９８６年）及びホープ等、バイオ キミ友エトバイオフィ！カ　アクタ、第８１２巻、５５〜６５頁（１９８５年） に記載され、これらの開示を全てそのまま本明細書に引用する。この手法は本発 明の凍結−融解常磁性及び超常磁性物質カプセル化リポソームの作製に使用する ことができる。

第２実施態様に於て本発明は直径約５０ｎｍ未満で常磁性及び／又は超常磁性物 質をカプセル化しているリポソームを包含するＭＨＩ造影剤を提供する。

後者の実施態様のリポソームはリポソームの直径が約５０ｎｍ以下を有するので あれば種々の通常の調製手法のいずれかを用いて作製することができる。当業者 に容易に明らかな通り通常のこの手法は音波処理、キレート透析、均質化、押出 と組合せた溶媒注入、凍結−融解押出、微小乳化等を包含する。これらの手法は 例えば米国特許第４，７２８，５７８号、英国特許出願第２１９３０９５号、米 国特許第４，７２８，５７５号、米国特許第４，７３７，３２３号、国際出願Ｐ ＣＴ／ＵＳ米国特許第４，５３３，２５４号、メイヒュー等、メソッズインエン ザイモロジー、第１４９巻、６４〜７７頁（１９６７年）、メイヒュー等、パイ キミカエトバ４オー第２２巻、４７〜５５頁（１９８７年）に述べられており、 全てそのまま本明細書に引用する。直径５０ｎｍを有するリポソームを作製する 好ましい手法として微小乳化又は凍結−融解押出（特に溶媒を含まない凍結−融 解押出手法）を使用する。最も好ましくは微小乳化を使用する。微小乳化はリポ ソーム放射線造影剤の大規模生産に適しているため特に好ましい。

凍結−融解手順は本明細書に詳細に記載されるが例えば国際出願ＰＣＴ−ＵＳ　 ８５１０１１６１．メイヤー等バイオキミカエトバイオフィシカアクタ　第８５ ８巻。

１６１〜１６８頁（１９８６年）及びホープ等、バイオキミカエトエヘイーオフ ィシカアクタ第８１２巻、５５〜６５頁（１９８５年）に記載される手順を包含 し、全てそのまま本明細書に引用する。

微小乳化手法は米国特許第４，５３３，２５４号、１４２２巻、４７〜５５頁（ １９８７年）に述べられており全てそのまま本明細書に引用する。詳細には微小 エマルジョン法は次の通り行なうことができる。

まず常磁性及び／又は超常磁性物質を含むリポソームを種々の通常のリポソーム 調製手法のいずれかを用いて最初に作製する。当業者に容易に明らかな通り、通 常のこの手法は音波処理、キレート透析、均質化、押出と組合せた溶媒注入等を 包含する。これらの手法等は例えば米国特許第４，７２８，５７８号、英国特許 出願第２１９３０９５号、米国特許第４，７２８，５７８号、米国特許第４，７ ３７，３２３号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ゛　米国特許第４，５３３，２５４号、 メイヒュー等、メソツズインエンザイモロジー第１４９巻、６４〜７７頁（１９ ８７年）メイヒュー等、バイオキミカエトバ（オーフィシカアクタ第７７５巻、 １６７〜１７４頁（１９８４年）及びチェング等、インベスチゲイテイブラジオ ロジ二第２２巻、４７〜５５頁（１９８７年）に述べられており、全てそのまま 本明細書に引用する。

次いでこうして調製したリポソーム組成物をマサチュセッツ州ニュートンにある バイオテクノロジーデベロップメント　コーポレーションの子会社ミクロフルイ ディクスコーポレーションから入手した装置ミクロフルイダイザー〇のような高 圧衝撃乳化機にかける。ミクロフルイダイザー■乳化機は米国特許第４．８５５ ，１６５号に記載され特許請求されており、この開示をそのまま本明細書に引用 する。この装置は高圧（約２３，０００　ｐｓｉまで）ポンプと乳化が起きる反 応室からなる。ポンプが組成物を２つの流れに分かれる室に送り込み、少なくと も２つのスリットに高速で通過させ、衝突して小さなサイズのリポソームが生ず る。当業者に認められる通り一般に複数回通過させると平均リポソームサイズが 小さくなり１粒子サイズ分布が狭くなる。同様に高圧はそれによって生じるせん 断と空洞現象により小さな平均リポソームサイズの形成を助けると考えられる。

１実施例として約１１，０ＯＯｐｓｉの圧力でミクロフルイダイザ−■による全 ３０回の通過之也口と平均リポソームサイズ約５０ｎｍ未満を有するリポソーム 組成物を生じる。

５０ｎｍ未満のサイズを有するリポソームは本発明の第２の実施態様に於て使用 することができるが、好ましくはリポソームの最小サイズは約２０ｎｍ、更に好 ましくは２０〜３５ｎｍ、最も好ましくは約３５ｎｍである。

一般にリポソームが小さい程、緩和現象及び／又はコントラスト増強が大きく及 び／又は循環半減期が長いことがわかった。

本発明のリポソームを作製するのに使用することができる材料はリポソーム構築 に適した、当業者に既知の材料又はその組合わせを含む、このような材料はコレ ステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスフ ァチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチ ジルイノシトール、リゾ脂質、脂肪酸、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴ 脂質、グリコリピド、グリコリピド、サルファチド、エーテルとエステル結合脂 肪酸を有する脂質、重合性脂質、及びその組合わせのような脂質を含むがこれら に限定されない、当業者に認められる通り、ポリサッカライドのような他の非脂 質及び他の重合体を単独で又は本リポソームを製造する場合の脂質材料と組合わ せて使用することができる。これらの材料は通常のリポソーム調製のプロトコー ルに従って種々の組合わせ及び比率で使用することができる。好ましいリポソー ム構造は脂質材料を含む構造であり、最も好ましくは約６０〜８０モル％のホス ファチジルコリンと約２０〜４０モル％のコレステロールを包含している。この ような構成は期待される優れた安定性と緩和特性のため最も好ましい。

本発明のリポソームは常磁性及び超常磁性物質を包囲する０本明細書で使用され る“常磁性物質”とは複合化剤又はタンパク質性巨大分子に共有結合又は非共有 結合した遷移元素、ランタニド及びアクチニドを包含する化合物を示す、また常 磁性物質とは安定なフリーラジカルを示す０元素は遷移元素及びランタニド元素 であることが好ましい、好ましい遷移元素及びランタニド元素としてはＧ　（ｍ ）　、　Ｍｎ　（ＩＩ）　、　Ｃｕ　（ＩＩ）　、　Ｃｒ　（ｎ）、Ｆａ　（Ｉ Ｉ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｇｏ　（ＩＩ）　、　Ｅｒ　（ＩＩ）　、　Ｎ１（ＩＩ ）、Ｅｕ（ｍ）及びＤｙ　（ｍ）がある、当業者に容易に明らかな適当な複合化 剤としてはジエチレン−トリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）　、エチレンジアミン 四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカ？／−Ｎ、　 Ｎ’、　Ｎ’、　Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１゜４．７．１０−テトラアザ シクロドデカンーＮ、　Ｎ’。

Ｎ”−三酢酸（ＤＯ３Ａ）　、３，６．９−トリアザ−１２−オキサ−３，６， ９−トリカルボキシメチレン−１０−カルボキシ−１３−フェニル−トリデカノ ン酸（Ｂ　−１９０３６）、ヒドロキシベンジルエチレンジアミンニ酢酸（）（ ＢＥＤ）、Ｎ、Ｎ’−ビス（ピリドキシルー５−ホスフェート）エチレンジアミ ン、Ｎ、Ｎ’　−二酢酸塩（ＤＰＤＰ）　、１，４．７−トリアザシクロノナン ーＮ、Ｎ’、Ｎ”−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロ テトラデカン−Ｎ　、　Ｎ　ｔ　、　ＮＩＩ　、　Ｎ　ＩＩ　＃−四酢［ｌ（Ｔ 　Ｅ　Ｔ　Ａ）があるがこれらに限定されない、好ましい複合化剤はＤＴＰＡ及 びＤＱＴＡであり、ＤＴＰＡが最も好ましい。適当なタンパク質巨大分子として はアルブミン、ポリアルギニン、ポリリシン、と−グロブリン及びβ−グロブリ ンがある。好ましいタンパク質性巨大分子はアルブミン、ポリアルギニン、ポリ リシン及びポリヒスチジンである。適当な安定フリーラジカルとしては安定なニ トロキシドがある０本明細書で用いられる“超常磁性物質”とはマグネタイトの ようなフェロ−又はフェリ磁性化合物を示す。所望される場合、血管作動性アミ ンを常磁性及び／又は超常磁性物質と共にカプセル化することができる。

好ましくは本発明のリポソームは常磁性物質をカプセル化している。更に好まし くは常磁性物質は複合化剤に結合したランタニド元素である。向夏に好ましくは 常磁性物質はＧｄ（ｍ）−ＤＴＰＡ又はＧｄ（ｍ）−ＤＯＴＡである。最も好ま しくは常磁性物質はＧｄ（ｍ）−ＤＴＰＡである。

本発明は患者に於て腫瘍組織の存在を診断するのに有用である。患者はいかなる 種類の哺乳類でもよいが最も好適にはヒトである。この方法は肝臓及び膵臓の腫 瘍の存在を診断するのに特に有用であるが他の器官又は筋肉部のような他の領域 の腫瘍を診断することができる。骨髄もまた本造影剤を使用するのに特に十分適 していると考えられる。

本発明のリポソームはまた血液プール画像診断即ち哺乳類系に存在する血液の画 像診断に有用である。従って本リポソームは健康な及び腫瘍両組織の血管分布を 評価するのに使用することができ、従って具体的には心筋又は脳における虚血の ような血管潅流減少の病理症状を評価するのに有用である。血液プール画像診断 剤として本発明のリポソームは血液量の測定や血管性漏出の評価（血管孔サイズ の評価を含む）にも有用であり、これらの分析は癌及び虚血を含む様々な疾患の 診断及び治療に重要である。

本発明の診断法は次の通り行なうことができる。まず患者に本発明のリポソーム 即ち凍結−融解押出法によって作製し、常磁性及び／又は超常磁性物質をカプセ ル化しているリポソーム又はどのように作製したリポソームであっても直径約５ ０ｎｍ未満を有し、常磁性又は超常磁性物質をカプセル化しているリポソームを 投与する。

次いでこの患者（患者全体又は患者の個々の器官又は領域）をＭＲＩを用いて走 査して患者の腫瘍組織又は血液プールの可視画像を得る。

当業者に認められる通り、投与は種々の投薬形で血管内、リンパ管内、非経口、 皮下、筋肉内又は腹腔内のような種々の方法で行なうことができる。好ましい投 与経路は血管内及びリンパ管内である。投与される有用な投薬量及び投与法は年 令、体重及び診断される哺乳類及び個々のリポソーム構成及び使用される常磁性 及び／又は超常磁性物質によって異なる。典型的には投薬量は低水準で開始し、 所望のコントラスト増強が得られるまで増加させる０本発明の診断方法を実施す る場合リポソームは単独で、別のものと併用して又は他の診断剤及び／又は治療 剤と併用して使用することができる。

使用されるＭＲ画像診断技術は常法であり１例えばり。

リアムアンドゥィルキンス、バルチモア　１９８６年）に記載される。予想され るＭＲＩ技術としては核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び電子スピン共鳴（Ｅ　Ｓ　Ｒ） があるが、これらに限定されない、好ましい画像診断法はＮＭＲである。

本発明は更に次の実施例に於て記載される。これらの実施例は添付の請求の範囲 を制限するものとして解釈されるべきではない。

ｘ】１乳 凍結−融解押出法によるＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームの作製及びその特性。

単ラメラ小胞を次の通り凍結−融解押出法を用いて作製した。卵ホスファチジル コリン（０，２１６ｇ）、コレステロール（０，０７７ｇ）及びコムギ胚芽ジガ ラクトシルジグリセリド（０，０２３ｇ）（モル比５５：４０：５）をクロロホ ルム原液１　ｍ　ｎに溶解した。３Ｈ−ＤＰＰＣＭＨ−ジパルミトイルホスファ チジルコリン）原液（０，２５ｍＣ１／２．５ｍＱトルエン、ＮＥＮカナダ）５ ０μ０を加えこの混合液をまず窒素下で蒸発させ、次に減圧下で２時間保持して 残留溶媒を除去した。

脂質混合液を０．６７Ｍ１５３Ｇｄ−ＤＴＰＡ　ｐＨ７，０，４ｒｍＱに分散さ せこれに１４０−イヌリン（０，２５ｍＣ１／　２．５　ａｒ　Ｑ水、ＮＥＮカ ナダ）５０μＱを加え、室温で回転ミキサー上で攪拌して多重ラメラ小胞（ＭＬ Ｖ）を得た。このＭＬＶをクリオーパイアル４　、５　ｍ　Ｑに移し。

次に液体窒素を用いて凍結−融解を５サイクル行った。

次に凍結融解したＭＬＶを窒素下で押出装置（リペックスバイオメンブランス） を用いて２枚重ねた０、４μポリカーボネートフイルター（ヌクレオボア）を１ ０回通過させてサイズを合せた６次にこのサイズの調製物の２／３を２枚重ねた ０、２μ　フィルターに１０回通過させた。

次に後者の調製物の１／２を２枚重ねた０、１μ　フィルターに１０回通過させ た。

これらのサイズの小胞調製物の各々は、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、６ｍＭＫＣＱ、１ ３９ｍＭ　ＮａＣｆｆ１からなる食塩緩衝液ＰＩ（７，４に室温で２時間攪拌し て膨潤させたセファデックス０５０Ｆ　（ファーマシア）によりクロマトグラフ ィー処理して外部Ｇｄ−ＤＴＰＡを除去した。

０５０Ｆを２３Ｘ１．５ｃｍバイオラドカラムに充填し、試料を加える前に少な くとも５０　ｍ　ｆ）、の緩衝液で平衡化した。試料は１　ｍ　Ａ充填した。小 胞をカラムのボイドボリュームの食塩緩衝液で溶出させ、試料をホープ等１匹イ オキミ力エトバイオフィシカアクタ、第１８２巻、５５〜６５頁（１９８５年） に記載される通りシンチレーション計数を用いて捕捉量を定量した。０．４μ小 胞の１バツチの場合、押出小胞を食塩緩衝液４Ｑに対して４℃で絶えず攪拌しな がら透析して捕捉されなかったＧｄ−ＤＴＰＡを除去した。透析外部媒体は４８ 時間に全部で８回変えた。１４Ｃ−イヌリントレーサーを用いてカプセル化効率 を決定した。

０．４ミクロン小胞のサイズはネガティブ染色法を用いて電子顕微鏡で評価した 。

異る小胞調製品に於ける脂質とＧｄ−ＤＴＰＡ濃度を表Ｉに示す、０．４μ小胞 は最高濃度のＧｄ−ＤＴＰＡを含んでいた。０．４ミクロン小胞調製物はＧ　ｄ 　−Ｄ　’ｒＰＡのカプセル化効率は３９％であり、透析により遊離Ｇｄ−ＤＴ ＰＡを除去した結果最高濃度のＧｄ　ＤＴＰＡ濃度を示した。電子顕微鏡の０． ４μ小胞は平均直径２３９±３９ｎｍを示した。

且−よ 凍結−融解Ｇｄ−ＤＴＰＡリポソームの特徴４００拳　１１６　１２４　３９ 拳非結合Ｇｄ−ＤＴＰＡはクロマトグラフィーによって除去し、他の場合は全て 透析を用いた。

実施例２ 凍結−融解押出法によって作製したＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームのインビトロ の安定性の分析。

実施例１で作製した０、４μ小胞のインビトロの安定性を標準食塩水（ｌｆｌず つ６回）に対して４℃で７２時間透析を行って試験した。安定性は７２時間の終 わりにリポソームに残存する１′’Ｇｄ−ＤＴＰＡ活性を計数して計算した。

これらの小胞は長時間の透析に対して１００％安定であることがわかった。

ス】口（ジ 凍結−融解押出法によって作製したＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームの生体内コン トラスト増強と毒性の分析。

生体内画像診断は全てシーメンス　１．５テスラ磁石（イセリン（Ｉｓｅｌｉｎ ）　）、Ｎ、Ｊ、）により行なった。スピンエコー法はＴ１及びＴ２両荷重画像 診断に使用した。

Ｔ１荷重シーケンスはパラメーターＴＲ／ＴＥ　：　４００ｍｓ　ｅ　ｃ／１６ ｍ５　ｅｃ−４アクイジシヨン、２５６ｘ２５６マトリツクス、１６ｃｍ視野領 域２　ｍ　ｍ厚スライスを使用した。Ｔ１計数に対して画像は所定のＴＥ２８ｍ ｓａａを用いＴＲは３００，５００．１５００及び３５００ｍｓｅｃに変えて得 た。Ｔ２計数に対して所定のＴ　Ｒ３５００ｍ　ｓ　ｅ　ｃとＴＥ値２８．４５ ．７０．９０及び１５００ｍｓｅｃを使用した。Ｔ１及びＴ２計数はＣＲＴモニ ターで問題の領域を選択してマグネトンシステム（イセリン、Ｎ、Ｊ、）による ソフトウェアを用いて行なった。

体重約４５０ｇの雄のバッフアロラットを７．５ｃｍ円形表面コイルを用いて走 査した。動物を背臥位で走査し肝臓、を柱周囲筋、腎臓、腎孟、膀胱及び血管組 織のシグナル強度を造影前及び後に測定した。ラットを０．４μＧｄ−ＤＴＰＡ リポソーム（８匹のラット）又は遊離のＧｄ−Ｉ）ＴＰＡ　（２匹のラット）造 影剤注入の前及び後に画像診断映像した。

実施例１で作製した０、４μリポソームの注入は２６ゲージのバタフライニード ルを用いて尾静脈注射により行なった。Ｇｄ−ＤＴＰＡリポソームを約２分間か けて注射した。リポソームは注射直前に同量の標準食塩水で希釈した０画像診断 後、動物を遅延毒性の徴候について８週間観察した。

ラットのＧｄ−ＤＴＰＡリポソームによる造影前及び後のスキャンは肝臓、腎皮 質及び血液組織のイメージ増強を示した。リポソーム中のＧｄ−ＤＴＰＡ　０． １ミリモル／ｋｇ以上の用量では、表■に示される通りシグナル強度（Ｓ、１． ）が劇的な増加を示した。最大増強は造影剤の注入直後に観察されたが、リポソ ームＧｄ−ＤＴＰＡの注入の２時間後に映像化し２匹では、肝及び血管組織のイ メージ増強は２時間維持されていた。遊離のＧｄ−ＤＴＰＡｏ、１及び０．２ミ リモル／　ｋ　ｇを注入した２匹の対照動物のスキャンは腎皮質、腎孟及び膀胱 の増強を示したが、肝臓又は血管組織の増強は顕著ではなかった。

Ｇｄ−ＤＴＰＡリポソームの１．Ｖ、注射中、呼吸困難又は他の毒性の徴候はな かった。ラットをリポソーム注入後２ケ月間観察し、次に屠殺したが、注入時あ るいは遅延フォロ一時及び肉眼的病理試験によるＧｄ−ＤＴＰＡリポソームから の毒性は証明されなかった。

表　■ Ｇｄ−ＤＴＰＡ凍槌二１乳匹煮ソーム劃１及側コントラ人凡昼汰 肝臓増強：　（肝Ｓ、１．後−肝Ｓ、１．前）＋（肝Ｓ、Ｉ。

前）、筋肉増強（を柱周囲筋）：（筋Ｓ、１．後−筋Ｓ。

■、前）十筋前、肝臓十筋肉は筋肉増強に対する肝臓増強の比率を意味する。造 影後Ｓ、１．は造影剤の１．ｖ。

注射３０分後のスキャンから測定した。Ｓ、１．＝シグナル強度、］ｊ、ｐｏ＝ リポソームＧｄ−ＤＴＰＡ、Ｘ＝平均。

傘注、５匹のラットにリポソーム内にカプセル化されたＧｄ−ＤＴＰＡ／ｋｇ　 Ｏ，１ミリモル用量を注射し、増強に対する平均値を示した。

失速例４ 凍結−融解押出法によって作製したＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームの調製とイン ビトロでの特性。

調製： 単ラメラ小胞をホープ等バ　オキミ力エトバイオフィシカ　アクタ、第１８２巻 、５５〜６５頁（１９８５年）に示される手順を用いて適度の圧力下ポリカーボ ネートフィルターを通して押出して作製した。小胞は卵ホスファチジルコリン（ ＰＣ）単独又は４０モル％のコレステロールと組合わせて構成された。ＰＣはア バンチポーラーリピッズから、コレステロールはシグマから入手し、共に精製せ ずに使用した。典型的にはＰＣ３，６ミリモル（２，８３ｇ）とコレステロール ２．４ミリモル（０，９３ｇ）を−緒に２５０　ｍ　Ｑの丸底フラスコ中で最少 量のクロロホルムに溶解し、これに１Ｈ−ジパルミトイル−ホスファチジルコリ ン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ）原液（２５０μｃｉ／２．５ｍＭ　トルエン、ＮＥＮ、カ ナダ）５０μｎを加えた。”Ｈ−ＤＰＰＣの目的は脂質濃度の定量化手段として 役立つことである。最初にクロロホルムを減圧下で回転蒸発により除去するとフ ラスコの壁に薄膜が残る。次にその内容物を減圧下（＜０　、１　ｍｍＨｇ）で 少なくとも２時間保持して残留溶媒を除去した。１４ｃｍイヌリン（２５０μＣ ｉ／２．５ｍＭ水、ＮＥＮ、カナダ）で標識した０、６７Ｍ　Ｇｄ−ＤＴＰＡ、 ｐＨ７（ナトリウム塩）２０ｍＱに脂質を室温で激しく振盪して分散させた。１ ４Ｃ−イヌリンは水性マーカーとして役立ち小胞の捕捉量の定量を容易にした。

分散により形成した多重ラメラ小胞を低温バイアルに移し、次に液体窒素で冷却 凍結した０次いで低温バイアルを脂質懸濁液が完全に融解するまで温水に入れた 。この凍結融解サイクルを更に４回繰り返した。次に凍結融解小胞を押出装置（ リペックスバイオメンブランス、カナダ）を用いて２枚重ねた０、４μポリカー ボネートフイルター（ヌクレオポア）に窒素圧（＜１００　ｐｓｉ）下で１０回 通過させてサイズをあわせ平均約４００ｎｍを有するリポソームを作製した１次 にこのサイズの調製物の一部を２枚重ねた０、２μフイルターに１０回通過させ て平均約２００ｎｍを有するリポソームを作製した１次に後者の調製物の一部を ２枚重ねた０、１又は０．０５μフイルターに更に１０回通過させて各々平均１ ００及び７０ｎｍを有するリポソームを作製した。各サイズの調製物の一部をシ ンチレーションカウンターに取り除いて”Ｈ−ＤＰＰＣ及び”ｃ−イヌリン含有 量を定量した。

各サイズの小胞に対して捕捉されない外部Ｇ　ｄ−ＤＴＰＡを食塩緩衝液（Ｉｏ ｎモル４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥ ＰＥＳ）、６ｍＭ　ＫＣＱ、１３９ｍＭ　ＮａＣＱ、ｐＨ７，４）４ｍに対して ４℃に於て徹底的透析によって除去した。透析外部媒体を２〜３日で合計８回（ ４Ｑずつ８回）変えた。

透析粒子のサイズをニコンプモデル２７０パーチクルサイザーを用いて準弾性光 散乱により６３４．２Ｑｍで行い標準累積分析により定量した。小胞の捕捉効率 は透析した小胞の一部を食塩緩衝液で平衡にしたセファデックス０５０Ｆ　（フ ァーマシア）によるクロマトグラフィー処理して定量した。捕捉した”Ｃ−イヌ リンを含む小胞をカラムに保持した。溶離した小胞試料を前述の通り二標識シン チレーション計数に使用した。

Ｇｄ−ＤＲＰＡの有効濃度０．２〜２ミリモルを含む各小胞調製物につきいくつ かの試料が得られるように小胞調製物をダルベツコのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ ）（ギブコ）で希釈してファントムを調製した。各希釈成約１０ｍＱを２０　ｍ 　Ｑのプラスチック注射器（ベクトンディキンソン）に入れバラフィルムで密封 して漏出を防ぎ注文製のアクリルファントムホルダーに入れた。このホルダーは 磁石の口径内にシリンジを長軸が水平になるように位置させる。

画像診断： ボディコイルを使用するシーメンス１．５テスラマグネトムホールボデイ　スキ ャナ（イセリン、Ｎ、Ｊ、）を用いてファントムを画像診断した。Ｔ１計数に対 して所定の置７ｍ５ｅｃ、ＴＲ値１００，３００．４５０．６００．９００．１ ２００．１８００．２５００及び３５００　ｍ　ｓ　ｅ　ｃによりスピン一二コ ーシーケンスを用いて映像を得た。他のパラメーターは４処理、２５６Ｘ２５６ マトリツクス、３０ｃｍ視野領域及び１０ｍｍスライスであった。

小胞安定性（保持）： 食塩水中、小胞調製物のインビトロの安定性（保持）を、調製後４℃に於て標準 食塩水（ＩＱずつ５回）に対して１２０時間透析（スペクトラポア１０ｍｍチュ ーブ、分子分画量１２〜１４，０００）Ｌ、、各時点で測定した。安定性は、適 当に標識した小胞内に残っている””Ｇｄ−ＤＴＰＡ活性のパーセントあるいは シンチレーション計数による３Ｈ−ＤＰＰＣ／”Ｃイヌリンの定量に基づいて計 算した。結果を表■に示す。

ス】１」ジ 卵ホスファチジルコリンとコレステロールの種々の比率を有するＧｄ−ＤＴＰＡ 含有リポソームの作製とインビトロでの特性 可変量の卵ホスファチジルコリンとコレステロールを使用した以外は実質的に実 施例４で記載した通り小胞を作製した。

また画像形成はシーメンス１゜５テスラマグネトムスキヤナで行なったほか東芝 Ｍ　Ｒ−５０Ａ　０　、５テルサホールボデイスキヤナにより行なった以外は実 質的に実施例４で記載した通り行なった。

結果を表■に示ず、結果はホスファチジルコリンと比べてコレステロールの割合 が大きい程、緩和現象が小さく、造影剤としてのリポソームの有効性が低くなる ことを示す。

表■ Ｇｄ−ＤＴＰＡ含有凍結融解ＰＣ：コレステロールリポソームの緩和現象 工小胞平均直径（ｍ琶＝と コレステロールモル％　１７０　１００　７００．５Ｔ　緩和現象（ｓｅｃ″″ Ｘｍμｍυ束０　１．３９９　（，１７８）　１．７３０　（，１８９）　２． ８５０　（，４２６）１０　１．２９４　（，１７４）　１．７９１　（。２１ ６）　２．６１８　（，３３４）２０　１．４０５　（，２１８）　１．８７８ 　）、２１９　２゜５５６　（，２８６）３０　０．８８５　（，１６２）　１ ．５５７　（，２２９）　２．２４１　（，２６１）４０　０．８０７　（，１ ６９）　１．２９８　（，１８８）　１．８６４　（，２１４）５０　０．５４ ９　（，１８４）　０．８８０　（，２２０）　１，３５４　（，２１５）１０ 　１．１０５　（，０６０）　１．６９７　（，０９７）　２．０３４　（，０ ８８）２０　１．０３９　（，０７４）　１．６２７　（，１０５）　１．９９ ２　（，３，１７）３００゜７２１　（，０５４）　１．２０９　（，０６３） 　１．８３０　（，０８７）４０　０．７１２　（，０６５）　１．０１７　（ ，０７７）　１．５２６　（，０９７）５０　０．３６１　（，０５９）　０． ７９４　（，０４３）　１．０００　（，０４９）ネ緩和現象値はＧｄ−ＤＰＴ Ａ有効濃度の４数値に対する直線回帰に基づく平均（±標準偏差）として表わす 。

去妻Ｏ引ジ 凍結−融解押出法によって作製したＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームの調製及び生 体分布特性 調製： １′３Ｇｄ−ＤＴＰＡ約１００μＣ：ｉをＧｄ−ＤＴＰＡ（７）一部として使用 し、ＤＰＰＬを使用しない以外は実質的に実施例４で記載した通り単ラメラ小胞 を作製した。

生体分布： 体重約２５０ｇの雄のフィッシャー３４４ラツトを生体分布の研究に使用した。

全ての実験に於てラットはロンプンＲｏ＋ａｐｕｎ＠（ハーバ−、カンサスシテ ィ）、０．０７ｍ　Ｑ　／　２５０　ｇ体重とケタミンＫｅｔａｍｉｎｅ■（パ ーク−ディビス、モリスプレインス、Ｎ、Ｊ、）、０．０５ｍ、Ｑ／　２５０　 ｇ体重の筋肉注射により麻酔した。造影剤注射はすべて尾静脈から約１分間かけ て行なった。

捕捉されたＧｄ−ＤＴＰＡを含む１００　ｎ　ｒｎ及び３゜ｎｍ両直径の脂質小 胞の生体分布を２５０ｇの雄フィッシャーラットで試験した。３〜５匹の動物に Ｇｄ−ＤＴＰＡの全投与量０．１ミリモル／　ｋ　ｇを静脈内に注射した。ラッ トを投与後１時間、４時間及び２４時間で屠殺した。血液、心臓、肝臓、肺臓、 筋肉、肺臓、腎臓、筋肉と脂肪試料を取り除き風体を量った空のガンマ計数管に 入れ、再び重量を量り計数した。結果は湿潤重量組織１ｇ当り注入全投与量の％ によって表わした。

結果を図１で報告する。結果はＧｄ−ＤＴＰＡ及び””Ｇｄ−ＤＴＰＡ　０．１ ミリモル／　ｋ　ｇの投与量で投与した平均直径１１００ｎと３　Ｏｎ、　ｎｏ の小胞について１５３Ｇｄ−ＤＴＰＡリポソームの生体分布を示している。図１ の棒は各々１．４及び２４時間に於ける８組に分類されている。各時点に於て左 から右に血液、心臓、肝臓。

肺臓、肺臓、腎臓、筋肉及び脂肪の生物分布データを報告している。結果が示す 通り小さい方のリポソームは肝臓、肺臓、肺、筋肉及び骨髄による取込みが高く 、血液プール相が著しく長いことを示す、従って小さい方の小胞は生物分布特性 により優れている。

図　１ スＪＮＵＬＬ 凍結−融解押出法によって作製したＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームによる肝転移 のインビボコントラスト増強細胞系及び腫瘍モデル： 使用した細胞系、Ｃ５は最初にフィッシャー新生ラットの肝臓から得、次にマウ スメタロチオネインプロモーターによって働く、Ｔ　２４　ｒ　ａ　ｓ遺伝子を 含むプラスミドを移入することによりインビトロでトランスフオームしたラット 肝上皮細胞系のクローン誘導体である。す（Ｌｉ）等、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、第３５ 巻、３４４頁（１９８８織、腹腔内及び肝臓内の生体内で急速に増殖することが 示されている。

この研究に使用される腫瘍は３　Ｘ　１０’細胞をラットの肝臓の表在葉に注入 して発生させた。１０５細胞を別々に３回約０．５ｃｍ”の面積に直接目で見て 注入した。

画像診断前に１４〜１７日間腫瘍を増殖させ次に屠殺した。

リポソーム調製： 卵ホスチジルコリンＣＥＰＣ）コレステロール（Ｃｈｏｌ）小胞（モル比６：４ ）を実施例４で記載した通り押出して作製した。

画像診断： ＭＲ画像診断を１５ｃｍへルムホルツ受診専用コイルを用いて全身用１．５Ｔシ ーメンスマグネトム（エアランゲン（Ｅ　ｒｌａｎｇｅｎ）、西独）により行な った。スピンエコー法をＴ　Ｒ／　Ｔ　Ｅ　４００　ｍ　ｓ　ｅ　ｃ　／　１７ 　ｍ　ｓ　ｅ　ｃ、２ｍｍスライス、４取込で行なった。画像をアキシャル及び コロナル両面に於ける造影前及び後を得、造影複画像は造影５〜６０分後に得た 。

ラットをエーテルで軽く鎮静し次に１．Ｐ、ケタミン／ロンプン０．１０ｍＱ／ 体重１００ｇで充分に鎮静した。

造影剤注入は約０．５ｍｎ量を２分間かけ尾静脈から行なった。投与量は次の通 りとし、遊離のＧｄ−ＤＴＰＡｏ、５及び０．２ｍＭ／ｋｇ、４００ｎｍＧｄ− ＤＴＰＡリポソーム０．５．０．２及び０　、１　ｍ　Ｍ　／　ｋ　ｇ、及び７ ０ｎ　ｍ　Ｇ　ｄ　−Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａリポソーム０．５．０　、２　ｍ　Ｍ　／ 　ｋ　ｇ、１匹のラットに各投与量の１つを注射した。

画像解析： 造影前及び後の画像を分け、１験法としてＭＲ及び腫瘍画像を判読する経験をつ んだ５人の放射線区に解読するようにＭＲ両画像示した。ＭＲスキャンは病理所 見または使用された造影剤の知識なしに放射線区に示された。放射線区は転移の 数を数え、病変場所をプロットし、病変サイズを測定するように指示された６次 に検出された病変の数とサイズを組織切片と相関させ、検出された転移の正しい 数を造影前及び後のスキャンに対して゛　決定した。マンーホイットニ−（Ｍａ ｎｎ　−Ｗｈｉｔｎｅｙ）試験を病変検出コントラスト前後の結果の統計的有意 性を試験するために使用した。

病理組織学： 画像診断直後ラットを過剰量のエーテルで層殺し肝臓を取り除き、１０％ホルマ リンで固定した。肝臓の肉眼的標本を写真にとり、２　ｍ　ｍ間隔でコロナルプ ラントに分けた。病変の数を数え病変のサイズを測定してＭＲ両画像よる所見と 相関させた。ヘマトキシリンとエオシン染色を用いて顕微鏡切片を調製し、光学 顕微鏡で研究した。

肝転移の検出： Ｇｄ−ＤＴＰＡによる造影前後の病変検出の精度を表Ｖに示す０表Ｖはリポソー ムＧｄ−ＤＴＰＡが５人の放射線区による病変検出に統計的な有意な改善を生じ たことを示す。遊離のＧｄ−ＤＴＰＡは病変検出を統計的に有意に減少させた。

実施例８ 微小乳化法によるＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームの作製とその特性。

単ラメラ小胞を次の通り微小乳化法を用いて調製した。卵ホスファチジルコリン （２０ｇ）とコレステロール（２，４６ｇ）をクロロホルム中で混合した。溶媒 を回転蒸発により最初に除去すると丸底フラスコの壁に薄膜を形成した６次にフ ラスコと内容物を減圧（＜　０．１ｍ　ｍ　Ｈｇ　）下モ約１．８時間放置した 。乾燥脂質をＧｄ−ＤＴＰＡ　（６７０ｍＭ）中で室温で振盪して再水和させて 脂質リンにより測定した場合約３００μモル／　ｍ　Ｑの濃度を有する分散液を 生成した。

ミクロフルイジクス＠Ｍ−１００Ｔ乳化機をこれにエタノール約１００　ｍ　Ｑ 、次に水２００　ｍ　Ｑ、次に透析緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１３９ｍＭ　 ＮａＣＱ、６ｍ　Ｍ　Ｋ　ＣＱ　、　ｐ　Ｈ７、４）　２００　ｍ　Ｑを通過さ せて清浄した。ポンプ圧を約１１，０００　ｐｓｉにセットして流速約２００ｍ １２／分を得、脂質分散液をミクロフルイダイザー■に水で冷却しながら通過さ せた。生成物を集め次に合計３０回装置に再循環させた。

小胞のサイズ分布をニコンプモデル２７０パーチクルサイザーを用いて準弾性光 散乱により６３４．２ｎｍで操作して標準累積分析により決定した。結果を表■ に示す。結果が示す通り作製した大多数のリポソームは直径約４２．８〜５２． １ｎｎを有する。

２１．０”　７８．６’ ２１．４　８２．７ ２１．８　８４．７ ４２．８　２９．０ ４４．４　９３．３ ４６．１　９９べ９ ４８．０　７６．４ ５０．０　１８，３ ５２．１　８．８ １７１．４’　９．０’ ２００．０’　１６．６’ ２４０．０’　２０．８’ ３００．０”　１２．８’ ４００．０’　５．２’ ６００．０’　０．４’ ”　ｄ　／　ｎ　ｍ　＝ナノメータによるリポソーム直径２相対面積＝最大４６ ．１ｎｍに比べて指定された直径を有するリポソームによって占められる全面積 ３データは機械のアーティファクトであってリポソームでないと考えられる。

３データはリポソームの集合体及び／又は微粉粒子を示すと考えられるゆ 大庭貫主 微小乳化法によるＧｄ−ＤＴＰＡ含有リポソームの作製と生体内コントラスト増 強の分析。

単ラメラ小胞を次の通り微小乳化法を用いて調製した。卵ホスファチジルコリン とコレステロールをクロロホルム中で８＝２の比で混合した。溶媒を回転蒸発に より最初に除去して丸底フラスコの壁に薄膜を形成した。

次にフラスコと内容物を減圧（＜　０．１ｍｍＨｇ）下で、約１８時間放置した 。乾燥脂質をＧｄ−ＤＴＰＡ　（６７０ｍ　Ｍ　）中で室温で振盪して再水和さ せて脂質リンで測定した場合約３００μモル／ｍΩの濃度を有する分散液を生成 した。

ミクロフルイジクス■Ｍ−１００Ｔ乳化機をこれにエタノール約１００ｍＱ次に 水２００ｍＱ、次に透析緩衝液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１３９＋＋＋ＭＮａＣ Ｑ、６ｍＭＫＣＱ、ｐＨ７，４）２００＋ｍＱに通過させて清浄した。ポンプ圧 を約１１，０ＯＯｐｓｉにセットして流速約２００ｍ１２／分を得、脂質分散液 を水で冷却しながらミクロフリダイザ−■に通過させた。生成物を集め次に合計 ３０回装置に再循環させた。

小胞のサイズ分布をニコンプモデル２７０パーヂクルサイザーを用いて準弾性光 散乱により６３４．２ｎｍで操作して標準累積分析により決定した。平均直径約 ５０ｎｍ以下を有するリポソームを得た。

画像診断： インビボ画像診断を全”Ｃ東芝ＭＲ−５ＯＡ　Ｏ，５テスラ全身用スキヤナで行 なった。スキャンパラメータは受信専用の表面コイルを用い、４取込によるＴＲ ＝４００ｍ５ｅｃ、ＴＥ＝１５ｍｓｅｃ、５ｍｍスライス、１ｍｍインタースラ イスギャップ、１５ｃｍ視野領域であった。

雄ウィスターラットを背臥位で走査し、肝臓、腎臓、を柱周囲筋並びに尿のシグ ナル強度を造影前及び後に測定し、造影後の間隔は１５分、１時間、４時間、２ ４時間及び４８時間を包含した。

上述の通り作製したリポソームの注入はラットの重量に基づいて０．１．０．０ ５、及び０．０２５ｍＭ／ｋｇの濃度にし、２６ゲージバターフライ二−ドルを 用いて尾静脈注射により行なった。リポソームを約２分間かけて注入し、注入直 前にまず同量の標準食塩水で希釈した。

造影前及び後のラットのスキャンは肝臓、腎臓及び尿の増強を示した。筋肉に対 する組織の比として報告した結果を図２〜４に示す、対照として投与量０．１ミ リモル／　ｋ　ｇで遊離Ｇｄ−ＤＴＰＡを注射したラットのスキャンを図５に報 告する。対照の結果は肝臓、腎臓及び尿の著しい増強を示さない。

本明細書で示し、記載したことに加えて本発明の種々の変更が前述の記述から当 業者に明らかになるであろう。このような変更も添付の請求の範囲内に入るもの とする。

図　２ 組　織／筋肉化 図　３ 組　織／筋肉化 図　４ 組　織／筋肉化 図　５ 組　織／筋肉化 手続補正書 モ成３年７月３日

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．凍結融解押出法によって作製され、常磁性及び／又は超常磁性物質をカプセ ル化しているリポソームを包含し、該リポソームの直径が約５０ｎｍ以下である ＭＲ１造影剤。
2. ２．該リポソームが溶媒を含まない凍結融解押出法によって作製される請求項１ 記載のＭＲＩ造影剤。
3. ３．該リポソームがコレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエ タノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスフ ァチジン酸、ホスファチジルイノシトール、リゾ脂質、脂肪酸、スフィンゴミエ リン、スフィンゴ糖脂質、グリコリピド、グリコリピド、サルファチド、エーテ ル及びエステル架橋脂肪酸を有する脂質、重合性脂質及びその組合わせからなる 群から選択される脂質材料を包含している請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
4. ４．該リポソームがホスファチジルコリンとコレステロールを包含している請求 項３記載のＭＲＩ造影剤。
5. ５．該リポソームが約６０〜８０モル％のホスファチジルコリンと約２０〜４０ モル％のコレステロールを包含している請求項４記載のＭＲＩ造影剤。
6. ６．該リポソームが約２０ｎｍから５０ｎｍ未満からなるサイズから選択される 請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
7. ７．該リポソームサイズが約２０〜３５ｎｍである請求項６記載のＭＲＩ造影剤 。
8. ８．該リポソームサイズが約３５ｎｍである請求項７記載のＭＲＩ造影剤。
9. ９．該リポソームが常磁性物質をカプセル化している請求項１記載のＭＲＩ造影 剤。
10. １０．該常磁性物質が複合化剤に結合したランタニド又は遷移元素である請求項 ９記載のＭＲＩ造影剤。
11. １１．該ランタニド又は遷移元素がＧｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｅｒ（Ｉ Ｉ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）及びＤｙ（ＩＩＩ）からなる群から選択さ れる請求項１０記載のＭＲＩ造影剤。
12. １２．該複合化剤がＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ、Ｄ０３Ａ、Ｂ−１９０３６ 、ＨＢＥＤ、ＤＰＤＰ、ＮＯＴＡ及びＴＥＴＡからなる群から選択される請求項 １０記載のＭＲＩ造影剤。
13. １３．該ランタニド元素がＧｄ（ＩＩＩ）であり、該複合剤がＤＴＰＡである請 求項１０記載のＭＲＩ造影剤。
14. １４．ＮＭＲ造影剤である請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
15. １５．肝臓又は脾臓に使用するためのＭＲＩ造影剤である請求項１記載のＭＲＩ 造影剤。
16. １６．（ｉ）請求項１記載のリポソームを患者に投与し、（ｉｉ）ＭＲＩを用い て患者を走査して腫瘍組織の可視画像を得ることを特徴とする、患者に於ける腫 瘍組織の存在を診断する方法。
17. １７．使用されるＭＲＩがＮＭＲである請求項１６記載の方法。
18. １８．誠意者の肝臓及び脾臓に於ける腫瘍組織の存在を診断するために用いられ る請求項１６記載の方法。
19. １９．直径約５０ｎｍ未満を有し、常磁性及び／又は超常磁性物質を包囲してい るリポソームを包含しているＭＲＩ造影剤。
20. ２０．該リポソームが微小乳化法によって作製される請求項１９記載のＭＲＩ造 影剤。
21. ２１．該リポソームが凍結融解押出法によって作製される請求項１９記載のＭＲ Ｉ造影剤。
22. ２２．該リポソームがコレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジル エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、ホスフ ァチジン酸、ホスファチジルイノシトール、リゾ脂質、脂肪酸、スフィンゴミエ リン、スフィンゴ糖脂質、グリコリピド、グリコリピド、サルファチド、エーテ ル及びエステル架橋脂肪酸を有する脂質、重合性脂質及びその組合わせからなる 群から選択される脂質材料を包含している請求項１９記載のＭＲＩ造影剤。
23. ２３．該リポソームがホスファチジルコリンとコレステロールを包含している請 求項２２記載のＭＲＩ造影剤。
24. ２４．該リポソームが約６０〜８０モル％のホスファチジルコリンと約２０〜４ ０モル％のコレステロールを包含している請求項２３記載のＭＲＩ造影剤。
25. ２５．該リポソームが約２０ｎｍから５０ｎｍ未満であるサイズから選択される 請求項１９記載のＭＲＩ造影剤。
26. ２６．該リポソームサイズが約２０〜３５ｎｍである請求項２５記載のＭＲＩ造 影剤。
27. ２７．該リポソームサイズが約３５ｎｍである請求項２６記載のＭＲＩ造影剤。
28. ２８．該リポソームが常磁性物質を包囲している請求項１９記載のＭＲＩ造影剤 。
29. ２９．該常磁性物質が複合化剤に結合したランタニド又は遷移元素である請求項 ２８記載のＭＲＩ造影剤。
30. ３０．該ランタニド又は遷移元素がＧｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｅｒ（Ｉ Ｉ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）及びＤｙ（ＩＩＩ）からなる群から選択さ れる請求項２９記載のＭＲＩ造影剤。
31. ３１．該複合化剤がＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ、Ｄ０３Ａ、Ｂ−１９０３６ 、ＨＢＥＤ、ＤＰＤＰ、ＮＯＴＡ及びＴＥＴＡからなる群から選択される請求項 ２９記載のＭＲＩ造影剤。
32. ３２．該ランタニド元素がＧｄ（ＩＩＩ）であり、該複合化剤がＤＴＰＡである 請求項２９記載のＭＲＩ造影剤。
33. ３３．ＮＭＲ造影剤である請求項１９記載のＭＲＩ造影剤。
34. ３４．肝臓又は脾臓に使用するためのＭＲＩ造影剤である請求項１９記載のＭＲ Ｉ造影剤。
35. ３５．（ｉ）請求項１９記載のリポソームを患者に投与し、（ｉｉ）ＭＲＩを用 いて患者を走査して腫瘍組織の可視面像を得ることを特徴とする患者に於ける腫 瘍組織の存在を診断する方法。
36. ３６．使用されるＭＲＩがＮＭＲである請求項３５記載の方法。
37. ３７．該患者の肝臓及び脾臓に於ける腫瘍組織の存在を診断するために用いられ る請求項３５記載の方法。
38. ３８．（ｉ）請求項１９記載のリポソームを患者に投与し、（ｉｉ）ＭＲＩを用 いて患者を走査して血液プールの位置の可視面像を得ることを特徴とする患者の 血液プールの面像診断方法。
39. ３９．使用されるＭＲＩがＮＭＲである請求項３８記載の方法。
40. ４０．患者に於ける健全又は腫瘍組織の血管分布を評価するために用いられる請 求項３８記載の方法。
41. ４１．患者の血液量を測定するために用いられる請求項３８記載の方法。
42. ４２．患者に於ける血管性漏出を評価するために用いられる請求項３８記載の方 法。